一種磁性復合納米粒子及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種磁性復合納米粒子及其制備方法，具體說是設(shè)及一種W乙締基化 晚為配基，對抗體具有選擇性吸附的的復合磁性納米粒子及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗體工程技術(shù)隨著現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展而逐步完善，已成為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的主力 軍，尤其在生物技術(shù)制藥領(lǐng)域中占有重要地位?？贵w藥物W其高度特異性的療效，對人體毒 副作用小，己被廣泛應用于臨床診療，主要用于提高人體免疫力W及治療惡性腫瘤等。由于 用途不同，抗體的來源也有很大的差別，如用于提高人體免疫力的抗體來源于健康人的血 漿；治療惡性腫瘤的抗體則是人源化的單克隆抗體，來源于雜交瘤細胞。無論是何種來源的 抗體在應用于之前都要經(jīng)過嚴格的安全性和藥效性審查；作為注射制劑的應用模式也對抗 體的純度提出了更高的要求，高效的分離純化工藝是抗體質(zhì)量的保證，也是決定生產(chǎn)成本 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
[0003] 在純化抗體過程中應用頻率較多的是W蛋白A和蛋白G為配基的親和色譜。蛋白 A和蛋白G是金黃色葡萄球菌的細胞壁蛋白，能與IgG類抗體的Fc片斷特異性結(jié)合。由于 其對抗體具有很高的選擇性而?？谟糜诳贵w的分離純化，已經(jīng)被廣泛應用到工業(yè)化的抗體 制備中扣SPatent4230685)。該方法存在一些缺陷，如蛋白A親和層析介質(zhì)的價格昂貴、成 本高；使用壽命短、缺乏有效的清洗方法；在酸性洗脫條件W及反復使用易導致其喪失生 物活性；由于配基屬于蛋白質(zhì)，易被存在原料液中的蛋白酶水解，從而降低分離效果，而配 基的脫落易造成抗體產(chǎn)品的污染等。運些不足之處限制了其在大規(guī)?？贵w純化領(lǐng)域中的應 用。而且蛋白質(zhì)A配基所具有的缺點，蛋白質(zhì)G和蛋白質(zhì)L同樣具有，此外蛋白質(zhì)G的價格 比蛋白質(zhì)A還要昂貴，同樣面臨著大規(guī)模應用困難的問題。
[0004] 免疫親和法（IAC) W抗原（或抗體）作為配體與載體結(jié)合，組成固定相，用于分離 樣品中能特異結(jié)合的抗體（或抗原）。由于抗原與抗體的結(jié)合的特異性非常強，免疫親和法 是分離抗體非常有效的方法，且純度很高。但抗原相當昂貴，使用壽命短，故不適用于工業(yè) 規(guī)模大量生產(chǎn)。 陽〇化]離子交換色譜作為一種最常用的色譜技術(shù)被用于抗體的分離純化。通常情況下運 種層析介質(zhì)對蛋白質(zhì)的吸附要求在比較低的離子強度（20-50mM緩沖液）下進行。因此，料 液一般需要預先脫鹽或稀釋，運樣會增加操作步驟和時間，影響生產(chǎn)能力。由于免疫球蛋白 大多是疏水的，且不同的抗體的疏水程度也不同，所W疏水色譜化1C)亦被用于免疫球蛋 白的分離純化。由于HIC使用的是高濃度的硫酸錠作為流動相，因此，分離后的樣品必須進 行脫鹽后才可進行下一步的分離操作。運不僅會增加生產(chǎn)成本，而且加入的鹽有可能會破 壞目標蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，干擾后續(xù)的分離步驟。但通常僅采用離子交換或疏水色譜很難一 步純化得到高純度的抗體蛋白。
[0006] 為了解決蛋白質(zhì)A親和分離介質(zhì)存在的上述問題，采用對抗體具有特異親和作用 的小分子配體來取代昂貴的蛋白質(zhì)A親和配體。如將含有諷基和琉基乙醇為配基的親硫色 譜（Porathetal.陽BSLetters,1985, 185:306)用于抗體的分離純化。疏水電荷誘導色 譜化y化ophobicchargeinductionC虹omatogra地y,肥1C)是一種分離純化抗體的新技 術(shù)燈ongHF，LinDQ，GaoD，etal.JC虹omatogr4,2013，1285:88-96)，肥1(：主要通過增 加疏水基團的鍵合密度，同時選擇合適的離子化配基，使其在較高抑時不帶電荷，使蛋白 在吸附時只依靠疏水相互作用。解吸附時通過調(diào)節(jié)洗脫液抑值，使固定相表面帶上與蛋白 表面相同的電荷，從而依靠靜電斥力將蛋白質(zhì)洗脫下來。美國專利扣SPatent5, 652, 348; 5, 719, 269 ;7, 144, 743)報道了利用雜環(huán)配體進行抗體的疏水相互作用進行吸附分離的新 型分離介質(zhì)及其制備方法。其中W琉基乙基化晚為配基的層析介質(zhì)已經(jīng)有化11 Bios巧ara 公司商品化生產(chǎn)。中國專利（CN101284224)報道了一種W琉基化晚和諷基為配基、W纖 維素/無機增重劑復合微球為基質(zhì)的分離抗體的擴張床吸附介質(zhì)及制備方法。中國專利 (CN201210202165. 8)報道了一種W親水性凝膠微球為基質(zhì)，在均S嗦活化劑中制成活化基 質(zhì)，然后鍵合4-(2-徑基乙基）-化晚等兩個小分子配體，用于分離抗體的擴張床分離介質(zhì) 及制備方法。
[0007] 磁性納米材料作為一種新型功能復合材料，因其具有吸附能力強、表面可修飾、易 分離和良好的生物相容性等特點，已廣泛應用于生物、環(huán)境等復雜體系樣品的前處理過程 中。相對于傳統(tǒng)色譜分離技術(shù)，磁性復合微球在外磁場作用下可迅速地進行分離、回收和再 利用。
[0008] 近年來，磁性分離技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化方面表現(xiàn)出很好的優(yōu)勢。運種吸附劑粒 子的磁學響應性可W達到在其他懸浮固體顆粒存在的情況下選擇性的富集和分離目標物 的目的，使得從生物粗制樣品中直接分離純化目標蛋白成為可能，比如，發(fā)酵液、細胞懸浮 液、血漿、牛奶、乳清W及植物萃取液等。磁性分離技術(shù)的應用擬除了色譜填充柱繁瑣的處 理過程，比如離屯、、過濾、基質(zhì)分離等，而且，磁性分離技術(shù)有其獨一無二的優(yōu)勢，比如快速、 溫和、適用范圍廣、容易操作、可W實現(xiàn)其他技術(shù)難W實現(xiàn)或者不能實現(xiàn)的分離等。
[0009] 將對抗體具有特異吸附性能的琉基-乙基化晚（ME巧作為配基鍵合到磁性復合微 球的表面，可將磁性納米粒子的超順磁性和疏水電荷誘導色譜配基MEP對抗體的特異吸附 性能相結(jié)合，制備出一種對抗體具有選擇性吸附的新型生物功能化的磁性復合納米材料， 是一種疏水電荷誘導磁性吸附劑。該磁性復合微球含有一個可離子化的化晚環(huán)和一個含有 硫元素的疏水尾部，其地a為5. 8,在通常的生理條件下如抑7-8時，化晚環(huán)不帶電，MEP與 抗體通過溫和的疏水相互作用結(jié)合，當抑降低后，化晚環(huán)帶上正電荷，此時抗體由于抑低 于它的等電點也帶上相同的正電荷，當靜電排斥作用大過疏水作用時，抗體就從介質(zhì)上洗 脫下來。該磁性復合微球既有很好的超順磁性，又表現(xiàn)出對抗體吸附很高的親和性和選擇 性，可用于抗體的快速分離與制備。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明所設(shè)及的W乙締基化晚為配基，對抗體具有選擇性吸附的磁性復合納米粒 子：W磁性復合納米粒子Fe3〇4@Si〇2或Fe 3〇4@聚合物為基質(zhì)，配基為經(jīng)硅烷偶聯(lián)劑琉乙基立 甲氧基硅烷通過琉基-締點擊反應偶聯(lián)的乙締基化晚，本實驗制備的磁性復合納米粒子的 結(jié)構(gòu)組成為：
[0011]
[0012] 配基為乙締基化晚，包括4-乙締基化晚、3-乙締基化晚、2-乙締基化晚。
[0013] 所述一種磁性復合納米粒子是一種W乙締基化晚為配基，對抗體具有選擇性吸附 的磁性復合納米粒子，所述的磁性復合納米粒子W具有超順磁性的化化納米粒子為核，具 有包覆的Si化或聚合物為殼的核-殼結(jié)構(gòu)，F(xiàn)e 3〇4@Si化或化3〇4@聚合物磁性復合納米粒子 的粒徑為250~lOOOnm，所述的乙締基化晚，包括4-乙締基化晚、3-乙締基化晚、2-乙締基 化晚。
[0014] 所述的一種磁性復合納米粒子，具有疏水電荷誘導固相吸附劑的性質(zhì)，是一種疏 水電荷誘導磁性吸附劑。配基偶聯(lián)后含有一個可離子化的化晚環(huán)和一個含有硫元素的疏水 尾部，在通常的生理條件下如抑7-8時，化晚環(huán)不帶電，MEP與抗體通過溫和的疏水相互作 用結(jié)合，當抑降低后，化晚環(huán)帶上正電荷，此時抗體由于抑低于它的等電點也帶上相同的 正電荷，當靜電排斥作用大過疏水作用時，抗體就從介質(zhì)上洗脫下來。
[0015] 所述的一種磁性復合納米粒子，在進行特異性吸附時，將含有特異性抗體的樣品， 如血液、血清、血漿、腹水、細胞培養(yǎng)液、乳液、生物工程表達的單克隆抗體或卵黃等生物原 料中免疫球蛋