專利名稱：家禽中的沙門氏菌疫苗的制作方法
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本申請要求于2006年12月11日提交的美國臨時專利申請系列號60/869,524的利益。
本文所引用或提及的所有文獻(“本文引用的文獻”)，和在本文引用的文獻中所引用或提及的所有文獻，以及在本文中或在通過提及而合并入本文的任何文獻中論及的任何產(chǎn)品的任何制造商指導(dǎo)、描述、產(chǎn)品說明書和產(chǎn)品印刷冊，特此通過提及而合并入本文，并且可以在本發(fā)明的實踐中使用。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及在動物(特別是禽類動物)中針對沙門氏菌(Salmonella)進行疫苗接種的領(lǐng)域。本發(fā)明還包括沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的試劑盒和用途。

背景技術(shù)：
沙門氏菌屬物種(Salmonella spp.)是除了慢性無癥狀帶菌狀態(tài)外還引起局限性或全身性感染的兼性細(xì)胞內(nèi)病原體。它們具有世界范圍的經(jīng)濟和公共衛(wèi)生重要性。在家禽中，禽傷寒和雞白痢病在下列的世界那些部分中持續(xù)導(dǎo)致經(jīng)濟損失其中養(yǎng)禽業(yè)持續(xù)增強的那些部分，和其中常見開放式禽舍(open sided housing)的那些部分。許多引起人類胃腸炎的血清型也在漸增。在改善衛(wèi)生和管理方面的成本或不實際性連同漸增的抗生素抗性問題表明，在家禽中進行疫苗接種作為現(xiàn)有防控措施的輔助措施將變得更有吸引力(Zhang-Barber L.等人，Vaccine，1999，17(20-21)2538-45)。
沙門氏菌是人類中通過食物傳播的疾病的主要原因之一。根據(jù)委員會關(guān)于人畜共患病的報告(European CommissionTrends andsources of zoonotic infections in animals，feed，food and manin the European Union and Norway in 2003)，在2003年由歐盟的15個成員國和挪威報告了135,546例的沙門氏菌病人類病例。
養(yǎng)禽業(yè)(尤其是在歐洲和美國中)處于來自衛(wèi)生當(dāng)局和消費者的要求降低人類受家禽來源的沙門氏菌污染(特別是沙門氏菌病)的風(fēng)險的強大壓力下(在美國中的病原體減少和HACCP，在EU中的CouncilDirective 92/117/EEC)。
因為沙門氏菌感染許多動物群體(例如哺乳動物、禽類)，所以始終存在患沙門氏菌病的風(fēng)險，而不論哪個國家、哪個季節(jié)或哪種食物處理實踐。
已經(jīng)用現(xiàn)有的抗微生物劑來治療人類胃腸感染的人畜共患病沙門氏菌屬物種原因。自20世紀(jì)90年代早期開始，已出現(xiàn)了對一系列抗微生物劑具有抗性的沙門氏菌菌株，這使得感染的治療效果降低，并且增加了人類感染由沙門氏菌屬物種引起的胃腸道感染的風(fēng)險。
如在前些年中，腸沙門氏菌腸亞種腸炎血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Enteritidis)(腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis))占優(yōu)勢，其導(dǎo)致了在歐盟和挪威中所有報告病例的61.8％(2002年67.1％)。在單個國家中的比率為87.9％(在奧地利中)至33.3％(在法國中)。腸沙門氏菌腸亞種鼠傷寒血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovarTyphimurium)(鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium))其次，其導(dǎo)致了所有病例的16.5％。在單個國家中的比率為5.8％(在奧地利中)至28.7％(在愛爾蘭中)。如在前些年中，在腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌之后，大多數(shù)病例由腸沙門氏菌腸亞種維爾肖氏血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovarVirchow)(維爾肖氏沙門氏菌(Salmonella Virchow))、腸沙門氏菌腸亞種嬰兒血清變種(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Infantis)(嬰兒沙門氏菌(Salmonella Infantis))和腸沙門氏菌腸亞種哈達爾血清變種(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Hadar)(哈達爾沙門氏菌(SallmonellaHadar))引起。這些血清變種中的每一種涉及小于1％的所有報告病例。
污染的主要來源是通過蛋和家禽肉消費。此類風(fēng)險的降低通過在蛋和肉生產(chǎn)鏈中自始至終的措施組合來達到，例如良好的飼養(yǎng)、衛(wèi)生實踐和疫苗接種。
關(guān)于食品衛(wèi)生和人畜共患病防控的共同體法規(guī)包括尋求控制和預(yù)防食品的沙門氏菌污染的許多條款。用于減少活動物中的沙門氏菌流行的措施被認(rèn)為是減少糧食污染和人類沙門氏菌病病例數(shù)目的最有效方法之一。
在2003年，公布了新的關(guān)于人畜共患病的歐洲法規(guī)；Regulation2160/2003規(guī)定了沿著食物鏈的病原體減少目標(biāo)的設(shè)定(主要對于動物群體)，以及國家防控計劃的建立以便滿足這些目標(biāo)。沙門氏菌屬物種是首要的目標(biāo)，特別是被視為具有公共衛(wèi)生重要性的血清型。目標(biāo)將在不同動物群體中漸進地設(shè)定原雞(Gallus gallus)的繁殖群、產(chǎn)蛋母雞、肉用仔雞、火雞和供屠宰肉用豬。迄今為止，僅對于原雞的繁殖群建立了目標(biāo)(Regulation 1003/2005)；該目標(biāo)被設(shè)定為1％，這意味著到2009年底，在EU范圍內(nèi)腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、哈達爾沙門氏菌和維爾肖氏沙門氏菌陽性的畜(禽)群的最大百分比將必須是1％。
關(guān)于種畜(禽)，Regulation 1091/2005禁止將抗微生物劑用作針對沙門氏菌的防控措施，而接受和推薦使用疫苗。對于來自委員會的涉及使用疫苗來防控家禽中的沙門氏菌的要求，“Scientific Panelon Biological Hazards”的結(jié)論和建議(The EFSA Journal(2004)114，1-74)在很大程度上贊同在農(nóng)場范圍內(nèi)使用疫苗來防控沙門氏菌。特別地，所述專家小組的結(jié)論尤其是 ·關(guān)于在家禽農(nóng)場中成功防控沙門氏菌感染的基礎(chǔ)是良好的飼養(yǎng)和衛(wèi)生實踐(包括涵蓋飼喂、鳥類、管理、清潔和消毒、防治嚙齒類動物等的所有方面)以及從生產(chǎn)中檢測出和去除陽性禽群。禽類的疫苗接種被認(rèn)為是用于增加鳥類針對沙門氏菌暴露的抵抗力和減少排菌(shedding)的措施。
·存在這樣的實驗和一些野外證據(jù)在經(jīng)疫苗接種的鳥類中水平減少的沙門氏菌生物的糞便排泄和全身性侵襲將導(dǎo)致食用蛋和環(huán)境的污染減少。
·如果防控計劃靶向下蛋雞/肉用仔雞的種禽或者產(chǎn)蛋母雞，并且禽群流行率高，那么疫苗接種在減少排菌和蛋污染方面可以是有用的。如果禽群流行率低，那么疫苗接種可能不是那么有用，但仍可以用作維持低流行率的預(yù)防措施之一。
沙門氏菌屬細(xì)菌存在超過2,000種的血清變種。
Kauffman和White分類(http://en.wikipedia.org/wiki/Kauffman-White-classification)允許將沙門氏菌屬的血清學(xué)變種彼此區(qū)分開。這個分類方案通過測定該細(xì)菌產(chǎn)生了哪些表面抗原來區(qū)分分離物。首先，測定“O”抗原類型?！癘”抗原是與細(xì)菌外膜的脂多糖相關(guān)聯(lián)的多糖。一旦確定了“O”抗原群，就測定了“H”抗原?！癏”抗原是與細(xì)菌鞭毛相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。沙門氏菌以兩個時期存在能動期和非能動期。這些也稱為特異期(specific phase)和非特異期(non-specific phase)。依賴于沙門氏菌所處的時期而產(chǎn)生不同的“H”抗原。傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)的致病菌株攜帶另外的抗原——“Vi”，之所以這樣稱呼是因為產(chǎn)生這種抗原的菌株具有增強的毒力，所述抗原與細(xì)菌莢膜相關(guān)聯(lián)。
根據(jù)Kauffman和White分類，形成了“O”-群沙門氏菌血清變種。
針對在雞中C群沙門氏菌的菌株建群，基于cya缺失型/crp缺失型哈達爾沙門氏菌和phoP缺失型哈達爾沙門氏菌開發(fā)了減毒疫苗(Roland K.等人，Avian Dis.，2004，48(3)445-52)。盡管cya缺失型/crp缺失型衍生物誘導(dǎo)了較高水平的血清抗體，但它不提供針對哈達爾沙門氏菌菌株建群的保護性免疫應(yīng)答。
Chacana等人(Chacana P.A.等人，Avian Dis.，2006，50(2)280-3)證實了，沙門氏菌減毒疫苗可以引發(fā)針對相同的Kauffmann-White分類方案血清群的成員的交叉免疫性。探究了由TAD沙門氏菌vacE(減毒的腸炎沙門氏菌疫苗)所賦予的針對禽傷寒的保護作用。從出生第一天開始，用不同的疫苗接種程序表對三組產(chǎn)蛋母雞進行疫苗接種，并之后在第28周或第52周時用2×105CFU的強毒雞沙門氏菌(Salmonella Gallinarum)菌株進行感染。評估了死亡率、糞便排菌和雞沙門氏菌的器官侵襲。腸炎沙門氏菌疫苗能夠針對雞沙門氏菌進行交叉免疫，根據(jù)Kauffmann-White分類，它們是D群沙門氏菌的兩種菌株。在第28周時，用3個口服劑量或者用與1個皮下劑量相組合的2個口服劑量進行疫苗接種的母雞受到該疫苗保護。然而，在第52周時，當(dāng)母雞在最后一次免疫接種后36周被感染時，該疫苗無法給予保護。
由于沙門氏菌血清變種的巨大數(shù)目，因此需要針對沙門氏菌的疫苗，所述疫苗能夠誘導(dǎo)針對超過一種沙門氏菌血清變種和/或針對超過一個Kauffmann-White分類群的沙門氏菌的保護性免疫應(yīng)答。
發(fā)明概述 因此，本發(fā)明涉及疫苗接種策略，其基于減毒的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用(primo-administration)和滅活的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用(boost-administration)。該疫苗接種策略可用于預(yù)防經(jīng)疫苗接種的受試者中同源和異源沙門氏菌的承載(portage)。
本發(fā)明的目的還在于提供使用免疫原性組合物或疫苗以便在禽類動物中預(yù)防同源和/或異源沙門氏菌的方法，其中向禽類動物施行減毒的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用，在數(shù)周后(尤其是在唯一的或第一次初激施用后2周至18周)施行滅活的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用。
本發(fā)明的目的還在于提供使用免疫原性組合物或疫苗以便在禽類動物中預(yù)防攜帶同源和/或異源沙門氏菌的方法，其中向禽類動物施行減毒的D群沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用，在數(shù)周后(尤其是在唯一的或第一次初激施用后2周至18周)施行滅活的B群沙門氏菌和滅活的D群沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用。B群和D群沙門氏菌的例子在本文中提供。
本發(fā)明的目的還在于提供用于對禽類動物進行疫苗接種的試劑盒，其包含至少兩個小瓶和具有施用指導(dǎo)的包裝說明書(packageinsert)，其中第一個小瓶包含減毒的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗，和第二個小瓶包含滅活的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗。任選地，可以包括另外的小瓶，所述小瓶包含用于多次初激施用的減毒的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗，和/或所述小瓶包含用于多次加強施用的滅活的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗。
應(yīng)當(dāng)指出，在本公開內(nèi)容中，特別是在權(quán)利要求書中，諸如“包含”、“包括”、“含有”等的術(shù)語可以具有在美國專利法中歸于其的含義；例如，它們可以表示“包含......在內(nèi)”、“包括......在內(nèi)”、“含有......在內(nèi)”等；并且諸如“基本上由......組成”的術(shù)語具有在美國專利法中歸于其的含義，例如，它們允許未明確敘述的要素，但排除在現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的或者影響本發(fā)明的基礎(chǔ)或新穎特征的要素。
這些和其他實施方案通過下面的詳細(xì)描述而得到公開，或者根據(jù)下面的詳細(xì)描述是顯而易見的，并且被下面的詳細(xì)描述所包括。
附圖簡述 作為舉例而給出的下面的詳細(xì)描述(其并不希望將本發(fā)明限制于所描述的具體實施方案)可以結(jié)合通過提及而合并入本文的附圖來理解，其中

圖1圖解說明了在攻擊后4-7天，在雞的脾臟中攻擊沙門氏菌菌株的再分離百分比。
圖2圖解說明了在攻擊后4-7天，在雞中攻擊沙門氏菌菌株的平均盲腸計數(shù)，以及標(biāo)準(zhǔn)偏差， 對于圖1和圖2，“對照”是未疫苗接種的對照組，其相應(yīng)于G.00；“L+K”是經(jīng)兩次疫苗接種的組，第一次用減毒的沙門氏菌疫苗和第二次用滅活的沙門氏菌疫苗，其相應(yīng)于G.01；“殺死的”是僅用滅活的沙門氏菌疫苗進行疫苗接種的組，其相應(yīng)于G.02。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及在禽類動物中使用免疫原性組合物或疫苗以便增加針對至少一種異源沙門氏菌的免疫應(yīng)答的方法，其中向禽類動物施行減毒的免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用，所述減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的屬于一種沙門氏菌血清變種的沙門氏菌；在相隔數(shù)周(尤其是2周至18周)后，施行滅活的免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用，所述滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的屬于一種沙門氏菌血清變種的沙門氏菌。所述減毒的沙門氏菌和所述滅活的沙門氏菌可以來自相同的血清變種或來自不同的血清變種。異源沙門氏菌是不同于在初激施用期間和在加強施用期間施用的免疫原性組合物或疫苗之中所使用的那些的細(xì)菌，例如另一種血清變種的沙門氏菌或另一個沙門氏菌群的沙門氏菌(根據(jù)Kauffmann-White分類)。
本發(fā)明的方法可以在禽類動物中使用，以便交叉保護禽類動物免患由至少一種異源沙門氏菌引起的疾病和/或預(yù)防在禽類動物中攜帶至少一種異源沙門氏菌。
本發(fā)明的方法還可以在禽類動物中使用，以便減少在受感染的禽類動物的脾臟和/或盲腸中的C群沙門氏菌細(xì)菌的數(shù)目，尤其是減少在受感染的禽類動物的脾臟和/或盲腸中的C1群沙門氏菌和C2群沙門氏菌細(xì)菌的數(shù)目，或減少在受感染的禽類動物的脾臟和盲腸中的B群沙門氏菌細(xì)菌和C群沙門氏菌細(xì)菌的數(shù)目。C群沙門氏菌的例子在本文中提供。
術(shù)語“免疫原性組合物”是指這樣的任何組合物，其一旦被注射到禽類動物中，就能夠誘導(dǎo)或刺激針對沙門氏菌的免疫應(yīng)答。
術(shù)語“疫苗組合物”或“疫苗”是指這樣的任何組合物，其一旦被注射到動物尤其是禽類動物中，就能夠誘導(dǎo)或刺激針對由沙門氏菌引起的疾病的保護性免疫應(yīng)答，和/或誘導(dǎo)或刺激保護性免疫應(yīng)答以預(yù)防或減少動物尤其是禽類動物中沙門氏菌的攜帶。
初激-加強方案包括使用至少一種通常的多肽、抗原、表位或免疫原來進行至少一次初激施用和至少一次加強施用。在初激施用中所使用的疫苗可以在性質(zhì)上不同于用作隨后的加強疫苗的那種疫苗。初激施用可以包括一次或多次施用。類似地，加強施用可以包括一次或多次施用。
本發(fā)明的方法包括向動物(優(yōu)選禽類動物)至少一次初激施用和至少一次加強施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗。動物可以是雄性或雌性的。這種施用可以尤其通過肌內(nèi)(IM)、皮內(nèi)(ID)或皮下(SC)注射或者經(jīng)由鼻內(nèi)或口服施用來進行，其中口服施用包括但不限于在飼料上或者在飲用水、凝膠或噴霧劑中進行施用。
藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體可以是水、注射用水、鹽水或緩沖液。可以向所述減毒的免疫原性組合物或疫苗中添加穩(wěn)定劑，例如甘油、糖類溶液，如蔗糖溶液。
在根據(jù)本發(fā)明方法的初激施用中使用的減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的沙門氏菌。減毒的沙門氏菌可以選自D群沙門氏菌和B群沙門氏菌，優(yōu)選選自由腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)、巴拿馬沙門氏菌(Salmonella Panama)、都柏林沙門氏菌(SalmonellaDublin)、雞沙門氏菌(Salmonella Gallinarum)、雞白痢沙門氏菌(Salmonella Pullorum)組成的D群，和選自由鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)、布倫登蘆普沙門氏菌(SalmonellaBraenderup)、阿哥納沙門氏菌(Salmonella Agona)、布雷登尼沙門氏菌(Salmonella Bredeney)、海德爾堡沙門氏菌(SalmonellaHeidelberg)、印地安那沙門氏菌(Salmonella Indiana)、圣保羅沙門氏菌(Salmonella Saint-Paul)、勃蘭登堡沙門氏菌(SalmonellaBrandenburg)組成的B群。在一個優(yōu)選的實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明方法的初激施用中使用的減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的D群沙門氏菌。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明方法的初激施用中使用的減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的B群沙門氏菌。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明方法的初激施用中使用的減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的D群沙門氏菌和至少一種減毒的B群沙門氏菌。在一個最優(yōu)選的實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明方法的初激施用中使用的減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及減毒的腸炎沙門氏菌。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明方法的初激施用中使用的減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及減毒的腸炎沙門氏菌和減毒的鼠傷寒沙門氏菌。
各種Kauffman-White沙門氏菌分類群的例子包括A、B、C1-3、D、E1-4、F、G、H和I群，它們的例子在下面提供。
例如，A群包括腸沙門氏菌腸亞種甲型副傷寒血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Paratyphi A)(甲型副傷寒沙門氏菌(Salmonella Paratyphi A))、甲型副傷寒沙門氏菌杜雷佐變種(Salmonella Paratyphi A variant durazzo)。
例如，B群包括腸沙門氏菌腸亞種乙型副傷寒血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Paratyphi B)(乙型副傷寒沙門氏菌(Salmonella Paratyphi B))、乙型副傷寒沙門氏菌歐登塞變種(Salmonella Paratyphi B variant odense)、腸沙門氏菌腸亞種爪哇血清變種(Salmonella enterica subspeciesenterica serovar Java)(爪哇沙門氏菌(Salmonella Java))、腸沙門氏菌腸亞種鼠傷寒血清變種(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Typhimurium)(鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium))、腸沙門氏菌腸亞種布倫登蘆普血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovarBraenderup)(布倫登蘆普沙門氏菌(Salmonella Braenderup))、腸沙門氏菌腸亞種阿哥納血清變種(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Agona)(阿哥納沙門氏菌(SalmonellaAgona))、腸沙門氏菌腸亞種布雷登尼血清變種(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Bredeney)(布雷登尼沙門氏菌(Salmonella Bredeney))、腸沙門氏菌腸亞種海德爾堡血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Heidelberg)(海德爾堡沙門氏菌(Salmonella Heidelberg))、腸沙門氏菌腸亞種印地安那血清變種(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Indiana)(印地安那沙門氏菌(Salmonella Indiana))、腸沙門氏菌腸亞種圣保羅血清變種(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Saint-Paul)(圣保羅沙門氏菌(Salmonella Saint-Paul))、腸沙門氏菌腸亞種勃蘭登堡血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Brandenburg)(勃蘭登堡沙門氏菌(Salmonella Brandenburg))、腸沙門氏菌腸亞種萊墨特血清變種(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Limete)(萊墨特沙門氏菌(Salmonella Limete))、腸沙門氏菌腸亞種阿格瑪血清變種(Salmonella enterica subspeciesenterica serovar Agama)(阿格瑪沙門氏菌(Salmonella Agama))、腸沙門氏菌腸亞種德爾比血清變種(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Derby)(德爾比沙門氏菌(SalmonellaDerby))、腸沙門氏菌腸亞種薩林納斯血清變種(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Salinatis)(薩林納斯沙門氏菌(Salmonella Salinatis))、腸沙門氏菌腸亞種斯坦利血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Stanley)(斯坦利沙門氏菌(Salmonella Stanley))。
例如，C1群包括腸沙門氏菌腸亞種丙型副傷寒血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Paratyphi C)(丙型副傷寒沙門氏菌(Salmonella Paratyphi C))、腸沙門氏菌腸亞種嬰兒血清變種(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Infantis)(嬰兒沙門氏菌(Salmonella Infantis))、腸沙門氏菌腸亞種姆班達卡血清變種(Salmonella entericasubspecies enterica seroar Mbandaka)(姆班達卡沙門氏菌(Salmonella Mbandaka))、腸沙門氏菌腸亞種利文斯通血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Livingstone)(利文斯通沙門氏菌(Salmonella Livingstone))、腸沙門氏菌腸亞種維爾肖氏血清變種(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Virchow)(維爾肖氏沙門氏菌(Salmonella Virchow))、腸沙門氏菌腸亞種俄亥俄血清變種(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Ohio)(俄亥俄沙門氏菌(SalmonellaOhio))、腸沙門氏菌腸亞種蒙得維的亞血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Montevideo)(蒙得維的亞沙門氏菌(Salmonella Montevideo))、腸沙門氏菌腸亞種田納西血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovarTennessee)(田納西沙門氏菌(Salmonella Tennessee))、腸沙門氏菌腸亞種羅森血清變種(Salmonella enterica subspeciesenterica serovar Rissen)(羅森沙門氏菌(Salmonella Rissen))、腸沙門氏菌腸亞種迪凱特血清變種(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Decatur)(迪凱特沙門氏菌(Salmonella Decatur))、腸沙門氏菌腸亞種巴雷利血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Bareilly)(巴雷利沙門氏菌(Salmonella Bareilly))、腸沙門氏菌腸亞種門斯頓血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovarMenston)(門斯頓沙門氏菌(Salmonella Menston))、腸沙門氏菌腸亞種奧拉寧堡血清變種(Salmonella enterica subspeciesenterica serovar Oranienburg)(奧拉寧堡沙門氏菌(SalmonellaOranienburg))、腸沙門氏菌腸亞種湯普森血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Thompson)(湯普森沙門氏菌(Salmonella Thompson))。
例如，C2群包括腸沙門氏菌腸亞種哈達爾血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Hadar)(哈達爾沙門氏菌(Salmonella Hadar))、腸沙門氏菌腸亞種新港血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Newport)(新港沙門氏菌(Salmonella Newport))、腸沙門氏菌腸亞種科特布斯血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Kottbus)(科特布斯沙門氏菌(Salmonella Kottbus))。
例如，C3群包括腸沙門氏菌腸亞種肯塔基血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Kentucky)(肯塔基沙門氏菌(Salmonella Kentucky))、腸沙門氏菌腸亞種阿爾巴尼血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Albany)(阿爾巴尼沙門氏菌(Salmonella Albany))。
例如，D群包括腸沙門氏菌腸亞種傷寒血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Typhi)(傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhi))、腸沙門氏菌腸亞種腸炎血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Enteritidis)(腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis))、腸沙門氏菌腸亞種巴拿馬血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Panama)(巴拿馬沙門氏菌(Salmonella Panama))、腸沙門氏菌腸亞種都柏林血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovarDublin)(都柏林沙門氏菌(Salmonella Dublin))、腸沙門氏菌腸亞種雞血清變種(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Gallinarum)(雞沙門氏菌(Salmonella Gallinarum))、腸沙門氏菌腸亞種雞白痢血清變種(Salmonella entericasubspecies enterica serovar Pullorum)(雞白痢沙門氏菌(Salmonella Pullorum))、腸沙門氏菌腸亞種恩多洛血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Ndolo)(恩多洛沙門氏菌(Salmonella Ndolo))、腸沙門氏菌腸亞種邁阿密血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Miami)(邁阿密沙門氏菌(Salmonella Miami))、腸沙門氏菌腸亞種仙臺血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovarSendai)(仙臺沙門氏菌(Salmonella Sendai))。
例如，E1群包括腸沙門氏菌腸亞種吉夫血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Give)(吉夫沙門氏菌(Salmonella Give))、腸沙門氏菌腸亞種鴨血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Anatum)(鴨沙門氏菌(Salmonella Anatum))、腸沙門氏菌腸亞種倫敦血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar London)(倫敦沙門氏菌(Salmonella London))、腸沙門氏菌腸亞種火雞血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovarMeleagridis)(火雞沙門氏菌(Salmonella Meleagridis))。
例如，E2群包括腸沙門氏菌腸亞種劍橋血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Cambridge)(劍橋沙門氏菌(Salmonella Cambridge))、腸沙門氏菌腸亞種紐因吞血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Newington)(紐因吞沙門氏菌(Salmonella Newington))。
例如，E3群包括腸沙門氏菌腸亞種明尼阿波利斯血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Minneapolis)(明尼阿波利斯沙門氏菌(Salmonella Minneapolis))。
例如，E4群包括腸沙門氏菌腸亞種西姆斯伯利血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Simsbury)(西姆斯伯利沙門氏菌(Salmonella Simsbury))、腸沙門氏菌腸亞種森夫頓堡血清變種(Salmonella enterica subspecies entericaserovar Senftenberg)(森夫頓堡沙門氏菌(SalmonellaSenftenberg))。
例如，F(xiàn)群包括腸沙門氏菌腸亞種阿柏丁血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Aberdeen)(阿柏丁沙門氏菌(Salmonella Aberdeen))。
例如，G群包括腸沙門氏菌腸亞種古巴血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Cubana)(古巴沙門氏菌(Salmonella Cubana))、腸沙門氏菌腸亞種浦那血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovar Poona)(浦那沙門氏菌(Salmonella Poona))。
例如，H群包括腸沙門氏菌腸亞種赫維什血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Heves)(赫維什沙門氏菌(Salmonella Heves))、腸沙門氏菌腸亞種昂德斯特港血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovarOnderstepoort)(昂德斯特港沙門氏菌(SalmonellaOnderstepoort))。
例如，I群包括腸沙門氏菌腸亞種巴西血清變種(Salmonellaenterica subspecies enterica serovar Brazil)(巴西沙門氏菌(Salmonella Brazil))、腸沙門氏菌腸亞種非丁伏斯血清變種(Salmonella enterica subspecies enterica serovarHvittingfoss)(非丁伏斯沙門氏菌(Salmonella Hvittingfoss))。
某些減毒的沙門氏菌疫苗和某些滅活的沙門氏菌疫苗是商購可得的。
美國專利號7,045,122；6,923,957；6,905,691；6,605,285；5,843,426；5,733,760；5,424,065；5,389,368；和6,592,869涉及沙門氏菌疫苗，包括減毒的和滅活的疫苗。
沙門氏菌屬物種可以通過將非回復(fù)性指定突變引入到基因組中來合理地進行減毒，從而產(chǎn)生活疫苗株。已經(jīng)鑒定了幾種這樣的基因，當(dāng)它們突變時，將使沙門氏菌減毒。特別地，在牽涉前分支酸(pre-chorismate)生物合成途徑的基因中具有非回復(fù)性突變的沙門氏菌菌株產(chǎn)生極佳的口服疫苗，該疫苗在宿主中誘發(fā)強的體液、局部和細(xì)胞免疫應(yīng)答(Chatfield S.N.等人，Vaccine，1989，7(6)495-8；Chatfield S.N.等人，F(xiàn)EMS Immunol.Med.Microbiol.，1993，7(1)1-7)，在芳香族生物合成途徑的aro基因中具有非回復(fù)性突變的沙門氏菌菌株(EP-B1-0322237)，在鼠傷寒沙門氏菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物RfaH突變體中具有非回復(fù)性突變的沙門氏菌菌株，其在小鼠中作為針對沙門氏菌病的減毒的口服疫苗是有效的(Nagy G.等人，Infect.Immun.，2006，74(10)5914-25)。
沙門氏菌可以通過修飾該細(xì)菌的基因組結(jié)構(gòu)來進行減毒，例如通過刪除沙門氏菌基因的一部分，通過將異源核苷酸序列插入沙門氏菌基因中，和/或通過用異源核苷酸序列置換沙門氏菌基因的一部分?？梢酝ㄟ^引入這樣的突變來使沙門氏菌減毒，所述突變(i)賦予營養(yǎng)缺陷型，(ii)干擾糖代謝和脂多糖生物合成，或(iii)影響對于毒力的完全展示而言所需的調(diào)節(jié)基因的某些整體能力。
例如，減毒的沙門氏菌可以是包含至少一種鏈霉素和一種利福平抗性代謝漂移突變以用于減毒作用的細(xì)菌(EP-B1-0642796)，例如腸炎沙門氏菌的減毒株Sm 24/Rif 12/Ssq(EP-B1-0642796)；通過在phoP調(diào)節(jié)區(qū)中的第一個突變(其引起在所述區(qū)域控制下的基因的組成型表達)和通過在pag或prg基因處的第二個突變而減毒的腸炎沙門氏菌(EP-B1-0563311)；通過在htrA基因中的非回復(fù)性突變而減毒的腸炎沙門氏菌(US-A-5,804,194)；對于一種或多種選自苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和對氨基苯甲酸的生長因子而言顯示出營養(yǎng)缺陷型的減毒的沙門氏菌，從而在不存在所述一種或多種生長因子的情況下它不能在基本培養(yǎng)基上生長(US-A-6,231,871)，例如以登錄號N93/43266保藏在澳大利亞政府分析實驗室(Australian GovernmentAnalytical Laboratories)的鼠傷寒沙門氏菌菌株STM-1(US-A-6,231,871)；通過N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍誘變而衍生的腸炎沙門氏菌的營養(yǎng)缺陷型突變體，例如E3/49菌株、1/37菌株、C7/1菌株、C7/2菌株、C7/18菌株、C7/19菌株、E1/23菌株、E1/25菌株、E2/7菌株、E3/44菌株和E3/51菌株(Martin G.等人，Berl.Münch.

Wschr.，1996，109(10)325-9)；在芳香族生物合成途徑的兩個離散的aro基因(例如，aroA和aroC，aroA和aroD，aroA和aroE)的每一個中具有非回復(fù)性突變的減毒的鼠傷寒沙門氏菌(EP-B1-0322237)；具有經(jīng)遺傳限定的aroC衍生物的減毒的腸炎沙門氏菌(LVR02菌株，參見Betancor L.等人，Vet.Microbiol.，2005，107(1-2)81-9)；以及具有突變的減毒的鼠傷寒沙門氏菌，所述突變使選自下列的基因失活hupA、dksA、rfaY、sipC或clpB(WO-A1-98/02523)。
還可以通過插入轉(zhuǎn)座子來獲得減毒性突變。例如，將突變體EZ870中的轉(zhuǎn)座子插入到腸炎沙門氏菌核苷酸序列中，所述腸炎沙門氏菌核苷酸序列與鼠傷寒沙門氏菌基因spiC(登錄號U51927，Ochman H.，Soncini F.C.Solomon F.和Groisman E.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93，7800-7804，1996)同源(在188bp重疊區(qū)中具有98.4％的相同堿基對)。經(jīng)遺傳修飾的腸炎沙門氏菌EZ870具有在BCCM/LMGCulture Collection，Laboratorium voor Microbiologie，Ledeganckstraat 35，B-9000 Gent，Belgium處的保藏號LMGP-18484(WO-A-99/37759)。
在根據(jù)本發(fā)明方法的加強施用中所使用的滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的沙門氏菌。所述滅活的沙門氏菌可以選自E群沙門氏菌、D群沙門氏菌、C群沙門氏菌和B群沙門氏菌，優(yōu)選地選自E1群沙門氏菌、E4群沙門氏菌、D群沙門氏菌、C1群沙門氏菌、C2群沙門氏菌、C3群沙門氏菌和B群沙門氏菌，和更優(yōu)選地選自由鴨沙門氏菌組成的E1群，選自由森夫頓堡沙門氏菌組成的E4群，選自由腸炎沙門氏菌、巴拿馬沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、雞沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌組成的D群，選自由嬰兒沙門氏菌、姆班達卡沙門氏菌、利文斯通沙門氏菌、維爾肖氏沙門氏菌、俄亥俄沙門氏菌、蒙得維的亞沙門氏菌、田納西沙門氏菌、羅森沙門氏菌組成的C1群，選自由哈達爾沙門氏菌、新港沙門氏菌、科特布斯沙門氏菌組成的C2群，選自由肯塔基沙門氏菌、阿爾巴尼沙門氏菌組成的C3群，以及選自由鼠傷寒沙門氏菌、布倫登蘆普沙門氏菌、阿哥納沙門氏菌、布雷登尼沙門氏菌、海德爾堡沙門氏菌、印地安那沙門氏菌、圣保羅沙門氏菌、勃蘭登堡沙門氏菌組成的B群。
在一個優(yōu)選的實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明方法的加強施用中所使用的滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的B群沙門氏菌和至少一種滅活的D群沙門氏菌。在另一個優(yōu)選的實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明方法的加強施用中所使用的滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的B群沙門氏菌、至少一種滅活的C群沙門氏菌和至少一種滅活的D群沙門氏菌。在一個最優(yōu)選的實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明方法的加強施用中所使用的滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及滅活的鼠傷寒沙門氏菌和滅活的腸炎沙門氏菌。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明使用方法的加強施用中所使用的滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及滅活的鼠傷寒沙門氏菌和滅活的腸炎沙門氏菌和至少一種滅活的C2群沙門氏菌。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，在根據(jù)本發(fā)明方法的加強施用中所使用的滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及滅活的鼠傷寒沙門氏菌和滅活的腸炎沙門氏菌和至少一種滅活的C2群沙門氏菌和至少一種滅活的C1群沙門氏菌。
沙門氏菌可以通過用滅活試劑進行處理來化學(xué)滅活或者熱滅活，所述滅活試劑例如為甲醛、吖丙啶、吖丙啶酰胺衍生物(例如乙酰吖丙啶)、2-甲基吖丙啶、β-丙內(nèi)酯、硫柳汞、丙酮。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述滅活試劑是甲醛。
在某些方面，優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的在禽類動物中使用免疫原性組合物或疫苗的方法包括向禽類動物施行減毒的免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用，所述減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的D群沙門氏菌；在相隔數(shù)周(例如2周至18周)后，施行滅活的免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用，所述滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的B群沙門氏菌和至少一種滅活的D群沙門氏菌。在該優(yōu)選方法的一個具體實施方案中，減毒的D群沙門氏菌細(xì)菌是腸炎沙門氏菌，滅活的B群沙門氏菌細(xì)菌是鼠傷寒沙門氏菌，和滅活的D群沙門氏菌細(xì)菌是腸炎沙門氏菌。
其他優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的在禽類動物中使用免疫原性組合物或疫苗的方法包括向禽類動物施行減毒的免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用，所述減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的D群沙門氏菌；在相隔數(shù)周(尤其是2周至18周)后，施行滅活的免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用，所述滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的B群沙門氏菌、至少一種滅活的C2群沙門氏菌和至少一種滅活的D群沙門氏菌。在該優(yōu)選方法的一個具體實施方案中，減毒的D群沙門氏菌細(xì)菌是腸炎沙門氏菌，滅活的B群沙門氏菌細(xì)菌是鼠傷寒沙門氏菌，滅活的D群沙門氏菌細(xì)菌是腸炎沙門氏菌，和滅活的C2群沙門氏菌細(xì)菌是哈達爾沙門氏菌。
其他優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的在禽類動物中使用免疫原性組合物或疫苗的方法包括向禽類動物施行減毒的免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用，所述減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的D群沙門氏菌；在相隔數(shù)周(例如2周至18周)后，施行滅活的免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用，所述滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的B群沙門氏菌、至少一種滅活的C1群沙門氏菌、至少一種滅活的C2群沙門氏菌和至少一種滅活的D群沙門氏菌。在該優(yōu)選方法的一個具體實施方案中，減毒的D群沙門氏菌細(xì)菌是腸炎沙門氏菌，滅活的B群沙門氏菌細(xì)菌是鼠傷寒沙門氏菌，滅活的D群沙門氏菌細(xì)菌是腸炎沙門氏菌，滅活的C2群沙門氏菌細(xì)菌是哈達爾沙門氏菌，和滅活的C1群沙門氏菌細(xì)菌是維爾肖氏沙門氏菌和/或嬰兒沙門氏菌。
其他優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的在禽類動物中使用免疫原性組合物或疫苗的方法包括向禽類動物施行減毒的免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用，所述減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的D群沙門氏菌和至少一種減毒的B群沙門氏菌；在相隔數(shù)周(例如2周至18周)后，施行滅活的免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用，所述滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的B群沙門氏菌和至少一種滅活的D群沙門氏菌。在該優(yōu)選方法的一個具體實施方案中，減毒的D群沙門氏菌細(xì)菌是腸炎沙門氏菌，減毒的B群沙門氏菌細(xì)菌是鼠傷寒沙門氏菌，滅活的B群沙門氏菌細(xì)菌是鼠傷寒沙門氏菌，和滅活的D群沙門氏菌細(xì)菌是腸炎沙門氏菌。
其他優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的在禽類動物中使用免疫原性組合物或疫苗的方法包括向禽類動物施行減毒的免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用，所述減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的D群沙門氏菌和至少一種減毒的B群沙門氏菌；在相隔數(shù)周(尤其是2周至18周)后，施行滅活的免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用，所述滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的B群沙門氏菌、至少一種滅活的C2群沙門氏菌和至少一種滅活的D群沙門氏菌。在該優(yōu)選方法的一個具體實施方案中，減毒的D群沙門氏菌細(xì)菌是腸炎沙門氏菌，減毒的B群沙門氏菌細(xì)菌是鼠傷寒沙門氏菌，滅活的B群沙門氏菌細(xì)菌是鼠傷寒沙門氏菌，滅活的D群沙門氏菌細(xì)菌是腸炎沙門氏菌，和滅活的C2群沙門氏菌細(xì)菌是哈達爾沙門氏菌。
其他優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的在禽類動物中使用免疫原性組合物或疫苗的方法包括向禽類動物施行減毒的免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用，所述減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的D群沙門氏菌和至少一種減毒的B群沙門氏菌；在相隔數(shù)周(例如2周至18周)后，施行滅活的免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用，所述滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的B群沙門氏菌、至少一種滅活的C1群沙門氏菌、至少一種滅活的C2群沙門氏菌和至少一種滅活的D群沙門氏菌。在該優(yōu)選方法的一個具體實施方案中，減毒的D群沙門氏菌細(xì)菌是腸炎沙門氏菌，減毒的B群沙門氏菌細(xì)菌是鼠傷寒沙門氏菌，滅活的B群沙門氏菌細(xì)菌是鼠傷寒沙門氏菌，滅活的D群沙門氏菌細(xì)菌是腸炎沙門氏菌，滅活的C2群沙門氏菌細(xì)菌是哈達爾沙門氏菌，和滅活的C1群沙門氏菌細(xì)菌是維爾肖氏沙門氏菌和/或嬰兒沙門氏菌。
可以向細(xì)菌懸浮液中添加佐劑，尤其是在培養(yǎng)和滅活后獲得的細(xì)菌懸浮液。佐劑可以選自氫氧化鋁、皂苷、與禽類組織相容的任何油包水乳狀液或水包油乳狀液(參見例如，Herbert W.J.，The Lancet，1965，October 16771；Brugh M.等人，Am.J.Vet.Res.，1983，44(1)72-5；Boersma W.J.A.等人，44th Forum in Immunology，“Characteristics and use of new-generation adjuvants”，503-511；Gast等人，Avian Diseases，1993，37(4)1085-91；Stone，Avian Diseases，1993，37399-405；Stone等人，Avian Diseases，1990，34979-983；Stone等人，Avian Diseases，1983，27(3)688-697；US-A-3,919,411；WO-A-05/009462，所有這些參考文獻通過提及而合并入本文)。
佐劑的例子包括但不限于，基于礦物油和/或植物油的水包油、水包油包水乳狀液，以及非離子型表面活性劑，例如嵌段共聚物、

此類乳狀液尤其是在“Vaccine Design-The Subunitand Adjuvant Approach”，Pharmaceutical Biotechnology，1995，vol.6，Michael F.Powell和Mark J.Newman(編輯)，Plenum Press，New York and London的第147頁中描述的那些，或者TS乳狀液，尤其是TS6乳狀液，以及LF乳狀液，尤其是LF2乳狀液(關(guān)于TS和LF乳狀液，參見WO-A-04/024027)。其他合適的佐劑為例如，維生素E，皂苷類，和交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，即

(Noveon；參見WO-A-99/51269；WO-A-99/44633)，

氫氧化鋁或磷酸鋁(“Vaccine Design，The subunit and adjuvantapproach”，Pharmaceutical Biotechnology，vol.6，Michael F.Powell和Mark J.Newman(編輯)，1995，Plenum Press New York)，生物學(xué)佐劑(例如，C4b，尤其是鼠C4b(Ogata RT等人，J.Biol.Chem.1989，264(28)16565-16572)或馬C4b，GM-CSF，尤其是馬GM-CSF(US-A-6,645,740))，毒素(例如，霍亂毒素CTA或CTB，大腸桿菌(Escherichia coli)熱不穩(wěn)定毒素LTA或LTB(Olsen C W等人，vaccine，1997，15(10)1149-1156；Fingerut E等人，Vaccine，2005，23(38)4685-4696；Zurbriggen R等人，Expert Rev Vaccines，2003，2(2)295-304；Peppoloni S等人，Expert Rev Vaccines，2003，2(2)285-293))，和CpG(例如，CpG#2395(參見Jurk M等人，Immunobiology2004，209(1-2)141-154)，CpG#2142(參見EP-B1-1,221,955中的SEQ.ID.NO890)，CpG#2135，CpG#2007，CpG#2336)。交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸(尤其是通過糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)的)的聚合物稱為卡波姆(Pharmeuropa，vol.8，no.2，1996年6月)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以參考美國專利號2,909,462，其提供了通過多羥基化合物而交聯(lián)的此類丙烯酸類聚合物，所述多羥基化合物具有至少3個羥基，優(yōu)選不超過8個此類基團，其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2個碳原子的不飽和的脂族基團替代。優(yōu)選的基團是含有2-4個碳原子的那些，例如，乙烯基、烯丙基和其他烯鍵式不飽和基團。不飽和基團還可以包含其他取代基，例如甲基。以

(Noveon)這一名稱進行銷售的產(chǎn)品是特別合適的。它們通過烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交聯(lián)。其中，可提及Carbopol 974P、934P、934、940和971P。
根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗可以有利地與穩(wěn)定劑一起進行冷凍干燥。可以根據(jù)眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)冷凍干燥操作程序來進行冷凍干燥。藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑可以是碳水化合物(例如，山梨糖醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、海藻糖)，谷氨酸鈉(Tsvetkov T等人，Cryobiology 1983，20(3)318-23；IsraeliE等人，Cryobiology 1993，30(5)519-23)，蛋白質(zhì)例如蛋白胨、白蛋白、乳清蛋白或酪蛋白，包含蛋白質(zhì)的試劑例如脫脂乳(Mills CK等人，Cryobiology 1988，25(2)148-52；Wolff E等人，Cryobiology 1990，27(5)569-75)，和緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖液，堿金屬磷酸鹽緩沖液)。佐劑可以用于制備可溶的冷凍干燥制劑。
可用的油的例子包括但不限于，礦物油，例如石蠟油，

6VR，

80；

52；萜烯油，例如角鯊烯和角鯊?fù)椋恢参镉?，例如大豆油、橄欖油、玉米油、霍霍巴油、花生油、棉籽油、向日葵油、紅花油、芝麻油、杏油、鱷梨油、小麥胚芽油、卡諾拉油菜油(canola oil)、亞麻籽油和杏仁油；魚油，例如鯊魚油、橘刺鯛(orange roughy)油、鯡魚油和鱈魚肝油；動物油，例如貂油、豬油和雞脂肪油。
在乳狀液疫苗中使用的表面活性劑的例子包括，例如

80(脫水山梨糖醇單油酸酯)、

80(聚山梨酯80)、

80、

85、

83(脫水山梨糖醇倍半油酸酯)、

85(脫水山梨糖醇倍半油酸酯)、和

61(聚氧乙烯脫水山梨糖醇)。適合于動物和植物性油包水疫苗的表面活性劑包括，例如粗黃(crude yellow)和純化的蜂蠟。此外，適合于包含角鯊烯和角鯊?fù)榈囊呙绲谋砻婊钚詣┌?

和

80。
優(yōu)選地，佐劑是油以形成包含石蠟油和表面活性劑的油包水乳狀液，尤其是石蠟油、多元醇與脂肪酸的酯、以及乙氧基化多元醇與脂肪酸的酯。
可以通過本發(fā)明的方法來進行疫苗接種的禽類動物包括小雞、母雞、火雞、鴨、小鴨、鵝、小鵝、珠雞、雉類、矮腳雞、鵪鶉、鴿。
本發(fā)明的方法涉及減毒的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用，以及滅活的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用。1日齡的禽類動物可以通過根據(jù)本發(fā)明的方法來進行疫苗接種，也就是說，可以向1日齡的禽類動物施行唯一的或第一次初激施用。優(yōu)選地，向1日-大約28日齡，更優(yōu)選地1日-大約15日齡的禽類動物施行唯一的或第一次初激施用。當(dāng)施行至少兩次初激施用時，這些初激施用優(yōu)選地以2-4周的間隔來進行施行。在唯一的或第一次初激施用后2-18周，優(yōu)選地在唯一的或第一次初激施用后3-10周，和更優(yōu)選地在唯一的或第一次初激施用后3-6周，施行加強施用。當(dāng)施用至少2次加強施用時，這些加強施用優(yōu)選相隔2-12周進行施用。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括兩次初激施用和兩次加強施用。初激施用優(yōu)選地以2-4周的間隔來進行施行。在第一次初激施用后6-10周，優(yōu)選地在第一次初激施用后8-10周，施行第一次加強施用。在第一次初激施用后14-18周，優(yōu)選地在第一次初激施用后15-16周，施行第二次加強施用。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括兩次初激施用和一次加強施用。初激施用優(yōu)選地以2-4周的間隔來進行施行。在第一次初激施用后6-18周，優(yōu)選地在第一次初激施用后6-16周，和更優(yōu)選地在第一次初激施用后11-16周，施行加強施用。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括一次初激施用和兩次加強施用。在初激施用后2-10周，優(yōu)選地在初激施用后3-6周，施行第一次加強施用。在初激施用后12-18周，優(yōu)選地在初激施用后14-16周，施行第二次加強施用。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括一次初激施用和一次加強施用。在初激施用后2-18周，優(yōu)選地在初激施用后3-10周，和更優(yōu)選地在初激施用后3-6周，施行加強施用。
根據(jù)本發(fā)明的方法，對于初激施用而言，免疫原性組合物或疫苗的合適的施用途徑包括，口服途徑，例如通過飲用水，或者眼途徑，例如通過噴霧。
根據(jù)本發(fā)明的方法，對于初激施用而言，減毒的免疫原性組合物或疫苗的劑量包括大約0.1mL-大約2.0mL，優(yōu)選地大約0.2mL-大約1.0mL，和更優(yōu)選地大約0.4mL-大約0.6mL。這些劑量具有大約106菌落形成單位/劑(CFU/劑)至大約1010CFU/劑的每種沙門氏菌菌株，優(yōu)選地大約108CFU/劑的每種沙門氏菌菌株。當(dāng)采用飲用水來將減毒的免疫原性組合物或疫苗由施用給禽類動物時，這些劑量被稀釋為大約1mL-大約5mL飲用水/禽類動物。
根據(jù)本發(fā)明的方法，對于加強施用而言，免疫原性組合物或疫苗的合適的施用途徑包括皮下(SC)途徑和肌內(nèi)(IM)途徑。根據(jù)本發(fā)明的方法，免疫原性組合物或疫苗可以通過具有針的注射器或通過無針裝置(例如，Pigjet，Avijet，Dermojet，Vitajet或Biojector(Bioject，Oregon，USA)，參見US-A-2006/0034867)來進行施用。
根據(jù)本發(fā)明的方法，對于加強施用而言，滅活的免疫原性組合物或疫苗的劑量可以為大約0.05mL-大約2.0mL，優(yōu)選地大約0.1mL-大約1.0mL，和更優(yōu)選地大約0.2mL-大約0.4mL。這些劑量具有大約106CFU/劑(滅活前)至大約1010CFU/劑(滅活前)的每種沙門氏菌菌株，優(yōu)選地大約108CFU/劑(滅活前)的每種沙門氏菌菌株。
本發(fā)明的另一個方面是用于根據(jù)本發(fā)明對禽類動物進行疫苗接種的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒包含至少兩個小瓶和具有施用指導(dǎo)的包裝說明書(package insert)，第一個小瓶包含減毒的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗以用于根據(jù)本發(fā)明方法的初激施用，和第二個小瓶包含滅活的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗以用于根據(jù)本發(fā)明方法的加強施用。任選地，試劑盒可以包含含有用于多次初激施用的減毒的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的小瓶，和/或含有用于多次加強施用的滅活的沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的小瓶。
在另一個實施方案中，用于對禽類動物進行疫苗接種的試劑盒包含至少兩個小瓶和具有施用指導(dǎo)的包裝說明書，第一個小瓶包含減毒的D群沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗，和第二個小瓶包含滅活的B群沙門氏菌和滅活的D群沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗。任選地，試劑盒可以包含含有用于多次初激施用的減毒的D群沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的小瓶，和/或含有用于多次加強施用的滅活的B群沙門氏菌和滅活的D群沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的小瓶。
現(xiàn)在，將通過下述非限制性實施例來進一步描述本發(fā)明。
實施例1 為了產(chǎn)生減毒疫苗，使用腸炎沙門氏菌噬菌體型4(PT4)菌株的腺嘌呤/組氨酸營養(yǎng)缺陷型雙重標(biāo)記突變體，其通過N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍誘變而衍生得到。該沙門氏菌菌株被命名為E 3/49菌株(Martin G.等人，Berl.Münch.

Wschr.，1996，109(10)325-9)。作為非通氣培養(yǎng)物，將沙門氏菌E 3/49菌株于37℃±1℃在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)18-24小時，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基包含酵母提取物、胰蛋白胨、Na2HPO4x2H2O、MgSO4x7H2O和注射用水，pH 7.6±0.2。所述培養(yǎng)物用10體積％的甘油來進行穩(wěn)定，以1.8ml的等分試樣裝入容器中，并貯存于-80℃±5℃。
將添加有葡萄糖的相同營養(yǎng)培養(yǎng)基用于細(xì)菌菌株的發(fā)酵。所述培養(yǎng)物是于37℃±1℃經(jīng)歷8-24小時的非通氣培養(yǎng)物或經(jīng)歷8-16小時的搖瓶培養(yǎng)物。接種物為0.2-10體積％。
所述培養(yǎng)物于+2℃至+8℃貯存最多4天。
收獲所獲得的細(xì)菌，并且依據(jù)生物體計數(shù)用經(jīng)緩沖的生理鹽水和20體積％的蔗糖溶液(最大濃度60％)進行稀釋。用NaOH或CH3COOH將疫苗的pH調(diào)整至7.0±0.5。
然后，將細(xì)菌懸浮液凍干以用于貯存。
使托架(tray)從底部向上逐步冷卻至0℃。將疫苗在凍干器中于-40℃的最低溫度冷凍大約3-4小時。一旦達到所需的真空，就起始主要干燥過程(將托架溫度控制在最高+10℃)，直至達到+5℃的產(chǎn)物溫度。隨后，在最高+35℃的托架溫度下進行最多12小時的第二次干燥。
干燥后，用干燥的無菌氮氣充滿所述瓶，自動密封，拋光，并貯存在冷的室中。
在0.5mL用于禽類動物的飲用水中重構(gòu)后獲得的減毒疫苗中，減毒的腸炎沙門氏菌的滴度為108菌落形成單位(CFU)/劑。
實施例2 為了產(chǎn)生滅活疫苗，使用兩種不同的沙門氏菌菌株，腸炎沙門氏菌PT 4菌株和鼠傷寒沙門氏菌DT 104菌株。
每種沙門氏菌菌株于在0.25％軟瓊脂中的胰胨豆胨培養(yǎng)液(TSA)中進行培養(yǎng)。
收獲所獲得的細(xì)菌，在注射用水中進行稀釋，并且在冷凍保護劑(20％甘油和5％蔗糖)存在下在-70℃的目標(biāo)溫度下于袋中進行冷凍以用于貯存。
對于腸炎沙門氏菌PT 4菌株的滅活，將包含腸炎沙門氏菌PT 4菌株的袋解凍，并且將細(xì)菌懸浮液轉(zhuǎn)移到無菌容器中。將滅活試劑，即35％甲醛溶液，以3.88％(甲醛溶液體積/培養(yǎng)物體積)的濃度加入到細(xì)菌懸浮液中。在通過攪拌進行混合后，將懸浮液轉(zhuǎn)移到另一個無菌容器中。于24℃在攪拌下滅活24小時。
對于鼠傷寒沙門氏菌DT 104菌株的滅活，進行與對于腸炎沙門氏菌PT 4菌株所描述的相同的過程。
將滅活的細(xì)菌貯存于+5℃+/-3℃直至用于進行配制。
將滅活的腸炎沙門氏菌PT 4細(xì)菌和滅活的鼠傷寒沙門氏菌DT 104細(xì)菌混合，并且用油包水乳狀液佐劑進行配制，所述油包水乳狀液佐劑包含石蠟油、多元醇與脂肪酸的酯、以及乙氧基化多元醇與脂肪酸的酯。
在成品中以100μg/mL的終濃度添加防腐劑(即硫柳汞)。
在滅活疫苗中，腸炎沙門氏菌PT 4菌株的滴度為108.3CFU/劑(滅活前)，和鼠傷寒沙門氏菌DT 104菌株的滴度為108CFU/劑(滅活前)。
實施例3 在該研究的第0天時，隨機選取30只1日齡的SPF(無特定病原體)雞，隨后分派到每組10只雞的3個組中。
所述組如下限定 -G.00＝對照組； -G.01＝實施例1的減毒疫苗(1日齡時)+實施例2的滅活疫苗(21日齡時)； -G.02＝實施例2的滅活疫苗(21日齡時)。
在鑒定后，將每個組分配至隔離單元直至第53天時。
在第0天時，通過口服途徑(直接遞送到口腔中)用1個劑量(至少108CFU)的0.5mL的實施例1的減毒疫苗對G.01組的動物進行疫苗接種。
在第21天時，通過肌內(nèi)途徑(在左胸肌肉深區(qū)中)用1個劑量的實施例2的滅活疫苗對G.01和G.02組的動物進行疫苗接種，0.3mL/劑量，腸炎沙門氏菌滴度為108.3CFU/劑(滅活前)，鼠傷寒沙門氏菌滴度為108CFU/劑(滅活前)。
G.01組最后進行疫苗接種，以避免與減毒的疫苗株的交叉污染。
在第49天，緊在攻擊之前對所有組進行抽血，然后就特異性抗體來對所收集的血清進行測試。G.00、G.01和G.02組通過IDEXX ELISA試驗和通過慢凝集試驗(Slow Agglutination Test，SAT)來進行測試。
在攻擊前一天(第48天)，在室溫下解凍一個等分試樣的海德爾堡沙門氏菌(B群沙門氏菌)，然后懸浮在100mL的Bio Mérieux胰胨豆胨液體培養(yǎng)基(Tryptone Soya Broth medium，TSB)中，并于37℃溫育14小時。
將獲得的細(xì)菌懸浮液進行離心，并且將菌株粒狀沉淀接種在新鮮的預(yù)溫的TSB中，并且于37℃經(jīng)過最佳生長時間段(5小時)進行溫育。
一旦通過光密度(在620nm處測量)評估的正在發(fā)展中的細(xì)菌培養(yǎng)物的滴度高至足以成為滴度為109CFU/0.2mL的懸浮液時，就將它用于感染所述雞。
將接種物在TSB中的系列10倍稀釋物接種在胰胨豆胨瓊脂(TSA)上，并且于37℃溫育24小時以用于計數(shù)，其中采用3次重復(fù)。
在第49天時，用滴度為108.9CFU/0.2ml的海德爾堡沙門氏菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物攻擊所有組。每只雞通過口服途徑來進行感染。
感染后4天(第53天)，對所有雞實施安樂死。在每只雞上對脾臟和盲腸進行無菌取樣，并且置于經(jīng)事先標(biāo)示的獨個管中。在收獲結(jié)束時，對所述管進行處理以用于沙門氏菌的再分離。
-將每個脾臟磨碎入10mL注射器中，并且在10mL經(jīng)緩沖的蛋白胨水(BPW)中進行稀釋， -將200μl的稀釋物置于XLT4+氨芐青霉素(以50μg/mL的比率添加)培養(yǎng)基上以用于計數(shù)(種子在瓊脂上擴散)。將平板于37℃溫育48小時。
預(yù)富集階段(PE) -然后，將所有稀釋的脾臟于37℃溫育16-20小時， -僅直接方法陰性的脾臟完全前進到下一個階段。
富集階段(E) -將“PE”脾臟懸浮液以1∶100的比率(在500μl中的5μl)接種到Rappaport Vassiliadis大豆(Rappaport Vassiliadis Soya，RVS)培養(yǎng)液中，并且于42℃溫育24小時。
選擇性分離 -將“E”脾臟懸浮液在XLT4+氨芐青霉素培養(yǎng)基上進行鋪板，然后于37℃溫育48小時，其中鋪板體積為10μl。典型的沙門氏菌菌落是黑色的或具有黑色中心，并且當(dāng)存在這種類型的菌落時，將該樣品評為陽性。
結(jié)果以“ccu/器官”來表示。
將收獲的盲腸內(nèi)容物(大約1g)無菌地收集在無菌管中，稱重，并在BPW中以1∶10(重量/體積)進行稀釋直至10e-7。
將10-2、10-3、10-5和10-7稀釋物于37℃溫育16-20小時(PE)，并且進一步進行處理以用于富集階段(E)和選擇性分離，如對于脾臟樣品一樣。
鑒定沙門氏菌菌落，并且標(biāo)明陽性平板。
如下對再分離數(shù)據(jù)進行分析 對于脾臟 -在預(yù)富集和富集后的陰性樣品的計數(shù)為0ccu/器官， -在預(yù)富集和富集后為陽性的在直接鋪板中的陰性樣品的計數(shù)為10ccu/樣品； 對于盲腸內(nèi)容物 -半定量結(jié)果以“ccu/g器官內(nèi)容物”來表示，基于稀釋方法和陽性(即，當(dāng)為陽性時，50μl+450μl直至10-2、10-3、10-5和10-7的稀釋度分別相應(yīng)于102.3、103.3、105.3和107.3ccu/g沙門氏菌盲腸內(nèi)容物)。
在疫苗接種后4周，所有經(jīng)免疫接種的和未免疫接種的雞的特異性抗體滴度的結(jié)果概括在表1中。
通過關(guān)于SAT的幾何平均滴度(GMT)以及通過關(guān)于S/N和IP腸炎沙門氏菌ELISA結(jié)果的算術(shù)平均滴度(AMT)來表示所述值。
表1
從未疫苗接種的組獲得的SAT和ELISA血清學(xué)結(jié)果恒定地是陰性的。
關(guān)于鼠傷寒沙門氏菌SAT結(jié)果，單獨的滅活疫苗顯示出符合邏輯的血清轉(zhuǎn)變(171SAT單位)，而減毒的腸炎沙門氏菌疫苗對于鼠傷寒沙門氏菌組分具有令人驚訝的協(xié)同效應(yīng)(197SAT單位)(15.2％)。
關(guān)于G.01和G.02腸炎沙門氏菌ELISA結(jié)果，AMT在減毒疫苗加滅活疫苗中顯示出比在單獨的滅活疫苗中更高的IP單位值(6.8％)，分別為63和59，其中陽性受試者/組為10/10。
表2概括了在感染后4天在脾臟和盲腸內(nèi)容物中海德爾堡沙門氏菌再分離的結(jié)果(表示為“陽性/總數(shù)”和“l(fā)og10ccu/脾臟或g”)。表2
-陰性 +陽性 d.p.直接鋪板 a.e.富集后 如表3中所記錄的，在感染后4天，海德爾堡沙門氏菌攻擊菌株顯示出其達到對照組內(nèi)部器官并在其中建群的能力(0/10的陰性樣品)以及分別在脾臟和盲腸內(nèi)容物中的10e1.2ccu/器官和10e4.7ccu/g的顯著的沙門氏菌計數(shù)。
關(guān)于脾臟結(jié)果，由與減毒疫苗相聯(lián)合的滅活疫苗(G.01)給予了針對海德爾堡沙門氏菌攻擊的最佳保護，其中與對照組相比較，Δ＝101.2ccu/脾臟。在G02組中通過單獨使用的滅活疫苗也達到了顯著結(jié)果(與對照組相比較，Δ＝100.9ccu/脾臟)。
關(guān)于盲腸內(nèi)容物結(jié)果，與減毒疫苗相聯(lián)合的滅活疫苗(G.01)顯示出了極佳水平的保護，其中與對照組相比較，Δ＝102.8ccu/脾臟。滅活疫苗顯示出顯著水平的盲腸內(nèi)容物保護，其中與對照組相比較，Δ＝101.2。
G.01組血清學(xué)結(jié)果顯示出在1日齡時的減毒疫苗注射對于滅活疫苗血清轉(zhuǎn)變的協(xié)同效應(yīng)。與單獨的滅活疫苗相比較，可定量的初激效應(yīng)對于腸炎沙門氏菌組分而言為6.8％(63ELISA IP單位)，和對于鼠傷寒沙門氏菌組分而言為令人驚訝的15.2％(197SAT單位)。
與減毒疫苗相聯(lián)合的滅活疫苗顯示出比單獨的滅活疫苗更完全的關(guān)于脾臟以及還有針對海德爾堡沙門氏菌盲腸內(nèi)容物侵襲的保護效應(yīng)，其中與對照結(jié)果相比較，Δ＝101.2ccu/脾臟和Δ＝102.8ccu/克盲腸內(nèi)容物。存在有清晰的組間保護作用增加，其由在滅活的腸炎沙門氏菌+鼠傷寒沙門氏菌疫苗之上實施減毒的腸炎沙門氏菌疫苗初激而誘導(dǎo)。
實施例4 進行與實施例3中所描述的相同的實驗，除了攻擊沙門氏菌菌株不是海德爾堡沙門氏菌而是嬰兒沙門氏菌。
在疫苗接種后4周，所有經(jīng)免疫接種的和未免疫接種的雞的特異性抗體滴度的結(jié)果概括在表3中。
通過關(guān)于SAT的幾何平均滴度(GMT)以及通過關(guān)于S/N和IP腸炎沙門氏菌ELISA結(jié)果的算術(shù)平均滴度(AMT)來表示所述值。
表3
從未疫苗接種的組獲得的SAT和ELISA血清學(xué)結(jié)果恒定地是陰性的。
關(guān)于鼠傷寒沙門氏菌SAT結(jié)果，單獨的滅活疫苗顯示出符合邏輯的血清轉(zhuǎn)變(139SAT單位)，而減毒的腸炎沙門氏菌疫苗對于鼠傷寒沙門氏菌組分具有令人驚訝的協(xié)同效應(yīng)(184SAT單位)。
關(guān)于G.01和G.02腸炎沙門氏菌ELISA結(jié)果，AMT在減毒疫苗加滅活疫苗中顯示出比在單獨的滅活疫苗中更高的IP單位值，分別為60和56，其中陽性受試者/組為10/10。
表4概括了在感染后7天在脾臟和盲腸內(nèi)容物中嬰兒沙門氏菌再分離的結(jié)果(表示為“陽性/總數(shù)”和“l(fā)og10ccu/脾臟或g”)。
表4
-陰性 +陽性 d.p.直接鋪板 a.e.富集后 如表4中所記錄的，在感染后7天，嬰兒沙門氏菌攻擊菌株顯示出其達到對照組內(nèi)部器官并在其中建群的能力(0/10的陰性樣品)以及分別在脾臟和盲腸內(nèi)容物中的102.3ccu/器官和106.1ccu/g的顯著的沙門氏菌計數(shù)。
關(guān)于脾臟結(jié)果，由與減毒疫苗相聯(lián)合的滅活疫苗(G.01)給予了針對嬰兒沙門氏菌攻擊的良好保護，其中與對照組相比較，Δ＝101.4ccu/脾臟。
關(guān)于盲腸內(nèi)容物結(jié)果，與減毒疫苗相聯(lián)合的滅活疫苗(G.01)顯示出了極佳水平的保護，其中與對照組相比較，Δ＝103.2ccu/脾臟。滅活疫苗顯示出顯著水平的盲腸內(nèi)容物保護，其中與對照組相比較，Δ＝102.2。
G.01組血清學(xué)結(jié)果顯示出在1日齡時的減毒疫苗注射對于滅活疫苗血清轉(zhuǎn)變的協(xié)同效應(yīng)。與單獨的滅活疫苗相比較，可定量的初激效應(yīng)對于腸炎沙門氏菌組分而言為7％(60 ELISA IP單位)，和對于鼠傷寒沙門氏菌組分而言為32％(184SAT單位)。
與減毒疫苗相聯(lián)合的滅活疫苗顯示出主要關(guān)于盲腸保護而言的更好的保護效應(yīng)(Δ＝103.2ccu/克)，和與單獨的滅活疫苗相類似的對于脾臟的保護(其中與對照結(jié)果相比較，Δ＝101.4ccu/器官)。
實施例5 進行與實施例3中所描述的相同的實驗，除了攻擊沙門氏菌菌株不是海德爾堡沙門氏菌而是維爾肖氏沙門氏菌。
在疫苗接種后4周，所有經(jīng)免疫接種的和未免疫接種的雞的特異性抗體滴度的結(jié)果概括在表5中。
通過關(guān)于SAT的幾何平均滴度(GMT)以及通過關(guān)于S/N和IP腸炎沙門氏菌ELISA結(jié)果的算術(shù)平均滴度(AMT)來表示所述值。
表5
從未疫苗接種的組獲得的SAT和ELISA血清學(xué)結(jié)果恒定地是陰性的。
關(guān)于鼠傷寒沙門氏菌SAT結(jié)果，單獨的滅活疫苗顯示出符合邏輯的血清轉(zhuǎn)變(149SAT單位)，而減毒的腸炎沙門氏菌疫苗對于鼠傷寒沙門氏菌組分具有令人驚訝的協(xié)同效應(yīng)(160SAT單位)。
關(guān)于G.01和G.02腸炎沙門氏菌ELISA結(jié)果，AMT在減毒疫苗加滅活疫苗中顯示出比在單獨的滅活疫苗中更高的IP單位值，分別為56和50，其中陽性受試者/組為10/10。
表6概括了在感染后4天在脾臟和盲腸內(nèi)容物中維爾肖氏沙門氏菌再分離的結(jié)果(表示為“陽性/總數(shù)”和“l(fā)og10ccu/脾臟或g”)。
表6
-陰性 +陽性 d.p.直接鋪板 a.e.富集后 如表6中所記錄的，在感染后4天，維爾肖氏沙門氏菌攻擊菌株顯示出其達到對照組內(nèi)部器官并在其中建群的能力(0/10的陰性樣品)以及分別在脾臟和盲腸內(nèi)容物中的102.4ccu/器官和106.5ccu/g的顯著的沙門氏菌計數(shù)。
關(guān)于脾臟結(jié)果，由與減毒疫苗相聯(lián)合的滅活疫苗(G.01)給予了針對維爾肖氏沙門氏菌攻擊的最佳保護，其中與對照組相比較，Δ＝102.3ccu/脾臟。在G02組中通過單獨使用的滅活疫苗也達到了良好結(jié)果(與對照組相比較，Δ＝101.8ccu/脾臟)。
關(guān)于盲腸內(nèi)容物結(jié)果，與減毒疫苗相聯(lián)合的滅活疫苗(G.01)顯示出了極佳水平的保護，其中與對照組相比較，Δ＝102.0ccu/脾臟。滅活疫苗顯示出顯著水平的盲腸內(nèi)容物保護，其中與對照組相比較，Δ＝101.0。
G.01組血清學(xué)結(jié)果顯示出在1日齡時的減毒疫苗注射對于滅活疫苗血清轉(zhuǎn)變的協(xié)同效應(yīng)。與單獨的滅活疫苗相比較，可定量的初激效應(yīng)對于腸炎沙門氏菌組分而言為12％(56 ELISA IP單位)，和對于鼠傷寒沙門氏菌組分而言為令人驚訝的7.4％(160SAT單位)。
與減毒疫苗相聯(lián)合的滅活疫苗顯示出比單獨的滅活疫苗更好的主要關(guān)于脾臟保護而言但還有針對維爾肖氏沙門氏菌盲腸內(nèi)容物侵襲的保護效應(yīng)，其中與對照結(jié)果相比較，Δ＝102.3ccu/脾臟和Δ＝102.0ccu/克盲腸內(nèi)容物。
實施例6 進行與實施例3中所描述的相同的實驗，除了攻擊沙門氏菌菌株不是海德爾堡沙門氏菌而是哈達爾沙門氏菌。最終的攻擊接種物滴度為109CFU/0.2mL。
在疫苗接種后4周，所有經(jīng)免疫接種的和未免疫接種的雞的特異性抗體滴度的結(jié)果概括在表7中。
通過關(guān)于SAT的幾何平均滴度(GMT)以及通過關(guān)于S/N和IP腸炎沙門氏菌ELISA結(jié)果的算術(shù)平均滴度(AMT)來表示所述值。
表7
從未疫苗接種的組獲得的SAT和ELISA血清學(xué)結(jié)果恒定地是陰性的。
關(guān)于鼠傷寒沙門氏菌SAT結(jié)果，單獨的滅活疫苗顯示出符合邏輯的血清轉(zhuǎn)變(171SAT單位)，而減毒的腸炎沙門氏菌疫苗對于鼠傷寒沙門氏菌組分具有令人驚訝的協(xié)同效應(yīng)(211SAT單位)。
關(guān)于G.01和G.02腸炎沙門氏菌ELISA結(jié)果，AMT在減毒疫苗加滅活疫苗中顯示出比在單獨的滅活疫苗中更高的IP單位值(6.8％)，分別為58和51，其中陽性受試者/組為10/10。
表8概括了在感染后4天在脾臟和盲腸內(nèi)容物中哈達爾沙門氏菌再分離的結(jié)果(表示為“陽性/總數(shù)”和“l(fā)og10ccu/脾臟或g”)。
表8
-陰性 +陽性 d.p.直接鋪板 a.e.富集后 如表8中所記錄的，在感染后4天，哈達爾沙門氏菌攻擊菌株顯示出其達到對照組內(nèi)部器官并在其中建群的能力(2/10和0/10的陰性樣品)以及分別在脾臟和盲腸內(nèi)容物中的101.3ccu/器官和105.1ccu/g的顯著的沙門氏菌計數(shù)。
關(guān)于脾臟結(jié)果，由與減毒疫苗相聯(lián)合的滅活疫苗(G.01)給予了針對哈達爾沙門氏菌攻擊的最佳保護，其中與對照組相比較，Δ＝100.9ccu/脾臟。在G02組中通過單獨使用的滅活疫苗也達到了有限的結(jié)果(與對照組相比較，Δ＝100.2ccu/脾臟)。
關(guān)于盲腸內(nèi)容物結(jié)果，與減毒疫苗相聯(lián)合的滅活疫苗(G.01)或者滅活疫苗(G.02)顯示出了相等水平的保護，其中與對照組相比較，Δ＝100.8ccu/脾臟。
G.01組血清學(xué)結(jié)果顯示出在1日齡時的減毒疫苗注射對于滅活疫苗血清轉(zhuǎn)變的協(xié)同效應(yīng)。與單獨的滅活疫苗相比較，可定量的初激效應(yīng)對于腸炎沙門氏菌組分而言為14％(58 ELISA IP單位)，和對于鼠傷寒沙門氏菌組分而言為令人驚訝的23％(211 SAT單位)。
與對照結(jié)果相比較，與減毒疫苗相聯(lián)合的滅活疫苗顯示出比單獨的滅活疫苗更好的主要針對哈達爾沙門氏菌盲腸內(nèi)容物侵襲的保護效應(yīng)。
表9概括了實施例3-6的結(jié)果，所述實施例3-6涉及在用異源血清變種的沙門氏菌進行攻擊后在受感染的雞的脾臟中的沙門氏菌分離。
表9
這些結(jié)果顯示，在根據(jù)本發(fā)明的方法進行兩次疫苗接種(例如，第一次用減毒的沙門氏菌疫苗，和第二次用滅活的沙門氏菌疫苗)的組和僅用滅活的沙門氏菌疫苗進行疫苗接種的組之間，存在處于6.5％風(fēng)險率(采用K2檢驗)的顯著差異和處于5％單側(cè)風(fēng)險率(采用精確Fischer檢驗)的顯著差異。
采用了使用減毒的腸炎沙門氏菌疫苗(D群)的初激施用的方法增強了二價的、含油的腸炎沙門氏菌/鼠傷寒沙門氏菌滅活疫苗針對來自B群以及來自C1和C2群的異源血清變種(它們不存在于所使用的疫苗配方中)攻擊的功效。通過在用異源血清變種的沙門氏菌進行攻擊后脾臟侵襲的減少，通過將根據(jù)本發(fā)明的方法進行兩次疫苗接種的組與僅用滅活的沙門氏菌疫苗進行疫苗接種的組進行比較，而顯著地顯示出了這種增強。
權(quán)利要求
1.一種方法，其包括
向禽類動物施行減毒的免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用，所述減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的沙門氏菌；之后施行滅活的免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用，所述滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的沙門氏菌，
其中所述初激施用和加強施用以2-18周的間隔來施行。
2.一種方法，其包括
向禽類動物施行滅活的免疫原性組合物或疫苗的至少一次初激施用，所述滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的沙門氏菌；之后施行減毒的免疫原性組合物或疫苗的至少一次加強施用，所述減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的沙門氏菌，
其中所述初激施用和加強施用以2-18周的間隔來施行。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種減毒的沙門氏菌或所述至少一種滅活的沙門氏菌選自B群沙門氏菌。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述B群沙門氏菌包括鼠傷寒沙門氏菌、布倫登蘆普沙門氏菌、阿哥納沙門氏菌、布雷登尼沙門氏菌、海德爾堡沙門氏菌、印地安那沙門氏菌、圣保羅沙門氏菌、勃蘭登堡沙門氏菌。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述B群沙門氏菌的所述至少一種減毒的沙門氏菌或所述至少一種滅活的沙門氏菌是鼠傷寒沙門氏菌。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種減毒的沙門氏菌或所述至少一種滅活的沙門氏菌選自D群沙門氏菌。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述D群沙門氏菌包括腸炎沙門氏菌、巴拿馬沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、雞沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述D群沙門氏菌的所述至少一種減毒的沙門氏菌或所述至少一種滅活的沙門氏菌是腸炎沙門氏菌。
9.權(quán)利要求2的方法，其中所述至少一種減毒的沙門氏菌或所述至少一種滅活的沙門氏菌選自B群沙門氏菌。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述B群沙門氏菌包括鼠傷寒沙門氏菌、布倫登蘆普沙門氏菌、阿哥納沙門氏菌、布雷登尼沙門氏菌、海德爾堡沙門氏菌、印地安那沙門氏菌、圣保羅沙門氏菌、勃蘭登堡沙門氏菌。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述B群沙門氏菌的所述至少一種減毒的沙門氏菌或所述至少一種滅活的沙門氏菌是鼠傷寒沙門氏菌。
12.權(quán)利要求2的方法，其中所述至少一種減毒的沙門氏菌或所述至少一種滅活的沙門氏菌選自D群沙門氏菌。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述D群沙門氏菌包括腸炎沙門氏菌、巴拿馬沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、雞沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述D群沙門氏菌的所述至少一種減毒的沙門氏菌或所述至少一種滅活的沙門氏菌是腸炎沙門氏菌。
15.權(quán)利要求1的方法
其中所述至少一種減毒的沙門氏菌是D群的沙門氏菌，所述至少一種滅活的沙門氏菌是B群的沙門氏菌，
所述方法進一步包括在施用所述至少一種滅活的B群的沙門氏菌之后大約2-大約18周，至少一次施用D群的沙門氏菌。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述減毒的D群沙門氏菌屬細(xì)菌是腸炎沙門氏菌，所述滅活的B群沙門氏菌屬細(xì)菌是鼠傷寒沙門氏菌，和所述滅活的D群沙門氏菌屬細(xì)菌是腸炎沙門氏菌。
17.用于對禽類動物進行疫苗接種的疫苗接種試劑盒或套件，其包含至少兩個小瓶和具有施用指導(dǎo)的包裝說明書，其中所述至少小瓶包含減毒的沙門氏菌和滅活的沙門氏菌，
其中所述疫苗接種試劑盒或套件可操作地進行裝配，以便執(zhí)行向所述禽類家族動物施用所述疫苗，并引發(fā)針對沙門氏菌的安全且保護性的免疫應(yīng)答。
18.權(quán)利要求16的疫苗接種試劑盒或套件，其中第一個小瓶包含減毒的D群沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗，和第二個小瓶包含滅活的B群沙門氏菌和滅活的D群沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗。
19.權(quán)利要求16的疫苗接種試劑盒或套件，其中所述至少兩個小瓶包含減毒的D群沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗以用于多次初激施用，以及滅活的B群沙門氏菌和滅活的D群沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗以用于多次加強施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及在動物(特別是禽類動物)中針對沙門氏菌進行疫苗接種的領(lǐng)域。本發(fā)明還包括沙門氏菌免疫原性組合物或疫苗的試劑盒和用途。本發(fā)明進一步涉及這樣的方法和組合物，其包括至少一次初激施用減毒的免疫原性組合物或疫苗，所述減毒的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種減毒的沙門氏菌，并且在至少一次加強施用滅活的免疫原性組合物或疫苗之前施用給禽類動物，所述滅活的免疫原性組合物或疫苗包含藥學(xué)上或獸醫(yī)學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體以及至少一種滅活的沙門氏菌。
文檔編號A61K39/02GK101578108SQ200780049566
公開日2009年11月11日 申請日期2007年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月11日
發(fā)明者F-X·勒格羅, S·勒米埃 申請人:梅瑞爾有限公司