專利名稱：可生物降解的且生物相容的封裝有腸炎沙門氏菌的聚合物微球體的制作方法
背景技術(shù)：
考慮到每年報道的大量腸炎沙門氏菌病病例，有明顯的對用以控制沙門氏菌屬腸內(nèi)病原體在家禽中的傳播以及用以防止該病原體傳播入它們的卵的可靠的方法的需求。無致病力的和滅活的可注射的腸炎沙門氏菌疫苗已經(jīng)被開發(fā)并且是有效的。但這些接種方法已知因為要求多次接種而導(dǎo)致雛雞嚴(yán)重緊張。
因此，非常需要這樣的方法，通過其可以以簡單、單劑量、有效且經(jīng)濟(jì)的方式使家禽對腸炎沙門氏菌免疫。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供長期釋放、生物相容的且可生物降解的、多孔聚合物微膠囊，其包括完整的滅活腸炎沙門氏菌。給藥后，腸炎沙門氏菌以兩階段(bipbasic)模式釋放，其中在約7至15天的時間內(nèi)，約20％至約50％的腸炎沙門氏菌以初始速釋(initial burst)的方式釋放，隨后在約70至約100天的時間內(nèi)，剩余的腸炎沙門氏菌以穩(wěn)定和持續(xù)的方式釋放。該微膠囊可以通過水包(油包水)乳化方法制備。
附圖的簡要說明

圖1A和圖1B分別顯示用PLGA 65∶35和PLGA 50∶50形成的負(fù)載有腸炎沙門氏菌的微球體的大小分布和形態(tài)學(xué)。
圖2顯示用PLGA 50∶50形成的負(fù)載有腸炎沙門氏菌的微球體的大小分布和形態(tài)學(xué)。
圖3A和圖3B顯示用PLGA 65∶35形成的負(fù)載有腸炎沙門氏菌的微球體釋放后的大小分布和形態(tài)學(xué)。
圖4顯示用PLGA 65∶35形成的負(fù)載有腸炎沙門氏菌的微球體釋放后的體外釋放圖(以3mg微球體計算)。
圖5顯示經(jīng)用PLGA 65∶35形成的負(fù)載有腸炎沙門氏菌的微球體治療的雛雞的抗體應(yīng)答。
發(fā)明的詳細(xì)描述微囊化是將活性物質(zhì)或者其他合乎需要的物質(zhì)的非常小的小滴或顆粒均勻地分布在聚合物基質(zhì)中的方法，該基質(zhì)是基本上惰性的且用以分隔或者保護(hù)該合乎需要的物質(zhì)。該合乎需要的物質(zhì)通過腐蝕、滲透或者基質(zhì)的破裂而從聚合物基質(zhì)中被釋放出來?；|(zhì)的大小或者材料的變化以及制備該微膠囊的方法的變化可以被用以控制核心物質(zhì)釋放的速率和時間。在下面的描述中，本發(fā)明的組合物被描述為微球體。如同在本文中所使用的，該術(shù)語包括微膠囊和微顆粒。該術(shù)語還包括“亞微”球體，也就是直徑在約0.1μm至10μm之間的球。
根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有完整的滅活腸炎沙門氏菌的微球體可以被給予家禽以保護(hù)家禽免于感染腸炎沙門氏菌。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的疫苗的單劑量在給予后3～4周就給家禽提供保護(hù)使其免于感染腸炎沙門氏菌，并且持續(xù)至少6個月的時間。
本發(fā)明的微球體的特征在于具有兩階段釋放模式。具體地說，該微球體在約7至約15天的時間內(nèi)，優(yōu)選是約7～10天內(nèi)提供微球體中總腸炎沙門氏菌的約20％至約50％的高初始釋放速率，隨后剩余的腸炎沙門氏菌在很長的時間內(nèi)以更低和穩(wěn)定的速率釋放，如下面所詳盡描述的。
用以形成本發(fā)明的微球體的優(yōu)選方法是將所選擇的聚合物溶解在一種或幾種溶劑中。更具體地說，優(yōu)選的方法使用稱為雙乳化方法(也稱為復(fù)乳化方法)的技術(shù)。在雙乳化方法中，腸炎沙門氏菌的水溶液被用所選擇的聚合物的大量非水溶液乳化?？梢酝ㄟ^超聲處理或者均化作用制備乳液。優(yōu)選的溶劑是二氯甲烷。其它合適的溶劑包括乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃和氯仿。水溶液和非水溶液的體積比通常在1∶80至約1∶12的范圍內(nèi)，優(yōu)選在約1∶40至1∶12的范圍內(nèi)。
溶劑的選擇和溶劑的量可以影響所得的微球體的大小和釋放圖。CH2Cl2或者其它溶劑的量影響聚合物溶液的粘度。使用相對少量的CH2Cl2將提供更粘稠的聚合物溶液，最終導(dǎo)致更大的微球體，并且最終導(dǎo)致更長的腸炎沙門氏菌釋放總時間。相對于聚合物的量，增加CH2Cl2的量將導(dǎo)致更多孔的(以及因此的更快釋放的)微球體的形成。
合乎需要地，聚合物在溶液中的濃度在約12至約150mg/ml的范圍內(nèi)，優(yōu)選在約30至約80mg/ml的范圍內(nèi)。如上面所提出的，這暗示如果需要顯著改變腸炎沙門氏菌的釋放圖，則可以改變濃度。同樣合乎需要地，腸炎沙門氏菌的水溶液在約20mg/ml至約600mg/ml的范圍內(nèi)，優(yōu)選在約30至約400mg/ml的范圍內(nèi)。聚合物與腸炎沙門氏菌的重量比影響腸炎沙門氏菌的釋放速率。釋放速率隨改比值降低而略微升高。聚合物重量與腸炎沙門氏菌重量的比在1.5∶1至40∶1的范圍內(nèi)，并且優(yōu)選在約4∶1至約40∶1的范圍內(nèi)。
所得乳液然后在更大量的水溶液中通過混合(微球體)或者通過超聲處理或均化作用(亞微球體)進(jìn)一步乳化，形成水包(油包水)雙乳液。用以形成第二乳液的優(yōu)選的溶液是磷酸緩沖鹽水(PBS)，其另外可以包括乳化劑。合適的乳化劑包括聚乙烯醇(PVA)、斯盤80和吐溫80。合適的乳化劑的量通常在約0.01％至約5％(重量)的范圍內(nèi)，對微球體，優(yōu)選的PVA的量是約0.05％(重量)，對亞微球體，優(yōu)選的PVA的量是約0.5％(重量)。乳化劑的濃度越高，球大小就越小，其將導(dǎo)致腸炎沙門氏菌的更快的釋放圖。
改變第一乳液和第二乳液的體積比可以影響溶劑的排除速率。溶劑的排除速率隨該比值降低而增加，其導(dǎo)致微球體的表層更密，進(jìn)一步導(dǎo)致腸炎沙門氏菌的緩慢釋放。第一乳液和第二乳液的體積比在約1∶500至約1∶1.5的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，該比值在約1∶50至約1∶1.5的范圍內(nèi)。
然后通過蒸發(fā)和/或萃取除去聚合物溶劑，使聚合物硬化并且將含有細(xì)菌的內(nèi)部水滴封裝入小微球體中，中數(shù)直徑通常為約0.1至約400μm，優(yōu)選為約5至約120μm。當(dāng)硬化完成后，微球體被過濾(微球體)或者離心(亞微球體)、洗滌并干燥?？梢杂?.02μm至20μm篩過濾，優(yōu)選用5μm篩過濾?？梢杂眉s15ml至約5000ml水進(jìn)行洗滌，通常用約100ml至約500ml磷酸緩沖鹽水(PBS)?？梢杂酶鶕?jù)常規(guī)技術(shù)的方法完成干燥，如真空干燥、冷凍干燥和流化床干燥。
合乎需要地，根據(jù)本發(fā)明制備的微球體每毫克微球體包含約25μg至約400μg腸炎沙門氏菌。通常，給予微球體以使動物得到總劑量至少是0.15mg滅活腸炎沙門氏菌。優(yōu)選地，給予每只雛雞的總劑量是約0.15mg至約15mg。
腸炎沙門氏菌的釋放可以通過兩種不同的機(jī)理實現(xiàn)。腸炎沙門氏菌可以通過擴(kuò)散通過聚合物基質(zhì)中填充有水的通道而被釋放，所述通道是由內(nèi)部水相產(chǎn)生的空隙或孔，或者在微球體形成期間通過溶劑排除而產(chǎn)生的空隙或孔的結(jié)果。微球體的孔隙率導(dǎo)致給予微球體后腸炎沙門氏菌的高初始速釋，因為處于或者靠近微球體的孔表面的腸炎沙門氏菌溶解在進(jìn)入孔中的體液中并從球中被帶走。根據(jù)本發(fā)明，總的封裝的腸炎沙門氏菌的約20％至約50％在初始速釋中被釋放，其通常在約7至約15天的時間內(nèi)發(fā)生。通過實現(xiàn)這種初始釋放速率，注射后僅3～4周，被給予微球體的家禽就表現(xiàn)出明顯的抗體應(yīng)答。相比于本領(lǐng)域已知的直到免疫接種后50天才導(dǎo)致明顯的抗體應(yīng)答的免疫接種方法來說，這是有優(yōu)勢的。
釋放的第二個機(jī)理是由于聚合物降解的腸炎沙門氏菌釋放。這在腸炎沙門氏菌初始速釋之后，并且導(dǎo)致微球體中剩余的腸炎沙門氏菌更緩和地釋放。通常，剩余的腸炎沙門氏菌在至少約10至約15周的時間內(nèi)被穩(wěn)定地釋放。可以通過改變影響聚合物水合速率的聚合物性質(zhì)來控制降解速率。這些性質(zhì)包括，例如，所使用的單體的選擇，組成聚合物的不同單體的比，以及聚合物的分子量。這些性質(zhì)可以影響聚合物的親水性和結(jié)晶性，它們又控制聚合物的水合速率。親水性的賦形劑，如糖類、表面活性劑、聚乙二醇(PEG)和低分子量聚酯也可以被摻入聚合物中以增加水合作用及改變聚合物的腐蝕速率。
在本發(fā)明中有用的聚合物包括聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物(poly(lactide-co-glycolide)copolymer，PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚原酸酯類、聚酐類和聚磷酸酯類。優(yōu)選的聚合物是聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物。雖然聚合物可以全部是聚交酯或全部是聚乙醇酸交酯，但優(yōu)選使用兩種聚合物的混合物(PLGA共聚物)，并且該共聚物優(yōu)選的組成在約65∶35至約50∶50的范圍內(nèi)。合適的聚合物分子量在約10000至約110000的范圍內(nèi)。合乎需要地，對于50∶50的組成，分子量是約40000至約75000，對于65∶35的組成，分子量是約10000至約75000。
通過改變聚合物性質(zhì)，也就是它的組成、分子量或者它的種類，可以影響釋放速率、通過擴(kuò)散而釋放的細(xì)菌對通過降解而釋放的細(xì)菌的比例，以及總的釋放時間。例如，改變PLGA的分子量或者聚合物中交酯的含量影響微球體在體液中降解的速率。增加聚(交酯-共-乙醇酸交酯)聚合物中乙醇酸交酯的含量和降低聚合物的分子量可以促進(jìn)聚合物的水解，因此提供增加的自聚合物腐蝕的腸炎沙門氏菌釋放。使用更高分子量的PLGA，例如在約75000至約110000的范圍內(nèi)，或者使用交酯和乙醇酸交酯的比例至少為約75∶25的含量，可以延長在初始速釋之后的腸炎沙門氏菌釋放時間。但是，合乎需要地使用更大體積的內(nèi)部水溶液以獲得更多孔的微球體，即使用包含相對聚乙醇酸交酯而言高的聚交酯含量，其仍能導(dǎo)致合乎需要的初始釋放。同樣，可以通過使用兩種不同種類的聚合物的組合來調(diào)節(jié)微球體的降解速率。例如，聚己內(nèi)酯(PCL)的降解速率比PLGA慢許多；PEG的降解速率快許多。用PEG和PLGA的混合物制備的微球體將具有更快的降解速率和更快的總腸炎沙門氏菌釋放速率。PEG對釋放的初始速釋幾乎沒有影響；可以通過微球體的孔隙率來控制初始速釋中腸炎沙門氏菌的釋放。
也可使用聚原酸酯類和聚酐類以兩階段釋放模式轉(zhuǎn)運腸炎沙門氏菌，如上面描述的PLGA那樣。在本文提供的指導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計聚合物基質(zhì)的組成以具有特定的合乎需要的釋放圖。
本發(fā)明的配方的pH通常在約5至約8的范圍內(nèi)。
除了腸炎沙門氏菌之外，本發(fā)明的配方可以包含其它成分，條件是任何這種其它成分均不干擾腸炎沙門氏菌或者其從微球體中的釋放，并且提供的量適于安全且有效的給藥。這些其它成分可以包括佐劑、營養(yǎng)物、藥物、肽和免疫調(diào)節(jié)劑。有用的佐劑包括氫氧化鋁、膠乳粒子或者脂質(zhì)體，其吸收抗原并增強(qiáng)免疫應(yīng)答。其它有用的佐劑可以包括皂苷和礦物油。
感興趣的肽包括胞壁酰二肽(MDP)，其促進(jìn)抗體產(chǎn)生并刺激和活化巨噬細(xì)胞。也可以包括海藻糖二霉菌酸酯用以刺激巨噬細(xì)胞。
可以在本發(fā)明的組合物中提供的免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，其具有復(fù)雜活性以激發(fā)巨噬細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞的噬菌作用，增加天然殺傷細(xì)胞的活性并促進(jìn)其它細(xì)胞因子的產(chǎn)生。另一個有用的免疫調(diào)節(jié)劑是腫瘤壞死因子(TNF)。某些復(fù)合糖類，如酶原、葡聚糖、葡聚糖硫酸酯和凝集素原(lectinan)也能夠被包括以用作免疫調(diào)節(jié)劑并活化巨噬細(xì)胞。
為了給予本發(fā)明的微球體，可以將適量微球體懸浮在PBS溶液中，并且將所得懸浮液通過注射或者口服給予家禽。合適的劑量包括約0.15mg至約15mg滅活的完整腸炎沙門氏菌。注射液可以通過肌內(nèi)或者皮下給予?？诜o藥可以通過滴管進(jìn)行或者通過將微球體懸浮液混在家禽飼料中進(jìn)行。
如上所述，已發(fā)現(xiàn)包含上述范圍內(nèi)的量的腸炎沙門氏菌的單劑量足以提供至少6個月的保護(hù)而免于感染腸炎沙門氏菌。在免疫接種約3～4周內(nèi)保護(hù)有效。
實施例將600mg聚合物PLGA 65∶35溶解在12ml CH2Cl2中。向該溶液中加入0.5ml腸炎沙門氏菌水懸浮液(72mg/ml，內(nèi)部水相)以通過超聲處理制備初級乳液。攪拌下在15℃將所得乳液注射入250ml磷酸緩沖鹽水(PBS)中以制備雙乳液，所述PBS含有0.05％(重量)聚乙烯醇(PVA)作為乳化劑。然后在4小時內(nèi)向該溶液中加入640ml含有0.05％(重量)PVA的PBS，用以將CH2Cl2萃取至外相。將所得含有腸炎沙門氏菌的微球體過濾，用PBS洗滌并真空干燥。微球體的大小在適合注射劑的0.5至120μm的范圍內(nèi)。圖1A顯示微球體的大小分布和形態(tài)學(xué)。顯然所制備的含有腸炎沙門氏菌的微球體具有多孔結(jié)構(gòu)。一旦微球體被給予，多孔結(jié)構(gòu)將允許腸炎沙門氏菌的高初始速釋，這將導(dǎo)致高的抗體應(yīng)答。
2.將5mg依照實施例4制備的負(fù)載有腸炎沙門氏菌的微球體懸浮在150μl蒸餾水中，并肌內(nèi)注射入6只14天大的雛雞。
3.將9mg依照實施例5制備的負(fù)載有腸炎沙門氏菌的微球體通過滴管口服給予6只14天大的雛雞。
4. 6只14天大的雛雞的第四組用作對照組并且不接受任何負(fù)載有腸炎沙門氏菌的微球體。在上面(1)中使用7天大的雛雞以研究雛雞的年齡對免疫接種是否有影響。
給予腸炎沙門氏菌一個月后，用5×107活腸炎沙門氏菌來激發(fā)三個治療組和對照組中的雛雞的免疫反應(yīng)。組4中的所有雛雞都患病，并表現(xiàn)出如明顯嗜睡(manifest somnolescence)、虛弱、缺乏食欲以及白堊色白色物質(zhì)粘附于肛門的臨床病征。而所有用腸炎沙門氏菌聚合物微球體治療的雛雞都沒有出現(xiàn)疾病癥狀。激發(fā)免疫反應(yīng)的結(jié)果列于下表1。從這些結(jié)果來看，顯然本發(fā)明的腸炎沙門氏菌微球體保護(hù)雛雞免于活腸炎沙門氏菌激發(fā)免疫反應(yīng)。
表1用腸炎沙門氏菌微球體治療后雛雞的激發(fā)免疫反應(yīng)的結(jié)果
權(quán)利要求
1.包含封裝有腸炎沙門氏菌的聚合物微球體的組合物，其中腸炎沙門氏菌以兩階段模式自微球體中釋放，兩階段模式的特征在于，第一階段中總腸炎沙門氏菌的約20％至約50％在約7至約15天的時間內(nèi)在初始速釋中釋放，在所述第一階段之后的第二階段中，剩余的腸炎沙門氏菌在約10至約15周的時間內(nèi)釋放。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中微球體包含聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物(PLGA)、聚原酸酯類、聚酐類、聚磷酸酯類或者它們的組合。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中微球體包含聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中交酯與乙醇酸交酯的比在約80∶20至約50∶50的范圍內(nèi)。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中交酯與乙醇酸交酯的比在約65∶35至約50∶50的范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求3的組合物，其中聚(交酯-共-乙醇酸交酯)的分子量在約10000至約110000的范圍內(nèi)。
7.權(quán)利要求1的組合物，其中微球體具有約0.1μm至約400μm的直徑。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中微球體具有約5μm至約120μm的直徑。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中微球體另外包含至少一種佐劑、營養(yǎng)物、藥物、肽、免疫調(diào)節(jié)劑或者它們的組合。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中摻入聚合物中的腸炎沙門氏菌的量是每毫克聚合物約25μg至約400μg。
11.包含遍及分布的腸炎沙門氏菌的聚合物微球體的制備方法，所述方法包括(a)用聚合物的非水溶液乳化腸炎沙門氏菌的水溶液；所述非水溶液具有約12mg/ml至約150mg/ml的重量體積比；其中腸炎沙門氏菌與聚合物的重量比為約1∶40至約1∶1.5，且水介質(zhì)與非水介質(zhì)的體積比為約1∶80至約1∶12；(b)將步驟(a)所得的油包水乳液與第二種水溶液混合以形成水包(油包水)雙乳液；(c)除去聚合物溶劑以產(chǎn)生多孔微球體；以及(d)將微球體過濾或者離心、洗滌并干燥。
12.權(quán)利要求11的方法，其中聚合物包含聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚原酸酯類、聚酐類、聚磷酸酯類或者它們的組合。
13.權(quán)利要求11的方法，其中聚合物溶劑包括CH2Cl2、乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃或者氯仿。
14.權(quán)利要求11的方法，其中第二種水溶液包含磷酸緩沖鹽水或者蒸餾水。
15.權(quán)利要求14的方法，其中第二種水溶液另外包含乳化劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中乳化劑包括聚乙烯醇、斯盤80或者吐溫80。
17.權(quán)利要求11的方法，其中微球體具有約0.1μm至約400μm的中數(shù)直徑。
18.權(quán)利要求11的方法，其中微球體包含聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物。
19.權(quán)利要求18的方法，其中交酯與乙醇酸交酯的比在約80∶20至約50∶50的范圍內(nèi)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中交酯與乙醇酸交酯的比在約65∶35至約50∶50的范圍內(nèi)。
21.權(quán)利要求18的方法，其中聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物的分子量在約10000至約110000的范圍內(nèi)。
22.權(quán)利要求11的方法，其中微球體另外包含至少一種佐劑、營養(yǎng)物、藥物、肽、免疫調(diào)節(jié)劑或者它們的組合。
23.權(quán)利要求11的方法，其中摻入聚合物的腸炎沙門氏菌的量是每毫克聚合物約25μg至約400μg。
24.免疫接種家禽使其免于感染腸炎沙門氏菌的方法，所述方法包括給予家禽有效量的權(quán)利要求1的微球體。
25.權(quán)利要求24的方法，其中微球體以生理學(xué)可接受的懸浮液被給予。
26.權(quán)利要求25的方法，其中懸浮液通過注射或者口服被給予。
27.權(quán)利要求24的方法，其中每只家禽接受的單劑量是約0.15mg至約5mg。
28.權(quán)利要求24的方法，其中家禽在給予微球體3～4周后顯示有效的腸炎沙門氏菌抗體應(yīng)答，其持續(xù)至少6個月。
29.免疫接種家禽使其免于感染腸炎沙門氏菌的方法，所述方法包括給予家禽單劑量的包含滅活腸炎沙門氏菌的微球體懸浮液，所述滅活腸炎沙門氏菌被封裝在包含聚(交酯-共-乙醇酸交酯)共聚物的多孔聚合物殼體中；所述微球體包含的腸炎沙門氏菌的總劑量為約0.15mg至約15mg；其中給予后腸炎沙門氏菌以兩階段模式自微球體中釋放，其中約20％至約50％的被封裝的腸炎沙門氏菌在給予懸浮液的7至約15天在第一階段中在初始速釋中釋放，剩余的腸炎沙門氏菌在約10至約15周的時間內(nèi)在第二階段中釋放。
30.權(quán)利要求29的方法，其中在給予微球體的約3～4周內(nèi)免疫接種有效。
全文摘要
將可生物降解的且生物相容的封裝有腸炎沙門氏菌的聚合物微球體給予雛雞以給雛雞提供持久的保護(hù)使其免于感染腸炎沙門氏菌。
文檔編號A61P31/04GK1346276SQ00806041
公開日2002年4月24日 申請日期2000年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月8日
發(fā)明者楊義燕, 吉米·況, 陳雪琴, 鐘臺生, 劉偉 申請人:分子農(nóng)業(yè)生物學(xué)院