專利名稱：甲型副傷寒沙門氏菌PagC亞單位疫苗及其制備方法
甲型副傷寒沙門氏菌PagC亞單位疫苗及其制備方法
技術(shù) 領(lǐng)域本文屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及甲型副傷寒沙門氏菌亞單位疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
傷寒是一種急性傳染病，包括傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhi)引起的傷寒和甲、乙、丙型副傷寒沙門氏菌(Salmonellaparatyphi A，Band C)引起的副傷寒。典型的臨床表現(xiàn)包括持續(xù)高熱、表情淡漠、腹部不適、肝脾腫大和周圍血象白細(xì)胞低下，部分病人有玫瑰疹和相對(duì)緩脈。傷寒還可引起高熱和腸道出血，具有很高的傳染性。人群對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌普遍易感，但兒童和青壯年發(fā)病率最高。據(jù)估計(jì)全球每年患傷寒(包括副傷寒) 的人數(shù)約2200萬(wàn)，死亡率超過0. 9%。而近幾年來(lái)，由于甲型副傷寒沙門氏菌臨床耐藥株以及多重耐藥株廣泛存在，致使甲型副傷寒暴發(fā)流行。甲型副傷寒沙門氏菌是無(wú)莢膜的革蘭氏陰性菌，其外膜蛋白在致病和刺激機(jī)體免疫應(yīng)答方面有不可忽視的作用。研究表明，沙門氏菌外膜蛋白具有良好的免疫原性及免疫保護(hù)性。PagC蛋白，其基因組注釋為外膜侵襲蛋白，是由pagC基因編碼的一個(gè)ISkDa的外膜蛋白，在沙門氏菌幾種傷寒血清型細(xì)菌中普遍存在，是沙門氏菌在巨噬細(xì)胞中存活及其在小鼠中表現(xiàn)出毒力的主要因素。在霍亂沙門氏菌中此蛋白也能增加動(dòng)物機(jī)體對(duì)細(xì)菌的免疫反應(yīng)性。選取PagC作為亞單位疫苗的組分，可以引起有效的免疫應(yīng)答，抵抗甲型副傷寒沙門氏菌的感染。但國(guó)內(nèi)外對(duì)此研究較少，已知的PagC種類較少。到目前為止，還沒有將 PagC蛋白用于制備甲型副傷寒沙門氏菌疫苗的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種新的甲型副傷寒沙門氏菌外膜蛋白PagC ；本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供該蛋白在制備甲型副傷寒沙門氏菌亞單位疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種甲型副傷寒沙門氏菌亞單位疫苗及其制備方法。本發(fā)明甲型副傷寒沙門菌外膜蛋白PagC的氨基酸序列如SEQID No. 2所示，實(shí)驗(yàn)表明，該蛋白具有良好的免疫保護(hù)性，可以用于制備預(yù)防或治療甲型副傷寒的藥物，尤其是疫苗。此外，由于PagC具有免疫中和活性，還可以通過制備PagC的特異性抗體來(lái)制備抗體藥物。本發(fā)明還提供用于編碼PagC的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 1所示?？紤]到密碼子的簡(jiǎn)并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響蛋白表達(dá)的條件下，對(duì)編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行修改。因此，本發(fā)明還包含對(duì)編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行的替換、添加和/或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸，具有與上述編碼基因具有相同功能的核苷酸序列。本發(fā)明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還提供制備達(dá)甲型副傷寒沙門氏菌外膜蛋白PagC的方法，包括將編碼 PagC的基因克隆至表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，獲得重組的目的蛋白。所述的表達(dá)載體選自質(zhì)粒pET30a及其適用于大腸桿菌系統(tǒng)的所有pET系列表達(dá)載體。

所述的大腸桿菌表達(dá)菌株選自E. coli BL21(DE3)、E. coliBL21(DE3)pLys、 Origami 或 Rosetta。述的轉(zhuǎn)化用熱休克轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。將所述的PagC基因克隆至質(zhì)粒pET30a，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，然后熱休克法轉(zhuǎn)化 E. coli BL21 (DE3)，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、破菌、離心、柱層析純化得到重組的PagC重組蛋白。在分發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用如下方法制備得到外膜蛋白PagC (1)在大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)PagC將PagC基因通過PCR擴(kuò)增，并引入Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)和6 X HIS標(biāo)簽，雙酶切后重組到大腸桿菌細(xì)胞的表達(dá)載體pET30a上，形成重組表達(dá)載體PagC/pET30a。通過熱休克法轉(zhuǎn)化用CaCl2制備的E. coli DH5 α，抽提質(zhì)粒并雙酶切驗(yàn)證正確后，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)以用于誘導(dǎo)表達(dá)PagC蛋白。含有目的基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步液體發(fā)酵并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。收集并破碎大腸桿菌細(xì)胞，SDS-PAGE和Western blot鑒定重組蛋白的分子量和免疫原性。(2)重組工程菌PagC/pET30a/BL21的大量發(fā)酵及其目的蛋白的純化在2L三角瓶中對(duì)重組工程菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。確定目的蛋白的表達(dá)形式，并計(jì)算目標(biāo)蛋白的表達(dá)率和產(chǎn)率；采用超聲的方式破菌，經(jīng)梯度離心的方法制得包涵體；選擇 GE公司的Ni親和預(yù)裝柱進(jìn)行純化。4°C下，采用梯度透析復(fù)性的方法對(duì)已純化好變性蛋白復(fù)性；此外，還進(jìn)一步進(jìn)行PagC蛋白的動(dòng)物免疫來(lái)確定PagC的免疫效果用PagC蛋白聯(lián)合鋁佐劑免疫BALB/c小鼠，并采用野生型甲型副傷寒沙門氏菌攻毒小鼠，ELISA方法測(cè)血清總IgG抗體及統(tǒng)計(jì)候選疫苗的保護(hù)率，評(píng)價(jià)該疫苗的免疫效果。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果(1)針對(duì)甲型副傷寒沙門氏菌疫苗的臨床試驗(yàn)中，國(guó)內(nèi)外基本上沒有單獨(dú)使用 PagC蛋白的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明使用PagC作為亞單位疫苗的主要組分，利用大腸桿菌系統(tǒng)獲得了高效表達(dá)。(2)基因工程手段構(gòu)建的重組PagC蛋白不含較大的融合標(biāo)簽，只含有一個(gè)6XHIS 標(biāo)簽便于后期純化操作。此標(biāo)簽基本上不會(huì)影響PagC蛋白本身的免疫原性。(3)在大腸桿菌中表達(dá)甲型副傷寒沙門氏菌的PagC蛋白，可以提高蛋白疫苗的表達(dá)水平。由于大腸桿菌結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快速、易于培養(yǎng)和發(fā)酵、生產(chǎn)成本低、目的蛋白產(chǎn)量高，這對(duì)于規(guī)?；a(chǎn)及其臨床應(yīng)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


圖1是PCR獲得目的片段(M =DNA Marker DL2000 ； 1 陰性對(duì)照；2 =PagC基因片段)；圖 2 是重組質(zhì)粒 PagC/pET30a 雙酶切鑒定(M :DNA MarkerDL2000 ； 1 :PagC/pET30a的Nde I和Xho I雙酶切)； 圖3是SDS-PAGE檢測(cè)重組PagC的表達(dá)(M 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 誘導(dǎo)后的pET30a/ BL21 ；2 未誘導(dǎo)的 PagC/pET30a/BL21 ；3 誘導(dǎo)后的 PagC/pET30a/BL21)；圖4是Western blot檢測(cè)重組PagC (Μ 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 重組PagC蛋白)；圖5是SDS-PAGE檢測(cè)PagC蛋白的純化結(jié)果(Μ 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1 未純化樣品； 2 流穿峰；3 =IOOmM咪唑洗脫峰；4 =IM咪唑洗脫峰)；圖6是鋁佐劑免疫后不同時(shí)間小鼠血清中PagC蛋白特異性IgG變化曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅僅用于舉例說(shuō)明本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。實(shí)施例中主要采用常規(guī)的基因工程分子生物學(xué)克隆方法，這些方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。按照以下實(shí)施例，不難根據(jù)具體情況略作修改和變換而成功實(shí)施本發(fā)明，這些修改和變換均落在本申請(qǐng)權(quán)利要求的范圍內(nèi)。表達(dá)載體選自質(zhì)粒pET30a及其適用于大腸桿菌系統(tǒng)的所有ρΕΤ系列表達(dá)載體。大腸桿菌表達(dá)菌株選自 Ε. coli BL21(DE3)、E. coliBL21 (DE3)pLys、Origami 或 Rosetta。在本實(shí)施例中，僅以鋁佐劑為例，來(lái)說(shuō)明本發(fā)明重組蛋白的免疫過程，但并不局限于該佐劑，弗氏佐劑也在實(shí)施例的范圍之內(nèi)。實(shí)施例1 甲型副傷寒沙門氏菌外膜蛋白PagC體外表達(dá)(1)甲型副傷寒沙門氏菌膜蛋白PagC基因的獲得以甲型副傷寒沙門氏菌50973菌株(來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心)的基因組作為模板，委托DNA合成公司合成上下游引物PagC-f :5-GGGAATTCCATATGGATACTAACGCCTTTTCCGTGG~3‘；PagC-r 5' -CCGCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAAACGGTATCCAACTCCG-3‘。其中，PagC-f、PagC-r用于擴(kuò)增PagC蛋白基因，并引入Nde I和Xho I酶切位點(diǎn)和6XHIS標(biāo)簽。使用Taq plus酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增:94V IOmin預(yù)變性；30個(gè)循環(huán)(94°C 30s， 52°C 30s, 72°C lmin) ；72°C 30min。用1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。(2)重組表達(dá)菌 PagC/pET30a/BL21 的構(gòu)建PagC基因純化后分別用Nde I和Xho I于37°C酶切2小時(shí)，回收純化片段，與純化的表達(dá)載體pET30a雙酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物通過熱休克法轉(zhuǎn)化用CaCl2制備的E. coli DH5ci，涂布Kan+-LB平板，37°C培養(yǎng)16小時(shí)，挑取數(shù)個(gè)單菌落接種Kan+-LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，堿裂解法抽提質(zhì)粒，Nde I和Xho I雙酶切質(zhì)粒鑒定含有預(yù)期大小的PagC基因，并且通過專業(yè)DNA測(cè)序公司測(cè)序結(jié)果序列正確。構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒采用上述方法再次轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)用于誘導(dǎo)表達(dá)PagC蛋白。(3) PagC蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分別挑取重組工程菌PagC/pET30a/BL21單菌落接種到Kan+-LB培養(yǎng)液中，37 °C 震蕩培養(yǎng)過夜，第二天按分別接種到新鮮Kan+-LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)至0D600約為1. O時(shí)，分別加入0. 5mmoIIPTG在37°C誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)。誘導(dǎo)結(jié)束后取適量樣品進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)，并用anti-his作為一抗Western blot鑒定。結(jié)果表明PagC蛋白的表觀分子量是18. 6KDa,與理論計(jì)算值基本一致。 在本實(shí)施例中，僅以pET30a，E. coli BL21 (DE3)和熱休克轉(zhuǎn)化法為例，來(lái)說(shuō)明本發(fā)明重組蛋白的構(gòu)建過程，但并不局限于該載體，宿主菌和轉(zhuǎn)化方法，其它PET系列載體，宿主菌E. coli BL21 (DE3)pLys、Origami, Rosetta和其它電轉(zhuǎn)化法或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法均在實(shí)施例的范圍之內(nèi)。實(shí)施例2 重組工程菌PagC/pET30a/BL21大量發(fā)酵及其目的蛋白的純化(1)重組工程菌大量發(fā)酵控制菌液0D600值約為0. 8時(shí)，加入lmmol/L IPTG，溫度37°C，發(fā)酵6小時(shí)。目標(biāo)蛋白的表達(dá)率約為40. 5%，產(chǎn)率為153mg/L，包涵體表達(dá)形式。(2) PagC包涵體的制備誘導(dǎo)后的菌液IOOOOg離心lOmin，菌沉淀以Tris緩沖液(0. 05mol/L NaCl， 0. 02mol/L Tris-Cl)重懸，冰水浴超聲破菌(破菌時(shí)間15min，功率100W，工作5s，暫停 10s，)。超聲后液體經(jīng)800g及18000g兩次離心后，所得18000g離心沉淀即為PagC包涵體。(3) PagC蛋白的純化和復(fù)性選擇GE公司的Ni親和預(yù)裝柱對(duì)包涵體進(jìn)行純化。包涵體用變性液(0. Imol/ L NaCl, 0. 05mol/L Tris-Cl，8M 尿素，0. 01mol/L 咪唑，pH9. 0)變性，然后用洗滌緩沖液(0. lmol/L NaCl,0. 05mol/L Tris-Cl，8M 尿素，0. 05mol/L 咪唑，pH9. 0)洗滌雜蛋白， 最后再使用洗脫緩沖液(0. lmol/L NaCl,0. 05mol/L Tris-Cl，8M 尿素，0. lmol/L 咪唑， pH9. 0)洗脫目的蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)，純化蛋白純度為93% ；純化后的蛋白采用梯度透析的方法進(jìn)行復(fù)性，4°C下，分別在不同濃度的尿素透析液(0.05mol/L Tris-Cl，10%甘油， 8M-6M-4M-2M-0M尿素，ImMEDTA, pH9. 0)中靜置透析，每個(gè)梯度保持12h，最后再透到緩沖液 (0. 05mol/L Tris-Cl, pH9. 0)中。中間過程中蛋白未析出。在本實(shí)施例中，僅以Ni親和層析法為例，來(lái)說(shuō)明本發(fā)明重組蛋白的純化過程，但并不局限于該純化方法，其它金屬離子螯合層析純化法、分子篩純化法、離子交換層析純化法或疏水層析純化法，均在實(shí)施例的范圍之內(nèi)。 實(shí)施例3 =PagC蛋白的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(I)PagC蛋白的動(dòng)物免疫BALB/c小鼠分成3組，每組均為20只小鼠。每組又分為兩小組，每小組10只，一小組取血，另外一小組攻毒。采用肌肉注射的方式，分別在0，2，4周進(jìn)行免疫。A組使用PBS ；B 組使用鋁佐劑；C組使用PagC蛋白+鋁佐劑。免疫劑量為每只小鼠0. 2ml，含有抗原10 μ g 鋁佐劑0.2mg。在每次免疫后10天，進(jìn)行血清采集。第一，二次采用眼角靜脈叢采血，第三次采用摘眼球采血。使用ELISA方法測(cè)血清總IgG抗體，并用SPSS軟件分析各組數(shù)據(jù)的組間差異性。結(jié)果表明小鼠抗PagC蛋白的IgG抗體效價(jià)很高。(2)動(dòng)物的攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)將同批次飼養(yǎng)的BALB/c小鼠40只分為4組，每組10只。用生理鹽水將培養(yǎng)好的甲型副傷寒沙門氏菌50973洗下，混勻后，比濁確定菌濃度。而后用濃度分別為60，30，15， 7. 5億/ml四個(gè)濃度的菌液攻毒，每只小鼠0. 5ml，腹腔注射。三天后記錄小鼠的死亡情況， 確定最小絕對(duì)致死量。
表1病原菌在Balb/C小鼠感染模型中最小絕對(duì)致死量的確定
權(quán)利要求
1.一種甲型副傷寒沙門氏菌外膜蛋白Page，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述外膜蛋白PagC的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.權(quán)利要求1所述外膜蛋白PagC在制備預(yù)防或治療甲型副傷寒疫苗中的應(yīng)用。
5.甲型副傷寒沙門氏菌PagC亞單位疫苗，其包括有效劑量的權(quán)利要求1所述的外膜蛋白PagC以及疫苗佐劑。
6.如權(quán)利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗佐劑為鋁佐劑或費(fèi)氏佐劑。
7.一種制備權(quán)利要求1所述外膜蛋白PagC的方法，其包括步驟將權(quán)利要求2所述的基因克隆至表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，獲得重組的目的蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主菌為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)、 E. coli BL21 (DE3)pLys、Origami或Rosetta，所述表達(dá)載體為適用于在所述宿主菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)載體。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于包括如下步驟將所述的PagC基因克隆至質(zhì)粒pET30a，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，然后熱休克法轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)、破菌、離心、柱層析純化得到重組的PagC重組蛋白。
10.一種制備權(quán)利要求5所述疫苗的方法，其包括將采用權(quán)利要求7 9所述的方法制備外膜蛋白PagC，并將其與適量免疫佐劑混合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲型副傷寒沙門氏菌亞單位疫苗PagC及其制備方法。該疫苗包括有效劑量的甲型副傷寒沙門氏菌外膜蛋白PagC以及疫苗佐劑。所述外膜蛋白PagC的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述制備方法是通過體外表達(dá)獲得外膜蛋白PagC，再與疫苗佐劑混合獲得。本發(fā)明生產(chǎn)成本低、目的蛋白產(chǎn)量高，這對(duì)于規(guī)模化生產(chǎn)PagC亞單位疫苗及其預(yù)防甲型副傷寒沙門氏菌感染具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102212120SQ201110078620
公開日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月30日
發(fā)明者曾明, 梁昊宇, 王恒樑, 王斌, 計(jì)國(guó)欣 申請(qǐng)人:中國(guó)食品藥品檢定研究院