檢測dock2基因多態(tài)熱點突變情況的引物和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及檢測D0CK2基因多態(tài)熱點突變情況 的引物和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聯(lián)合免疫缺陷病是一種多基因遺傳病，其可分為:x性聯(lián)遺傳、常染色體隱性遺傳 型和散發(fā)型。聯(lián)合免疫缺陷病將導(dǎo)致淋己樣干細胞先天性分化異常，嬰兒出生后缺乏T細胞 和B細胞，使體液免疫和細胞免疫均發(fā)生缺陷，不能合成自己的免疫球蛋白，從而導(dǎo)致患者 對細菌、真菌、病毒等缺乏抵抗力，易發(fā)侵襲性感染?；純涸诔錾?-2個月內(nèi)發(fā)病，如得不 到有效治療，多于1歲內(nèi)死亡。目前國外已經(jīng)將該病列為"急診病例"，一旦診斷明確立即進 行造血干細胞移植，能及時為患兒贏得新生。
[0003] D0CK2基因位于人類第5號染色體上，總長446136bp，共52個外顯子。D0CK2基因編 碼的蛋白質(zhì)屬于CDM蛋白家族。它在造血細胞中特異性表達，主要在外周血白細胞，并通過 活化Rac來參與淋己細胞的遷移所需的肌動蛋白細胞骨架重構(gòu)。當(dāng)D0CK2基因發(fā)生突變， Racl的活化受損，趨化因子誘導(dǎo)的遷移和肌動蛋白的聚合在T細胞、B細胞和NK細胞中發(fā)生 缺陷。缺乏運種基因的小鼠在淋己細胞的遷移和引導(dǎo)中表現(xiàn)出嚴(yán)重的損傷。近來Do化S等人 報道，其在5名聯(lián)合免疫缺陷病的患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)分裂2基因(D0CK2)的等位基因突變，其 中3名患者通過干擾素或D0CK2表達治療后正?；Ｌ崾綝ock2的突變情況對聯(lián)合免疫缺陷 病有重要意義。對D0CK2的突變檢測無疑能對聯(lián)合免疫缺陷病的早診斷和及時的針對性治 療起重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測D0CK2基因多態(tài)突變熱點的引物，采用PCR技術(shù)，可 用于快速檢測骨髓增生異常綜合征患者體內(nèi)D0CK2基因多態(tài)位點的突變情況。所述檢測 D0CK2基因多態(tài)熱點突變情況的引物，包括：
[0005] 擴增D0CK2基因的引物，其堿基序列為：
[0006] D0CK2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTATGGGTTGTTTCTTGTCTCCT
[0007] D0CK2-1R：AACAGCTATGACCATGCCATCGGAAGTAGGTTAAATGAG
[0008] D0CK2-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTAACCTTTGATTGAATGCCT
[0009] D0CK2-2R：AACAGCTATGACCATGTAGGTTGGATTCTTGAGCTGTTT
[0010] D0CK2-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTCGCCGAACTGTTTTAT
[0011] D0CK2-3R：AACAGCTATGACCATGGAGAAAGAGGCTAAGCAAATACA
[0012] D0CK2-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTTATCCAGGGAGGAGGACTTT
[0013] D0CK2-4R：AACAGCTATGACCATGCTCTTCAACTTGCTGTGAGGC
[0014] D0CK2-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTACTGGCTGCTTTACGAG
[0015] D0CK2-5R：AACAGCTATGACCATGTATGATGAGGGCTATTGACTGG
[0016] D0CK2-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGCAATATTTATTCTGCTTTCG
[0017] D0CK2-6R：AACAGCTATGACCATGGTCTCCTTTTTAAAGTCAAAGGG
[001引進一步地，還包括測序引物，其堿基序列為：
[0019] 檢測D0CK2基因的測序引物堿基序列為：
[0020] Ml3F:TGTAAAACGACGGCCAGT
[0021] Ml3R：AACAGCTATGACCATG
[0022] 進一步地，引物序列D0CK2-1F和D0CK2-1R是擴增D0CK2基因第6外顯子序列的引 物，引物序列D0CK2-2F和D0CK2-2R是擴增D0CK2基因第22外顯子序列的引物，引物序列 D0CK2-3F和D0CK2-3R是擴增D0CK2基因第33外顯子序列的引物，引物序列D0CK2-4F和 D0CK2-4R是擴增D0CK2基因第37外顯子序列的引物，引物序列D0CK2-5F和D0CK2-5R是擴增 D0CK2基因第40外顯子序列的引物，引物序列D0CK2-6F和D0CK2-6R是擴增D0CK2基因第44外 顯子序列的引物。
[0023] 本發(fā)明還提供了檢測D0CK2基因第6、22、33、37、40、44號外顯子突變情況的方法， 包括W下步驟：
[0024] 1.抽提血液/中的DNA;
[002引 2.用PCR擴增步驟1中提取的DNA;
[0026] 3.對步驟2中的擴增產(chǎn)物進行測序；
[0027] 4.對測序結(jié)果進行判斷，確定D0CK2基因是否發(fā)生突變；
[002引其中PCR擴增引物為：
[0029] 擴增D0CK2基因的引物，其堿基序列為：
[0030] D0CK2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTATGGGTTGTTTCTTGTCTCCT
[0031] D0CK2-1R：AACAGCTATGACCATGCCATCGGAAGTAGGTTAAATGAG
[0032] D0CK2-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTAACCTTTGATTGAATGCCT
[0033] D0CK2-2R：AACAGCTATGACCATGTAGGTTGGATTCTTGAGCTGTTT
[0034] D0CK2-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTCGCCGAACTGTTTTAT
[00；35 ] D0CK2-3R: AACAGCTATGACCATGGAGAAAGAGGCTAAGCAAATACA [00；36] D0CK2-4F: TGTAAAACGACGGCCAGTGTTATCCAGGGAGGAGGACTTT
[0037] D0CK2-4R：AACAGCTATGACCATGCTCTTCAACTTGCTGTGAGGC
[0038] D0CK2-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTACTGGCTGCTTTACGAG
[0039] D0CK2-5R：AACAGCTATGACCATGTATGATGAGGGCTATTGACTGG
[0040] D0CK2-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGCAATATTTATTCTGCTTTCG [0041 ] D0CK2-6R：AACAGCTATGACCATGGTCTCCTTTTTAAAGTCAAAGGG
[0042] 進一步地，測序引物堿基序列為；
[0043] 檢測D0CK2基因的測序引物堿基序列為：
[0044] Ml3F：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0045] Ml3R：AACAGCTATGACCATG
[0046] 本發(fā)明還提供了一種檢測D0CK2基因多態(tài)突變位點的試劑盒，包括：
[0047] (i)血液DNA抽提試劑；
[0048] (i i)檢測體系PCR擴增反應(yīng)液；
[0049] (iii)測序體系試劑；
[0050] 其中PCR擴增反應(yīng)液引物為：
[00引](i)擴增D0CK2基因的引物，其堿基序列為：
[0052] D0CK2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTATGGGTTGTTTCTTGTCTCCT [005；3] D0CK2-1R:AACAGCTATGACCATGCCATCGGAAGTAGGTTAAATGAG
[0054] D0CK2-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTAACCTTTGATTGAATGCCT
[0055] D0CK2-2R：AACAGCTATGACCATGTAGGTTGGATTCTTGAGCTGTTT
[0056] D0CK2-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTCGCCGAACTGTTTTAT
[0057] D0CK2-3R：AACAGCTATGACCATGGAGAAAGAGGCTAAGCAAATACA [005引 D0CK2-4F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTATCCAGGGAGGAGGACTTT
[0059] D0CK2-4R：AACAGCTATGACCATGCTCTTCAACTTGCTGTGAGGC
[0060] D0CK2-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTACTGGCTGCTTTACGAG [0061 ] D0CK2-5R：AACAGCTATGACCATGTATGATGAGGGCTATTGACTGG
[0062] D0CK2-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGCAATATTTATTCTGCTTTCG
[0063] D0CK2-6R：AACAGCTATGACCATGGTCTCCTTTTTAAAGTCAAAGGG
[0064] 進一步地，測序引物堿基序列為；
[00化]Ml3F:TGTAAAACGACGGCCAGT
[0066] Ml3R：AACAGCTATGACCATG
[0067] 有益效果:本發(fā)明設(shè)計了擴增D0CK2第6、22、33、37、40、44號外顯子序列的引物。采 用PCR技術(shù)，構(gòu)建了穩(wěn)定的擴增體系。通過調(diào)整引物濃度、退火溫度等反應(yīng)條件，可使擴增效 率達到最佳。D0CK2基因的突變類型不定，因此本發(fā)明所述引物既能將所述D0CK2全部6、22、 33、37、40、44外顯子序列都擴增出來，也保證無論運些外顯子的何處位置發(fā)生突變，都不會 出現(xiàn)漏檢的情況。相比較巧光定量PCR法降低了檢測的成本和難度。巧光定量PCR法要針對 不同的突變類型設(shè)計多個探針，成本高，檢測難度大。
【附圖說明】
[0068] 圖1為D0CK2基因在染色體上定位圖
[0069] 圖2為D0CK2-1F/R的電泳圖，Μ為Marker DL 2000,1-16為送檢的血液樣本1-16號， 如圖2所示，引物D0CK2-1F/R擴增有效，且條帶單一。
[0070] 圖3為D0CK2-2F/R的電泳圖，Μ為Marker DL 2000,1-16為送檢的血液樣本1-16號， 如圖3所示，引物D0CK2-2F/R擴增有效，且條帶單一。
[0071] 圖4為D0CK2-3F/R的電泳圖，Μ為Marker DL 2000,1-16為送檢的血液樣本1-16號， 如圖4所示，引物D0CK2-3F/R擴增有效，且條帶單一。
[0072] 圖5為D0CK2-4F/R的電泳圖，Μ為Marker DL 2000,1-16為送檢的血液樣本1-16號， 如圖5所示，引物D0CK2-4F/R擴增有效，且條帶單一。
[0073] 圖6為D0CK2-5F/R的電泳圖，Μ為Marker DL 2000,1-16為送檢的血液樣本1-16號， 如圖6所示，引物D0CK2-5F/R擴增有效，且條帶單一。
[0074] 圖7為D0CK2-6F/R的電泳圖，Μ為Marker DL 2000,1-16為送檢的血液樣本1-16號， 如圖7所示，引物D0CK2-6F/R擴增有效，且條帶單一。
[00 巧]圖8、9、10、11、12、13 分別為樣本1、2、3、4、5、6的 D0CK2 第 6、22、33、37、40、44 號外顯 子野生型測序截圖。
【具體實施方式】
[0076] 下面結(jié)合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實施例中未說明 的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編 的《精編分子生物學(xué)實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0077] 實施例1
[0078] 一種檢測D0CK2基因多態(tài)突變位點的引物，該引物的設(shè)計是針對D0CK2突變熱點所 設(shè)計的特異性擴增引物，包括：
[0079] 擴增D0CK2基因包含第6、22、33、37、40、44號外顯子序列的引物，其堿基序列為：
[0080] D0CK2-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTATGGGTTGTTTCTTGTCTCCT [0081 ] D0CK2-1R：AACAGCTATGACCATGCCATCGGAAGTAGGTTAAATGAG
[0082] D0CK2-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTTAACCTTTGATTGAATGCCT
[0083] D0CK2-2R：AACAGCTATGACCATGTAGGTTGGATTCTTGAGCTGTTT
[0084] D0CK2-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCGTCGCCGAACTGTTTTAT
[00 化]D0CK2-3R:AACAGCTATGACCATGGAGAAAGAGGCTAAGCAAATACA [00 化]D0CK2-4F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTTATCCAGGGAGGAGGACTTT
[0087] D0CK2-4R：AACAGCTATGACCATGCTCTTCAACTTGCTGTGAGGC
[0088] D0CK2-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTACTGGCTGCTTTACG