專利名稱：人源HIV抗體的Fab片段及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人源HIV抗體的Fab片段及其編碼基因與應用。
背景技術：
獲得性免疫缺陷綜合征(Acquiredimmunodeficiency syndrome, AIDS)簡稱艾滋病，是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染引起以T細胞免疫功能缺陷為主的綜合征。自1981年發(fā)現(xiàn)艾滋病以來，全球感染人群超過6000萬，其中約 2500萬已經(jīng)死亡。新的感染人數(shù)和死亡人數(shù)逐年增加。據(jù)WHO估計，現(xiàn)在每天就有1.6萬新發(fā)感染；推測十年后大約有1億人感染，這無疑將是人類社會的一大災難。我國HIV感染已從播散期進入快速增長期，現(xiàn)有感染者約70萬人，其中艾滋病病人8萬余例。在云南、 河南、新疆等省份，HIV感染已出現(xiàn)流行趨勢。雖然目前我國HIV感染者占總人口的比例很低，但絕對感染人數(shù)在亞洲居第二位，在全球居第十四位(WHO)。因此，大力開展艾滋病防治已成為當務之急。如果防治措施不力，必將對我國的人口健康和社會發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響。 疫苗是預防“世紀瘟疫”艾滋病的最好的手段，但二十多年來，還沒有一個HIV疫苗的臨床方案被證明有效。在今后相當長的一段時期內(nèi)，有效的HIV疫苗恐難有重大突破?？笰IDS 藥物的開發(fā)對于人類的健康與社會的發(fā)展有著重要意義。隨著高效逆轉錄療法(highly activeanti-retroviral therapy, HAART)，也稱雞尾酒療法引入艾滋病的治療以來，HIV-I 感染者的預期壽命得到延長。然而，HIV-I并不能被徹底地從病人的免疫系統(tǒng)中清除，病人必須終身用藥。由于HIV-I基因組為RNA，病毒不斷產(chǎn)生變異，在藥物的選擇壓力下，產(chǎn)生大量耐藥毒株，導致已有的用藥方案失去作用。此外，長期用藥對病人會產(chǎn)生嚴重的毒副作用，并給其帶來沉重的經(jīng)濟負擔。目前的形勢下，有效的抗AIDS藥物，尤其是抗現(xiàn)有耐藥株藥物的開發(fā)也十分迫切。因此，大力研究HIV-I感染以及誘導機體免疫應答的分子機制，尤其是HIV中和抗體的產(chǎn)生機制及其在艾滋病治療、預防以及診斷中的應用，是當前重大的科學問題。HIV-I進入靶細胞的過程主要由包被糖蛋白gpl60介導。該蛋白由表面亞基gpl20 和跨膜亞基gp41通過非共價鍵連接。在天然狀態(tài)下，gpl60為三聚體，其中三分子的gpl20 形成一個球狀復合物，而三分子gp41則象三個腳，插入病毒包膜內(nèi)。在HIV感染靶細胞過程中，gpl20主要功能是與受體CD4分子和輔助受體(趨化因子受體CCR5或CXCR4等)結合，而gp41分子主要介導病毒和細胞的膜融合。HIV包膜蛋白不但介導病毒感染靶細胞的過程，同時也是誘導中和抗體反應的關鍵蛋白。艾滋病疫苗失敗的一個主要的原因是以往所設計的各種疫苗免疫原都不能誘導有效的HIV中和抗體。深入研究HIV感染免疫應答的分子基礎，尤其是中和抗體的分子機制，并據(jù)此改造免疫原以誘導中和抗體，是當前艾滋病疫苗設計的重點策略。盡管HIV自然感染不能誘導保護性免疫，但一些感染者的血清(多克隆抗體)卻具有中和不同亞型的廣譜中和活性，說明HIV本身具有保守的中和抗體表位。 過去幾年對先前分離的幾個廣譜中和單克隆抗體(bl2，2G12，2F5，4E10)進行了結構解析， 證實它們識別包膜蛋白gpl20或gp41上相對保守的抗原結構，主要阻斷受體結合和膜融合過程。因此，HIV中和抗體也被認為是“天然的”的病毒進入抑制劑，動物攻毒實驗和病人治療的臨床實驗皆證實被動免疫具有顯著的預防和治療效果。因此，深入研究HIV中和抗體免疫應答的分子機制，篩選和設計可以誘導中和抗體的疫苗抗原，具有極其重要的理論意義和應用價值。目前已知的中和抗體都是針對包膜蛋白。如單克隆抗體IgG_bl2和2G12作用于包膜蛋白的gpl20亞基，可以阻斷病毒與受體的結合，而4E10和2F5則作用于gp41亞基， 主要是通過阻斷病毒細胞膜融合過程而發(fā)揮中和作用。由于近年艾滋病疫苗研究的不斷失敗，國際社會對HIV中和抗體的研究投入極大的熱情，期望通過分離和鑒定新的病毒中和抗體，解析它們的作用抗原表位，為設計艾滋病疫苗提供新線索。比如，近期發(fā)現(xiàn)了具有很好病毒中和活性的人源單克隆抗體VRC01、VRC02、VRC03、PG9和PGI6等。廣譜高效的HIV 中和抗體不但可以指導疫苗設計，而且具有可能的治療和預防作用，對HIV感染的診斷也具有重要的意義。HIV具有高度變異性，造成多種亞型(Subtypes)和重組型(CRF)在世界不同地區(qū)的流行。先前的幾個HIV廣譜中和抗體都是從B亞型感染者分離鑒定，最近分離的廣譜中和抗體P9和pl6來源于非洲A亞型感染者(Science，2009)。然而，目前發(fā)現(xiàn)的HIV廣譜中和抗體僅是少數(shù)，介導血清中和活性的大部分抗原表位有待鑒定(Nature，2009)。在我國流行著多種HIV亞型，特別是BC和AE重組型已成為主要的流行毒株，僅國內(nèi)特有的CRF-BC 既占50%以上。因此，我國臨床試驗或研發(fā)中的艾滋病疫苗主要針對BC和AE重組型HIV 毒株。最近，我們觀察了國內(nèi)HIV流行毒株對廣譜中和抗體的敏感性，結果發(fā)現(xiàn)測試的多數(shù) CRF-BC和CRF-AE毒株對廣譜中和抗體bl2，2G12和2F5具有顯著的抗性(Resistance)，但可以被感染者的血清有效中和，提示BC和AE重組型病毒含有特殊的中和表位結構。為此， 我們提出的科學問題是=CRF-BC和CRF-AE中和抗體的分子機制是什么？回答這一問題不但是HIV感染基礎免疫學的重要課題，而且對艾滋病疫苗的研發(fā)至關重要。而分離和鑒定新的HIV中和性單克隆抗體正是回答這一科學問題的重要手段，有助于突破艾滋病疫苗研發(fā)和免疫治療的科學瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種人源抗艾滋病病毒(HIV)基因工程抗體及其編碼基因與應用。本發(fā)明所提供的人源抗艾滋病病毒(HIV)基因工程抗體是抗體的Fab片段，它由抗體的重鏈的Fd片段和抗體的輕鏈組成，所述輕鏈由可變區(qū)\和恒定區(qū)Q組成，所述重鏈 Fd片段由可變區(qū)Vh和恒定區(qū)亞單位ChI組成，所述V1^Pt均由決定簇互補區(qū)(CDRs)和框架區(qū)(Framework Region, FRs)組成，所述決定簇互補區(qū)由CDR1、CDR2和CDR3組成；其中， 所述\的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分別如序列3的第27-32位所示、如序列3的第50-52位所示，如序列3的第89-98位所示，所述Vh的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分別如序列4的第26-33位所示、如序列4的第51-58位所示，如序列3的第97-116位所
7J\ ο所述抗體的Fab片段中，所述Vh和\的框架區(qū)可均來源于人。所述Vh的氨基酸序列具體可如序列表中序列4的第1-125位所示；所述\的氨基酸序列具體可如序列表中序列3的第1-107位所示。
所述Q和所述ChI均可來源于人。 所述抗體重鏈的Fd片段的氨基酸序列具體可如序列表中的序列4所示；所述輕鏈的氨基酸序列具體可如序列表中的序列3所示。其中，序列表中的序列3和序列4分別由 214和239個氨基酸殘基組成。含有所述抗體的Fab片段的IgG，將所述抗體的Fab片段的 Vh和\連接得到的單鏈抗體也屬于本發(fā)明的保護范圍。下述1)或2)的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍1)所述抗體的Fab片段的編碼基因；2)所述衍生抗體的編碼基因。其中，所述1)的編碼基因具體可為如下A)-E)中任一所述的DNA分子，所述2)的編碼基因具體可為如下A)、B)、F)或G)中任一所述的DNA分子A)所述\的⑶Rl的編碼序列如序列表中序列1的第79-96位所示，所述\的 CDR2編碼序列如序列表中序列1的第148-156位所示，所述\的CDR3的編碼序列如序列表中序列1的第265-294位所示，所述Vh的CDRl的編碼序列如序列表中序列1的第76-99 位所示，所述Vh的CDR2的編碼序列如序列表中序列1的第151-174位所示，所述Vh的CDR3 的編碼序列如序列表中序列1的第289-348位所示；B)所述Vh的編碼序列如序列表中序列2的第1-375位所示；所述\的編碼序列如序列表中序列1的第1-321位所示；C)所述Fab片段的Fd片段的編碼序列如序列表中序列2所示，所述Fab片段的輕鏈的編碼序列如序列表中序列1所示；D)在嚴格條件下與A)或B)或C)限定的DNA序列雜交且編碼所述抗體的Fab片段的DNA分子；E)與A)或B)或C)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述抗體的Fab 片段的DNA分子；F)在嚴格條件下與A)或B)限定的DNA序列雜交且編碼所述衍生抗體的DNA分子；G)與A)或B)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述衍生抗體的DNA 分子。其中，序列表中的序列1由642個脫氧核苷酸組成，序列表中的序列2由717個脫
氧核苷酸組成。含有上述編碼基因的重組載體、重組細胞、重組菌或重組病毒也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組載體具體可為將上述編碼基因插入pComb3XSS的多克隆位點得到的重組載體。實驗證明上述抗體的Fab片段或其編碼基因可用于制備抑制HIV假病毒感染的產(chǎn)品；說明上述抗體的Fab片段或其編碼基因、上述衍生抗體或其編碼基因可用于制備HIV疫
田ο所述HIV疫苗具體可為HIV-I疫苗。本發(fā)明采用噬菌體抗體展示技術，從我國B/C重組型HIV感染者分離HIV包膜蛋
6白特異性人源單克隆Fab抗體，命名為HY498，它具有特殊的序列結構，可以與多種亞型的 HIV包膜蛋白結合，對HIV具有很強的中和活性。可利用該抗體的⑶R區(qū)或Fab或IgG全抗體基因，可在原核細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和真核細胞及任何表達系統(tǒng)中制備不同形式的基因工程抗體，以用于制備治療、預防和診斷HIV感染和艾滋病的藥物、疫苗以及診斷試劑。


圖1為HY498對HIV毒株SF162的中和活性。圖2為HY498與多種HIV抗原的免疫反應性。 圖3為HY498對gpl20 二硫鍵和糖鏈的依賴性分析。圖4為HY498與CN54_gpl20突變體的反應性。圖5為HY498與多個已知抗體的競爭抑制實驗。圖6為噬菌體肽庫陽性克隆的ELISA篩選。
具體實施例方式本發(fā)明運用噬菌體表面呈現(xiàn)技術，從中國新疆地區(qū)一 B/C重組亞型HIV感染者獲得外周血淋巴細胞，通過基因工程技術構建了人源抗HIV基因工程抗體文庫，并從中篩選獲得特異性抗HIV基因工程Fab抗體HY498，獲得該抗體基因及其在原核細胞中的表達，表位分析表明該抗體作用于HIV包膜蛋白的受體結合部位，具有對HIV感染的中和活性。HY498是一種人源的在原核細胞中獲得穩(wěn)定表達的重組IgG Fab功能性片段，可特異性結合HIV的包膜蛋白，對HIV感染具有中和活性。該抗體作用于病毒包膜蛋白的受體結合區(qū)。HY498特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來源于對人源抗HIV抗體基因庫的特異性篩選獲得，相應的三個決定簇互補區(qū)域(Complementarity-Determining Regions, CDRs) ⑶R1、⑶R2和⑶R3為該抗體特有的全新序列，見后面所附抗體基因序列。HY498抗體重鏈隸屬于家族VHl (IGHV1-18*01)，抗體輕鏈隸屬于家族VLl (IGKV1_39*01)。本發(fā)明所提供的人源抗艾滋病病毒(HIV)基因工程抗體是抗體的Fab片段HY498， 其抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定簇互補區(qū)域(CDRs)CDRl、CDR2 和CDR3中特異性核苷酸序列決定，其相應的氨基酸序列構成了抗體的特異性抗原結合區(qū)域。換言之，其輕鏈和重鏈可變區(qū)相應的三個CDR區(qū)序列組合及其CDR之間的框架區(qū)(Frame Region, FRs)序列組成了每個抗體可變區(qū)特征。HY498重鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3序列分別為GYTFNSNG、ISGHSDET 和 ARSLLRSLERLMGGTDAFDI，輕鏈的 CDRU CDR2 和 CDR3 序列分別為QSISSY、AAS 和 QQSYSTPRTF。HY498的Fd片段的核苷酸如序列表中序列2所示，HY498的輕鏈的編碼序列如序列表中序列1所示；HY498的Fd片段的氨基酸序列如序列表中的序列4所示；HY498的輕鏈的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。根據(jù)HY498可變區(qū)中特異性核苷酸或氨基酸序列，可在體外人工合成與此相同或接近的核苷酸序列或編碼相同氨基酸的核苷酸序列，從而可以獲得相同的抗體基因或用于相關基因的改造；利用上述獲得的HY498基因，可在原核細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和真核細胞及任何表達系統(tǒng)中制備不同形式的基因工程抗體，或以此為基礎進行改建而獲得含有該抗體基因的其他基因，從而獲得類似于HY498具有結合并中和HIV的抗體產(chǎn)物。以下的優(yōu)選實施例對本發(fā)明作詳細說明，但不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。下述實施例中的實驗方法，為說明本發(fā)明，采用的材料與試劑包括噬菌體表達載體為 pComb3XSS、pComb3XTT,見由 Barbas 等人編著的((Phage Display-A LaboratoryManual)) 一書的 第 9 章(Carbos F. Barbas III, Dennis R. Burton, Jamie K. Scott, Gregg J. Siverman. Phage Display-Α Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. NewYork)。所用輔助噬菌體為 VCSM13 (美國 Stratagene 公司 Cat No 200251-81)； 菌株為 XLI-Blue (Stratagene 公司 Cat No 200228) ；mRNA 分離試劑盒(Invitrogen 公司 PartNo 45-0019)；第一鏈合成試劑盒(Invitrogen 公司 SuperScriptTM II First-StrandSynthesis System for RT-PCR Cat No 11904-18) ；PCR擴增試劑Platinum PCRSuperMix High Fidelity (Invitrogen 公司 Cat No 12532)；膠回收試劑盒 QIAquick GelExtraction kit(QIAGEN Cat No 28706)；內(nèi)切酶 Sfi I(Roche 公司 Cat No 1288059)； T4 連接酶(New England Biolab 公司 Cat No :M0202)；胰酶(Sigma Cat No :T7409)；酶標抗人 Fab 二抗(Sigma Cat No :A0293)；酶標抗 HA 二抗(Sigma Cat No :H6533) ；TMB 底物(Sigma Cat No :T0440)；核酸酶(Novagen 公司 Cat No 70746-3)；鎳填料 Ni-NTA Superflow(GE公司Cat No 17-5318-02)；蛋白G(GE公司)；肽噬菌體展示文庫(美國 New England Biolab 公司，Cat No :E8110S) ；HRP 標記抗 M13 抗體(SinoBiological Inc, Cat No :11973-MM05)o HIV骨架質粒pSG3"ENV(表達HIV基因組中除ENV之外的所有蛋白)由美國國立衛(wèi)生研究院 NIH AIDS Research and ReferenceReagent Program 提供 (Cat No 11051)；用于制備HIV假病毒表達SF162的包膜蛋白編碼質粒見He等發(fā)表的文獻 (He Y, Honnen W, Krachmarov C, Kayman S, Corvalon J, Pinter A.Efficient isolation of novel human monoclonal antibodies with neutraliζingactivity against HIV-I from transgenic mice expressing human Ig loci.Journal ofImmunology,2002 ； 169 595-605)；用于制備HIV假病毒表達HXB2的包膜蛋白編碼質粒見He等發(fā)表的文獻(He Y， Liu S, Li J,Lu H, Qi Z,Liu Z,Debnath AK,Jiang S. Conserved Salt-bridge between the N-and C-Terminal Heptad Repeat Regions of HIV_lgp41 Core Structure Is Critical for Virus Entry and Inhibition. Journal of Virology,2008 ；82 (22) : 11129—11139)。實施例1為HY498的篩選和制備方法；實施例2為HY498對HIV的中和活性；實施例3-5為HY498的反應活性；實施例6為HY498表位模擬肽的篩選和表位分析。實施例1、人源抗HIV抗體的Fab片段的制備一、人源抗HIV抗體的Fab片段的基因序列和氨基酸序列的獲得1、噬菌體抗體庫的構建建庫技術主要參考Barbas等所介紹的方法(Carbos F. Barbas III，Dennis R. Burton,Jamie K. Scott,Gregg J. Siverman. Phage Display—A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York)，如抗體基因的引物設計及PCR擴增、噬菌體表達載體的制備等。首先進行人源IgG Fab段基因的PCR擴增。其步驟是采用淋巴細胞分離液從HIV感染者分離外周血單核淋巴細胞(PBMC)，以mRNA分離試劑盒提取總細胞RNA，然后以第一鏈合成試劑盒的Oligo-dT引物將提取的RNA經(jīng)逆轉錄制備成cDNA。用一組第一輪PCR引物以cDNA為模板擴增重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因，PCR條件為94°C 15秒， 560C 15秒，72°C 90秒，30個循環(huán)。同時，以一套PCR引物以pComb3XTT為模板分別擴增抗體重鏈恒定區(qū)基因ChI片段和輕鏈恒定區(qū)基因Ck片段。上述PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，以DNA純化試劑盒QIAquick kit (德國QIAGEN公司)純化后獲得第一輪PCR產(chǎn)物。隨后，用第二輪PCR引物分別對重鏈可變區(qū)(VH)和恒定區(qū)(ChI)基因、輕鏈可變區(qū)(VL)和恒定區(qū)(Ck)基因進行連接，PCR條件為94°C 15秒，56°C 15秒72°C 2分鐘，20個循環(huán)。如此 VH和ChI連接后產(chǎn)生重鏈的Fd片段(其中，HY498的Fd片段的核苷酸序列如序列表中的序列2所示)，VL和Ck連接后產(chǎn)生輕鏈(其中，HY498的輕鏈的核苷酸序列如序列表中的序列1所示)。第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，以DNA純化試劑盒QIAquick kit (德國 QIAGEN公司)純化。再用第三輪PCR引物對重鏈和輕鏈基因進行連接，PCR條件為94°C 15 秒，560C 15秒72°C 3分鐘，20個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒QIAquick kit)回收后獲得1. 5Kb左右的Fab基因片段。將Fab片段和載體pComb3XSS均用Sfi I酶切后經(jīng) QIAquick kit回收。將Fab酶切回收產(chǎn)物和載體pComb3XSS酶切回收的3. 3Kb片段通過T4 連接酶進行連接，得到連接產(chǎn)物pComb3XSS-Fab。連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后用15 μ 1蒸餾水重懸，電轉導入300 μ 1的XLI-Blue感受態(tài)中(電轉條件=Bio-Red電轉儀，0. 2cm電轉杯， 2.漲伏電壓)。電轉后用5ml SOC培養(yǎng)基37°C 250rpm轉搖1小時，加入IOml含有氨芐青霉素和四環(huán)素的SB培養(yǎng)基并于37°C 250rpm轉搖2小時，加入183ml含有氨芐青霉素和四環(huán)素的SB培養(yǎng)基和2ml滴度為1012pfu/ml的輔助噬菌體VCSM13，于37°C 300rpm轉搖2小時后加入卡那霉素至70μβ/πι1，置37°C 300rpm轉搖過夜。次日，于3000g離心15分鐘后上清用4% PEG8000和3% NaCl沉淀，經(jīng)15000g4°C離心15分鐘后用2ml含1 % BSA的TBS 緩沖液(PH 7.4)重懸沉淀，全速離心5分鐘，上清過濾分裝保存-80°C冰箱中。2、噬菌體抗體庫的特異性富集和篩選用于噬菌體抗體庫的特異性富集和篩選的抗原為真核表達的重組HIV gpl20蛋白，來自8/(重組型!11￥-1病毒株0陽4(簡稱為0陽41 120)。用5(^ 1 0. IM NaHCO3(pH8. 6) 溶液包被CNM-gpl20蛋白于酶標板微孔中，每孔0. 5 μ g，于4°C過夜；次日，用150 μ 1 3% BSA 37°C封閉1小時，棄封閉液，每孔加入50 μ 1新鮮噬菌體抗體庫，37°C孵育2小時，棄去未結合噬菌體，用0. 5% TBST沖洗5次(第二次10次、第三、四次各15次)，每次沖洗用移液器吹打10-20次，吸凈液體后每孔加入50 μ 1 10mg/ml胰酶TBS溶液，37°C孵育30 分鐘，將洗脫的噬菌體加入2ml新鮮制備的XLI-Blue菌液(0D_ = 1)中，室溫孵育15分鐘，加入6ml含有氨芐青霉素和四環(huán)素的SB培養(yǎng)基，于37°C 250rpm轉搖2小時，加入91ml 含有氨芐青霉素和四環(huán)素的SB培養(yǎng)基和Iml滴度為1012pfu/ml的輔助噬菌體VCSM13，再于37 °C 300rpm轉搖2小時后加入卡那霉素至終濃度70μ g/ml，37°C 300rpm轉搖過夜。于 3000g離心15分鐘后，上清用4% PEG8000和3% NaCl沉淀，經(jīng)15000g于4°C離心15分鐘后用2ml含1 % BSA的TBS (pH7. 4)重懸沉淀，全速離心5分鐘，上清過濾保存，取50 μ 1加入已包被CNM-gpl20蛋白的酶標板中，如此反復富集4次。3、HIV特異性Fab抗體的小量誘導表達和檢測將4次富集的噬菌體稀釋106、107、108倍后各取1μ 1加入50μ 1新鮮制備的 XLI-Blue菌液，室溫感染15分鐘，涂氨芐抗性LB板。第二天選擇合適菌落密度的板挑取單克隆菌落，每個單克隆菌落加入到2ml含氨芐青霉素的SB培養(yǎng)基中，于37°C 300rpm轉搖6小時，每管中取0. 2 μ 1菌液在氨芐抗性LB板上保菌，然后各加入8 μ 10. 5Μ IPTG， 37°C 300rpm轉搖過夜。次日離心取上清進行ELISA檢測。具體步驟是，將CNM_gpl20以 1 μ g/ml 濃度用 100 μ 1 0. IM NaHCO3(ρΗ8. 6)溶液包被，4°C過夜。第二天用 200 μ 1 3% BSA 37°C封閉1小時，棄封閉液，用0.05% PBS-T洗一遍，加入100 μ 1過夜誘導的細菌上清，37°C孵育1小時，0.05% PBS-T洗三遍。加入100 μ 1酶標抗人Fab 二抗(1 30000稀釋)，37°C孵育1小時，以0. 05% PBS-T洗三遍。用TMB顯色30分鐘，2M H2SO4終止，酶標儀檢測吸光度A值。4、人源抗HIV抗體的Fab片段的核酸序列和氨基酸序列分析從保菌板上挑取陽性克隆相應的菌落，用QIAGEN Miniprep Kit質粒提取試劑盒提取質粒DNA進行核苷酸序列測序。測序為自動測序，輕鏈測序引物為 5，-AAGACAGCTATCGCGATTGCAG-3，重鏈測序引物為 5，-ACCTATTGCCTACGGCAGCCG-3，。將獲得的序列進行分析，并與hternet網(wǎng)絡上基因庫中的IgG序列比對，證實HY498為人源特異性Fab抗體，具有特有的輕鏈和重鏈基因可變區(qū)序列。HY498的Fd片段的編碼序列如序列表中序列2所示，HY498的輕鏈的編碼序列如序列表中序列1所示；其中序列表中序列2的第1-375位為Vh的編碼序列；序列表中序列1 的第1-321位為\的編碼序列；其中，八的CDRl的編碼序列如序列表中序列1的第79-96 位所示，Vl的CDR2編碼序列如序列表中序列1的第148-156位所示，Vl的CDR3的編碼序列如序列表中序列1的第沈5-294位所示；VH的CDRl的編碼序列如序列表中序列2的第 76-99位所示，Vh的⑶R2的編碼序列如序列表中序列2的第151-174位所示，Vh的⑶R3的編碼序列如序列表中序列2的第289-348位所示。HY498的Fd片段的氨基酸序列如序列表中的序列4所示；Vh的氨基酸序列如序列表中序列4的第1-125位所示；\的氨基酸序列具體可如序列表中序列3的第1-107位所示。\中含有3個決定簇互補區(qū)CDR1、CDR2和 ⑶R3，其氨基酸序列分別如序列表中序列3的第27-32位、50-52位和89-98位所示；被這有3個決定簇互補區(qū)間隔的其余四個區(qū)為框架區(qū)。Vh中含有3個決定簇互補區(qū)⑶R1、⑶R2 和⑶R3，其氨基酸序列分別如序列表中序列4的第沈-33位、51-58位和97-116位所示；被這3個決定簇互補區(qū)間隔的其余四個區(qū)為框架區(qū)。實施例2、人源抗HIV抗體的Fab片段的表達和純化將上述篩選獲得的含有序列2所示的HY498的Fd片段的編碼基因和序列1所示的 HY498的輕鏈編碼基因的重組載體pComb3XSS-Fab轉化至大腸桿菌T0P10F，感受態(tài)細胞，挑取單個菌落加入到500ml含20mM MgCl2和50 μ g/ml氨芐青霉素的SB培養(yǎng)基中37°C 250rpm 搖 5-8 小時(OD600 = 1)，加入 Iml 0. 5M IPTG，37°C 250rpm 搖 16 小時，細菌 _80°C凍融破菌，加入25 μ 1多粘菌素B溶液，0. 5μ 1核酸酶冰上搖勻1小時，10000轉速離心30分鐘， 上清用鎳填料Ni-NTA Superflow N柱或蛋白G柱純化(依說明書提供的方法進行)。得到純化的人源抗HIV抗體的Fab片段(ΗΥ498)。實施例3、ΗΥ498對HIV的中和活性檢測采用HIV假病毒感染系統(tǒng)評價人源抗HIV抗體的Fab片段的抗病毒活性。具體步驟為，將表達HIV毒株SF162或ΗΧΒ2的ENV蛋白的質粒pcDNA3. I-ENV和骨架質粒 pSG3"ENV(表達HIV基因組中除ENV之外的所有蛋白)，按質量比1 2的比例轉染細胞，同時設pSG3 AENV對照，即只轉染相同量的pSG3"ENV。于37°C、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育^rr以后使質粒進入細胞，而后換液，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48hr，假病毒分泌至上清中。用移液器盡量多地吸出細胞培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)板中的上清，經(jīng)0. 45 μ m濾器過濾或 IOOOg離心IOmin取上清，向其中加入FBS使其終濃度為20%，轉移入聚丙烯管中于-80°C 保存?zhèn)溆没蛑苯舆M行病毒滴定。收獲大量的假病毒后，加入牛血清終濃度達20%，分裝凍存。取出假病毒在96孔板中做5倍稀釋，8個梯度，4個復孔，終體積為ΙΟΟμΙ。其中用 pSGy單獨轉染所收上清做相同稀釋。將TZM-bl細胞胰酶消化，細胞計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基將細胞稀釋至IO5個/ml，每孔加100 μ 1，每孔細胞為IO4個，加入DEAE-dextran，終濃度為15μ g/ml。將96孔板放入細胞培養(yǎng)箱中，37 °C，5% CO2培養(yǎng)48小時。之后從細胞培養(yǎng)箱中取出96孔板，從上樣孔中吸棄上清，加入30 μ 1細胞裂解液，放置IOmin后加入 100 μ 1熒光素酶檢測試劑。用移液器從每孔中吸出ΙΟΟμΙ液體，加于對應96孔白板中， 于微孔板光度計讀取發(fā)光值。以ρ363ΔΕΝν對照孔化學發(fā)光值的3倍作為cutoff值，結果用S/C0值表示。用Reed-Muench法計算假病毒的病毒滴度。為檢測HY498的中和病毒活性，將人源抗HIV抗體的Fab片段(HY498)按倍比稀釋鋪入96孔板中，終體積為50μ 1，其中用50 μ 1 DMEM培養(yǎng)基替代藥物作為陰性對照。加入TZM-bl細胞100 μ 1 (IO5個細胞/ ml)含DEAE-dextran終濃度為15 μ g/ml，加入已獲得的HIV-1假病毒50 μ 1，每孔相當于 IOOTCID5ci。培養(yǎng)4 后，利用熒光素酶檢測試劑(!Iomega)測定每孔的相對熒光單位(RLU)。 半數(shù)中和劑量是能引起50%最大效應(量反應)的劑量，用半數(shù)中和劑量(ND5。)表示。結果如圖1所示，HY498對HIV病毒株SF162的中和活性(ND50)為1. 12 μ g/ml，對HIV病毒株 HXB2的中和活性(ND5tl)為5. 60 μ g/ml，該結果說明該Fab片段為HIV中和抗體。實施例4、HY498與HIV包膜蛋白的反應性以ELISA法檢測HY498與15種來自不同亞型HIV的包膜蛋白重組抗原(gpl20或 gpl40)的交叉反應性，包括HIV亞型A，B和C。其步驟為，將每個蛋白以1 μ g/ml濃度用 100 μ 1 0. IM NaHCO3 (ρΗ8. 6)溶液分別包被，4°C 過夜。第二天用 200ml 3% BSA37°C 封閉 1小時，棄封閉液，0. 05% PBS-T洗一遍，加入100μ 1小量誘導的細菌上清，37°C孵育1小時后，用0.05% PBS-T洗三遍。加入ΙΟΟμΙ以1 30000稀釋的酶標抗人Fab 二抗，37°C 孵育1小時，0. 05% PBS-T洗三遍。用TMB顯色30分鐘，2M H2SO4終止，酶標儀檢測吸光度A值。結果發(fā)現(xiàn)，HY498可以與來自不同HIV亞型的包膜蛋白重組抗原反應。如圖2所示，HY498 可以與來自 92RW020 (A)、Bal (B)、HXB2 (B)、JRFL (B)、JRCSF (B)、89. 6 (B)、YU2 (B)、 R2 (B)、LAI (B)、Dul56. 12(C)、96ZM951 (C)和CN54 (B/C)病毒株的重組包膜蛋白反應。對照抗體SARS-20為一抗SARS冠狀病毒S蛋白的抗體，不與以上HIV抗原有任何交叉反應。實施例5、HY498作用于依賴于gpl20糖基和環(huán)區(qū)的構象表位為測定Fab抗體與二硫鍵降解的gpl20反應性，取CNM_gpl20用PBS稀釋至 50 μ 1，加二硫蘇糖醇(DTT)至10mM，加碘乙酰胺至10mM，不加DTT和碘乙酰胺作對照，兩者于37°C孵育30分鐘，用0. IM NaHCO3(pH8. 6)溶液包被，4°C過夜。第二天用200ml 3% BSA 37°C封閉1小時，棄封閉液，0. 05% PBS-T洗一遍，加入100 μ 1 Fab抗體(15 μ g/ml)，37°C 孵育1小時，0.05% PBS-T洗三遍。加入ΙΟΟμΙ以1 30000稀釋的酶標抗人Fab 二抗， 37°C孵育1小時，0. 05% PBS-T洗三遍。用TMB顯色30分鐘，2M H2SO4終止，酶標儀檢測吸光度A值。如圖3所示，HY498與天然構象的gpl20反應，但不與DTT處理的gpl20反應，說明抗體表位取決于二硫鍵依賴的構象；同時，為測定gpl20上的糖鏈是否參與抗體的表位，CNM-gpl20先用內(nèi)切糖苷酶PNGase F處理，然后用于ELISA包被。圖3的結果也顯示， HY498不與去糖后的gpl20反應，說明gpl20糖鏈對抗體表位的重要性。因此，HY498作用于糖基依賴的gpl20構象表位。為進一步分析HY498的作用表位，采用三個去掉gpl20環(huán)區(qū)的突變體作為ELISA抗原，它們分別是缺失V1V2環(huán)(八￥1￥2)、缺失￥3環(huán)(AV3)和V1V2、 V3環(huán)都缺失(AV1V2V3)的CNM-gpl20蛋白。從圖4的結果可見，單獨V1V2缺失可導致 HY498的反應性顯著減弱，單獨V3環(huán)缺失或V1V2V3環(huán)全部缺失皆可導致抗體的反應性消失，說明V1V2環(huán)和V3環(huán)尤其是V3環(huán)對兩抗體的表位組成極其重要。實施例6、HY498的競爭實驗為確定HY498在gpl20上的識別位點，采用競爭ELISA法測定HY498是否與已知表位的抗體競爭結合gpl20。競爭抗體包括針對gpl20受體(⑶4)結合區(qū)的抗體IgGbl2和 HY5，針對V3環(huán)的447-52D和HY7，以及針對gpl20糖鏈表位的2G12。將CNM_gpl20蛋白以 1 μ g/ml 濃度用 100 μ 1 0. IM NaHCO3(ρΗ8. 6)溶液包被，4°C過夜。第二天用 200ml3% BSA 37°C封閉1小時，棄封閉液，0. 05% PBS-T洗一遍，加入100 μ 1競爭抗體(100 μ g/ml)，37°C 孵育1小時。0. 05% PBS-T洗三遍，加入100 μ 1 Fab抗體，37°C孵育1小時。0. 05% PBS-T 洗三遍，加入100μ 1以1 4000稀釋的酶標抗HA 二抗，37°C孵育1小時，0.05% PBS-T洗三遍。用TMB顯色30分鐘，2M H2SO4終止，酶標儀檢測吸光度A值。結果見圖5。HY498與 HY5有部分競爭，但可與IgGbl2有效競爭，說明HY498抗體可以競爭結合針對gpl20上⑶4 結合區(qū)的位點。圖5的結果也說明，HY498不與針對V3環(huán)區(qū)的抗體447-52D和HY7以及針對糖鏈表位的抗體2G12有競爭結合于gpl20。因此，HY498抗體的表位主要針對gpl20的受體結合部位。實施例7、HY498表位模擬肽的篩選和表位分析為鑒定HY498抗體結合表位及關鍵的結合氨基酸位點，本發(fā)明進一步采用New England Biolabs 公司的 12 肽噬菌體展示文庫(ph. D. 12 peptide library)篩選與 HY498 特異性結合的模擬肽。主要步驟為，在滅菌聚苯乙烯96孔微量板中，每孔加入150 μ 1 100 μ g/ml的HY498 (溶于0. IM ρΗ8· 6的NaHC03)，4°C輕微震蕩，孵育過夜。倒掉包被液。 每板(或孔)加滿封阻液
，4°C作用至少 1小時。封阻反應后，用100 μ 1的TBST緩沖液(TBS+0. 1 % Tween-20)，稀釋2X IO11的噬菌體(即10 μ 1的原始文庫)，然后加到已包被好的板上，室溫溫和搖動10-60分鐘。用0. 3ml TBST 洗 10 次。每孔加入 100 μ 1 0. 2MGlycine-HCl (pH 2. 2)，lmg/ml BSA 來分離已結合的分子溫和搖動10分鐘，洗脫液加入干凈微量離心管中。然后再用15 μ 1 IM Tris-HCKpH 9.1)中和洗脫液。將洗脫的噬菌體溶液加入20ml對數(shù)生長前期的ER2738菌液中，37°C震蕩培養(yǎng) 4. 5 小時。IOOOOrpm 離心 10 分鐘。加入 1/6 體積的 PEG/NaCl (20% PEG-8000, 2. 5M NaCl)溶液，4°C靜置過夜。IOOOOrpm 4°C離心15分鐘。倒掉上清，用ImL PBS溶解沉淀噬菌體。4°C離心5分鐘，吸取上清，加入1/6體積的PEG/NaCl溶液，4°C靜置1小時。IOOOOrpm 4°C離心15分鐘。倒掉上清，用200 μ L PBS溶解沉淀噬菌體，4°C保存。重復上述步驟，進行再一輪的篩選。第三輪篩選后，挑取單一噬菌體空斑至對數(shù)期的ER2738菌中，37°C培養(yǎng) 4. 5-5小時，離心收集噬菌體上清進行ELISA檢測。包被10 μ g/ml濃度的HY498，加入上述噬菌體上清孵育，然后加入HRP標記抗M13抗體(1 5000稀釋)作為二抗，以BSA包被作為陰性對照。圖6顯示噬菌體多肽的檢測結果。噬菌體庫篩選的多肽針對目標抗體HY498 的讀值顯著高于BSA對照3倍以上，有較好的特異性。根據(jù)噬菌體ELISA的檢測結果挑選陽性克隆，通過擴增后，按12肽噬菌體展示文庫操作說明書的常規(guī)操作抽提DNA，以該DNA 模板進行測序，獲得以上噬菌體展示肽的序列，見表1。采用hternet網(wǎng)絡Mapitope分析軟件(Bublil EM, Freund NT, Mayrose I, Penn 0, Roitburd-Berman A, J, Rubinstein ND, Pupko Τ, Gershoni JM, Stepwise Predictionof Conformational Discontinuous B-Cell Epitopes Using the Mapitope Algorithm. PROTEINS :Structure, Function, and Bioinformatics 2007 ；68 :294-304.)對模擬肽序列進行分析，預測的HY498抗體結合的 gpl20關鍵氨基酸序列。HY498結合的關鍵氨基酸包括ASN92、PHE93、MET95、TRP96、LYS97、 ASN98、THR236、GLY237、PR0238、SER274、VAL275、ASN276、PHE277、THR278、ASP279、ASN280、 SER347、GLN352、PHE353、GLY354、ASN355、ASN356、LYS357、THR358、SER393、THR394、TRP395、 PHE396、TYR484。經(jīng)序列和結構分析，這些氨基酸的多數(shù)參與形成受體結合。經(jīng)序列和結構分析，這些氨基酸的多數(shù)也位于gpl20受體結合區(qū)域。該結果與上述實驗表明的結果即 HY498的表位坐落在gpl20受體結合區(qū)吻合。因此，HY498中和病毒的機制是通過阻斷病毒吸附結合靶細胞的過程。同時，分析表明，HY498結合的氨基酸位點與文獻報道的IgGbl2、 F105等抗體結合的表位不同。
權利要求
1.抗體的Fab片段，它由抗體的重鏈的Fd片段和抗體的輕鏈組成，所述輕鏈由可變區(qū) Vl和恒定區(qū)Q組成，所述重鏈Fd片段由可變區(qū)Vh和恒定區(qū)亞單位C0I組成，所述Vh和\ 均由決定簇互補區(qū)和框架區(qū)組成，所述決定簇互補區(qū)由⑶R1、⑶R2和⑶R3組成；其特征在于所述\的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分別如序列3的第27-32位所示、如序列3 的第50-52位所示，如序列3的第89-98位所示；所述Vh的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列分別如序列4的第26-33位所示、如序列4的第51-58位所示，如序列4的第97-116位所示。
2.根據(jù)權利要求1所述抗體的Fab片段，其特征在于所述Vh和\的框架區(qū)均來源于人。
3.根據(jù)權利要求1或2所述抗體的Fab片段，其特征在于所述Vh的氨基酸序列如序列表中序列4的第1-125位所示；所述\的氨基酸序列如序列表中序列3的第1-107位所示。
4.根據(jù)權利要求1或2或3所述抗體的Fab片段，其特征在于所述Q和所述ChI均來源于人。
5.根據(jù)權利要求1至4中任一所述抗體的Fab片段，其特征在于所述抗體重鏈的Fd 片段的氨基酸序列如序列表中的序列4所示；所述輕鏈的氨基酸序列如序列表中的序列3 所示。
6.由權利要求1至5中任一所述抗體的Fab片段衍生的抗體，是下述a)或b)的抗體a)由權利要求1至5中任一所述抗體的Fab片段的Vh和\連接得到的單鏈抗體；b)含有權利要求1至5中任一所述抗體的Fab片段的IgG。
7.下述1)或2)的編碼基因1)權利要求1至5中任一所述抗體的Fab片段的編碼基因；2)權利要求6所述衍生的抗體的編碼基因。
8.根據(jù)權利要求7所述的編碼基因，其特征在于所述1)的編碼基因為如下A)-E)中任一所述的DNA分子，所述2)的編碼基因為如下A)、B)、F)或G)中任一所述的DNA分子A)所述\的CDRl的編碼序列如序列表中序列1的第79-96位所示，所述\的CDR2編碼序列如序列表中序列1的第148-156位所示，所述VJ勺CDR3的編碼序列如序列表中序列 1的第265-294位所示，所述Vh的⑶Rl的編碼序列如序列表中序列2的第76-99位所示， 所述Vh的⑶R2的編碼序列如序列表中序列2的第151-174位所示，所述Vh的⑶R3的編碼序列如序列表中序列2的第289-348位所示；B)所述Vh的編碼序列如序列表中序列2的第1-375位所示；所述\的編碼序列如序列表中序列1的第1-321位所示；C)所述Fab片段的Fd片段的編碼序列如序列表中序列2所示，所述Fab片段的輕鏈的編碼序列如序列表中序列1所示；D)在嚴格條件下與A)或B)或C)限定的DNA序列雜交且編碼所述抗體的Fab片段的 DNA分子；E)與A)或B)或C)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述抗體的Fab片段的DNA分子；F)在嚴格條件下與A)或B)限定的DNA序列雜交且編碼所述衍生抗體的DNA分子；G)與Α)或B)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述衍生抗體的DNA分子。
9.含有權利要求7或8所述的編碼基因的重組載體、重組細胞、重組菌或重組病毒。
10.下述1)或2的應用1)權利要求1至5中任一所述抗體的Fab片段或其編碼基因在制備下述a)_c)中任一物質中的應用a)診斷HIV感染和/或艾滋病的試劑，b)治療和/或預防HIV感染的藥物或疫苗，c)治療和/或預防艾滋病的藥物或疫苗；2)權利要求6所述衍生抗體或其編碼基因在制備下述d)-f)中任一物質中的應用d)診斷HIV感染和/或艾滋病的試劑，e)治療和/或預防HIV感染的藥物或疫苗，f)治療和/或預防艾滋病的藥物或疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人源HIV抗體的Fab片段及其編碼基因與應用。該抗體的Fab片段，由抗體的重鏈的可變區(qū)VH和恒定區(qū)亞單位CH1和抗體的輕鏈組成，所述輕鏈由可變區(qū)VL和恒定區(qū)CL組成，所述VH和VL均由決定簇互補區(qū)(CDRs)和框架區(qū)(FrameworkRegion，F(xiàn)Rs)組成，所述決定簇互補區(qū)由CDR1、CDR2和CDR3組成，所述VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列2的第27-32位所示、如序列2的第50-52位所示，如序列2的第89-98位所示，所述VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列3的第26-33位所示、如序列3的第51-58位所示，如序列3的第97-116位所示。該Fab片段及其編碼基因制備不同形式的基因工程抗體，以用于制備治療、預防和診斷HIV感染和艾滋病的藥物、疫苗以及診斷試劑。
文檔編號C12R1/93GK102212133SQ20111007816
公開日2011年10月12日 申請日期2011年3月30日 優(yōu)先權日2011年3月30日
發(fā)明者萬超, 何玉先, 孫堅萍, 張超, 滿來 申請人:中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所