專利名稱：：工程改造的抗il-23抗體的制作方法工程改造的抗IL-23抗體發(fā)明領(lǐng)域總的來說，本發(fā)明涉及白細(xì)胞介素-23p19(IL-23pl9)特異性抗體及其用途。更具體而言，本發(fā)明涉及識別人IL-23pl9并調(diào)節(jié)其特別是在炎性、自身免疫和增生性病癥中的活性的人源化抗體。
背景技術(shù)：
：免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用以使個體免于傳染劑例如細(xì)菌、多細(xì)胞生物和病毒，以及免于癌癥。這個系統(tǒng)包括幾種類型的淋巴樣和髓樣細(xì)胞，例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DCs)、嗜酸性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞。這些淋巴樣和髓樣細(xì)胞通常產(chǎn)生稱為細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo)蛋白。免疫應(yīng)答包括炎癥，即，免疫細(xì)胞全身性或在身體的特定部位中積累。響應(yīng)傳染劑或外來物質(zhì)，免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子依次調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞增殖、發(fā)育、分化或遷移。免疫應(yīng)答可以產(chǎn)生病理性后果，例如，當(dāng)它涉及過度炎癥時，如在自身免疫性病癥中(參見，例如，Abbas等人，(編輯)(2000)Ce〃*WM/簡/ar/m聽wo/ogy,W.B.SaundersCo.，Philadelphia,PA;Oppenheim和Feldmann(編輯)(2001)C,h力eAcademicPress,SanDiego,CA;vonAndrian和Mackay(2000)7Vew/.Met/.343:1020-1034;Davidson和Diamond(2001)臉wJ.她d345:340-350)。白細(xì)胞介素12(IL-12)是由p35和p40亞基組成的異二聚分子。研究已指出IL-12在幼稚T細(xì)胞分化成分泌IFN丫的T輔助1型CD4+淋巴細(xì)胞中起關(guān)鍵作用。同樣已顯示IL-12是體內(nèi)T細(xì)胞依賴性免疫和炎癥應(yīng)答所必需的。(參見，例如，Cua等人,(2003)淑騰421:744-748。IL-12受體由IL-12卩1和IL-12卩2亞基組成。白細(xì)胞介素23(IL-23)是包含2個亞基的異二聚細(xì)胞因子IL-23特有的p19和與IL-12共有的p40。p19亞基與IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、和IL-12的p35亞基在結(jié)構(gòu)上相關(guān)。IL-23通過與包含IL-23R和IL-12P1的異二聚受體結(jié)合介導(dǎo)信號傳導(dǎo)，所述IL-12pi與IL-12受體共有。許多早期研究證實(shí)p40中的遺傳缺陷(p40敲除小鼠；p40KO小鼠)后果比在p35KO小鼠中發(fā)現(xiàn)的那些更嚴(yán)重。這些結(jié)果中的一些通過IL-23的發(fā)現(xiàn)以及p40KO阻止IL-12和IL-23表達(dá)的發(fā)現(xiàn)最終得到解釋(參見，例如，Oppmann等人，(2000)/畫謂'(y13:715-725;Wiekowski等人，(2001)丄/mmw"o/.166:7563-7570;Parham等人，(2002)//mmw"o/168:5699-708;Frucht(2002)Sc/S7X五2002,E1畫E3;Elkins等人，(2002)/w/ec"ow/謹(jǐn)謹(jǐn)(y70:1936-1948)。通過使用p40KO小鼠的近期研究已顯示IL-23和IL-12兩者的阻斷是關(guān)于各種炎性和自身免疫性病癥的有效治療。然而，通過p40阻斷IL-12看起來具有各種全身性后果，例如對機(jī)會性微生物感染的易感性增力口。在使用抗體作為體內(nèi)治療劑中的最主要限制是抗體的免疫原性。因?yàn)榇蠖鄶?shù)單克隆抗體衍生自嚙齒類動物，所以在人中重復(fù)使用導(dǎo)致產(chǎn)生針對治療抗體的免疫應(yīng)答。此類免疫應(yīng)答導(dǎo)致治療功效最小化和潛在的致命性過敏反應(yīng)最大化的損失。減少嚙齒類動物抗體免疫原性的最初努力涉及其中小鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)融合的嵌合抗體的產(chǎn)生。Liu等人(1987)尸rac.Ato/.S"84:3439-43。然而，用人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的雜交體(hybrid)注射的小鼠發(fā)展針對人可變區(qū)的強(qiáng)烈抗抗體應(yīng)答，從而暗示整個嚙齒類動物Fv區(qū)在此種嵌合抗體中的保留可能仍在患者中導(dǎo)致不需要的免疫原性。一般認(rèn)為可變結(jié)構(gòu)域的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)環(huán)包含抗體分子的結(jié)合部位。因此，嘗試將嚙齒類動物CDR環(huán)嫁接到人構(gòu)架上(即，人源化)以進(jìn)一步使嚙齒類動物序列減到最小。Jones等人(1986)Mm^e321:522;Verhoeyen等人(1988)239:1534。然而，CDR環(huán)交換仍不能一致地導(dǎo)致具有與來源抗體相同的結(jié)合性質(zhì)的抗體。人源化抗體中構(gòu)架殘基(FR),牽涉于CDR環(huán)支持的殘基中的變化也是保持抗原結(jié)合親和力所需的。Kabat等人(1991)J./wmw"o/.147:1709。盡管許多人源化抗體構(gòu)建體中CDR嫁接的使用和構(gòu)架殘基保持已得到報道，但難以預(yù)測特定序列是否將導(dǎo)致具有所需結(jié)合性質(zhì)和有時生物學(xué)性質(zhì)的抗體。參見，例如，Queen等人(1989)/Voc.A^f/.Jc^f.S"V&486:10029，Gorman等人(1991)尸rac.AAw/.爿cadt/&488:4181,和Hodgson(1991)^o化c/mo/ogy(^Vr,9:421-5。此外，大多數(shù)先前研究使用不同的人序列用于動物輕和重鏈可變序列，從而使得此類研究的預(yù)言性有問題。已使用已知抗體的序列或，更一般地，具有已知x射線結(jié)構(gòu)的抗體，抗體NEW和KOL的那些。參見，例如，Jones等人，同上；Verhoeyen等人，同上；和Gorman等人，同上。關(guān)于少數(shù)人源化構(gòu)建體的確切序列信息已得到報道。本發(fā)明提供了工程改造的IL-23pl9抗體及其治療炎性、自身免疫和增生性病癥的用途。附圖簡述圖1A-1C顯示了小鼠抗人IL-23pl9抗體克隆重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的比較。指出了關(guān)于克隆7G10、6H12、13F11、13B5、7E2、13Gl、IICIO、1E10、30F11、34E4、5B12、6H4、9C9、IIBIO、30El、33D2、20A9、22E9、29D5、21A10、33B12、固ll、19E9、10G8、3D7、39G2、35F12、49A10、34F9和7D7的CDRs,以及CDR共有序列。圖2A-2C顯示了小鼠抗人IL-23pl9抗體克隆輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的比較。指出了關(guān)于克隆7G10、6H12、13F11、13B5、7E2、13G1、IICIO、IEIO、30F11、34E4、5B12、6H4、9C9、IIBIO、33D2、20A9、22E9、29D5、21A10、33B12、lOHll、19E9、10G8、3D7、39G2、35F12、49A10、34F9和7D7的CDRs。沒有提供關(guān)于克隆30E1的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。提供了關(guān)于輕鏈CDR序列的3個亞家族中每一個的共有序列，在本文中稱為輕鏈亞家族(a)、(b)和(c)。在圖2A-2C中從頂端到底部顯示了這些序列亞家族。發(fā)明概述本發(fā)明基于IL-23阻斷抑制炎性、自身免疫和異常增生的觀察。本發(fā)明包含結(jié)合人IL-23p19的結(jié)合化合物，例如抗體或其片段，包括人源化或嵌合重組抗體，所述結(jié)合化合物包含至少1個抗體輕鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，后者具有選自SEQIDNOs:81-89的至少1個、2個或3個CDRs。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含選自SEQIDNOs:81-83的至少1個CDRL1和選自SEQIDNOs:84-86的至少1個CDRL2和選自SEQIDNOs:87-89的至少1個CDRL3。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合化合物包含至少1個抗體重鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，后者具有選自SEQIDNOs:78-80的至少1個、2個或3個CDRs。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合化合物包含構(gòu)架區(qū)，其中構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列是全部或基本上全部人免疫球蛋白氨基酸序列。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含具有SEQIDNOs:81-89的序列或任選地其變體的至少1個、2個或3個輕鏈CDRs。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合化合物包含具有SEQIDNOs:78-80的序列或任選地其變體的至少l個、2個或3個重鏈CDRs。在各種實(shí)施方案中，相對于各自SEQIDNos的序列，變體包含最高達(dá)l個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、IO個或更多保守修飾的氨基酸殘基。保守氨基酸置換在表1中提供。在其他實(shí)施方案中，結(jié)合化合物包含至少1個抗體輕鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，后者具有選自SEQIDNos:69-77的至少1個、2個或3個CDRs。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含選自SEQIDNOs:69-71的至少1個CDRL1和選自SEQIDNOs:72-74的至少1個CDRL2和選自SEQIDNOs:75-77的至少1個CDRL3。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合化合物包含至少1個抗體重鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，后者具有選自SEQIDNOs'.66-68的至少1個、2個或3個CDRs。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含具有SEQIDNOs:69-77的序列或其變體的至少1個、2個或3個輕鏈CDRs。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其包含選自SEQIDNOs:69-71或其變體的至少1個CDRL1,和選自SEQIDNOs:72-74或其變體的至少1個CDRL2，和選自SEQIDNOs:75-77或其變體的至少1個CDRL3。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含具有SEQIDNOs:66-68的序列或其變體的至少1個、2個或3個重鏈CDRs。在各種實(shí)施方案中，相對于各自SEQIDNos的序列，變體包含最高達(dá)1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多保守修飾的氨基酸殘基。在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物包含選自SEQIDNos:2和4的殘基43-53、69-75和108-116的至少1個、2個或3個輕鏈CDRs,以及選自SEQIDNos:l和3的殘基45-54、69—85和118-123的至少1個、2個或3個重鏈CDRs。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合化合物包含具有SEQIDNO:2或4的殘基20-129的序列或其變體的抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合化合物包含具有SEQIDNO:1或3的殘基20-134的序列或其變體的抗體重鏈可變結(jié)構(gòu)域。在各種實(shí)施方案中，相對于各自SEQIDNos的序列，變體包含最高達(dá)l個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、30個、40個或50個或更多保守+務(wù)飾的氨基酸殘基。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合化合物包含抗體輕鏈，其包含SEQIDNO:2或4的成熟形式(殘基20-233)的序列，或基本上由SEQIDNO:2或4的成熟形式(殘基20-233)的序列組成。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合化合物包含抗體重鏈，其包含SEQIDNO:l或3的成熟形式(殘基20-464)的序列，或基本上由SEQIDNO:1或3的成熟形式(殘基20-464)的序列組成。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物在包含殘基82-95、或殘基133-140、或兩者的表位處與人IL-23p19(SEQIDNO:29)結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中，IL-23pl9結(jié)合化合物與表位結(jié)合，所述表位包含殘基E82、G86、S87、D88、T91、G92、E93、P94、S95、H106、P133、S134、Q135、P136、W137、R139和L140,以及任選地殘基K83、F90和L110中的一些或全部。在各種實(shí)施方案中，關(guān)于目的抗體的表位通過下述方法確定獲得抗體抗原復(fù)合物的X射線晶體結(jié)構(gòu)，并且確定IL-23pl9上的哪個殘基位于目的抗體上殘基的指定距離內(nèi)，其中指定距離是例如4A或5A。在一些實(shí)施方案中，表位被定義為沿著IL-23pl9序列的一段8個或更多鄰接氨基酸殘基，其中殘基的至少50%、70%或85。/。位于抗體的指定距離內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物與人IL-23結(jié)合，并且具有輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)，后者與SEQIDNO:2或4的殘基20-129具有至少95%、90%、85%、80%、75%或50%的序列同源性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合化合物，所述結(jié)合化合物與人IL-23結(jié)合，并且具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh),后者與SEQIDNO:1或3的殘基20-134具有至少95%、卯％、85%、80%、75%或50%的序列同源性。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合化合物包含具有輕鏈的抗體，或基本上由具有輕鏈的抗體組成，所述輕鏈具有SEQIDNO:2或4的成熟形式(即殘基20-233)的序列。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合化合物包含具有重鏈的抗體，或基本上由具有重鏈的抗體組成，所述重鏈具有SEQIDNO:1或3的成熟形式(即殘基20-464)的序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在交叉阻斷測定(cross-blockingassay)中能夠阻斷本發(fā)明的結(jié)合化合物與人IL-23的結(jié)合的抗體。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及能夠阻斷IL-23介導(dǎo)的活性的結(jié)合化合物，此類活性包括但不限于，與其受體結(jié)合或促迸Th17細(xì)胞的增殖或存活。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物進(jìn)一步包含重鏈恒定區(qū)，其中所述重鏈恒定區(qū)包含yl、y2、y3或丫4人重鏈恒定區(qū)或其變體。在各種實(shí)施方案中，輕鏈恒定區(qū)包含x或K人輕鏈恒定區(qū)。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合化合物是多克隆、單克隆、嵌合、人源化或全人抗體或其片段。本發(fā)明還預(yù)期結(jié)合片段是選自Fab、Fab，、Fab，-SH、Fv、scFv、F(ab，)2和雙抗體的抗體片段。本發(fā)明包含抑制人受試者中的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括以有效阻斷IL-23的生物學(xué)活性的量給有此需要的受試者施用對IL-23特異的抗體(或其結(jié)合片段)。在一些實(shí)施方案中，對IL-23特異的抗體是人源化或嵌合抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是炎癥應(yīng)答，包括關(guān)節(jié)炎、牛皮痺和炎性腸病。在其他實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是自身免疫應(yīng)答，包括多發(fā)性硬化、葡萄膜炎、全身性紅斑狼瘡和糖尿病。在另一個實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是對于癌癥的。本發(fā)明還預(yù)期施用另外的免疫抑制劑或抗炎劑。本發(fā)明的結(jié)合化合物可以在組合物中，所述組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合的結(jié)合化合物，或其結(jié)合片段。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包含免疫抑制劑或抗炎劑。本發(fā)明包含編碼本發(fā)明結(jié)合化合物的抗體實(shí)施方案的多肽序列的分離的核酸。核酸可以在表達(dá)載體中與控制序列可操作地連接，所述控制序列由用載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞識別。還包含的是包含載體的宿主細(xì)胞，和生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括在其中核酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從而生產(chǎn)多肽，和從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收多肽。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的結(jié)合化合物的藥物。詳述如本文包括附加權(quán)利要求所使用的，除非上下文另有明確說明，單詞的單數(shù)形式例如"一個(a)"、"一種(an)"和"該(the)"包括其相應(yīng)的復(fù)數(shù)參考。下表7提供了在本申請中使用的序列標(biāo)識符列表。本文引用的所有參考文獻(xiàn)都引入作為參考，其程度與每個單個出版物、專利申請或?qū)＠貏e并個別指出引入作為參考相同。I.定義除非上下文另有或明確說明，"激活"、"刺激"和"處理"當(dāng)應(yīng)用于細(xì)胞或受體時，可以具有相同含義，例如，用配體激活、刺激或處理細(xì)月包或受體。"配體"包含天然和合成配體，例如，細(xì)胞因子、細(xì)胞因子變體、類似物、突變蛋白質(zhì)和衍生自抗體的結(jié)合組合物。"配體"還包含小分子，例如，細(xì)胞因子的肽才莫擬物(peptidemimetics)和抗體的肽沖莫擬物。"激活"可以指如由內(nèi)部機(jī)制以及由外部或環(huán)境因素調(diào)節(jié)的細(xì)胞激活。例如，細(xì)胞、組織、器官或生物的"應(yīng)答"包含生物化學(xué)或生理學(xué)行為中的變化，例如，在生物區(qū)室內(nèi)的濃度、密度、附著或遷移，基因表達(dá)率，或分化狀態(tài)，其中所述變化與激活、刺激或處理相關(guān)，或與內(nèi)部基質(zhì)例如遺傳編程相關(guān)。分子的"活性"可以描述或指分子與配體或受體的結(jié)合，催化活性；刺激基因表達(dá)或細(xì)胞信號傳導(dǎo)、分化或成熟的能力；抗原活性，其他分子活性的調(diào)節(jié)等。分子的"活性，，還可以指調(diào)節(jié)或維持細(xì)胞與細(xì)胞相互作用例如附著中的活性，或維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)例如細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架中的活性。"活性"還可以指比活性，例如，[催化活性]/[mg蛋白質(zhì)]、或[免疫活性]/[mg蛋白質(zhì)]、生物區(qū)室中的濃度等。"增殖活性，，包含促進(jìn)例如正常細(xì)胞分裂以及癌癥、肺瘤、發(fā)育異常、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移或血管發(fā)生，為例如正常細(xì)胞分裂以及癌癥、腫瘤、發(fā)育異常、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移或血管發(fā)生所必需的，或與例如正常細(xì)胞分裂以及癌癥、腫瘤、發(fā)育異常、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移或血管發(fā)生特異性相關(guān)的活性。"施用"和"處理"當(dāng)應(yīng)用于動物、人、實(shí)^^受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物學(xué)流體時，指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細(xì)胞、組織、器官或生物學(xué)流體的接觸。"施用"和"處理"可以指例如治療、藥物代謝動力學(xué)、診斷、研究和實(shí)驗(yàn)方法。細(xì)胞的處理包含試劑與細(xì)胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細(xì)胞接觸。"施用"和"處理"還意指通過試劑、診斷、結(jié)合組合物或通過另一種細(xì)胞體外和先體外后體內(nèi)處理例如細(xì)胞。"處理，，當(dāng)應(yīng)用于人、獸醫(yī)學(xué)或研究受試者時，指治療處理、預(yù)防或預(yù)防性(preventative)措施，研究和診斷應(yīng)用。"處理，，當(dāng)應(yīng)用于人、獸醫(yī)學(xué)或研究受試者，或細(xì)胞、組織或器官時，包含IL-23激動劑或IL-23拮抗劑與人或動物受試者、細(xì)胞、組織、生理區(qū)室或生理學(xué)流體的接觸。"細(xì)胞的處理"還包含其中IL-23激動劑或IL-23拮抗劑例如在流體相或膠體相中接觸IL-23受體(IL-23R/IL-12R|31異二聚體)的情況，以及其中激動劑或拮抗劑不接觸細(xì)胞或受體的情況。如本文所使用的，術(shù)語"抗體"指顯示所需生物學(xué)活性的任何形式的抗體或其片段。因此，它以最廣泛的含義使用，并且具體包含單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們顯示所需生物學(xué)活性。如本文所使用的，術(shù)語"IL-23p19結(jié)合片段"或"其結(jié)合片段"包含這樣的抗體片段或衍生物，其仍基本上保留其抑制IL-23pl9活性的生物學(xué)活性。因此，術(shù)語"抗體片段"或IL-23pl9結(jié)合片段指全長抗體的部分，一般是其抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如，sc-Fv;和由抗體片段形成的多特異性抗體。一般地，結(jié)合片段或衍生物保留至少10y。的其IL-23pl9抑制活性。優(yōu)選地，結(jié)合片段或衍生物保留至少25%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%(或更多)的其IL-23pl9抑制活性，盡管具有足夠親和力以發(fā)揮所需生物學(xué)作用的任何結(jié)合片段將是有用的。還預(yù)期IL-23p19結(jié)合片段可以包括基本上不改變其生物學(xué)活性的保守氨基酸置換。如本文所使用的，術(shù)語"單克隆抗體"指得自基本上均質(zhì)抗體群體的抗體，即，構(gòu)成群體的個別抗體是相同的，除了可以以小量存在的可能天然存在的突變外。單克隆抗體是高特異性的，針對單個抗原表位。相比之下，常規(guī)(多克隆)抗體制劑一般包括針對不同表位(或?qū)ζ涮禺?的許多抗體。修飾詞"單克隆，，指如得自抗體的基本上均質(zhì)群體的抗體特征，并且不應(yīng)被解釋為需要通過任何具體方法生產(chǎn)抗體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過首先由Kohler等人，(1975)A^fwre256:495描述的雜交瘤方法進(jìn)行制備，或可以通過重組DNA法(參見，例如，美國專利號4,816,567)進(jìn)行制備。"單克隆抗體，，還可以使用例如Clackson等人，(1991)A^we352:624-628和Marks等人，(1991)A/o/.Ao/.222:581-597中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫中進(jìn)行分離。本文的單克隆抗體具體包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)，其中重和/或輕鏈的部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而一條或多條鏈的其余部分與衍生自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此種抗體的片段，只要它們顯示所需生物學(xué)活性(美國專利號4,816,567;和Morrison等人，(1984)尸rac.A^/.爿cadS"'.V&481:6851-6855)。"結(jié)構(gòu)域抗體"是只包含重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的免疫學(xué)功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，2個或更多VH區(qū)與肽接頭共價連接以制備二價結(jié)構(gòu)域抗體。二價結(jié)構(gòu)域抗體的2個Vh區(qū)可以耙向相同或不同抗原。"二價抗體"包含2個抗原結(jié)合部位。在一些情況下，2個結(jié)合部位具有相同抗原特異性。然而，二價抗體可以是雙特異性的(參見下文)。如本文所使用的，術(shù)語"單鏈Fv"或"scFv"抗體指包含抗體的Vh和Vt結(jié)構(gòu)域的抗體片段，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單條多肽鏈中。一般地，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包含在Vh和Vl結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，這使得sFv能夠形成用于抗原結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv的綜述，參見Pluckthun(1994)ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113巻，Rosenburg和Moore編輯Springer-Verlag,NewYork,第269-315頁。本文的單克隆抗體還包括駱駝源化(camelized)單結(jié)構(gòu)域抗體。參見，例如，Muyld飄ans等人(2001)7Ve油腸c/z置Sc/.26:230;Reichmann等人(1999)丄/mww"o/.A^AoA231:25;WO94/04678;W094/25591;美國專利號6，005,079,所述參考文獻(xiàn)在此整體引入作為參考)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含具有修飾的2個Vh結(jié)構(gòu)域從而使得形成單結(jié)構(gòu)域抗體的單結(jié)構(gòu)域抗體。如本文所使用的，術(shù)語"雙抗體"指具有2個抗原結(jié)合部位的小抗體片段，所述片段包含在相同多肽鏈中與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)(Vh-Vl或Vl-Vh)。通過使用太短而不允許相同鏈上的2個結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對并且產(chǎn)生2個抗原結(jié)合部位。雙抗體在例如EP404,097;WO93/11161;和Holliger等人(1993)尸rac.淑/.^tec/.Sc/,f/&490:6444-6448中更充分地描述。關(guān)于工程改造的抗體變體的綜述，一般參見Holliger和Hudson(2005)淑.S她c/mo/.23:1126-1136。如本文所使用的，術(shù)語"人源化抗體"指包含來自非人(例如，鼠)抗體以及人抗體的序列的抗體形式。此種抗體包含衍生自非人免疫球蛋白的最低限度的序列。一般而言，人源化抗體將包含基本上所有至少1個，且一般是2個可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，一般是人免疫球蛋白的那種。當(dāng)必需區(qū)分人源化抗體(例如hum6H12)與親本嚙齒類動物抗體(例如小鼠6H12,或"m6H12")時，給抗體克隆名稱添加前綴"hum"。嚙齒類動物抗體的人源化形式一般將包含親本嚙齒類動物抗體相同的CDR序列，盡管可以包括某些氨基酸置換以增加人源化抗體的親和力或增加人源化抗體的穩(wěn)定性。本發(fā)明的抗體還包括具有修飾的(或阻斷的)Fc區(qū)以提供改變的效應(yīng)子功能的抗體。參見，例如，美國專利號5,624,821;WO2003/086310;WO2005/120571;WO2006/0057702;Presta(2006Z>wgZ)e/Zveo;^ev.58:640-656。此種4奮飾可以用于增強(qiáng)或抑制免疫系統(tǒng)的各種反應(yīng)，在i貪斷和治療中具有可能有益的作用。Fc區(qū)的改變包括氨基酸變化(置換、缺失和插入)、糖基化或去糖基化和添加多個Fc。關(guān)于Fc的變化還可以改變治療抗體中的抗體半衰期，并且較長的半衰期將導(dǎo)致頻率較少的給藥，與伴隨的方便性增加和材料的使用減少。參見Presta(2005)C7/w./wmwwo/.116:731在734-35。術(shù)語"全人抗體，，指只包含人免疫球蛋白蛋白質(zhì)序列的抗體。如果在小鼠、小鼠細(xì)胞或衍生自小鼠細(xì)胞的雜交瘤中生產(chǎn)，那么全人抗體可以包含鼠碳水化合物鏈。類似地，"小鼠抗體"指只包含小鼠免疫球蛋白序列的抗體。如本文所使用的，術(shù)語"高變區(qū)"指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體氨基酸殘基。高變區(qū)包含來自"互補(bǔ)性決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3),和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3);Kabat等人，(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.)和/或來自"高變環(huán)"的那些殘基(即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的殘基26-32(LI)、50-52(L2)和91-96(L3),和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的26-32(HI)、53-55(H2)和96—101(H3);Chothia和Lesk,(1987)乂Mo/.196:901-917)。如本文所使用的，術(shù)語"構(gòu)架"或"FR"殘基指除本文定義為CDR殘基的高變區(qū)殘基外的那些可變結(jié)構(gòu)域殘基。上文的殘基編號涉及Kabat編號系統(tǒng)，并且不必詳細(xì)對應(yīng)于所附的序列表中的序列編號。參見表2和3，其中序列編號參考序列表。"結(jié)合化合物"指能夠與靶結(jié)合的分子、小分子、大分子、多肽、抗體或其片段或類似物、或可溶性受體。"結(jié)合化合物，，還可以指能夠與靶結(jié)合的分子復(fù)合物，例如非共價復(fù)合物，電離分子，和共價或非共價修飾的分子，例如，通過磷酸化、乙?；?、交聯(lián)、環(huán)化或有限切割修飾的。當(dāng)關(guān)于抗體使用時，術(shù)語"結(jié)合化合物"指抗體及其結(jié)合片段。"結(jié)合"指結(jié)合組合物與靶的結(jié)合，其中所述結(jié)合導(dǎo)致結(jié)合組合物的正常布朗運(yùn)動減少，在其中結(jié)合組合物可以溶解或懸浮于溶液中的情況下。"結(jié)合組合物，，指與穩(wěn)定劑、賦形劑、鹽、緩沖劑、溶劑或添加劑組合的，能夠與粑結(jié)合的分子，例如結(jié)合化合物。"保守修飾的變體，，或"保守置換"指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且一般可以制備而不改變所得到的分子的生物學(xué)活性的氨基酸置換。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到，一般而言，多肽的非必需區(qū)中的單個氨基酸置換基本上不改變生物學(xué)活性(參見，例如，Watson等人，A/o/ecw/wSzo/ogyo/G騰,TheBenjamin/CummingsPub.Co.,笫224頁(第4版1987))。此種示例性置換優(yōu)選依照如下表1中所示的那些來進(jìn)行表1<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>如說明書和權(quán)利要求自始至終所使用的，術(shù)語"基本上由......組成"或變形指包括任何所述元件或元件組，并且任選包括具有與所述元件類似或不同性質(zhì)的其他元件，所述其他元件不相當(dāng)大地改變指定給藥方案、方法或組合物的基本或新性質(zhì)。作為非限制性例子，基本上由所迷氨基酸序列組成的結(jié)合化合物還可以包括一種或多種氨基酸，包括一種或多種氨基酸殘基的置換，所述一種或多種氨基酸不相當(dāng)大地影響結(jié)合化合物的性質(zhì)。"有效量"包含足以改善或預(yù)防醫(yī)學(xué)狀況的癥狀或病征的量。有效量還意指足以允許或促進(jìn)診斷的量。關(guān)于特定患者或獸醫(yī)學(xué)受試者的有效量可以依賴于此種因素而變，如待治療的狀況、患者的總體健康、施用的方法途徑和劑量以及副作用嚴(yán)重性(參見，例如，頒發(fā)給Netti等人的美國專利號5,888,530)。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。作用將導(dǎo)致診斷測量或參數(shù)改善至少5%、通常至少10%、更通常至少20%、最通常至少30%、優(yōu)選至少40%、更優(yōu)選至少50%、最優(yōu)選至少60%、理想地至少70%、更理想地至少80%、和最理想地至少90%,其中100%被定義為由正常受試者顯示的診斷參數(shù)(參見，例如，Maynard等人，(1996)^//a"必ooA。/S(9尸s/orGoodC7zmca/尸rac"ce，InterpharmPress,BocaRaton,FL;Dent(2001)Good丄a60ra/10/7GoodC7/m'ca/尸raWce,UrchPubl.,London,UK)。"外源性，，指取決于背景，在生物、細(xì)胞或人體外產(chǎn)生的物質(zhì)。"內(nèi)源性"指取決于背景，在細(xì)胞、生物或人體內(nèi)產(chǎn)生的物質(zhì)。"免疫狀況"或"免疫病癥"包含，例如，病理炎癥、炎性病癥、和自身免疫性病癥或疾病。"免疫狀況"還指感染、持續(xù)感染和增生性狀況，例如癌癥、腫瘤和血管發(fā)生，包括對抗經(jīng)由免疫系統(tǒng)的根除的感染、腫瘤和癌癥。"癌性狀況"包括例如，癌癥、癌細(xì)胞、腫瘤、血管發(fā)生和癌變前狀況例如發(fā)育異常。"炎性病癥"意指這樣的病癥或病理學(xué)狀況，其中所述病理學(xué)整體或部分起因于例如免疫系統(tǒng)的細(xì)胞數(shù)目中的變化，遷移率中的變化，或激活中的變化。免疫系統(tǒng)的細(xì)胞包括例如，T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨嗟細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞(APCs)、樹突細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、或與免疫學(xué)特異性相關(guān)的任何其他細(xì)胞，例如細(xì)胞因子生產(chǎn)性內(nèi)皮或上皮細(xì)胞。"IL-17生產(chǎn)細(xì)胞，，意指不是經(jīng)典TH1型T細(xì)胞或經(jīng)典TH2型細(xì)胞，被稱為TH17細(xì)胞的T細(xì)胞。TH17細(xì)胞在Cua和Kastelein(2006)A^./wmwwo/.7:557-559;Tato和O，Shea(2006)A^fwe441:166-168;Iwakura和Ishigame(2006)J.C/z"./騰W.116:1218-1222中更詳細(xì)地討論，所述參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容在此整體引入作為參考。"IL-17生產(chǎn)細(xì)胞，，還意指表達(dá)美國專利申請公開號2004/0219150的表10B的基因或多肽(例如，促分裂原應(yīng)答性P蛋白；趨化因子配體2;白細(xì)胞介素17(IL-17);轉(zhuǎn)錄因子RAR相關(guān)的；和/或細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)3抑制劑)的T細(xì)胞，所述專利的公開內(nèi)容在此整體引入作為參考，其中通過IL-23激動劑處理的表達(dá)大于用IL-12激動劑的處理，其中"大于"如下定義。用IL-23激動劑的表達(dá)為用IL-12處理的一般至少5倍、一般至少10倍、更一般至少15倍、最一般至少20倍、優(yōu)選至少25倍、和最優(yōu)選至少30倍。表達(dá)可以例如用基本上純的IL-17生產(chǎn)細(xì)胞群體處理進(jìn)行測量。此外，"IL-17生產(chǎn)細(xì)胞，，包括在細(xì)胞發(fā)育或細(xì)胞分化途徑中定型為分化成如上定義的IL-17生產(chǎn)細(xì)胞的^且細(xì)力包或前體細(xì)力包。關(guān)于IL-17生產(chǎn)細(xì)胞的祖細(xì)胞或前體細(xì)胞可以在引流(draining)淋巴結(jié)(DLN)中找到。此外，"IL-17生產(chǎn)細(xì)胞"包含如上定義的IL-17生產(chǎn)細(xì)胞，其已例如通過佛波酯、離子載體和/或致癌劑激活，進(jìn)一步分化，貯存，冷凍，脫水，滅活，例如通過細(xì)胞凋亡、蛋白酶解、或脂質(zhì)氧化部分降解，或例如通過重組技術(shù)修飾。如本文所使用的，術(shù)語"分離的核酸分子"指被鑒定并且與至少一種污染核酸分子分開的核酸分子，在抗體核酸的天然來源中它一般與所述污染核酸分子結(jié)合。分離的核酸分子不同于其中它在自然界中發(fā)現(xiàn)的形式或設(shè)置。因此分離的核酸分子區(qū)別于當(dāng)它存在于天然細(xì)胞中時的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括在一般表達(dá)抗體的細(xì)胞中包含的核酸分子，其中例如核酸分子在染色體定位中不同于天然細(xì)胞的那種。表達(dá)"控制序列"指可操作地連接的編碼序列在特定宿主生物中表達(dá)所必需的DNA序列。適合于原核生物的控制序列例如包括啟動子、任選地操縱基因序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動子、多腺苦酸化信號和增強(qiáng)子。當(dāng)將核酸置于與另一種核酸序列的功能關(guān)系內(nèi)時，它是"可操作地連接的"。例如，關(guān)于前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA與關(guān)于多肽的DNA可操作地連接，如果它表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白的話；啟動子或增強(qiáng)子與編碼序列可操作地連接，如果它影響序列的轉(zhuǎn)錄的話；或核糖體結(jié)合位點(diǎn)與編碼序列可操作地連接，如果它^皮這樣放置以促進(jìn)翻譯的話。一般地，"可操作地連接的"意指被連接的DNA序列是鄰接的，并且在分泌前導(dǎo)序列的情況下，是鄰接的和在閱讀相(readingphase)中。然而，增強(qiáng)子不必是鄰接的。通過在方便的限制位點(diǎn)上連接來實(shí)現(xiàn)相連。如果此種位點(diǎn)不存在，那么依照常規(guī)實(shí)踐使用合成寡核普酸銜接子或接頭。如本文所使用的，表達(dá)"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"和"細(xì)胞培養(yǎng)物"可互換使用，并且所有此種名稱都包括后代。因此，單詞"轉(zhuǎn)化體"和"轉(zhuǎn)化的細(xì)胞"包括原代受試細(xì)胞和由其衍生的培養(yǎng)物而不考慮轉(zhuǎn)移數(shù)目。還應(yīng)當(dāng)理解由于故意或非有意的突變，所有后代在DNA含量方面可能不是精確相同的。包括了具有與最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選的相同的功能或生物學(xué)活性的突變體后代。當(dāng)預(yù)期不同名稱時，它根據(jù)上文將是清楚的。如本文所使用的，"聚合酶鏈反應(yīng)"或"PCR"指其中微量核酸-RNA和/或DNA的特定部分如例如美國專利號4,683,195中所述進(jìn)行擴(kuò)增的程序或技術(shù)。一般地，來自目的區(qū)域末端或超出所述末端的序列信息需要是可獲得的，從而使得可以設(shè)計寡核苷酸引物；這些引物在序列方面將與待擴(kuò)增模板的相反鏈相同或相似。2個引物的5，末端核苷酸可以與擴(kuò)增材料的末端一致。PCR可以用于擴(kuò)增特定DNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列、和由總細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄的cDNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等。一般參見Mullis等人(1987)CoWSpr/"g版Zw^wa"亡S/o/.51:263;Erlich,纟扁專專(1989)PCRTECHNOLOGY(StocktonPress,N.Y.)如本文所4吏用的，PCR^皮一見為用于擴(kuò)增核酸測試樣品的一個但不是唯一的核酸聚合酶反應(yīng)法的例子，所述方法包括使用已知核酸作為引物和核酸聚合酶以擴(kuò)增或產(chǎn)生核酸的特定部分。如本文所使用的，術(shù)語"種系序列"指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可以使用未重排免疫球蛋白DNA的任何合適來源。"抑制劑"和"拮抗劑"或"激活劑"和"激動劑"分別指例如用于激活例如配體、受體、輔因子、基因、細(xì)胞、組織或器官的抑制或激活分子。例如基因、受體、配體或細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑是改變基因、受體、配體或細(xì)胞的活性的分子，其中活性在其調(diào)節(jié)性質(zhì)方面可以被激活、抑制或改變。調(diào)節(jié)劑可以單獨(dú)起作用，或它可以使用輔因子，例如蛋白質(zhì)、金屬離子或小分子。抑制劑是減少、阻斷、阻止、延遲激活、滅活、脫敏、或下調(diào)例如基因、蛋白質(zhì)、配體、受體或細(xì)胞的化合物。激活劑是增加、激活、促進(jìn)、增強(qiáng)激活、敏化、或上調(diào)例如基因、蛋白質(zhì)、配體、受體或細(xì)胞的化合物。抑制劑也可以被定義為減少、阻斷或滅活組成型活性的組合物。"激動劑"是與靶相互作用以引起或促進(jìn)靶激活中的增加的化合物。"拮抗劑"是對抗激動劑的作用的化合物。拮抗劑阻止、減少、抑制或中和激動劑的活性。拮抗劑還可以阻止、抑制或減少靶例如靶受體的組成型活性，甚至在不存在經(jīng)鑒定的激動劑時。為了檢查抑制程度，例如，包含給定例如蛋白質(zhì)、基因、細(xì)胞或生物的樣品或測定用潛在的激活或抑制劑處理，并且與不使用試劑的對照樣品比較。對照樣品，即不用試劑處理，被指定100%的相對活性值。當(dāng)相對于對照活性值是約90%或更少、一般85%或更少、更一般80%或更少、最一般75%或更少、通常70%或更少、更通常65%或更少、最通常60%或更少、一般55%或更少、通常50%或更少、更通常45%或更少、最通常40%或更少、優(yōu)選35%或更少、更優(yōu)選30%或更少、再更優(yōu)選25%或更少、和最優(yōu)選小于25%時，達(dá)到抑制。當(dāng)相對于對照活性值是約110%、一般至少120%、更一般至少140%、更一般至少160%、通常至少180%、更通常至少2倍、最通常至少2.5倍、一般至少5倍、更一般至少10倍、優(yōu)選至少20倍、更優(yōu)選至少40倍、和最優(yōu)選高于40倍時，達(dá)到激活。激活或抑制中的終點(diǎn)可以如下進(jìn)行監(jiān)控。例如細(xì)胞、生理學(xué)流體、組織、器官和動物或人受試者的激活、抑制和對處理的應(yīng)答可以通過終點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)控。終點(diǎn)可以包含預(yù)定量或百分比的例如炎癥、致癌性、或細(xì)胞脫?；蚍置跇?biāo)記(indicia),例如細(xì)胞因子、有毒氧或蛋白酶的釋放。終點(diǎn)可以包含例如預(yù)定量的離子流或運(yùn)輸；細(xì)胞遷移；細(xì)胞粘附；細(xì)胞增殖；轉(zhuǎn)移潛力；細(xì)胞分化；和表型中的變化，例如，涉及炎癥、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期或轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)中的變化(參見，例如，Knight(2000X4"".C7/仏丄a6.30:145-158;Hood和Cheresh(2002)A^^w""ev.Owcw2:91-100;Timme等人，(2003)Cwr.i>wgT^ge"4:251-261;Robbins和Itzkowitz(2002)Mec/.C/,".A^W/z爿w.86:1467-1495;Grady4口Markowitz(2002)iev.Gewom/cs/fww.3:101-128;Bauer等人，(2001)G/za36:235-243;Stanimirovic和Satoh(2000)Sra/"尸"Ao/.10:113-126)。抑制終點(diǎn)一般是對照的75%或更少、優(yōu)選對照的50%或更少、更優(yōu)選對照的25%或更少、和最優(yōu)選對照的10%或更少。一般地，激活終點(diǎn)是對照的至少150%、優(yōu)選對照的至少2倍、更優(yōu)選對照的至少4倍、和最優(yōu)選對照的至少10倍。"配體，，指例如可以充當(dāng)受體的激動劑或拮抗劑的小分子、肽、多肽和膜相關(guān)或膜結(jié)合分子、或其復(fù)合物。"配體"還包含不是激動劑或拮抗劑，但可以與受體結(jié)合的試劑。此外，"配體"包括這樣的膜結(jié)合配體，其已例如通過化學(xué)或重組方法變成可溶形式的膜結(jié)合配體。按照慣例，當(dāng)配體是在笫一種細(xì)胞上膜結(jié)合的時，受體通常存在于第二種細(xì)胞上。第二種細(xì)胞可以具有與第一種細(xì)胞相同或不同的特性。配體或受體可以完全是細(xì)胞內(nèi)的，即，它可以位于胞質(zhì)、核或一些其他細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。配體或受體可以改變其定位，例如從細(xì)胞內(nèi)區(qū)室至質(zhì)膜的外表面。配體和受體的復(fù)合物被稱為"配體受體復(fù)合物"。當(dāng)配體和受體涉及信號傳導(dǎo)途徑時，配體存在于信號傳導(dǎo)途徑的上游位置處而受體存在于下游位置處。提供"小分子"用于毛嚢的生理學(xué)和病癥處理。"小分子"被定義為具有小于10kD、一般小于2kD、和優(yōu)選小于lkD的分子量的分子。小分子包括但不限于，無機(jī)分子、有機(jī)分子、包含無機(jī)組分的有機(jī)分子、包含放射性原子的分子、合成分子、肽模擬物和抗體模擬物(antibodymimetics)。作為治療劑，小分子可以比大分子對細(xì)胞更可透過、對降解更不易感、和更不易于引發(fā)免疫應(yīng)答。小分子，例如抗體和細(xì)胞因子的肽模擬物，以及小分子毒素得到了描述(參見，例如，Casset等人，(2003)Aoc/zem.3/—,紐C謹(jǐn)應(yīng)w.307:198-205;Muyldermans(2001)丄5,o&c/mo/.74:277-302;Li(2000)S/c^c/wo/.18:1251-1256;Apostolopoulos等人，(2002)Cwr.Met/.C&w.9:411-420;Monfardini等人，(2002)Cwr.Z)饑8:2185-2199;Domingues等人，(1999)to5zo/.6:652-656;Sato和Sone(2003)Aoc/zem.J.371:603-608;頒發(fā)給Stewart等人的美國專利號6,326,482)。"特異性地，，或"選擇性地，，結(jié)合當(dāng)涉及配體/受體、抗體/抗原、或其他結(jié)合對時，指作為蛋白質(zhì)和其他生物產(chǎn)品的異質(zhì)群體中蛋白質(zhì)存在的決定因素的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定條件下，指定配體與特定受體結(jié)合并且不以顯著量與樣品中存在的其他蛋白質(zhì)結(jié)合。預(yù)期方法的抗體、或衍生自抗體的抗原結(jié)合部位的結(jié)合組合物與其抗原結(jié)合，其親和力為無關(guān)抗原的親和力的至少2倍、優(yōu)選至少10倍、更優(yōu)選至少20倍、和最優(yōu)選至少100倍。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體將具有大于約109升/摩爾的親和力，如例如通過Scatchard分析(Munsen等人，(1980)Aoc/ze附.107:220-239)測定的。如本文所使用的，術(shù)語"免疫調(diào)諧劑"指抑制或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的天然或合成試劑。免疫應(yīng)答可以是體液或細(xì)胞應(yīng)答。免疫調(diào)諧劑包含免疫抑制劑或抗炎劑。如本文所寸吏用的，"免疫抑制劑(immunosuppressiveagent)"、"免疫抑制藥物"或"免疫抑制劑(immunosuppressant)"是在免疫抑制治療中用于抑制或阻止免疫系統(tǒng)活性的治療劑。在臨床上它們用于阻止移植的器官和組織(例如，骨髓、心臟、腎、肝)排斥，和/或自身免疫性疾病或最可能是自身免疫起源的疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、全身性紅斑狼瘉、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化)治療中。免疫抑制藥物可以分類為4個組糖皮質(zhì)激素類細(xì)胞抑制劑；抗體(包括生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(BiologicalResponseModifiers)或DMARDs);作用于親免素的藥物；其他藥物，包括在增生性病癥治療中使用的已知化學(xué)治療劑。特別地，對于多發(fā)性硬化，本發(fā)明的抗體可以與稱為copaxones的新類型髓鞘結(jié)合蛋白樣治療劑結(jié)合施用。"抗炎劑"或"消炎藥"用于表示類固醇或非類固醇類治療劑。類固醇也稱為皮質(zhì)類固醇是緊密類似皮質(zhì)醇的藥物，所述皮質(zhì)醇是由腎上腺天然生產(chǎn)的激素。類固醇用作關(guān)于某些炎性狀況的主要治療，例如系統(tǒng)性脈管炎(血管炎癥)；和肌炎(肌肉炎癥)。類固醇還可以選擇性用于治療炎性狀況例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(在身體兩側(cè)上的關(guān)節(jié)中發(fā)生的慢性炎癥性關(guān)節(jié)炎)；全身性紅斑狼瘡(由異常免疫系統(tǒng)功能引起的泛發(fā)性疾病)；Sj6gren氏綜合征(引起眼睛干澀和口干的慢性病癥)。非類固醇消炎藥，通?？s寫為NSAIDs，是具有止痛、退熱和抗炎作用的藥物-它們減少疼痛、發(fā)熱和炎癥。術(shù)語"非類固醇"用于區(qū)別這些藥物與類固醇，所述藥物(在廣泛范圍的其他作用中)具有類似的類二十烷酸抑制、抗炎作用。NSAIDs—般指示用于下列狀況的癥狀緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；骨關(guān)節(jié)炎；炎性關(guān)節(jié)病(例如強(qiáng)直性脊柱炎、牛皮痺性關(guān)節(jié)炎、Reiter氏綜合征)；急性痛風(fēng)；痛經(jīng)；轉(zhuǎn)移性骨痛；頭痛和偏頭痛；手術(shù)后疼痛；由于炎癥和組織損傷的輕度至中等疼痛；發(fā)熱；和腎絞痛。NSAIDs包括水楊酸鹽、芳基鏈烷酸(arlyalknoicacids)、2-芳基丙酸(profens)、N-芳基鄰氨基苯甲酸(滅酸)、昔康類(oxicams)、昔布類(coxibs)和N-磺酰苯胺(sulphonanilides)。II.概要本發(fā)明提供了工程改造的抗IL-23抗體，及其治療炎性、自身免疫和增生性病癥的用途。許多細(xì)胞因子在神經(jīng)學(xué)病癥的病理學(xué)或修復(fù)中具有作用。IL-6、IL-17、干擾素y(IFNy)、和粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)已與多發(fā)性硬化相關(guān)(Matusevicius等人，(19995:101-104;Lock等人,(2002)淑匿她d.8:500-508)。IL國la、IL-1卩和轉(zhuǎn)化生長因子卩l(xiāng)(TGF-卩1)在ALS、帕金森氏病和阿爾茨海默氏病中起作用(Hoozemans等人，(2001)￡bcp.Gera"M/.36:559-570;Griffin和Mrak(2002)脂.72:233-238;Ilzecka等人，(2002)C,h"e20:239-243)。TNF畫a、IL-1卩、IL國6、IL-8、干擾素y(IFNy)和IL-17看起來調(diào)節(jié)針對腦缺血的應(yīng)答(參見，例如，Kostulas等人，(1999)30:2174-2179;Li等人，(2001)臉腳/麵謹(jǐn)/.116:5-14)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與ALS相關(guān)(Cleveland和Rothstein(2001)淑,2:806-819)。炎性腸病癥例如克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、乳糜瀉和過敏性腸綜合征，由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和細(xì)胞因子介導(dǎo)。例如，克羅恩氏病與增加的IL-12和IFNy相關(guān)，而潰瘍性結(jié)腸炎與增加的IL-5、IL-13和轉(zhuǎn)化生長因子(3(TGF(3)相關(guān)。IL-17表達(dá)還可以在克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎中增加(參見，例如，Podolsky(2002)臉w她d347:417-429;Bouma和Strober(2003)淑.紐./畫,/.3:521-533;Bhan等人，(1999)/mmzmo/.169:195-207;Hanauer(1996)A^wE"g/.丄A/ed334:841-848;Green(2003)T7z"匿"362:383-391;McMa廳(2003)Wew五"g/.丄Med348:2573-2574;Horwitz和Fisher(2001)五"g/.A/ed344:1846-1850;Andoh等人，(2002)/"亡J.Mo/.10:631-634;Nielsen等人，(2003)Scam/./.Go^*oe"^x>/.38:180-185;Fujino等人，(2003)Gz^52:65-70)。皮膚、關(guān)節(jié)、CNS的炎性疾病以及增生性病癥引發(fā)類似的免疫應(yīng)答，因此IL-23阻斷應(yīng)提供這些免疫介導(dǎo)的炎性病癥的抑制，而不構(gòu)成宿主對抗全身性感染的能力。拮抗IL-23應(yīng)減輕與炎性腸病、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和特應(yīng)性皮炎相關(guān)的炎癥。IL-23抑制劑的使用還將提供增生性病癥例如癌癥，和自身免疫性病癥例如多發(fā)性硬化、I型糖尿病和SLE的抑制。IL-23在這些各種病癥中的描述可以在下述公開的PCT申請中找到WO04/081190;WO04/071517;WO00/53631;和WO01/18051，所有所述專利都引入本文作為參考。IL-23的p19亞基是造血細(xì)胞因子的'長鏈，家族成員(Oppmann等人(2000)同上)，并且包含稱為A、B、C和D的4個^真充的(packed)a螺旋，具有上-上-下-下拓樸結(jié)構(gòu)。4個螺旋通過3個多肽環(huán)進(jìn)行連接。A-B和C-D環(huán)被制作得相對長，因?yàn)樗鼈冞B接平行螺旋。短B-C環(huán)連接反向平行的B和C螺旋。IL-23的p19亞基是螺旋狀細(xì)胞因子的IL-6家族成員。這個細(xì)胞因子家族通過3個保守表位(部位I、II和III;Bravo和Heath(2000)J.19:2399-2411)與其同族受體結(jié)合。p19亞基與3個細(xì)胞因子受體亞基相互作用以形成感受態(tài)信號傳導(dǎo)復(fù)合物。當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時，p19亞基首先與p40亞基形成復(fù)合物，它與IL-12共有所述p40亞基。如上所述，pl9p40復(fù)合物作為異二聚蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分泌，并且稱為IL-"(參見，例如，Oppmann等人，同上)。轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-"信號所需的細(xì)胞受體復(fù)合物由IL-6/IL-12細(xì)胞因子家族的tall信號傳導(dǎo)受體亞基的2個成員組成IL-23特異性IL-23R(參見，例如Parham等人，同上)和與IL-12共有的IL-12Rbl。對'長鏈，細(xì)胞因子/受體識別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的了解已顯示，盡管大面積的蛋白質(zhì)表面被隱藏在細(xì)胞因子-受體復(fù)合物的構(gòu)造中，但相互作用的親和力受少數(shù)、通常緊密聚簇的氨基酸殘基控制，所述氨基酸殘基在結(jié)合界面的中心內(nèi)形成能量'熱點(diǎn)，。支配大蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面的結(jié)合能的殘基身份已稱為'功能表位，。相互作用的親和力(和因此的生物學(xué)特異性)因而由配體和受體的功能表位的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性限定。詳細(xì)的誘變研究已顯示構(gòu)成細(xì)胞因子和受體的功能表位的最重要?dú)埢鞘杷越佑|，其涉及非極性側(cè)鏈例如色氨酸、非極性側(cè)鏈的脂族組分或多肽主鏈。非極性'核心，由對結(jié)合能較不重要的極性殘基環(huán)(halo)圍繞。動力學(xué)研究指出功能表位的主要作用是通過減少復(fù)合物的解離速率來穩(wěn)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。已建議細(xì)胞因子和受體之間的初始接觸受隨機(jī)擴(kuò)散或蛋白質(zhì)表面'滾動，控制，產(chǎn)生許多不穩(wěn)定的接觸。當(dāng)受體和配體的功能表位連接時，復(fù)合物隨后#:穩(wěn)定化(參見，例如Bravo和Heath,同上)。III.IL-23特異性抗體的產(chǎn)生可以使用用于產(chǎn)生單克隆抗體的任何合適的方法。例如，可以用連接或未連接(例如，天然存在的)形式的IL-23異二聚體，或其片段免疫受體?？梢允褂萌魏魏线m的免疫接種方法。此種方法可以包括佐劑、其他免疫刺激劑、重復(fù)加強(qiáng)免疫接種、和一種或多種免疫接種途徑的使用。任何合適的IL-23來源都可以用作免疫原用于產(chǎn)生對p19亞基特異的非人抗體，本文公開的組合物和方法。此種形式包括但不限于，全蛋白，包括通過本領(lǐng)域已知的重組、合成、化學(xué)或酶促降解方法產(chǎn)生的連接和天然存在的異二聚體、一種或多種肽和表位。足以產(chǎn)生生物學(xué)活性抗體的任何形式的抗原都可以用于產(chǎn)生抗體。因此，引發(fā)抗原可以是單個表位、單個表位、或單獨(dú)或與本領(lǐng)域已知的一種或多種免疫原性增強(qiáng)劑組合的整個蛋白質(zhì)。引發(fā)抗原可以是分離的全長蛋白質(zhì)、細(xì)胞表面蛋白(例如，用由至少部分抗原轉(zhuǎn)染的細(xì)胞免疫)、或可溶蛋白(例如，只用蛋白質(zhì)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域部分免疫)?？乖梢栽诨蛐揎椉?xì)胞中產(chǎn)生。編碼抗原的DNA可以是基因組或非基因組的(例如cDNA),且編碼至少部分細(xì)力包外結(jié)構(gòu)域。如本文所〗吏用的，術(shù)語"部分"指適當(dāng)?shù)刈钚?shù)目的氨基酸或核酸，以構(gòu)成目的抗原的免疫原性表位?？梢允褂眠m合于轉(zhuǎn)化目的細(xì)胞的任何遺傳載體，包括但不限于，腺病毒載體、質(zhì)粒、和非病毒載體例如陽離子脂質(zhì)。任何合適的方法都可以用于引發(fā)具有抑制IL-23的所需生物學(xué)性質(zhì)的抗體。需要由各種哺乳動物宿主例如小鼠、嚙齒類動物、靈長類動物、人等制備單克隆抗體(mAbs)。用于制備此種單克隆抗體的技術(shù)描述可以在例如下述參考文獻(xiàn)中找到例如，Stites等人，(編輯)BasicandClinicalImmunology(第4版)LangeMedicalPublications,LosAltos，CA,以及其中引用的參考文獻(xiàn)；Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManualCSHPress;Goding(1986)MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice(2ded.)AcademicPress,NewYork,NY。因此，單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的多種技術(shù)來獲得。一般地，來自用所需抗原免疫的動物的脾細(xì)胞通常通過與骨髓瘤細(xì)胞融合進(jìn)行無限增殖化。參見Kohler和Milstein(1976),//wmmo/.6:511-519。無限增殖化的可替代方法包括用EB病毒、癌基因或逆轉(zhuǎn)錄病毒、或本領(lǐng)域已知的其他方法轉(zhuǎn)化。參見，例如，Doyle,等人(編輯，1994和周期增刊)CellandTissueCulture:LaboratoryProcedures,JohnWileyandSons,NewYork,NY。才尤具有只于4元原的所需特異性和親和力的抗體生產(chǎn)篩選起于單一無限增殖化細(xì)胞的集落，并且通過此種細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體得率可以通過各種技術(shù)得到增強(qiáng)，包括注射入脊推動物宿主的腹膜腔內(nèi)。可替代地，根據(jù)例如由Huse等人，(1989)246:1275-1281概述的一般規(guī)程，通過篩選來自人B細(xì)胞的DNA文庫可以分離編碼單克隆抗體或其結(jié)合片段的DNA序列。其他合適的技術(shù)涉及在噬菌體或相似載體中選擇抗體文庫。參見，例如，Huse等人，246:1275-1281(1989);和Ward等人，A^we341:544-546(1989)。本發(fā)明的多肽和抗體可以連同或不連同力務(wù)飾佳:用，包括嵌合或人源化抗體。經(jīng)常地，多肽和抗體將通過與提供可檢測信號的物質(zhì)共價或非共價連接進(jìn)行標(biāo)記。廣泛多樣的標(biāo)記和綴合技術(shù)是已知的，并且在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中廣泛報道。合適的標(biāo)記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、磁性顆粒等。教導(dǎo)此種標(biāo)記使用的專利包括美國專利號3，817,837;3,850,752;3，939，350;3,996,345;4,277,437;4,275,149;和4,366,241。同樣，可以生產(chǎn)重組免疫球蛋白，參見，Cabilly美國專利號4,816,567;和Queen等人(1989)A^7爿cadt/&486:10029-10033;或可以在轉(zhuǎn)基因小鼠中制備，參見Mendez等人(1997)A/^wt^15:146-156;還參見Abgenix和Medarex技術(shù)。針對IL-23的預(yù)定片段的抗體或結(jié)合組合物可以通過用多肽、片段、肽或表位與載體蛋白質(zhì)的綴合物免疫接種動物來產(chǎn)生。單克隆抗體由分泌所需抗體的細(xì)胞制備?？梢跃团c正?；蛉毕菪虸L-23的結(jié)合篩選這些抗體。通常通過ELISA測定的，這些單克隆抗體通常將以至少約1[iM的Kd結(jié)合、更通常至少約300nM、一般至少約30nM、優(yōu)選至少約10nM、更優(yōu)選至少約3nM或更佳。合適的非人抗體還可以使用下文實(shí)施例5中描述的生物學(xué)測定進(jìn)行鑒定。IV.IL-23特異性抗體的人源化任何合適的非人抗體都可以用作關(guān)于高變區(qū)的來源。關(guān)于非人抗體的來源包括但不限于，鼠、兔類動物(Lagomorphs)(包括兔)、牛和靈長類動物。在極大程度上，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的高變區(qū)殘基被來自具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)的高變區(qū)殘基替換，所述非人物種例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可以包含在受體抗體或供體抗體中未找到的殘基。制備這些修飾以進(jìn)一步改善所需生物學(xué)活性的抗體表現(xiàn)。關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見Jones等人(1986)Atowe321:522-525;Reichmann等人(1988)A^w^332:323-329;和Presta(1992)Cwr.Sz'o/.2:593-596。關(guān)于重組改造抗體的方法已例如由Boss等人(美國專利號4,816,397),Cabilly等人(美國專利號4,816,567),Law等人(歐洲專利申請公開號438310)和Winter(歐洲專利申請公開號239400)描述。人源化抗IL-23抗體的氨基酸序列變體通過將合適的核苷酸變化引入人源化抗IL-23抗體DNA內(nèi)或通過肽合成來制備。此種變體包括，例如，來自對于人源化抗IL-23F(ab)顯示的氨基酸序列(例如，如SEQIDNos:l和2中)內(nèi)的殘基的缺失、和/或插入到所述殘基內(nèi)和/或所述殘基的置換。制備缺失、插入和置換的任何組合以獲得最終構(gòu)建體，前提是所述最終構(gòu)建體具有所需特征。氨基酸變化還可以改變?nèi)嗽椿笽L-23抗體的翻譯后加工，例如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。用于鑒定作為用于誘變的優(yōu)選位置的人源化抗IL-23pl9抗體多肽的某些殘基或區(qū)域的有用方法被稱為"丙氨酸分區(qū)誘變"，如由Cunningham和Wells(1989)244:1081-1085描述的。此處，殘基或靼殘基組^皮鑒定(例如，帶電殘基例如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且被中性或帶負(fù)電的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)替換，以影響氨基酸與IL-23抗原的相互作用。顯示對置換的功能敏感性的氨基酸殘基隨后通過在置換位點(diǎn)處或?qū)τ谥脫Q位點(diǎn)引入進(jìn)一步或其他變體進(jìn)行改善。因此，盡管用于引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)定的，但突變自身的性質(zhì)無需是預(yù)定的。例如，為了分析給定位點(diǎn)處的突變表現(xiàn)，在耙密碼子或區(qū)域處進(jìn)行Ala分區(qū)或隨機(jī)誘變，并且就所需活性篩選表達(dá)的人源化抗IL-23pl9抗體變體。氨基酸序列插入包括長度為1個殘基至包含100個或更多殘基的多肽的氨基和/或羧基末端融合物，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N末端曱硫氨酰殘基的人源化抗IL-23抗體或與附加表位融合的抗體。人源化抗IL-23抗體分子的其他插入變體包括酶或多肽與人源化抗IL-23抗體的N或C末端的融合物，所述多肽增加抗體的血清半衰期。另一種類型的變體是氨基酸置換變體。這些變體在人源化抗IL-23pl9抗體分子中具有至少一個氨基酸殘基被去除并且在其位置中插入不同殘基。對于置換誘變最感興趣的位點(diǎn)包括高變環(huán)，但FR改變也是預(yù)期的。涉及抗原結(jié)合的高變區(qū)殘基或FR殘基一般以相對保守的方式進(jìn)行置換。抗體的另一種類型的氨基酸變體改變抗體的最初糖基化模式。改變意指缺失抗體中發(fā)現(xiàn)的一個或多個碳水化合物部分，和/或添加抗體中不存在的一個或多個糖基化位點(diǎn)?？贵w的糖基化一般是N聯(lián)或O聯(lián)的。N聯(lián)指碳水化合物部分與天冬酰胺殘基側(cè)鏈的附著。其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，是關(guān)于碳水化合物部分與天冬酰胺側(cè)鏈的酶促附著的識別序列。因此，多肽中這些三肽序列中任一個的存在產(chǎn)生潛在糖基化位點(diǎn)。O聯(lián)糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺(aceylgalactosamine)、半乳糖或木糖之一與羥基氨基酸、最通常為絲氨酸或蘇氨酸的附著，盡管5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸也可以使用。給抗體添加糖基化位點(diǎn)通過下述方便地完成改變氨基酸序列從而使得它包含上述三肽序列中的一種或多種(對于N聯(lián)糖基化位點(diǎn))。改變還可以通過下述進(jìn)行給原始抗體的序列添加一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基，或經(jīng)由給原始抗體的序列置換一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(對于O聯(lián)糖基化位點(diǎn))。再另一種類型的氨基酸變體是殘基置換以提供最終人源化抗體的更大化學(xué)穩(wěn)定性。例如，天冬酰胺(N)殘基可以進(jìn)行改變，以減少在嚙齒類動物CDR內(nèi)的任何NG序列處形成異天冬氨酸(isoaspartate)的可能性。在一個實(shí)施方案中，使天冬酰胺變成谷氨酰胺(Q)。異天冬氨酸形成可能使抗體與其靶抗原的結(jié)合變?nèi)酰蛲耆∠贵w與其靶抗原的結(jié)合。Presta(2005)丄是rgyC/z"./mmwwo/.116:731在734。此外，嚙齒類動物CDRs中的曱硫氨酸殘基可以進(jìn)行改變，以減少甲硫氨酸碌u會氧化的可能性，所述氧化可以減少抗原結(jié)合親和力并且還有助于最終抗體制劑中的分子異質(zhì)性。同前。在一個實(shí)施方案中，使甲硫氨酸變成丙氨酸(A)。隨后篩選具有此種置換的抗體，以確保所述置換不使IL-23p19結(jié)合親和力減少至無法接受的水平。編碼人源化IL-23特異性抗體的氨基酸序列變體的核酸分子通過本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行制備。這些方法包括但不限于，從天然來源中分離(在天然存在的氨基酸序列變體的情況下)，或通過人源化抗IL-23pl9抗體的早期制備的變體或非變體形式的寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR諸變和盒式誘變制備。一般地，人源化抗IL-23抗體的氨基酸序列變體將具有這樣的氨基酸序列，其與重或輕鏈的原始人源化抗體氨基酸序列具有至少75%的氨基酸序列同一性、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、和最優(yōu)選至少95%。關(guān)于這種序列的同一性或同源性在本文中^皮定義為，在該序列比對和必要時引入缺口以達(dá)到最大限度的百分比序列同一性，并且任何保守置換不視為序列同一性的部分后，候選序列中與人源化抗IL-23殘基相同的氮基酸殘基的百分比。N末端、C末端、或抗體序列內(nèi)的內(nèi)部延伸、缺失或插入中無一應(yīng)凈皮解釋為影響序列同一性或同源性。人源化抗體可以選自免疫球蛋白的任何種類，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE。優(yōu)選地，抗體是IgG抗體?？梢允褂肐gG的任何同種型，包括IgG!、IgG2、IgG3和IgG4。還預(yù)期了IgG同種型的變體。人源化抗體可以包含來自超過一個種類或同種型的序列。通過在下文描述的生物學(xué)測定中篩選抗體容易地達(dá)到必需恒定結(jié)構(gòu)域序列的最優(yōu)化，以產(chǎn)生所需生物學(xué)活性。同樣地，任一種類的輕鏈可以在本文的組合物和方法中使用。具體地，k、人或其變體在本組合物和方法中是有用的?？梢詉過置換、插入或缺失至少一個殘基進(jìn)行;秀變，從;而使得CDR序列不同于使用的人和非人抗體序列。預(yù)期此種突變將是最低限度的。一般地，至少75。/。的人源化抗體殘基將對應(yīng)非人CDR殘基的那些、更通常90%、且最優(yōu)選大于95%。可以使用來自人抗體的FR序列的任何合適的部分。FR序列可以通過置換、插入或缺失至少一個殘基進(jìn)行誘變，從而使得FR序列不同于使用的人和非人抗體序列。預(yù)期此種突變將是最低限度的。一般地，至少75%的人源化抗體殘基將對應(yīng)人FR殘基的那些、更通常90%、且最優(yōu)選大于95%。CDR和FR殘基根據(jù)Kabat的標(biāo)準(zhǔn)序列定義進(jìn)行確定。Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,NationalInstitutesofHealth,BethesdaMd.(1987)。SEQIDNOs:5-16和31-48顯示了各種小鼠抗人IL-23pl9抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，且SEQIDNOs:17-28和49-65描述了輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列。SEQIDNOs:66-68是關(guān)于重鏈CDRs(CDRH1、CDRH2和CDRH3)的共有序列，并且包含關(guān)于抗體家族的重鏈CDRs中每個位置上最常見的氛基酸殘基，所述抗體家族由7G10、6H12、13F11、13B5、7E2、13G1、IICIO、1E10、30F11、34E4、5B12、6H4、9C9、IIBIO、30E1、33D2、20A9、22E9、29D5、21A10和33B12組成。圖1A-IC提供了本發(fā)明的各種抗體的重鏈的序列隊(duì)列。如圖2A-2C中所示，本文公開的本發(fā)明抗體的輕鏈CDRs被分成3個亞家族，稱為(a)、(b)和(c)。輕鏈亞家族(a)由抗體7G10、6H12、13F11、13B5、7E2、13G1、IICIO、30F11、34E4、6H4、33D2和33B12組成。輕鏈亞家族(b)由抗體1E10、20A9、22E9、29D5、5B12、9C9和11B10組成。輕鏈亞家族(c)由抗體lOHll、19E9、10G8、39G2、35F12、49A10、34F9和7D7組成。這些輕鏈亞家族用于衍生CDRL1(a)、CDRL1(b)和CDRL1(c)的共有CDR序列(SEQIDNOs:69-71),以及關(guān)于每個亞家族的相應(yīng)共有序列CDRL2(SEQIDNOs:72-74)和CDRL3(SEQIDNOs:75-77)。關(guān)于輕鏈CDRs的共有序列包含關(guān)于每個抗體亞家族的輕鏈CDRs中每個位置上最常見的氣基酸殘基。表2和3限定人源化抗IL-23pl9抗體6H12、7G10、10H11和22E9的各種結(jié)構(gòu)域，以及本發(fā)明的幾種鼠抗體的輕和重鏈可變結(jié)構(gòu)域。SEQIDNos:1-4的殘基1-19代表關(guān)于hum6H12和hum7G10的重和輕鏈的信號序列。hum6H12和hum7G10的輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別位于SEQIDNqs:2^4的殘羞130-233處^hum6H12和hum7G10的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別位于SEQIDNos:1和3的殘基135-464處，其中CH1位于殘基135-242處，CH2+鉸鏈位于殘基243-357處且CH3位于殘基358-464處。所有其他抗體都作為輕和重鏈可變區(qū)(Vl和Vh)呈現(xiàn)，并且因此缺乏信號序列和恒定結(jié)構(gòu)域。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其結(jié)合片段包含CDRs,所述CDRs包含在某些位置處的幾個可變氨基酸之一。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其結(jié)合片段包含SEQIDNOs:78-89處列出的"CDR可變"結(jié)構(gòu)域。這些"CDR可變，，序列包括相關(guān)抗體的每個家族的共有序列以及包含那個家族內(nèi)所有觀察到的序列變體的可變位置。此類序列變體顯示于圖1A-1C和2A-2C中。在另一個實(shí)施方案中，潛在CDRs中的可變氨基酸選自在本文報道的家族中出現(xiàn)2次或更多次的那些氨基酸。這些抗體是上文描述的"CDR可變，，抗體的亞群，其中在給定序列家族中CDR的給定位置處只出現(xiàn)1次的氨基酸不包括在潛在CDRs的庫中。通過簡單檢查圖1A-1C和2A-2C,這些"單次出現(xiàn)"的氨基酸置換容易地進(jìn)行確定，并且因此從"CDR可變"序列中排除。這個狹窄范圍的潛在CDR序列在本文中被稱為"多次出現(xiàn)的可變CDR"。為了方便起見，這種命名在本文中用于指"CDR可變，，序列的這種亞群。在再一實(shí)施方案中，潛在CDRs不限于上文描述的"CDR可變"序列，還包括任何觀察到的氨基酸的保守修飾變體，如使用表1的數(shù)據(jù)確定的。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，潛在CDRs包括本文公開的任何單個序列CDR的變體，包括共有序列SEQIDNOs:66-77，其中所述變體包含相對于/>開的序列的1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、IO個或更多保守氨基酸置換，如使用表l的數(shù)據(jù)確定的。還預(yù)期了嵌合抗體。如上所述，一般的嵌合抗體包含與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源的重和/或輕鏈的部分，而一條或多條鏈的其余部分與衍生自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，以及此種抗體的片段，只要它們顯示所需生物學(xué)活性(美國專利號4,816,567;和Morrison等人(1984)尸toc.A^/.S""&4M:6851-6855)。雙特異性抗體在本方法和組合物中也是有用的。如本文所使用的，術(shù)語"雙特異性抗體，，指具有關(guān)于至少2種不同抗原表位，例如IL-23pl9和IL-23p40的結(jié)合特異性的抗體，一般是單克隆抗體。在一個實(shí)施方案中，表位來自相同抗原。在另一個實(shí)施方案中，表位來自2種不同抗原。用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，雙特異性抗體可以使用2個免疫球蛋白重鏈/輕鏈對的共表達(dá)來重組生產(chǎn)。參見，例如，Milstein等人(1983)A/"化re305:537-39?？商娲?，雙特異性抗體可以使用化學(xué)連接進(jìn)行制備。參見，例如，Brennan等人，(1985)Scze"ce229:81。雙特異性抗體包括雙特異性抗體片^a。參見，例如，Hollinger等人，(1993)尸roc.淑/.Sc/.A90:6444-48，Gruber等人，,丄//wmmo/.152:5368(1994)。在再其他的實(shí)施方案中，可以給本文提供的人源化Vl和VH區(qū)附加不同的恒定結(jié)構(gòu)域。例如，如果本發(fā)明的抗體(或片段)的特定預(yù)期用途要求改變的效應(yīng)子功能，那么可以使用除IgGl外的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域。盡管IgGl抗體提供長半衰期和效應(yīng)子功能，例如補(bǔ)體激活和依賴抗體的細(xì)胞毒性，但此種活性可能不是抗體的所有用途需要的。在此類情況下可以使用例如IgG4恒定結(jié)構(gòu)域。V.人源化抗IL-23的生物學(xué)活性可以就體外抑制性生物學(xué)活性或合適的結(jié)合親和力篩選具有在本文中鑒定為人源化抗IL-23抗體中所需特征的抗體。為了篩選與由目的抗體(例如，阻斷細(xì)胞因子與其受體結(jié)合的那些)結(jié)合的人IL-23(即p19亞基)上的表位結(jié)合的抗體，可以執(zhí)行常規(guī)交叉阻斷測定，例如Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,編輯Harlow和DavidLane(1988)中描述的那種。與相同表位結(jié)合的抗體可能在此類測定中交叉阻斷，但并非所有交叉阻斷抗體都將必然在精確相同的表位處結(jié)合，因?yàn)榻徊孀钄嗫梢云鹨蛴谟煽贵w在附近或甚至重疊表位處結(jié)合的抗體結(jié)合的空間位阻?？商娲?，可以執(zhí)行例如如在Champe等人(1995)Ao/.CT^ot.270:1388-1394中描述的表位作圖，以確定抗體是否結(jié)合目的表位。如由Cunningham和Wells(1989)Scze廳244:1081-1085描述的"丙氨酸分區(qū)誘變"，或人IL-23中氨基酸殘基的一些其他形式的點(diǎn)誘變也可以用于確定關(guān)于本發(fā)明的抗IL-23抗體的功能表位。然而，誘變研究還可以揭示對IL-23的總體三維結(jié)構(gòu)關(guān)鍵的、但不直接涉及抗體-抗原接觸的氨基酸殘基，并且因此可能需要其他方法以證實(shí)使用這種方法確定的功能表位。還可以通過評估抗體與包含人IL-23p19片段(SEQIDNO:39)的肽的結(jié)合來確定由特異性抗體結(jié)合的表位?？梢院铣砂琁L-23pl9序列的一系列重疊肽，并且篩選例如在直接ELISA、竟?fàn)嶦LISA中(在其中評估肽阻止抗體與IL-23pl9的結(jié)合的能力，所述IL-23pl9與微量滴定板的孔結(jié)合)、或在芯片上的結(jié)合。此類肽篩選方法可能不能檢測一些不連續(xù)的功能表位，即涉及沿著IL-23pl9多肽鏈的一級序列不是鄰接的氨基酸殘基的功能表位。由本發(fā)明的抗體結(jié)合的表位還可以通過結(jié)構(gòu)方法進(jìn)4亍確定，例如X射線晶體結(jié)構(gòu)測定(例如，WO2005/044853)、分子建才莫和核磁共振(NMR)分光術(shù)，包括當(dāng)游離時和當(dāng)在與目的抗體的復(fù)合物中結(jié)合時，IL-23中不穩(wěn)定酰胺氬的H-D交換速率的NMR測定(Zinn-Justin等人(1992)飾c/z謹(jǐn)勿31,11335-11347;Zinn-Justin等人(1993)^oc/z函勿32,6884-6891)。關(guān)于X射線晶體學(xué)，結(jié)晶化可以使用本領(lǐng)域已知方法(例如Giege等人(1994)JctoCV^to〃o^:D50:339-350;McPherson(1990)￡z#:,Aoc/zem.189:1-23)中的任何一種來完成，包括微分批(microbatch)(例如Chayen(1997)5:1269-1274)、懸滴蒸氣擴(kuò)散(例如McPherson(1976)Ao/.CTzew.251:6300-6303)、放入晶種和透析。需要使用濃度為至少約1mg/mL且優(yōu)選約10mg/mL-約20mg/mL的蛋白質(zhì)制劑。結(jié)晶化可以在沉淀劑溶液中最佳地達(dá)到，所述沉淀劑溶液包含聚乙二醇1000-20,000(PEG;平均分子量為約1000-約20,000Da),優(yōu)選約5000-約7000Da,更優(yōu)選約6000Da,而濃度為約10%-約30%(w/v)。還可能需要包括蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，例如，濃度為約0.5%-約20%的甘油。在沉淀劑溶液中還可能需要合適的鹽，例如氯化鈉、氯化鋰或檸檬酸鈉，優(yōu)選以約ImM-約1000mM的濃度。沉淀劑優(yōu)選被緩沖至約3.0-約5.0，優(yōu)選約4.0的pH。在沉淀劑溶液中有用的特定緩沖劑可以不同，并且是本領(lǐng)域眾所周知的(Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,第3版(1994)Springer-Verlag，NewYork)。有用的緩沖齊i的例子包括但不限于，HEPES、Tris、MES和乙酸鹽。晶體可以在廣泛的溫度范圍下生長，包括2。C、4°C、8"C和26。C。抗體抗原晶體可以使用眾所周知的X射線衍射技術(shù)進(jìn)行研究，并且可以使用計算機(jī)軟件例如X-PLOR(YaleUniversity,1992,由MolecularSimulations,Inc.分發(fā)的；參見，例如Blundell和Johnson(1985)7We仇E""mo/.114和115,H.W.Wyckoff等人，編輯，AcademicPress;美國專利申請公開號2004/0014194),和BUSTER(Bricogne(1993)v4"aD49:37-60;Bricogne(1997)A/"/z.Ewzymo/.276A:361-423，Carter和Sweet,編輯；Roversi等人(2000MctoOyW.D56:1313-1323)進(jìn)行改善，所述參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容在此整體引入作為參考。與本發(fā)明的抗體結(jié)合相同的表位的另外抗體可以通過下述方法獲得，例如，就與表位的結(jié)合篩選針對IL-23產(chǎn)生的抗體，或用包含人IL-23片段的肽免疫接種動物，所述人IL-23片段包含表位序列。與相同的功能表位結(jié)合的抗體可以預(yù)期顯示相似的生物學(xué)活性，例如阻斷受體結(jié)合，并且此種活性可以通過抗體的功能測定加以證實(shí)。抗體親和力(例如，對于人IL-23)可以使用標(biāo)準(zhǔn)分析進(jìn)行測定。優(yōu)選的人源化抗體是以僅僅約lxl0々的Kd但結(jié)合人IL-23pl9的那些；優(yōu)選僅僅約lxl(T8;更優(yōu)選僅僅約lxlO'9;和最優(yōu)選僅僅約lxl0'1QM。在本組合物和方法中有用的抗體及其片段是生物學(xué)活性抗體和片段。如本文所使用的，術(shù)語"生物學(xué)活性"指能夠結(jié)合所需抗原表位并且直接或間接發(fā)揮生物學(xué)作用的抗體或抗體片段。一般地，這些作用起因于IL-23與其受體結(jié)合的失敗。如本文所使用的，術(shù)語"特異性"指抗體與靶抗原表位的選擇性結(jié)合。通過在一組給定條件下比較與IL-23的結(jié)合和與無關(guān)抗原或抗原混合物的結(jié)合，可以測試抗體的結(jié)合特異性。如果抗體與IL-23的結(jié)合為與無關(guān)抗原或抗原混合物的結(jié)合的至少10倍，且優(yōu)選50倍，那么它被視為特異性的。與IL-23"特異性結(jié)合"的抗體不與不包含IL-23衍生序列的蛋白質(zhì)結(jié)合，即，如本文所使用的，"特異性"涉及IL-23特異性，而不涉及可能存在于所研究中的蛋白質(zhì)中的任何其他序列。例如，如本文所使用的，與IL-23"特異性結(jié)合"的抗體一般將與FLAG-hIL-23結(jié)合，所述FLAG-hIL-23是包含IL-23和FLAG⑧肽標(biāo)記的融合蛋白，但它不與單獨(dú)或當(dāng)與除IL-23外的蛋白質(zhì)融合時的FLAG⑧肽標(biāo)i己結(jié)合。本發(fā)明的IL-23特異性結(jié)合化合物，例如抑制性IL-23pl9特異性抗體，可以以任何方式抑制其生物學(xué)活性，包括但不限于，通過腹膜巨噬細(xì)胞生產(chǎn)IL-1卩和TNF,和通過TH17細(xì)胞生產(chǎn)IL-17(參見Langrish等人(2004)/mmw"o/.202:96-105)?？笽L-23pl9抗體還將能夠抑制IL-17A、IL畫17F、CCL7、CCL17、CCL20、CCL22、CCR1和GM畫CSF的基因表達(dá)(參見Langrish等人(2005)Ex/.Md201:233-240)。本發(fā)明的IL-23特異性結(jié)合化合物，例如抗IL-23pl9抗體，還將阻斷IL-23增強(qiáng)TH17細(xì)胞增殖或存活的能力。Cua和Kastelein(2006)A^f./mmw"o/.7:557-559。工程改造的抗IL-23pl9的抑制活性將在炎性、自身免疫和增生性病癥治療中是有用的。此種病癥在PCT專利申請公開WO04/081190;WO04/071517;WO00/53631;和WO01/18051中描述，所述專利的公開內(nèi)容在此整體引入作為參考。VI.藥物組合物為了制備包括IL-23激動劑或拮抗劑的藥物或無菌組合物，使細(xì)胞因子類似物或突變蛋白質(zhì)、對于其的抗體、或其核酸與藥學(xué)上可接受的載體或貝武開j劑';昆合,參見,例長口,Aem/"gto"^尸/zan^"cez^/ca/5Wewcesandf/.iS.尸/zor謹(jǐn)co戸'".'油"ow"/Formw/a^,MackPublishingCompany,Easton,PA(1984)。治療和診斷劑制劑可以通過與例如凍干粉末、漿、水溶液或懸浮液形式的生理學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來制備(參見，例^口,Hardman等人，(2001)Gooc/zwa""/dGz7maw》77ze尸/2armaco/og/ca/6腦so/77zera/ewto，McGraw-Hill,NewYork,NY;Gennaro(2000)iem/wgfow.'T7zeSc/ewceZVac"ceo/*尸/za777ac少,Lippincott,Williams,和Wilkins,NewYork,NY;Avis等人，(編輯)(1993)尸/zarwacew"ca/Z)ayageForms.'尸arewfera/Met^'c"/7ows,MarcelDekker,NY;Lieberman等人,(纟扁專尋)(1990)P/^rmacewdca/DosageFor腸.'7^/"s，MarcelDekker,NY;Lieberman等人,(編輯)(1990)尸/za，acew"ca/DorageFor譜.'S，e脂，MarcelDekker,NY;Weiner和Kotkoskie(2000rox/cz'/ySa/,,MarcelDekker,Inc.，NewYork,NY)。單獨(dú)或與l良抑制劑組合施用的抗體組合物的喜性和治療功效可以通過細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)崉游镏械臉?biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序來測定，例如用于測定LD5G(對50%的群體致死的劑量)和ED5Q(在50%的群體中治療上有效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比是治療指數(shù)，并且它可以表示為LDso和EDso之間的比。顯示高治療指數(shù)的抗體是優(yōu)選的。由這些細(xì)胞列劑量。此種化合物的劑量優(yōu)選位于包括具有很少毒性或沒有毒性的EDso的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。取決于使用的劑型和利用的施用途徑，劑量可以在這個范圍內(nèi)變化。施用方式不是特別重要的。合適的施用途徑可以例如包括經(jīng)口、直腸、跨粘膜或腸施用；腸胃外遞送，包括肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。用于藥物組合物中或?qū)嵺`本發(fā)明方法的抗體的施用可以以多種常>見方式來進(jìn)^亍，例如，經(jīng)口攝食、吸入、局部應(yīng)用或皮膚、皮下、腹膜內(nèi)、腸胃外、動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。靜脈內(nèi)施用于患者是優(yōu)選的。可替代地，可以以局部而不是全身方式施用抗體，例如，經(jīng)由將抗內(nèi)，通常在貯存或持續(xù)釋放制劑中。此外，可以施用在靶向的藥物遞送系統(tǒng)中的抗體，例如，在用組織特異性抗體包被的脂質(zhì)體中，靶向例如受累:織并i由受累組^選擇性吸收:''、''、'°選擇關(guān)于治療劑的施用方案取決于幾種因素，包括實(shí)體的血清或組織周轉(zhuǎn)率、癥狀水平、實(shí)體的免疫原性、和生物基質(zhì)中靶細(xì)胞的可接近性。優(yōu)選地，施用方案使遞送給患者的治療劑的量達(dá)到最大，與可接受的副作用水平一致。因此，遞送的生物制劑的量部分取決于特定實(shí)體和待治療狀況的嚴(yán)重性。在抗體、細(xì)胞因子和小分子的合適劑量選擇中的指導(dǎo)是可獲得的(參見，例如，Wawrzynczak(1996)爿""力o^v77zera;^，BiosScientificPub.Ltd,Oxfordshire,UK;Kresina(編輯)(1991)M9w0c/0wa/爿油力cxi^,Cyfohwes爿/Y/z"'to，MarcelDekker，NewYork,NY;Bach(ed.)(1993)Mwoc/owa/*〃'6o<i^aw<i尸，,c/e772era/yz力爿w/oz./wwwweZ^ewes,MarcelDekker,NewYork,NY;Baert等人，(2003)臉w丄她d348:601-608;Milg醒等人，(1999)Wew五"g/.J.A/W.341:1966-1973;Slamon等人，(2001)WewJ.344:783-792;Beniaminovitz等人，(2000)E"g/.J.342:613-619;Ghosh等人，(2003)7Vew五wg/.Me<i.348:24-32;Lipsky等人，(2000)/.M^.343:1594-1602)合適劑量的確定由臨床醫(yī)生進(jìn)行，例如，使用本領(lǐng)域已知或懷疑影響治療或預(yù)測影響治療的參數(shù)或因素。一般地，劑量從略微小于最佳劑量的量開始，并且其后它通過小增量進(jìn)行增加，直至相對于任何負(fù)面副作用達(dá)到所需或最佳作用。重要的診斷測量包括例如產(chǎn)生的炎癥癥狀或產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子水平的那些。優(yōu)選地，將使用的生物制劑衍生自與靶向用于治療的動物相同的物種，從而使針對試劑的炎性、自身免疫或增生性應(yīng)答減到最小?？贵w、抗體片段和細(xì)胞因子可以通過連續(xù)輸注、或通過例如l天、1周、或1-7次/周時間間隔的給藥提供。劑量可以靜脈內(nèi)、皮下、局部、經(jīng)口、鼻、直腸、肌內(nèi)、大腦內(nèi)、脊柱內(nèi)或通過吸入提供。優(yōu)選的給藥方案是涉及避免明顯不需要的副作用的最大劑量或給藥頻率的給藥方案。周總劑量通常是至少0.05pg/kg體重、更通常至少0.2pg/kg、最通常至少0.5昭/kg、一般至少1嗎/kg、更一般至少10pg/kg、最一般至少100嗎/kg、優(yōu)選至少0.2mg/kg、更優(yōu)選至少1.0mg/kg、最優(yōu)選至少2.0mg/kg、最佳至少10mg/kg、更最佳至少25mg/kg、和最最佳至少50mg/kg(參見，例如，Yang等人，(2003)Met/.349:427-434;Herold等人，(2002)AAew五"g/.丄346:1692-1698;Liu等人，(1999)丄尸，/z.67:451-456;Portielji等人，(20003)Cawcer/mmwwo/./m/mmof/ze/:52:133-144)。小分子治療劑，例如肽模擬物、天然產(chǎn)物或有機(jī)化學(xué)制品的所需劑量在摩爾/kg基礎(chǔ)上約與對于抗體或多肽的相同。如本文所使用的，"抑制"或"治療"或"處理"包括與自身免疫疾病或病原體誘導(dǎo)的免疫病理學(xué)相關(guān)的癥狀發(fā)展的延緩，和/或?qū)⒁蝾A(yù)期發(fā)展的此種癥狀的嚴(yán)重性中的減少。該術(shù)語進(jìn)一步包括改善現(xiàn)有的不受控制或有害的自身免疫相關(guān)或病原體誘導(dǎo)的免疫病理學(xué)癥狀，預(yù)防另外的癥狀、和改善或預(yù)防此種癥狀的潛在原因。因此，該術(shù)語指已對脊推動物受試者賦予有利的結(jié)果，所述受試者具有自身免疫或病原體誘導(dǎo)的免疫病理學(xué)疾病或癥狀，或具有發(fā)展此種疾病或癥狀的可能。如本文所使用的，術(shù)語"治療有效量"或"有效量"指IL-23pl9特異性結(jié)合化合物例如和抗體的量，當(dāng)單獨(dú)或與另外的治療劑組合施用于細(xì)胞、組織或受試者時，所述量有效預(yù)防或改善自身免疫疾病或病原體誘導(dǎo)的免疫病理學(xué)相關(guān)疾病或狀況或疾病進(jìn)展。治療有效劑量進(jìn)一步指這樣的化合物量，其足以導(dǎo)致癥狀的改善，例如，相關(guān)醫(yī)學(xué)狀況的治療、治愈、預(yù)防或改善，或此種狀況的治療、治愈、預(yù)防或改善率的增加。當(dāng)應(yīng)用于單獨(dú)施用的單個活性成分時，治療有效劑量指單獨(dú)的那種成分。當(dāng)應(yīng)用于組合時，治療有效劑量指導(dǎo)致療效的活性成分的組合量，無論是組合、順次還是同時施用。治療劑的有效量將使癥狀一般減少至少10%;通常至少20%;優(yōu)選至少約30%;更優(yōu)選至少40%;和最優(yōu)選至少50%。關(guān)于與第二種治療劑，例如細(xì)胞因子、類固醇、化學(xué)治療劑、抗生//aniw朋等人,(編輯)(2001)<3"<iGz7wa";77ze尸/armaco/og/ca/5as7'so/77ze廠a/ew"(^，第10片反,McGraw-Hill,NewYork,NY;Poole禾口Peterson(纟扁專辱)(2001)尸/zarm"cc^/zen2pew"cs/orjt/vawced/Vachce.'爿尸n2"/c"/^4//roac/z,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila,,PA;Chabner和Longo(編輯)(2001)C麵erC7^mof/2en3p_y<3/<iSz'0Aen3/7y,Lippincott,Williams&Wilkins,Phila.,PA。本發(fā)明的藥物組合物還可以包含其他免疫抑制劑或免疫調(diào)諧劑?？梢允褂萌魏魏线m的免疫抑制劑，包括但不限于，抗炎劑、皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢菌素、他克莫司(即，F(xiàn)K-506)、西羅莫司、干擾素、可溶性細(xì)胞因子受體(例如，sTNRF和sIL-lR),中和細(xì)胞因子活性的試劑(例如，英夫單抗、依那西普(etanercept))、霉酚酸酯、15-脫氧精胍菌素(15-deoxyspergualin)、沙立度胺、檔、扭太咪爾、石危唑噤呤、來氟洛米、環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤等。藥物組合物還可以與其他治療方式例如光線療法和放射一起使用。一般的獸醫(yī)學(xué)、實(shí)驗(yàn)或研究受試者包括猴、狗、貓、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、馬和人。VII.抗體生產(chǎn)關(guān)于本發(fā)明抗體的重組生產(chǎn)，分離編碼2條鏈的核酸并插入一種或多種可復(fù)制載體內(nèi)，用于進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或用于表達(dá)。使用常規(guī)程序(例如，通過使用能夠與編碼抗體的重和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)容易地分離并測序編碼單克隆抗體的DNA。許多載體是可用的。載體組分一般包括但不限于，下述中的一種或多種信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗IL-23pl9抗體的輕和重鏈兩者由相同載體例如質(zhì)?；蛳俨《据d體表達(dá)。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來生產(chǎn)。在一個實(shí)施方案中，抗體在培養(yǎng)的哺乳動物或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人胚腎(HEK)293細(xì)胞、小鼠骨髓瘤NSO細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、草地夜蛾(印otfo/^ra)卵巢(Sf9)細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，由CHO細(xì)月包分泌的抗體凈皮回收并通過標(biāo)準(zhǔn)層析法進(jìn)行純化，例如A蛋白、陽離子交換、陰離子交換、疏水相互作用和羥磷灰石層析。所得到的抗體被濃縮并貯存于20mM乙酸鈉，pH5.5中。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體根據(jù)WO2005/040395中所述方法在酵母中進(jìn)行生產(chǎn)。簡言之，將編碼目的抗體的單獨(dú)輕或重鏈的載體引入不同的酵母單倍體細(xì)胞內(nèi)，例如，不同交配型的酵母巴斯德畢赤氏酵母(尸,c/n"/aWons),所述酵母單倍體細(xì)胞是任選互補(bǔ)的營養(yǎng)缺陷體。轉(zhuǎn)化的單倍體酵母細(xì)胞隨后可以進(jìn)行交配或融合，以產(chǎn)生能夠生產(chǎn)重和輕鏈兩者的二倍體酵母細(xì)胞。二倍體菌抹隨后能夠分泌完全裝配的和生物學(xué)活性抗體。2條鏈的相對表達(dá)水平可以通過下述進(jìn)行最優(yōu)化，例如使用具有不同拷貝數(shù)的載體、使用不同強(qiáng)度的轉(zhuǎn)錄啟動子、或誘導(dǎo)來自驅(qū)動編碼1條或2條鏈的基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動子的表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，將多種不同抗IL-23pl9抗體("原始"抗體)各自的重和輕鏈引入酵母單倍體細(xì)胞內(nèi)，以制備表達(dá)多條輕鏈的一種交配型的單倍體酵母菌抹文庫，和表達(dá)多條重鏈的不同交配型的單倍體酵母菌抹文庫。這些單倍體菌抹文庫可以進(jìn)行交配(或融合為原生質(zhì)球)，以生產(chǎn)表達(dá)包含輕和重鏈的各種可能排列的抗體組合文庫的一系列二倍體酵母細(xì)胞。隨后可以篩選抗體組合文庫，以確定任何抗體中的任一個是否具有優(yōu)于(例如對于IL-23更高的親和力)原始抗體那些的性質(zhì)。參見，例如，WO2005/040395。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是其中抗體可變結(jié)構(gòu)域的部分連接在分子量約13kDa的多肽中的人結(jié)構(gòu)域抗體。參見，例如，美國專利公開號2004/0110941。此種單結(jié)構(gòu)域、低分子量試劑提供了就合成的容易性、穩(wěn)定性和施用途徑而言的眾多優(yōu)點(diǎn)。VIII.用途本發(fā)明提供了關(guān)于使用工程改造的抗IL-23用于治療和診斷例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的炎性病癥和狀況，以及自身免疫和增生性病癥的方法。提供了用于治療下述疾病的方法例如多發(fā)性硬化(MS),包括復(fù)發(fā)-緩解型MS和原發(fā)性進(jìn)行性MS,阿爾茨海默氏病，肌萎縮性側(cè)索硬化(也稱為ALS;LouGehrig氏病)，缺血性腦損傷，朊病毒病和HIV相關(guān)癡呆。還提供了用于治療神經(jīng)病性疼痛、創(chuàng)傷后神經(jīng)病、Guillain-Barre綜合征(GBS)、末梢多發(fā)性神經(jīng)病和神經(jīng)再生的方法。提供了用于治療或改善多發(fā)性硬化、或神經(jīng)系統(tǒng)的其他炎性病癥或狀況的一種或多種下述特征、癥狀、方面、表現(xiàn)或病征的方法腦損害、髓鞘損害、脫髓鞘、脫髓鞘斑、視覺障礙、平衡或協(xié)調(diào)缺失、痙攣狀態(tài)、感覺障礙、失禁、疼痛、虛弱、疲勞、麻痹、認(rèn)知缺損、智力遲鈍、復(fù)視、視神經(jīng)炎、感覺異常、步態(tài)共濟(jì)失調(diào)、疲勞、Uhtoff氏癥狀、神經(jīng)痛、失語、運(yùn)用不能、癲癇發(fā)作、視野缺失、癡呆、錐體束外現(xiàn)象、抑郁、健康感、或其他情緒癥狀、慢性進(jìn)行性脊髓病、和通過磁共振成像(MRI)包括釓增強(qiáng)損害、誘發(fā)電位記錄、或檢查腦脊液檢測的癥狀(參見,例i口,Kenealy等人(2003)丄iVew7x>/mmimo/.143:7畫12;Noseworthy等人(2000)TVew丄A^t/.343:938-952;Miller等人(2003)五"g/.J.348:15-23;Chang等人(2002)iVew五"g/.J.A/W.346:165-173;Bruck和Stadelmann(2003)A^wo/.Sc/.24Suppl.5:S265-S267)。此外，本發(fā)明提供了用于治療和診斷炎性腸病癥，例如克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、乳糜瀉和過敏性腸綜合征的方法。提供了用于治療或改善炎性腸病癥的一種或多種下述癥狀、方面、表現(xiàn)或病征的方法食物吸收不良、改變的腸運(yùn)動性、感染、發(fā)熱、腹痛、腹瀉、直腸出血、體重減輕、營養(yǎng)不良病征、肛門周圍疾病、腹部塊，和生長不足，以及腸并發(fā)癥例如狹窄、瘺、中毒性巨結(jié)腸、穿孔和癌癥，并且包括內(nèi)窺4竟所見，例如，脆性、口掩和線性潰瘍、鵝卵石樣表現(xiàn)、假息肉和直腸受累，和此外抗酵母抗體(參見，例如，Podolsky,同上；Hanauer，同上；Horwitz和Fisher,同上)。還預(yù)期了下述病癥的治療炎性病癥，例如牛皮癬，特應(yīng)性皮炎，關(guān)節(jié)炎，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和牛皮癬關(guān)節(jié)炎，自身免疫病癥，例如全身性紅斑狼癡和I型糖尿病，和增生性病癥例如癌癥(參見，例如，PCT專利申請WO04/081190;WO04/071517;WO00/53631;和WO01/18051)。本發(fā)明的IL-23pl9結(jié)合化合物還可以與其他細(xì)胞因子的一種或多種拮抗劑(例如抗體)組合使用，所述其他細(xì)胞因子包括但不限于，IL誦17A、IL-1卩、IL-6和TGF國卩。參見，例如，Veldhoen(2006)/畫畫(y24:179-189;Dong(2006)A^."ev./mmimo/.6(4):329-333。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的IL-23pl9結(jié)合化合物在另一種或多種拮抗劑例如抗IL-17A抗體的施用之前、同時或之后施用。在一個實(shí)施方案中，IL-17A結(jié)合化合物單獨(dú)或與本發(fā)明的IL-23拮抗劑抗體組合用于治療不利的免疫應(yīng)答(例如，MS、克羅恩氏病)的急性早期。在后面一種情況下，IL-17A結(jié)合化合物可以逐步減少，并且用單獨(dú)的IL-23拮抗劑的治療持續(xù)以維持不利應(yīng)答的抑制?？商娲?，針對IL-1p、IL-6和/或TGF-卩的拮抗劑可以與在本發(fā)明的IL-23pl9結(jié)合化合物同時、在其之前或之后施用。參見Cua和Kastelein(2006)Ato./附mw"o/.7:557-559;Tato和O，Shea(2006)Atowe441:166-168;Iwakura和Ishigame(2006)J./騰就116:1218-1222。參考下述實(shí)施例可以最佳理解本發(fā)明的廣泛范圍，所述實(shí)施例不預(yù)期使本發(fā)明限制于具體實(shí)施方案。本文的所有引用都引入本文作為參考，其程度與每個單個出版物或?qū)＠暾執(zhí)貏e并個別指出引入作為參考相同。如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可進(jìn)行本發(fā)明的許多修飾和變化。本文描述的具體實(shí)施方案僅為了舉例而提供，并且本發(fā)明將受到附加權(quán)利要求的條款，連同此種權(quán)利要求對其授權(quán)的等同方案的全部范圍的限制；并且本發(fā)明不受具體實(shí)施方案的限制，所述具體實(shí)施方案在本文中為了舉例而呈現(xiàn)。實(shí)施例實(shí)施例1一般方法分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法得到了描述(Maniatis等人(1982)Mo/ecw/wC7om'/7g,JZ^6oraor少M(fèi)a肌a/，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY;Sambrook和Russell(2001)M/ecw/arC7om'wg,#3見ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY;Wu(1993)紐o油'畫fD亂第217巻，AcademicPress,SanDiego,CA)。標(biāo)準(zhǔn)方法也出現(xiàn)于Ausbel等人(2001)Q#re"f尸rotoco/sMo/ecw/arS/o/ogy,#巻,JohnWileyandSons,Inc.NewYork,NY，所述參考文獻(xiàn)描述了在細(xì)菌細(xì)胞中的克隆和DNA誘變(第1巻)、在哺乳動物細(xì)胞和酵母中的克隆(第2巻)、復(fù)合糖和蛋白質(zhì)表達(dá)(第3巻)以及生物信息學(xué)(第4巻)。關(guān)于蛋白質(zhì)純化的方法包括免疫沉淀、層析、電泳、離心和結(jié)晶化4尋到了4苗述(Coligan等人(2000)Cw^rew/17VWocoAyz."尸rofez力5Wewce,JohnWileyandSons,Inc.,NewYork)?；瘜W(xué)分析、化學(xué)修飾、翻譯后修飾、融合蛋白的生產(chǎn)、蛋白質(zhì)的糖基化得到了描述(參見，例^口,Coligan等人(2000)Cw/reW/VotocoAyz力/Vofe/w5"c/ewce，,24，JohnWileyandSons,Inc.,NewYork;Ausubel等人(2001)Cwre"f尸ratocoAsw力M^/ecw/or,3表JohnWileyandSons,Inc.,NY,NY,笫16.0.5-16,22.17頁；Sigma隱Aldrich,Co.(2001)/W韭/orZj/eiS"ewceA譜arc/z,StLouis，MO;第45-89頁；AmershamPharmaciaBiotech(2001)5/oDz>e"c>7,Piscataway,N丄,第384-391頁)。多克隆和單克隆抗體的生產(chǎn)、純化和斷裂得到了描述(Coligan等人(2001)Cwrew/1/VofcoAs/mmwwo/ogy,,/蕃，JohnWileyandSons,Inc.,NewYork;Harlow和Lane(1999)f/s7';gJw〃力oc/^,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY;Harlow和Lane',同上)。用于表征配體/受體相互作用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是可用的(參見，例如，Coligan等人(2001)Cwrewf/Vofco/s/mwzmo/ogy，,44，JohnWiley,Inc.，NewYork)。關(guān)于流式細(xì)胞術(shù)，包括熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)的方法是可用的(參見,例^口,Owens等人(1994)F/owQK0mef7尸"'wc^/es/orC7z力/ca/丄aZo/^/10^7TVac"ce,JohnWileyandSons,Hoboken,NJ;Gi雨(2001)F/owC,認(rèn)&》#2應(yīng)；Wiley誦Liss,Hoboken,NJ;Shapiro(2003)尸rac"ca/F/cwCy畫efry,JohnWileyandSons,Hoboken,NJ)。適合于修飾核酸，包括核酸引物和探針，多肽和抗體，用于作為例如診斷試劑使用的焚光試劑是可用的(MolecularProbes(2003)C她/ogwe，MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR;Sigma畫Aldrich(2003)C齒/ogwe,St.Louis,MO)。免疫系統(tǒng)組織學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法得到了描述(參見，例如，Muller-Harmelink(ed.)(1986)H謹(jǐn)朋7Tz戸z^.,//z'Wo/af/zo/ogyaw/尸a/^o/ogy,SpringerVerlag，NewYork,NY;Hiatt等人，(2000)Co/orJ/7<xyo/州加/ogy,Lippincott,Williams,andWilkins，Phila,PA;Louis等人,(2002W加/ogy.'7fccfawt/力/肌McGraw-Hill,NewYork,NY)。用于測定例如抗原片段、前導(dǎo)序列、蛋白質(zhì)折疊、功能結(jié)構(gòu)域、糖基化位點(diǎn)和序列比對的軟件包和數(shù)據(jù)庫是可用的(參見，例如，GenBank，VectorNTISuite(Info腿x，Inc,Bethesda，MD);GCGWisconsinPackage(Accelrys,Inc.，SanDiego,CA);DeCypher(TimeLogicCorp.，CrystalBay,Nevada);Menne等人(2000)5z.o/"/c^wa/7'cs16:741-742;Menne等人(2000)5/oz'"/wma"cs^/7/7//c加'纖淑e16:741-742;Wren等人(2002)Co附/W.尸ng/^ww68:177-181;vonHeijne(1983)/133:17-21;vonHeijne(1986)A^c/e,c^4"^14:4683-4690)。實(shí)施例2抗人IL-23pl9抗體的人源化小鼠抗人IL-23pl9抗體6H12和7G10的人源化基本上如PCT專利申請公開WO2005/047324和WO2005/047326中所述來進(jìn)行，所述專利引入作為參考。將所選抗IL-23單克隆抗體(6H12和7G10)的可變輕和重結(jié)構(gòu)域克隆并分別與人k輕鏈(CL結(jié)構(gòu)域)和人IgGl重鏈(CHl-鉸鏈國CH2-CH3)融合。將非人VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與一組5個人VH種系氨基酸序列進(jìn)行比H來自亞群IGHVl和IGHV4的1個代表和來自亞群IGHV3的3個4戈表。VH亞群列舉于M,P.Lefranc,"NomenclatureoftheHumanImmunoglobulinHeavy(IGH)Genes"，Experimental和ClinicalImmunogenetics，18:100-116,2001中。6H12和7G10抗體針對亞群VH1中的人重鏈種系DP-14評分最高。對于所有非人抗體，VL序列是VL的k亞類。將非人VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與一組4個人VLk種系氨基酸序列進(jìn)行比較。4個的組包含來自4個確定的人VL亞群中每一個的1個代表，所述人VL亞群列舉于V.BarbieandM畫P.Lefranc,"TheHumanImmunoglobulinKappaVariable(IGKV)GenesandJoining(IGKJ)Segments",Expe".膨齒/C7zmca//m羅wogeweto,15:171-183,1998和M.國P.Lefranc,"NomenclatureoftheHumanImmunoglobulinKappa(IGK)Genes",五義/e"'wew/^/朋(iC7/m'ca//mmwwogewWcs,18:161-174，2001中。4個亞群還對應(yīng)Kabat等人"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest",U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPub.91-3242,第5版，1991,第103-130頁中列舉的4個亞群。6H12和7G10抗體針對亞群VLkl中的人輕鏈種系Z-012評分最高。一旦確定了可變重和輕鏈的耙氨基酸序列，就產(chǎn)生編碼全長人源化抗體的質(zhì)粒。從編碼具有VH3DP-46和VLklZ-012種系構(gòu)架的人源化抗IL-10抗體的質(zhì)粒開始，使用Kunkel誘變(參見，例如，KunkelTA.(1985)A^/.」c^/.t/.S.爿82:488-492)改變質(zhì)粒，以使DNA序列變成靶人源化6H12或7G10序列。同時，將密碼子最優(yōu)化摻入變化內(nèi)以提供潛在最優(yōu)化表達(dá)。所得到的人源化重和輕鏈序列，包括信號序列，分別在SEQIDNos:1和2(抗體6H12)處以及SEQIDNos:3和4(對于抗體7G10)處提供。抗體10H11針對亞群VH3中的人抗體重鏈種系DP-46和亞群VLkIII中的輕鏈種系Z-A27評分最高?？贵w22E9針對亞群VH1中的人抗體重鏈種系DP-14和亞群VLkIV中的輕鏈種系Z-B3評分最高。所得到的人源化重和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列，分別在SEQIDNos:90和91(抗體10H11)處以及SEQIDNos:92和93(對于抗體22E9)處提供。實(shí)施例3使用KinExA技術(shù)測定關(guān)于人源化抗人IL-23的平衡解離常數(shù)(KD)關(guān)于抗人IL-23抗體的平4釺解離常數(shù)(Kd)使用KinExA3000儀器(SapidyneInstrumentsInc.,www.sapidyne.com)進(jìn)行測定。KinExA使用動態(tài)排除測定法(KineticExclusionAssaymethod)的原理，其基于抗體、抗原和抗體-抗原復(fù)合物的混合物中未復(fù)合抗體的濃度測量。游離抗體的濃度通過使混合物暴露于固相固定化的抗原非常短暫的時間段進(jìn)行測量。在實(shí)踐中，這通過使溶液相抗原-抗體混合物流經(jīng)流動池中捕獲的抗原包被的顆粒來完成。由該儀器產(chǎn)生的數(shù)據(jù)使用定制軟件進(jìn)行分析。使用數(shù)學(xué)理論基于下述假定計算平衡常數(shù)1.結(jié)合遵循關(guān)于平衡的可逆結(jié)合等式kon[Ab][Ag]=k。ff[AbAg]2.抗體和抗原1:l結(jié)合，并且總抗體等于抗原-抗體復(fù)合物加游離抗體。3.儀器信號與游離抗體濃度線性相關(guān)。才艮據(jù)Sapidyne"ProtocolforcoatingPMMAparticleswithbiotinylatedligandshavingshortornonexistentlinkerarms",用生物素化的rhIL-23包被98微米PMMA顆粒(Sapidyne,目錄號440198)。關(guān)于rhIL-23的生物素化，根據(jù)制造商的建議(Pierce公告(bulletin)0874)使用EZ畫linkTFPPEO-生物素(Pierce,目錄號21219)。所有實(shí)驗(yàn)程序均根據(jù)KinExA3000手冊來進(jìn)行。使用3種形式的異二聚IL-23蛋白質(zhì)。天然或非連接的人IL-23包含通過二硫鍵共價連接的2條鏈，pl9和p40。"非連接的"IL-23包含在293T細(xì)胞中與人pl9:FLAG-標(biāo)記肽共表達(dá)的人p40，并且經(jīng)過抗FLAG肽親和柱進(jìn)行純化。通過非還原SDS-PAGE,純化的非連接的IL-23顯示在對應(yīng)于二聚體、三聚體等的分子量處的多聚IL-23形式的存在。"Elastikine"IL-23是包含F(xiàn)LAG-標(biāo)記肽GLU-標(biāo)記肽人p40:elasti-接頭人pl9的單鏈肽。elasti-接頭肽序列衍生自R&DSystems形式的商品化IL-23。Elastikine在293T細(xì)月包中進(jìn)行表達(dá)并且經(jīng)過抗FLAG肽親和柱進(jìn)行純化。通過非還原SDS-PAGE,純化的elastikineIL-23顯示在對應(yīng)于二聚體、三聚體等的分子量處的多聚IL-23形式的存在。在SF9細(xì)胞中共表達(dá)的非標(biāo)記的、非連接形式的天然人IL-23pl9/p40購自eBioscience(目錄號34-8239)。通過非還原SDS-PAGE，純化的eBioscience人IL-23沒有顯示多聚IL-23形式的存在。所有運(yùn)行在下述條件下一式兩份地進(jìn)行樣品體積1.5mL;樣品流速0.25mL/分鐘；標(biāo)記體積0.5mL;標(biāo)記流速0.25mL/分鐘；mAb濃度0.1nM;最高的Ag(hIL-23)濃度:4.0nM;最低的Ag(hIL-23)濃度3.91nM。制備抗原的2倍系列稀釋物并且與恒定濃度的抗體混合。使混合物在室溫下溫育2小時至平衡。表4顯示了KinExA分析結(jié)果。表4通過KinExa測定的Ko值人IL-23抗體K。(pM)elastikine6H1254,48非連接的6H12>1200eBioscience6H12>1000,>920elastiki加hu6H1228，36elastikine7G1041，9.2elastikinehu7G1049，16elastikine39G219非連接的39G234eBioscience39G2620elastikine35F1253eBioscience35F12>700elastikine13B522eBioscience13B555elastikine7D72.7elastikine3D70.84elastikine49A107.4elastikine13F1111elastikine33B126.8實(shí)施例4使用BIAcore技術(shù)測定關(guān)于人源化抗人IL-23pl9抗體的平衡解離常數(shù)(Kd)使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)程序?qū)⑺信潴w(抗IL-23mAbs)固定化在BIAcoreCM5傳感器芯片上。所有實(shí)驗(yàn)于25。C并且在PBS中以10^L/分鐘的流速來進(jìn)行。所有IL-23形式在PBS中進(jìn)行稀釋以產(chǎn)生各種濃度。關(guān)于各種相互作用的動力學(xué)常數(shù)使用BIAevaluation軟件3.1進(jìn)行測定。使用計算的解離和結(jié)合速率常數(shù)確定KD。蛋白質(zhì)以下述濃度使用以0.33mg/mL溶于PBS中的抗IL-23mAbhu7G10;以0.2mg/mL溶于PBS中的抗IL-23mAbhu6H12;以0.30mg/mL溶于PBS中的bac-wt人IL-23;以0.10mg/mL溶于PBS中的eBioscience人IL-23;以0.33mg/mL溶于PBS中的N222Q人IL-23。除了上述蛋白質(zhì)外，還使用其他形式。"Bac-wt"人IL-23在序列方面等同于"elastikine，，人IL-23。這種IL-23在SF9細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)并且經(jīng)過抗FLAG肽親和柱進(jìn)行純化。通過非還原SDS-PAGE,純化的IL-23沒有顯示多聚IL-23形式的存在。"N222Q，，人IL-23在序列方面等同于"elastikine，，人IL-23，只是除了在p40亞基中Asn222改變成Gln(GenBank登記號P29460)。這種IL-23在SF9細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)并且經(jīng)過抗FLAG肽親和柱進(jìn)行純化。通過非還原SDS-PAGE,純化的N222QIL-23沒有顯示多聚IL-23形式的存在。對于所有實(shí)驗(yàn)使用下述固定化和再生條件流速5pL/分鐘；NHS/EDC:10^L;蛋白質(zhì)溶于10mM乙酸鈉(NaAcetate),pH5.0的5ing/mL:10pL;乙醇胺40pL;再生550mMNaOH。表5提供了如通過BIAcore測定的Ko值。表5通過BIAcore的Kd測定人IL-23抗體KD(nM)bac-wthu7G1010N222Qhu7G100.3,1.0eBiosciencehu7G103.2，9.0bac-wthu6H125.1N222Qhu6H120.5hu6H12實(shí)施例5用于評估中和性抗IL-23抗體的增殖生物測定單克隆抗體生物學(xué)中和IL-23的能力通過應(yīng)用短期增殖生物測定進(jìn)行評估，所述短期增殖生物測定使用表達(dá)重組IL-23受體的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化體Ba/F3-2.21o細(xì)胞響應(yīng)人IL-23而增殖并且所述應(yīng)答可以#皮中和性抗IL-23抗體抑制。針對在劑量應(yīng)答曲線的線性區(qū)域內(nèi)、接近平臺和在EC50之上選擇的IL-23濃度滴定抗體。通過比色法^吏用AlamarBlue測量增殖或其缺乏，所述AlamarBlue是基于代謝活性檢測的生長指示劑染料?？贵w中和IL-23的能力通過其IC50值，或誘導(dǎo)IL-23增殖半數(shù)最大抑制的抗體濃度進(jìn)行評估。/丄-23A脊襲子勿^敏屑和勿應(yīng)潛#細(xì)月包系IL-23R表達(dá)IL-23應(yīng)答B(yǎng)a/F3畫2.21o-hlL-23RhlL-23R,hlL國12RBl人，Cyno將Ba/F3轉(zhuǎn)染子維持在RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、502-巰基乙醇、2mML-谷氨酰胺、50^g/mL青霉素-鏈霉素和10ng/mL小鼠IL-3中。"Cyno"指食蟹猴IL-23。#崖亙參都定凝#^:Ba/F3增殖生物測定在RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、50uM2-巰基乙醇、2mML-谷氨酰胺和50ug/mL青霉素-鏈霉素中進(jìn)行。程,測定在96孔平底平板(Falcon3072或類似的)中進(jìn)行。所有試劑制備和細(xì)胞懸浮液使用合適的生物測定培養(yǎng)基。測定體積是150iliL/孔?？笽L-23抗體的滴定與IL-23在室溫下預(yù)溫育30-60分鐘，在這期間制備細(xì)胞。在抗體-細(xì)胞因子預(yù)溫育后將細(xì)胞加入平板中。使生物測定平板在增濕的組織培養(yǎng)室(37C,5%C02)中溫育40-48小時。在培養(yǎng)時間結(jié)束時，以16.5pL/孔加入AlamarBlue(Biosource目錄弁DAL1100)并允許顯色5-12小時。隨后在570nm和600nm處閱讀吸光度(VERSAmaxMicroplateReader,MolecularProbes),并且獲得OD57o-6oo°對于每種樣品一式兩份地進(jìn)行。勿應(yīng)翔務(wù)使用健康生長狀態(tài)的細(xì)胞，一般為3-8x10VmL的密度。將細(xì)胞計數(shù)，沉淀，在生物測定培養(yǎng)基中洗滌2次，并懸浮至合適的密度用于鋪平板。將IL-23制備至工作濃度(3ng/mL)并且以75加入第1個孔中。通過橫過孔在生物測定培養(yǎng)基中25:50pL滴定進(jìn)行1:3的系列稀釋，剩余50pL/孔。使細(xì)胞懸浮至合適的密度用于以100pL/孔鋪平板。^和戎#身#-^吝將抗體制備至工作濃度(30|Lig/mL)并且以75jxL加入第1個孔中。通過橫過孔在生物測定培養(yǎng)基中25:50滴定進(jìn)行1:3的系列稀釋，剩余50iliL/孔。合適濃度的IL-23以50^L/孔加入包含滴定的抗體的孔中。使細(xì)胞懸浮至合適的密度以用于以50pL/孔鋪平板，并且在抗體-細(xì)胞因子預(yù)溫育后加入。源定使用GraphPadPrism3.0軟件，針對細(xì)胞因子或抗體濃度標(biāo)繪吸光度，并且使用S形劑量-應(yīng)答的非線性回歸(曲線擬合)測定IC50值。表6顯示通過抗IL-23pl9抗體用于阻斷Ba/F3細(xì)胞增殖的IC50值表6通過抗IL-23抗體用于阻斷Ba/F3細(xì)胞增殖的IC50值IC50(nM)人IL-23抗體IC50(nM)■■一一—elastikine7G1022，18非連接的7G103000eBioscience7G103100，510elastikinehu7G1029非連接的hu7G1010000eBiosciencehu7G107800el肪tikine6H129,11非連接的6H121500eBioscience6H121300，500elastikinehu6H1227非連接的hu6H124000eBiosciencehu6H123200elastikine13B57,5非連接的l犯5113eBioscience13B531elastikine33B124,3非連接的3犯12193eBioscience3犯1257elastikine39G29,5非連接的39G267eBioscience39G211el助tiki加35F1215，5非連接的35F1273eBioscience35F1212elastikine3D73,3非連接的3D737eBioscience3D72實(shí)施例6關(guān)于抗IL-23pl9抗體7G10的表位關(guān)于抗體7G10與人IL-23pl9(SEQIDNO:29)結(jié)合的表位通過X射線晶體學(xué)進(jìn)行測定。測定關(guān)于抗體7G10的嵌合形式的Fab片段和非連接的人IL-23的復(fù)合物的座標(biāo)，所述非連接的人IL-23包含pl9和p40亞基。人IL-23pl9的序列在SEQIDNO:29處找到，并且人IL-12/IL-23p40的成熟形式的序列在GenBank登記號P29460的殘基23-328處找到?？贵w7G10的嵌合形式包含i)這樣的重鏈，其包含與人重鏈恒定區(qū)(SEQIDNO:3的殘基135-464)融合的小鼠7G10VH結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:6)，和ii)這樣的輕鏈，其包含與人輕鏈恒定區(qū)(SEQIDNO:4的殘基130-233)融合的小鼠7G10Vl結(jié)枸域(SEQIDNO:18)。在抗體7G10上的殘基4.0A內(nèi)的IL-23氨基酸殘基包括E82、G86、S87、D88、T91、G92、E93、P94、S95、H106、P133、S134、Q135、P136、W137、R139、L140。另外的殘基K83、F90和L110在5.0A內(nèi)。IL-23pl9上的氨基酸殘基4支視為在抗體的給定距離(例如4.0A或5.OA)的話。大多數(shù)這些接觸的殘基落入沿著IL-23pl9的一級結(jié)構(gòu)的2個主要聚簇內(nèi)，其中第1個聚簇包含殘基82-95(其中14個殘基中的11個在抗體的5.0A內(nèi)，且14個中的9個在4.0A內(nèi))，且第二個聚簇包含殘基133-140(其中8個殘基中的7個在抗體的4.0A內(nèi))。這些聚簇限定了包含IL-23p19的8個或更多鄰接氨基酸殘基段的表位，其中50%、70%和85%或更多殘基位于抗體的5.0A內(nèi)。與這些聚簇中任一或兩者結(jié)合的抗體將預(yù)期阻斷抗體7G10的結(jié)合。已知所有6個CDR序列之間的強(qiáng)序列同源性(參見圖1A-1C和2A-2C),可能包含"(a)輕鏈亞家族"的其他抗體(6H12、33B12、13F11、13B5、13G1、IICIO、7E2、30F11、34E4、6H4、33D2)也將與IL-23pl9中的和抗體7G10基本上相同的表位結(jié)合。關(guān)于"(a)輕鏈亞家族，，可變結(jié)構(gòu)域序列的抗體的共有CDR序列在SEQIDNOs:69、72和75提供。相應(yīng)的重鏈可變結(jié)構(gòu)域共有序列在SEQIDNOs:66-68提供。與和抗體7G10相同的表位結(jié)合的抗體將預(yù)期顯示類似的生物學(xué)活性，例如在實(shí)施例5和表6處描述的測定中阻斷Ba/F3細(xì)胞增殖，盡管可能具有某些可變親和力和IC50s。表7提供了序列表中序列的簡述。<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可進(jìn)行本發(fā)明的許多修飾和變化。本文描述的具體實(shí)施方案僅為了舉例而提供，并且本發(fā)明將受到附加權(quán)利要求的條款，連同此種權(quán)利要求對其授權(quán)的等同方案的全部范圍的限制；并且本發(fā)明不受具體實(shí)施方案的限制，所述具體實(shí)施方案在本文中為了舉例而呈現(xiàn)。上述出版物或文件的引用并不意味著承認(rèn)前述中的任何一種是有關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，也不意味著它構(gòu)成這些出版物或文件的內(nèi)容或日期的任何承認(rèn)。本文參考的美國專利其他出版物在此；I入作為參考。權(quán)利要求1.一種與人IL-23結(jié)合的結(jié)合化合物，其包含至少1個抗體輕鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，包含選自SEQIDNOs81-89的至少1個CDR序列；和至少1個抗體重鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，包含選自SEQIDNOs78-80的至少1個CDR序列。2.權(quán)利要求l的結(jié)合化合物，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，包含選自SEQIDNOs:81-89的至少2個CDR序列；和所述抗體重鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，包含選自SEQIDNOs:78-80的至少2個CDR序列。3.權(quán)利要求l的結(jié)合化合物，其中所述抗體輕鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，具有選自SEQIDNOs:81-89的至少3個CDR序列；和所述抗體重鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，具有選自SEQIDNOs:78-80的至少3個CDR序列。4.權(quán)利要求3的結(jié)合化合物，其包含來自SEQIDNOs:81-83的至少1個CDRL1;來自SEQIDNOs:84-86的至少1個CDRL2;和來自SEQIDNOs:87-89的至少1個CDRL3。5.權(quán)利要求4的結(jié)合化合物，其包含來自SEQIDNOs:69-71的至少1個CDRL1;來自SEQIDNOs:72-74的至少1個CDRL2;和來自SEQIDNOs:75-77的至少1個CDRL3。6.—種與人IL-23結(jié)合的結(jié)合化合物，其包含抗體輕鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，包含來自SEQIDNOs:69-71或其變體的至少1個CDRL1;來自SEQIDNOs:72-74或其變體的至少1個CDRL2;來自SEQIDNOs:75-77或其變體的至少1個CDRL3;和抗體重鏈可變區(qū)，或其片,殳，包含SEQIDNOs:66-68的CDR序列或其變體，其中所述變體包含最高達(dá)5個保守修飾的氨基酸置換。7.權(quán)利要求6的結(jié)合化合物，其中CDRL1包含SEQIDNO:69的所述序列或其變體；CDRL2包含SEQIDNO:72的所述序列或其變體；和CDRL1包含SEQIDNO:75的所述序列或其變體。8.—種與人IL-23結(jié)合的結(jié)合化合物，其包含抗體輕鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，包含SEQIDNO:2或4的殘基20-129的序列，或其變體；和抗體重鏈可變區(qū)，或其結(jié)合片段，包含SEQIDNO:1或3的殘基20-134的序列，或其變體；其中所述變體包含最高達(dá)20個保守修飾的氨基酸置換。9.權(quán)利要求8的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物是包含下迷的抗體或其結(jié)合片段包含SEQIDNO:2或4的殘基20-129的輕鏈可變區(qū)；和包含SEQIDNO:1或3的殘基20-134的重鏈可變區(qū)。10.權(quán)利要求9的結(jié)合化合物，其包含基本上由SEQIDNO:2的成熟形式(殘基20-233)組成的輕鏈；和基本上由SEQIDNO:1的成熟形式(殘基20-464)組成的重鏈。11.一種結(jié)合化合物，其在包含SEQIDNO:29的殘基82-95或殘基133-140的表位處與人IL-23結(jié)合。12.權(quán)利要求11的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物與包含SEQIDNO:29的殘基82-95和殘基133-140的表位結(jié)合。13.權(quán)利要求12的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物與包含SEQIDNO:29的殘基E82、G86、S87、D88、T91、G92、E93、P94、S95、H106、P133、S134、Q135、P136、W137、R139和L140的表位結(jié)合。14.一種與人IL-23結(jié)合的結(jié)合化合物，其包含與SEQIDNO:2或4的殘基20-129具有至少90%同源性的輕鏈可變區(qū)；和與SEQIDNO:1或3的殘基20-134具有至少90%同源性的重鏈可變區(qū)。15.—種抗體，其在交叉阻斷測定中能夠阻斷權(quán)利要求4的結(jié)合化合物與人IL-23的結(jié)合。16.權(quán)利要求4的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物阻斷IL-23介導(dǎo)的活性。17.—種分離的核酸，其編碼權(quán)利要求4的結(jié)合化合物的至少1個所述輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)。18.—種表達(dá)載體，其包含與控制序列可操作地連接的權(quán)利要求17的核酸，當(dāng)用所述載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞時，所述控制序列由所述宿主細(xì)胞識別。19.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求18的表達(dá)載體。20.—種生產(chǎn)多肽的方法，其包括在其中核酸序列表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞，從而生產(chǎn)包含輕和重鏈可變區(qū)的多肽；和從所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所述多肽。21.權(quán)利要求4的結(jié)合化合物，其進(jìn)一步包含重鏈恒定區(qū)，所述重鏈恒定區(qū)包含yl人重鏈恒定區(qū)或其變體，其中所述變體包含最高達(dá)20個保守修飾的氨基酸置換。22.權(quán)利要求4的結(jié)合化合物，其進(jìn)一步包含重鏈恒定區(qū)，所述重鏈恒定區(qū)包含y4人重鏈恒定區(qū)或其變體，其中所述變體包含最高達(dá)20個保守修飾的氨基酸置換。23.權(quán)利要求4的結(jié)合化合物，其中所述結(jié)合化合物是選自Fab、Fab，、Fab，-SH、Fv、scFv、F(ab，)2和雙抗體的抗體片革殳。24.—種抑制人受試者中的免疫應(yīng)答的方法，其包括以有效阻斷IL-23的生物學(xué)活性的量給有此需要的受試者施用對IL-23特異的抗體，或其結(jié)合片段，其中所述抗體是權(quán)利要求4的抗體。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述免疫應(yīng)答是炎癥應(yīng)答。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述受試者患有選自關(guān)節(jié)炎、牛皮辨和炎'l"生腸病的病癥。27.權(quán)利要求24的方法，其中所述免疫應(yīng)答是自身免疫應(yīng)答。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述受試者患有選自多發(fā)性硬化、全身性紅斑狼瘡和糖尿病的病癥。29.權(quán)利要求24的方法，其中所述受試者患有癌癥。30.權(quán)利要求24的方法，其進(jìn)一步包括施用免疫抑制劑或抗炎劑。31.—種組合物，其包含與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合的權(quán)利要求4的結(jié)合化合物。32.權(quán)利要求31的組合物，其進(jìn)一步包含免疫抑制劑或抗炎劑。全文摘要提供了針對人IL-23p19的工程改造的抗體，及其例如在炎性、自身免疫和增生性病癥治療中的用途。文檔編號C07K16/24GK101296944SQ200680040146公開日2008年10月29日申請日期2006年8月29日優(yōu)先權(quán)日2005年8月31日發(fā)明者B·M·拜爾,L·G·普雷斯塔,P·奧爾思,R·N·因格拉姆,Y·-H·劉申請人:先靈公司