專利名稱：：用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)和改善皺紋的肽以及包含該肽的化妝品組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種人類胸腺素P-4(T(34)-模擬肽(humanthymosin卩-4(T(34)-mimickingpeptide)及其用途。
背景技術(shù)：
：毛發(fā)是一種細(xì)胞器(organelle)，根據(jù)毛嚢的生長(zhǎng)階段其生長(zhǎng)受到多種生長(zhǎng)因子的復(fù)雜調(diào)節(jié)。通常將毛嚢的分化和相關(guān)的毛發(fā)周期分成幾個(gè)階段毛發(fā)生長(zhǎng)初期、其中觀察到毛發(fā)脫落的毛發(fā)生長(zhǎng)中期、其中毛發(fā)生長(zhǎng)停止的毛發(fā)生長(zhǎng)終期；以及其中新的毛發(fā)產(chǎn)生并生長(zhǎng)的新的毛發(fā)生長(zhǎng)初期(Paus，R.，等人和Cotsarelis,G.(1999)Thebiologyofhairfollicles.N.Engl.J.Med.341，491-497)。將毛發(fā)生長(zhǎng)的毛發(fā)生長(zhǎng)初期階段分成兩個(gè)亞階段一個(gè)是使毛發(fā)從毛球產(chǎn)生進(jìn)入毛嚢的階段，而另一個(gè)是在毛嚢內(nèi)形成硬的角蛋白的階段。直到毛發(fā)生長(zhǎng)中期毛發(fā)一直在自我生長(zhǎng)。毛發(fā)生長(zhǎng)初期階段中毛發(fā)的壽命為3~6年。在毛發(fā)生長(zhǎng)初期階段的毛發(fā)占總毛發(fā)(100，000150，000根毛發(fā))的80~90%并且經(jīng)過(guò)1個(gè)月生長(zhǎng)大約1~1.5cm。在毛發(fā)生長(zhǎng)初期后的毛發(fā)生長(zhǎng)中期，毛發(fā)的新陳代謝變慢以保持毛發(fā)的形狀而毛發(fā)的生長(zhǎng)緩慢。此外，在該階段不形成角蛋白。毛發(fā)生長(zhǎng)中期持續(xù)1~1.5個(gè)月并占總毛發(fā)的1%。毛球收縮分成被毛嚢包繞的毛乳頭并依次移動(dòng)到上部。此時(shí)顯示細(xì)胞分裂停止。在毛發(fā)生長(zhǎng)終期階段，毛球皺縮，毛嚢逐漸收縮，并且毛根被推向上方最終去除(毛根部份向上升并且毛嚢的深度減少了1/3)。該階段是以毛發(fā)脫落為特點(diǎn)并且持續(xù)3~4個(gè)月。在毛發(fā)生長(zhǎng)終期階段的毛發(fā)占總毛發(fā)的4~14%(出生后占30~40%)并且僅通過(guò)用力沖危理或刺激就容易掉落。最后，在新的毛發(fā)生長(zhǎng)初期在毛發(fā)生長(zhǎng)初期階段中被毛嚢包繞的毛球與毛乳頭聯(lián)合誘導(dǎo)形成新的毛發(fā)。然后，新的毛發(fā)向上推進(jìn)并自然去除在生長(zhǎng)終期的舊毛發(fā)。以上描述的毛發(fā)周期不可能以相同的模式出現(xiàn)。根據(jù)如疾病、遺傳、身體狀態(tài)和年齡的條件的不同毛發(fā)周期可能不同。例如，可能發(fā)現(xiàn)一些如有未終止的毛發(fā)生長(zhǎng)終期的新的毛發(fā)生長(zhǎng)初期、沒(méi)有終毛發(fā)的毛發(fā)生長(zhǎng)初期以及柔軟的終毛發(fā)進(jìn)入毛發(fā)生長(zhǎng)中期的異常。此外，隨著社會(huì)變得更加復(fù)雜，如環(huán)境污染、應(yīng)激和許多化學(xué)性化合物的促使毛發(fā)脫落的因素逐漸增加。因此，受脫發(fā)困擾的人的數(shù)量有增加的趨勢(shì)。但是，還沒(méi)有提出能明顯預(yù)防毛發(fā)脫落或促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的化合物或物質(zhì)。因此，在本領(lǐng)域仍需要開(kāi)發(fā)能促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的新的物質(zhì)。1981年在牛的胸腺內(nèi)發(fā)現(xiàn)了胸腺素P-4(T(34)。T(34是由44個(gè)氨基酸組成的分子量為4.982kDa的弱酸性蛋白質(zhì)，并且理論上具有5.1的等電點(diǎn)。Tp4含有如谷氨酸和賴氨酸殘基的多個(gè)極性氨基酸。例如，TP4含有11個(gè)天冬氨酸和谷氨酸殘基，以及9個(gè)賴氨酸和精氨酸殘基。圖1顯示了推測(cè)的包含兩個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)的TP4的二級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的是T(34在細(xì)胞遷移和分化中作為調(diào)節(jié)劑起重要的作用并且還參與了傷口愈合和血管生成(Frohm,M.，Gunne，H.,Bergman,A.C,Agerberth，B.,Bergman,T.，Boman，A.，Liden,S.,Jornvall,H.和Boman,II.G.(1996)Biochemicalandantibacterialanalysisofhumanwoundandblisterfluid.Eur.J.Biochem.237，86-92)。但是，天然存在形式的TP4很有可能顯示出降低的治療效力，這是因?yàn)檫@樣的形式既不是生物學(xué)穩(wěn)定的也不是物理學(xué)均質(zhì)的。此外，天然形式的TfW相對(duì)低的皮膚滲透性也是個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題。因此，仍長(zhǎng)期需要開(kāi)發(fā)用來(lái)改善T(34的穩(wěn)定性和皮膚滲透性的新途徑。在本申請(qǐng)中，參考了多項(xiàng)專利和出版物并在括號(hào)內(nèi)提供了引用的出處。為更完整地描述本發(fā)明和本發(fā)明相關(guān)的技術(shù)水平，在本申請(qǐng)中完整引入這些專利的公開(kāi)內(nèi)容和出版物作為參考。
發(fā)明內(nèi)容為克服上述常規(guī)技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究以制備和篩選多種與天然存在TP4有相同活性的人類胸腺素p-4-衍生肽，并且已經(jīng)選擇出一種顯現(xiàn)出較高活性和穩(wěn)定性的肽，最終完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的為提供一種具有人類胸腺素(3-4(T(34)活性的肽。本發(fā)明的另一個(gè)目的為提供一種用于預(yù)防或治療胸腺素P-4-有效的紊亂或狀態(tài)的組合物。本發(fā)明的又另一個(gè)目的為提供一種預(yù)防或治療胸腺素(3-4-有效的紊亂或狀態(tài)的方法。本發(fā)明的又一目的為提供具有人類胸腺素(3-4(T卩4)活性的肽用于制備預(yù)防或治療胸腺素(3-4-有效的紊亂或狀態(tài)的組合物的用途。從以下詳細(xì)描述與所附權(quán)利要求和附圖中，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得明顯。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種具有人類胸腺素P-4(T(34)活性的肽，其包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于預(yù)防或治療胸腺素P-4-有效的紊亂或狀態(tài)的組合物，其包含如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的具有人類胸腺素P-4(TP4)活性的肽作為活性成分。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種預(yù)防或治療胸腺素(3-4-有效的紊亂或狀態(tài)的方法，其包括對(duì)受試者施用包含如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的具有人類胸腺素P-4(T(34)活性的肽作為活性成分的組合物。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的具有人類胸腺素J3-4(T(34)活性的肽用于制備預(yù)防或治療胸腺素J3-4-有效的紊亂或狀態(tài)的組合物的用途。本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究以制備和篩選多種與天然存在T|34有相同活性的人類胸腺素|3-4-衍生肽，并且已經(jīng)選擇出一種顯現(xiàn)出較高活性和穩(wěn)定性的肽。此外，本發(fā)明人通過(guò)》f飾人類T卩4-源肽(T(34-originatedpeptide)的氨基酸序列制備修飾肽，該修飾肽對(duì)如熱、酸和堿的理化因素具有好很多的穩(wěn)定性。本發(fā)明的包含SEQIDNO:l氨基酸序列的肽是天然存在T^4的肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)。本發(fā)明的肽包含人類T卩4-衍生的SEQIDNO:1氨基酸序列。優(yōu)選地，所述肽主要由SEQIDNO:l氨基酸序列組成。最優(yōu)選地，所述肽由SEQIDNO:l氨基酸序列組成。本文所用術(shù)語(yǔ)"肽"是指通過(guò)肽鍵連接氨基酸殘基而形成的直鏈分子。用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)化學(xué)合成法，尤其是固相合成技術(shù)(Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85:2149-54(1963);Stewart等人，SolidPhasePeptideSynthesis,2nd.ed.,PierceChem.Co.:Rockford，111(1984))可以制備本發(fā)明的肽。本發(fā)明的肽具有T(34-相關(guān)活性并顯現(xiàn)出與天然存在TP4相同或相似的體內(nèi)功能和功效。本文所用術(shù)語(yǔ)"Tp4-相關(guān)活性"是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的天然存在T卩4的任何以及全部活性，例如，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成和傷口愈合。由于制備本發(fā)明的肽是為了模擬天然存在TP4的作用，本發(fā)明的肽可以發(fā)揮天然存在T(34的全部體內(nèi)活性。由于本發(fā)明的肽顯現(xiàn)出與天然存在TP4相同或相似的功能和作用并顯示出與天然存在T(34相似的生物學(xué)活性，所以可將其有利地用于預(yù)防或治療胸腺素(3-4-有效的紊亂或狀態(tài)。如在試驗(yàn)性實(shí)施例1中所證明的，本發(fā)明的肽顯示出與天然存在T(34幾乎相同的生物學(xué)活性(見(jiàn)圖5)。本文所用術(shù)語(yǔ)"胸腺肽|3-4-有效的紊亂或狀態(tài)，，是指能用天然存在T(34預(yù)防或治療的紊亂或狀態(tài)。優(yōu)選地，可以將本發(fā)明的肽的著重預(yù)防或治療功效的活性描述為抗炎癥性活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)活性、傷口愈合，增加膠原、彈性蛋白、層粘連蛋白和透明質(zhì)酸的生物合成，治療牙周疾病或改善皮膚狀態(tài)。更優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物顯現(xiàn)出改善皮膚狀態(tài)的功效。尤其是，由于其因此，當(dāng)本發(fā)明的組合物局部施用于皮膚時(shí)，皮膚狀態(tài)顯著改善變得明顯。仍更優(yōu)選地，由本發(fā)明的組合物帶來(lái)的皮膚狀態(tài)的改善包括改善皺紋或皮膚彈性、預(yù)防皮膚老化、預(yù)防毛發(fā)脫落、促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、治療特異性變態(tài)反應(yīng)、改善皮膚濕度、去除暗斑或治療痤瘡，最優(yōu)選地，改善皺紋或〗足進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。的增殖，誘導(dǎo)原膠原、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸和纖連蛋白的生物合成以使角質(zhì)細(xì)胞層、表皮和真皮再生，從而引起皺紋、皮膚彈性和皮膚濕度的改善，預(yù)防皮膚衰老并治療特異性變態(tài)反應(yīng)綜合征。如在試驗(yàn)性實(shí)施例5中證明的，在動(dòng)物模型中所述肽與對(duì)照(未處理組)相比使得毛發(fā)生長(zhǎng)增加了25-30%。即使本發(fā)明的肽本身具有比天然存在T(34更高的穩(wěn)定性，其修飾使其能夠具有更高的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，SEQIDNO:l氨基酸序列具有至少一個(gè)用乙?；?、藥基曱氧羰基(fluorenylmethoxycarbonylgroup)、曱?；?、棕櫚?；⑷舛罐⒒?、硬脂?；蚓垡叶?PEG),最優(yōu)選用乙?；Ｗo(hù)的氨基酸殘基。本文所用術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定性"是指體內(nèi)穩(wěn)定性以及貯存穩(wěn)定性(例如，在室溫下的貯存穩(wěn)定性)。上述保護(hù)基團(tuán)保護(hù)本發(fā)明的肽在體內(nèi)免受蛋白酶的攻擊。8更優(yōu)選地，用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的氨基酸殘基為在N-末端或C-末端，最優(yōu)選在N-末端(Lys殘基)保護(hù)的氨基酸殘基。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，為增強(qiáng)穩(wěn)定性將在肽C-末端的Gin殘基的-COOH修飾成羥基(-OH)或氨基(-NH2)。由于本發(fā)明的肽，優(yōu)選地，含有保護(hù)基團(tuán)的修飾肽在其N-和/或C-末端被保護(hù)，其在37匸的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)了并且其對(duì)如酸和^5成的理化因素的穩(wěn)定性也同樣優(yōu)異。因此，由于本發(fā)明的肽具有顯著的長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定性，可以有利地將其用于制備需要長(zhǎng)期貯存的如藥物、準(zhǔn)-藥物(quasi-drug)、化妝品和牙齒/口腔清潔或護(hù)理產(chǎn)品的產(chǎn)品。本發(fā)明的組合物可以作為藥物或化妝品組合物制備。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述組合物為包含(a)藥用有效量的包含SEQIDNO:1氨基酸序列的肽；和(b)可藥用載體的藥物組合物。本文所用術(shù)語(yǔ)"藥用有效量"是指足以顯示出并實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的肽的效能和活性的量。本發(fā)明的藥物組合物內(nèi)含有的可藥用載體，其通常用在制藥配方中，但不限于此，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡膠(mbberarable)、磷酸鉀、精氨酸鹽(arginate)、凝膠、硅酸鉀、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、曱基纖維素、羥基苯曱酸曱酯、羥基苯曱酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。根據(jù)本發(fā)明所述的藥物組合物可以另外包含潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、增甜劑、增香劑、乳化劑、懸浮劑和防腐劑?？梢栽诶酌黝D藥物學(xué)(Remington'sPharmaceuticalSciences)(第19版，1995)中找到適合的可藥用載體和配方的詳細(xì)描述，這些內(nèi)容在此被完整引用作為參考。根據(jù)本發(fā)明所述的藥物組合物可以經(jīng)口或經(jīng)胃腸外施用，并且優(yōu)選地，為經(jīng)胃腸外，例如，經(jīng)靜脈、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、透皮或局部施用。本發(fā)明的藥物組合物的適合劑量可以根據(jù)制藥方法，施用方法，患者的年齡、體重、性別、發(fā)病狀態(tài)、飲食，施用時(shí)間，施用途徑，排泄率和對(duì)所用藥物組合物的敏感性而變化。優(yōu)選地，可以按0.0001~ioo嗎的每日劑量施用本發(fā)明的藥物組合物。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，可以與如上所述的可藥用載體和/或賦形劑一起配制根據(jù)本發(fā)明所述的藥物組合物，最終提供幾種形式的單劑量型和多劑量型。配方的非限制性實(shí)例包括，但不限于，在油或水介質(zhì)中的溶液、混懸液或乳狀液、浸膏、酏劑、顆粒、粒劑、片劑和膠嚢，并且可以進(jìn)一步包含分散劑或穩(wěn)定劑。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述組合物為包含(a)美容有效量的含有SF々IDNO:1氨基酸序列的肽；和(b)化妝品可用載體的化妝品組合物。本文所用術(shù)語(yǔ)"美容有效量"是指足以實(shí)現(xiàn)以上所述的改善皮膚狀態(tài)的功效的量。可以將本發(fā)明的化妝品組合物制成很多種形式，例如，包括溶液、混懸液、乳狀液、膏、油膏、凝膠、霜、洗劑、粉、肥皂、含表面活性劑的清潔劑、油、粉底、乳狀液粉底、蠟狀粉底和噴霧劑。具體而言，可以將本發(fā)明的化妝品組合物制成以下形式柔膚劑、營(yíng)養(yǎng)液、營(yíng)養(yǎng)霜、按摩霜、精華素、眼霜、清潔霜、清潔泡沫、清潔水、涂覆劑(pack)、噴霧劑或斗分。當(dāng)將本發(fā)明的化妝品組合物制成膏、霜或凝膠形式時(shí)，其可以包含動(dòng)物或植物脂肪、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅樹(shù)脂、月彭潤(rùn)土、二氧化硅、滑石、氧化鋅或這些物質(zhì)的混合物。在粉或噴霧劑的配方中，其可以包含乳糖、滑石、二氧化硅、氫氧化鋁、硅酸釣、聚酰胺粉末和這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑可以另外包含常規(guī)的推進(jìn)劑，例如，含氯氟烴、丙烷/丁烷或二曱醚。溶液和乳狀液的配方中可以包含溶劑、增溶劑和乳化劑，例如水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、千醇、苯曱酸芐酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇、油、甘油脂肪酯(glycerolfattyesters)、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯。混懸液的配方可以包含液體稀釋劑，例如，水、乙醇或丙二醇；混懸劑，例如乙氧化異硬脂醇(ethoxylatedisostearyalcohol)、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯山梨糖醇酐酯(polyoxyethylenesorbitanester)、樣i晶纖維素、氫氧化鋁(aluminummetahydroxide)、膨潤(rùn)土、瓊脂和黃芪力交或這些物質(zhì)的混合物。含表面活性劑的清潔組合物的配方可以包含脂族醇硫酸酯、脂族醇醚硫酸酯、磺基丁二酸單酯、異硫代硫酸酯(isothinate)、咪唑鎗酯衍生物(imidazoliumderivative),牛磺酸曱酯、肌氨酸酯(sarcocinate)、脂肪酸酰胺醚石克酸酯、烷基酰胺甜菜堿(alkylamidobetain)、脂族醇、甘油脂肪酸酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物(lanolinederivatives),乙氧基化脂肪酸甘油酯或這些成分的混合物。和載體。所述輔助配合劑的非限制性實(shí)例包括防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、維生素、著色劑、氣味添加劑或這些物質(zhì)的混合物。'能或作用并且其生物學(xué)活性與天然存在T(34的幾乎相同。此外，本發(fā)明的肽具有比天然存在T(34更高的穩(wěn)定性和皮膚滲透性。在此背景下，包含本發(fā)明肽的組合物可以顯現(xiàn)出對(duì)改善胸腺素P-4-有效的紊亂或狀態(tài)的極好功效。此外，可以有利地將本發(fā)明的肽應(yīng)用于藥物、化妝品、牙膏和口腔清潔和護(hù)理用的組合物，最優(yōu)選地，為化妝品。具體而言，可以有利地將本發(fā)明的肽應(yīng)用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的化、U-口仏口Po現(xiàn)在將通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是這些實(shí)施例是為了更具體地說(shuō)明，而如所附權(quán)利要求所述的本發(fā)明的范圍并不限于這些實(shí)施例也不受這些實(shí)施例的限制。圖1所示為胸腺素(3-4(TI34)的一級(jí)結(jié)構(gòu)和推測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖2示意性地顯示了合成本發(fā)明的示例性肽的方法。圖3所示為在實(shí)施例中制備的乙?；?八肽的高效液相層析分析的結(jié)果。圖4所示為在實(shí)施例中制備的乙?；?八肽的質(zhì)譜分析的結(jié)果。圖5所示為本發(fā)明的八肽和乙?；?八肽的生物學(xué)活性的測(cè)量結(jié)果。圖6所示為乙?；?八肽的穩(wěn)定性的分析結(jié)果。圖7所示為證明乙?；?八肽促進(jìn)人類角質(zhì)細(xì)胞活性的顯微鏡圖像。圖8所示為乙?；?八肽對(duì)人類角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)率的影響。圖9所示為顯示用乙酰基-八肽培養(yǎng)細(xì)胞中原膠原水平增加的圖。圖IO所示為顯示在用乙?；?八肽培養(yǎng)的細(xì)胞中透明質(zhì)酸水平增加的圖。圖11為顯示施用含有乙?；?八肽的化妝品的BalbC小鼠皮膚厚度改變的顯微鏡圖像。圖12為顯示乙?；?八肽對(duì)小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)的影響的照片。具體實(shí)施例方式實(shí)施例合成實(shí)施例1:Fmoc-Lys(Boc)畫(huà)Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)畫(huà)Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-樹(shù)脂的合成將700mg氯三苯曱基氯樹(shù)脂(CTL樹(shù)脂，NovaBiochemCatNo.01-64-0021)導(dǎo)入反應(yīng)器，向其中加入10ml二氯曱烷(MC)，然后攪拌3分鐘。去除溶液后，向生成物中加入10ml二甲基曱酰胺(DMF)然后進(jìn)行攪拌3分鐘，其后去除溶劑。向反應(yīng)器中加入10ml二氯曱烷溶液然后向反應(yīng)器中加入200mmole的Fmoc-Gln(trt)-OH和400mmole的DIEA，其后將該混合物攪拌溶解然后在攪拌下進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。用過(guò)量DCM/DMF(1:1)洗滌后，向生成物中加入1OmlDMF并進(jìn)行攪拌3分鐘，接著去除溶劑。將10ml脫保護(hù)溶液(deprotectionsolution)(20%哌啶/DMF)加入到反應(yīng)器并在室溫下攪拌IO分鐘然后去除溶液。加入等體積的脫保護(hù)溶液后，進(jìn)行反應(yīng)10分鐘并去除溶液，接著依次用DMF、MC和DMF洗滌從而生成Gln-(trt)-CTL樹(shù)脂。在新反應(yīng)器中加入10ml的DMF溶液然后加入200mmole的Fmoc-Thr(tBu)-OH、200mmole的HoBt和200mmole的Bop，接著攪拌溶解。將400mmole的DIEA加入到反應(yīng)器中并進(jìn)行攪拌以溶解所有的固體成分。將溶解的氨基酸溶液導(dǎo)入含有脫保護(hù)樹(shù)脂(deprotectedresin)的反應(yīng)器中并在室溫下攪拌進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。接著去除反應(yīng)溶液，用DMF溶液攪拌該生成物3次以去除未反應(yīng)的殘余物。取少量反應(yīng)的樹(shù)脂用(水合)茚三酮試驗(yàn)評(píng)價(jià)反應(yīng)的程度。以與如上所述的相同的方式用20Q/。的哌^(guò)!t/DMF溶液進(jìn)行脫保護(hù)兩次以生成Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL樹(shù)脂。用DMF和MC洗滌后，進(jìn)行(水合)茚三酮試驗(yàn)并進(jìn)行如上所述的氨基酸的連接?；诒景l(fā)明人設(shè)計(jì)的氨基酸序列，將Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(BoC)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH與樹(shù)脂連接。分別用DMF、MC和曱醇洗滌制備的肽基樹(shù)脂3次并在氮?dú)夥障赂稍铮浜髮⑵湓赑205下真空干燥，最終得到Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL-樹(shù)脂。合成實(shí)施例2:Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink酰胺樹(shù)脂的合成將1.42g(lmmole)的Fmoc-Rink酰胺樹(shù)月旨(NovaBiochemCatNo.01-64-0013)導(dǎo)入反應(yīng)器，向其中加入10ml的二氯曱烷(MC)，接著攪拌3分鐘。去除溶液后，向生成物加入10ml二曱基曱酰胺(DMF)然后進(jìn)行攪拌3分鐘，其后去除溶劑。將10ml脫保護(hù)溶液(20。/。哌咬/DMF)力。入反應(yīng)器并在室溫下攪拌IO分鐘然后去除溶液。加入等體積的脫保護(hù)溶液后，進(jìn)行反應(yīng)IO分鐘然后去除溶液，接著依次用DMF、MC和DMF洗滌。向新反應(yīng)器加入10ml的DMF;容液然后加入2mmole的Fmoc-Gln(trt)-OH、2mmole的HoBt和2mmole的Bop,接著攪拌溶解。將4mmole的DIEA加入反應(yīng)器并進(jìn)行攪拌以溶解所有的固體成分。將溶解的氨基酸溶液導(dǎo)入含有脫保護(hù)樹(shù)脂的反應(yīng)器中并在室溫下攪拌進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。接著去除反應(yīng)溶液，用DMF溶液攪拌生成物3次以去除未反應(yīng)的殘余物。取反應(yīng)的樹(shù)脂通過(guò)(水合)茚三酮試驗(yàn)評(píng)價(jià)反應(yīng)的程度。用20。/。的哌啶/DMF溶液，以如上所述的相同的方式進(jìn)行脫保護(hù)2次以生成Gln(trt)-Rink酰胺樹(shù)脂。用DMF和MC洗滌后，進(jìn)行(水合)節(jié)三酮試驗(yàn)并進(jìn)行如上所述的氨基酸的連接?；诒景l(fā)明人設(shè)計(jì)的氨基酸序列，將Fmoc-Glu(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Lys(Boc)-OH與樹(shù)脂連接。分別用DMF、MC和曱醇洗滌制備的肽基樹(shù)脂3次，并在氮?dú)夥障赂稍铮浜笤赑20s下真空干燥，最終得到Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)畫(huà)Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink酰胺樹(shù)脂。實(shí)施例1:Fmoc畫(huà)/V肽(Fmoc-Lys-Leu-Lys-Lys國(guó)Thr-Glu-Thr-Gln-OH)的合成合成實(shí)施例1中制備的Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL樹(shù)脂在由TFA、TIS和水(TFA:TIS:水，95:2.5:2.5)組成的溶液中溫育1小時(shí)。將該樹(shù)脂過(guò)濾并用少量體積的TFA溶液洗滌，其后用母液合并濾液。在減壓下蒸餾以降低總體積至一半，用冷乙醚誘導(dǎo)沉淀并用離心法收集形成的沉淀物，其后用冷乙醚洗滌2次。在氮?dú)夥障赂稍镌撋晌镆灾频?.1g未提純的Fmoc-八肽(Fmoc-KLKKTETQ)(收率91.9%)。用分子量分析器測(cè)量終產(chǎn)物的分子量為U98.5(理論MW1197.4)。實(shí)施例2:Ac-八肽(Ac-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)的合成用DMF溶脹在合成實(shí)施例1中制備的Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL樹(shù)脂并與20。/。哌咬/DMF溶液反應(yīng)2次10分鐘以去除Fmoc-保護(hù)基團(tuán)。將2ml乙酸酐、610mg的HoBt和1.77g的Bop導(dǎo)入新反應(yīng)器，然后將1.56ml的D正A加入反應(yīng)器中，隨后攪拌。將預(yù)制備的乙酸酑導(dǎo)入含有所述樹(shù)脂的反應(yīng)器并進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。依次用DMF、MC和曱醇洗滌該樹(shù)脂3次并徹底干燥。將干燥后的肽樹(shù)脂加入圓底燒瓶并與30mL離去溶液(leavingsolution)[含有95%TFA、2.5%蒸餾水和2.5%苯硫基曱烷]在室溫下間歇攪拌反應(yīng)2小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用少量體積的TFA溶液洗滌，其后用母液合并濾液。在減壓下蒸餾以降低總體積至一半，用50mL冷乙醚誘導(dǎo)沉淀并用離心法收集形成的沉淀物，其后用冷乙醚洗滌2次。去除母液后，在氮?dú)夥障赂稍镌撋晌镆灾频?.93g未提純的乙?；?八肽(Ac-KTKKTETQ)(收率91.4%)。用高效液相層析分餾所述未提純的肽，并收集主要的肽然后進(jìn)行蒸餾以去除乙腈，隨后進(jìn)行凍干制得0.72g提純的目的肽。用高效液相層析分析最終制備的肽，顯示純度為96%(圖3)。最后收率為70.9%。用質(zhì)量分析器測(cè)量的終產(chǎn)物的分子量為1018.0(理論MW1017.2)，證明成功合成了目的肽Ac-KTKKTETQ(圖4)。實(shí)施例3:曱?；?八肽(曱?；?Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)的合成用DMF溶脹在合成實(shí)施例1中制備的Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL樹(shù)脂并與20。/。哌咬/DMF溶液反應(yīng)2次10分鐘以去除Fmoc-保護(hù)基團(tuán)。將2ml乙酸肝、610mg的HoBt和1.77g的15Bop導(dǎo)入新反應(yīng)器，然后將1.56ml的DIEA加入該反應(yīng)器，然后攪拌。將預(yù)制備的乙酸酐導(dǎo)入含有所述樹(shù)脂的反應(yīng)器中然后進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。依次用DMF、MC和甲醇洗滌該樹(shù)脂3次并徹底干燥。將干燥過(guò)的肽基樹(shù)脂加入圓底燒瓶并與30mL的離去溶液[含有95%TFA、2.5%蒸餾水和2.5%苯硫基曱烷]在室溫下間歇攪拌反應(yīng)2小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用少量體積的TFA溶液洗滌，其后用母液合并濾液。在減壓下蒸餾以降^f氐總體積至一半，用50mL冷乙醚i秀導(dǎo)沉淀并用離心法收集形成的沉淀物，其后用冷乙醚洗滌2次。去除母液后，在氮?dú)夥障赂稍镌撋晌镆灾频?.88g未提純的曱?；?八肽(曱?；?KTKKTETQ)(收率87.7%)。用分子量分析器測(cè)量的終產(chǎn)物的分子量為1003.6(理論MW1003.2)。實(shí)施例4:棕櫚酰-八肽(棕櫚酰-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)的合成用DMF溶脹在合成實(shí)施例1中制備的Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL樹(shù)脂并用20。/。哌咬/DMF溶液反應(yīng)2次10分鐘以去除Fmoc-保護(hù)基團(tuán)。將5ml的DMF中的1.5mmo1棕櫚酰氯化物和1.56ml的DIPEA導(dǎo)入含有所述樹(shù)脂的反應(yīng)器并在35。C下進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。用30mL的DMF洗滌該生成物3次并用30mL的DCM洗滌4次并在氮?dú)夥障赂稍铮缓笤跍p壓下用P20s干燥，生成含有被棕櫚酰基保護(hù)的側(cè)鏈的十肽。將lg干燥的肽基樹(shù)脂加入圓底燒瓶中并與30mL離去溶液[含有95%TFA、2.5%蒸餾水和2.5。/。苯硫基甲烷]在室溫下間歇攪拌反應(yīng)1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用少量體積的TFA溶液洗滌，其后用母液合并濾液。在減壓下蒸餾以降低總體積至一半，用50mL冷乙醚誘導(dǎo)沉淀并用離心法收集形成的沉淀物，其后用冷乙醚洗滌2次。去除母液后，在氮?dú)夥障赂稍镌撋晌镆灾频?.4g未提純的棕櫚酰-十肽(棕櫚酰-KTKKTETQ)(收率113.9%)。用分子量分析器測(cè)量終產(chǎn)物的分子量為1230.2(理論MW1229.6)。實(shí)施例5和6:硬脂?；?八肽(硬脂?；?Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)和肉豆蔻基-八肽(肉豆蔻基-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-OH)的合成將在合成實(shí)施例1中制備的Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-CTL樹(shù)脂分成2批并與20。/。哌夂/DMF溶液反應(yīng)2次10分鐘以去除Fmoc-保護(hù)基團(tuán)。將5mLDMF中的1.5mmo1的肉豆蔻基氯化物(肉豆蔻基-十肽)或5mlDMF中的1.5mmo1的硬脂酰氯化物(硬脂酰-十肽)和1.56mL的DIPEA導(dǎo)入含有所述樹(shù)脂的反應(yīng)器并在35。C下進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。用30mLDMF洗滌該生成物3次并用30mLDCM洗滌4次并在氮?dú)夥障赂稍?，然后在減壓下用P205干燥，制得含有用肉豆蔻基或硬脂?；Ｗo(hù)的側(cè)鏈的十肽。將lg干燥的肽基樹(shù)脂加入圓底燒瓶并與10mL的離去溶液(含有81.5%TFA、5%蒸餾水、5%苯硫基曱烷、5%苯酚、2.5。/。EDT和1。/。TIS)在室溫下間歇攪拌1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用少量體積的TFA溶液洗滌，其后用母液合并濾液。在減壓下蒸餾以降低總體積至一半，用50mL冷乙醚誘導(dǎo)沉淀并用離心法收集形成的沉淀物，其后用冷乙醚洗滌2次。去除母液后，在氮?dú)夥障赂稍镌撋晌镆灾频胠.Olg未提純的肉豆蔻基-十肽(肉豆蔻基-KTKKTETQ)(收率84.1%)和l.lg未提純的硬脂酰-十肽(^更脂酰-KTKKTETQ)(收率87.5%)。用分子量分析器測(cè)量的終產(chǎn)物的分子量肉豆蔻基-十肽為1202.4(理論MW1201.5)以及硬脂酰-十肽為1258.5(理論MW1257.7)。實(shí)施例7:Fmoc-八肽(Fmoc-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-THr-Gln-NH2)的合成合成實(shí)施例2中制備的Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink酰胺樹(shù)脂在由TFA、TIS和水(TFA:TIS:水，95:2.5:2.5)組成的溶液中溫育1小時(shí)。將所述樹(shù)脂過(guò)濾并用少量體積的TFA溶液洗滌，其后用母液合并濾液。在減壓下蒸餾以減少總體積至一半，用冷乙醚誘導(dǎo)沉淀并通過(guò)離心收集形成的沉淀物，接著用冷乙醚洗滌2次。在氮?dú)夥障虑г镌撋晌镆灾频?.98g未提純的Fmoc-八肽(Fmoc-KLKKTETQ-NH2)(收率81.9%)。用分子量分析器測(cè)量的終產(chǎn)物的分子量為1196.9(理論MW1196.4)。實(shí)施例8:Ac-八肽(Ac-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)的合成用DMF溶脹在合成實(shí)施例2中制備的Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink酰胺扭t脂并與20。/。哌咬/DMF溶液反應(yīng)2次10分鐘以去除Fmoc-保護(hù)基團(tuán)。將2ml的乙酸酐、610mg的HoBt和1.77g的Bop導(dǎo)入新反應(yīng)器，然后將1.56mL的D正A加入反應(yīng)器，然后攪拌。將預(yù)制備的乙酸酐導(dǎo)入含有所述樹(shù)脂的反應(yīng)器并進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。依次用DMF、MC和曱醇洗滌該樹(shù)脂三次并徹底干燥。將干燥的肽基樹(shù)脂加入圓底燒瓶并與30mL離去溶液[含有95%TFA、2.5%蒸餾水和2.5%苯硫基曱烷]在室溫下間歇攪拌反應(yīng)2小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用少量體積的TFA溶液洗滌，其后用母液合并濾液。在減壓下蒸餾以降低總體積至一半，用50mL冷乙醚誘導(dǎo)沉淀并用離心法收集形成的沉淀物，其后用冷乙醚洗滌2次。去除母液后，在氮?dú)夥障赂稍镌撋晌镆灾频?.87g未提純的乙?；?八肽(AC-KTKKTETQ-NH2)(收率85.6%)。用高效液相層析分餾未提純的肽，收集主要的肽并進(jìn)行蒸餾以去除乙腈，接著通過(guò)凍干制得0.72g提純的目的肽。用高效液相層析分析最終制備的肽顯示純度為96%。最后收率為70.9%。用質(zhì)量分析器測(cè)量終產(chǎn)物的分子量為1016.9(理論MW1016.2)，證明成功合成了目的肽，Ac-KTKKTETQ-NH2。實(shí)施例9:曱?；?八肽(曱?；?Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)的合成用DMF;容月長(zhǎng)在合成實(shí)施例2中制備的Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink酰胺樹(shù)脂并與20。/。哌夂/DMF溶液反應(yīng)2次10分鐘以去除Fmoc-保護(hù)基團(tuán)。將2ml的乙酸肝、610mg的HoBt和1.77g的Bop導(dǎo)入新反應(yīng)器，然后將1.56ml的D正A加入該反應(yīng)器，然后攪拌。將預(yù)制備的乙酸酐導(dǎo)入含有所述樹(shù)脂的反應(yīng)器并進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。依次用DMF、MC和甲醇洗滌該樹(shù)脂三次并徹底干燥。將干燥的肽基樹(shù)脂加入圓底燒瓶并與30mL離去溶液[含有95。/。TFA、2.5%蒸餾水和2.5。/。苯硫基曱烷]在室溫下間歇攪拌反應(yīng)2小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用少量體積的TFA溶液洗滌，其后用母液合并濾液。在減壓下蒸餾以降低總體積至一半，用50mL冷乙醚誘導(dǎo)沉淀并用離心法收集形成的沉淀物，其后用冷乙醚洗滌2次。去除母液后，在氮?dú)夥障赂稍镌撋晌镆灾频?.89g未提純的曱?；?八肽(曱?；?KTKKTETQ-NH2)(收率88.8%)。用分子量分析器測(cè)量的終產(chǎn)物的分子量為1002.8(理論MW1002.2)。實(shí)施例10:棕櫚?；?八肽(棕櫚酰基-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)的合成用DMF溶脹在合成實(shí)施例2中制備的Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink酰胺樹(shù)脂并與20。/。哌啶/DMF溶液反應(yīng)2次10分鐘以去除Fmoc-保護(hù)基團(tuán)。將5mLDMF中的1.5mmo1棕櫚酰基氯化物和1.56mL的DIPEA導(dǎo)入含有所述樹(shù)脂的反應(yīng)器并在35。C下反應(yīng)1小時(shí)。用30mLDMF洗滌該生成物3次并用30mLDCM洗滌4次并在氮?dú)夥障赂稍?，然后在減壓下用P20s干燥，制得含有用棕櫚?；Ｗo(hù)的側(cè)鏈的十肽。將lg干燥的肽樹(shù)脂加入圓底燒瓶并與30mL離去溶液[含有95%TFA、2.5%蒸餾水和2.5%苯硫基曱烷]在室溫下間歇攪拌反應(yīng)1小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用少量體積的TFA溶液洗滌，其后用母液合并濾液。在減壓下蒸餾以降低總體積至一半，用50mL冷乙醚誘導(dǎo)沉淀并用離心法收集形成的沉淀物，其后用冷乙醚洗滌2次。去除母液后，在氮?dú)夥障赂稍镌撋晌镆灾频?.3g未提純的棕櫚?；?十肽(棕櫚?；?10100^丁(>皿2)(收率105.8%)。用分子量分析器測(cè)量終產(chǎn)物的分子量為1229.4(理論MW1228.6)。實(shí)施例11和12:硬脂酰-八肽(硬脂酰-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)和肉豆蔻基-八肽(肉豆蔻基-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-NH2)的合成將在合成實(shí)施例2中制備的Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Glu(tBu)-Thr(tBu)-Gln(trt)-Rink酰胺樹(shù)脂分成2批并與20。/。哌。定/DMF溶液反應(yīng)2次10分鐘以去除Fmoc-保護(hù)基團(tuán)。將5mLDMF中的1.5mmo1的肉豆蔻基氯化物(肉豆蔻基-十肽)或5mlDMF中的1.5mmo1的硬脂酰氯化物(硬脂?；?十肽)和1.56mL的DIPEA導(dǎo)入含有所述樹(shù)脂的反應(yīng)器并在35。C下進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。用30mLDMF洗滌該生成物3次并用30mLDCM洗滌4次并在氮?dú)夥障赂稍锶缓笤跍p壓下用P205干燥，制得含有用肉豆蔻基或硬脂?；Ｗo(hù)的側(cè)鏈的十肽。將lg干燥的肽基樹(shù)脂加入圓底燒瓶并與10mL的離去溶液(含有81.5%TFA、5%蒸餾水、5%苯硫基曱烷、5%苯酚、2.5%EDT和1。/。TIS)在室溫下間歇攪拌反應(yīng)l小時(shí)。將樹(shù)脂過(guò)濾并用少量體積的TFA溶液洗滌，其后用母液合并濾液。在減壓下蒸餾以降低總體積至一半，用50mL冷乙醚誘導(dǎo)沉淀并用離心法收集形成的沉淀物，其后用冷乙醚洗滌2次。去除母液后，在氮?dú)夥障赂稍镌撋晌镆灾频?.98g未提純的肉豆蔻基-十肽(肉豆蔻基-KTKKTETQ-NH2)(收率81.6%)和1.02g未#是純的石更脂酰-十肽(硬脂酰-10100^1(>皿2)(收率81.2%)。用分子量分析器測(cè)量的終產(chǎn)物的分子量肉豆蔻基-十肽為1201.4(理論MW1200.5)以及硬脂酰-十肽為1257.2(理論MW1256.7)。實(shí)施例13:納米肽的制備將在實(shí)施例2中合成的50mg乙?；娜芙庥?00mL蒸餾水中。將該肽與5g卵磷脂、0.3mL油酸鈉、50mL乙醇和少量體積的油混合，用蒸餾水將其體積調(diào)整至1L。終溶液在高壓下進(jìn)行微流化以乳化，從而制得大小為100-nm的納米體(nanosomes)。將該納米體制備成終濃度為大約50ppm并用作化妝品的成分。配方實(shí)施例1:柔力夫劑按照以下成分配制含有在實(shí)施例13中制備的乙?；牡募{米體的柔膚劑。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>配方實(shí)施例2:營(yíng)養(yǎng)霜按照以下成分配制含有在實(shí)施例13中制備的乙?；牡募{米體的營(yíng)養(yǎng)添和。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>配方實(shí)施例3:營(yíng)養(yǎng)液按照以下成分配制含有在實(shí)施例13中制備的乙酰基十肽的納米體的營(yíng)養(yǎng)液o表3<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>配方實(shí)施例4:精華素按照以下成分配制含有在實(shí)施例13中制備的乙?；牡募{米體的精華表4<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>配方實(shí)施例5~7:染發(fā)劑(HairToner)按照以下成分配制含有在實(shí)施例2中制備和提純的乙?；牡募{米體的染發(fā)劑。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>試驗(yàn)性實(shí)施例1:測(cè)試生物學(xué)活性根據(jù)Falco等人的方法用BALB/MK角質(zhì)細(xì)胞測(cè)量卩H]-胸苷的摻入(Falco等人(1988)Oncogene.,2,573)以評(píng)價(jià)實(shí)施例2的提純的乙?；?八肽的生物學(xué)活性。將BALB/MK角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)在含有添加100%FBS(月臺(tái)牛血清)的EMEM(Eagle'sminimalessentialmedia,Gibco，美國(guó))的250ml弁瓦中。用0.25%胰蛋白酶溶液處理培養(yǎng)的BALB/MK角質(zhì)細(xì)胞以使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部脫離并離心收集細(xì)胞團(tuán)。將細(xì)胞在不含F(xiàn)BS的EMEM中懸浮，將其等分試樣，2xl(^個(gè)細(xì)胞/0.3mL培養(yǎng)基加入24-孔板的每個(gè)孔并在37°C下7%C02中培養(yǎng)24小時(shí)。用2倍含0.2(w/v)。/o牛血清白蛋白的EMEM連續(xù)稀釋在實(shí)施例2中制備的2ng/ml乙?；穗?，并將0.3mL稀釋過(guò)的肽加入每個(gè)孔，接著在37。C下7。/QC02中繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。然后，將0.5|iCi的[3司-胸苷(Amersham,TRK686,68Ci/mmol)加入每個(gè)孔并培養(yǎng)過(guò)夜。去除上清液后，用PBS(磷酸緩沖鹽水)洗滌細(xì)胞一次并用O.lmL0.25%的胰蛋白酶在37°C下培養(yǎng)5分鐘以使細(xì)胞從板底部脫離。將含有10%FBS的0.5mL的EMEM加入每個(gè)孔并用細(xì)胞收集器使細(xì)胞與玻璃纖維濾器(12孔細(xì)胞收集器，Millipore，美國(guó))粘附。用lmL蒸餾水洗滌該濾器1次，用lmL乙醇洗滌l次，并在60。C下靜置30分鐘干燥。沿干燥的濾器添加2mL的閃爍混合物(scintillationcocktail)至閃爍小瓶并使其在室溫下靜置30分鐘，其后如圖5中所示用閃爍計(jì)數(shù)器(Beckman,美國(guó))測(cè)定摻入細(xì)胞的放射性。如圖5中所示，本發(fā)明的乙?；穗囊詣┝恳蕾嚪绞酱龠M(jìn)胸苷摻入角質(zhì)細(xì)胞。因此，可以理解的是本發(fā)明的乙?；穗木哂信c完整的Tf3-4F相似的生物學(xué)活性。試驗(yàn)性實(shí)施例2:評(píng)價(jià)穩(wěn)定性為評(píng)價(jià)提純的乙?；穗牡姆€(wěn)定性，將八肽和乙酰基十肽溶解于50mM的Tris-HCl(pH值8.0)中至濃度為10嗎/mL。將大腸桿菌(E.coli)產(chǎn)生的重組胸腺素P-4溶解于相同的緩沖液中至濃度為l昭/mL作為對(duì)照。將上述制備的溶液導(dǎo)入玻璃小并瓦并在37。C下靜置。然后，在0、1、10、25、50、75和100天取該溶液并用BALB/MK角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行卩H]-胸苷摻入以測(cè)定肽和重組胸腺素(3-4的剩余活性(圖6)。以在0天取樣的活性(100。/。)的相對(duì)值給出該結(jié)果。如圖6中所示，隨時(shí)間流逝天然存在胸腺素P-4的活性急劇下降。相反，本發(fā)明的八肽的活性并沒(méi)有顯示隨時(shí)間的流逝而下降。尤其是，含有乙?；Ｗo(hù)的N-末端的乙?；穗娘@現(xiàn)出極好的穩(wěn)定性。試驗(yàn)性實(shí)施例3:測(cè)試肽對(duì)HaCaT角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用根據(jù)Rizzino等人的方法(Rizzino等人CancerRes"48:4266(1988))用IIaCaT角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行SRB(磺酰羅丹明B)(SulforhodamineB)比色法，以測(cè)試本發(fā)明的肽對(duì)角質(zhì)細(xì)胞增殖的作用。將HaCaT角質(zhì)細(xì)胞(TheKoreanCellLineBank)培養(yǎng)在含有添力。100%FBS(胎牛血清)的EMEM(Eagle'sminimalessentialmedia,Gibco，美國(guó))的250mL瓶中。用0.25%胰蛋白酶處理培養(yǎng)的HaCaT角質(zhì)細(xì)胞以將細(xì)胞/人培養(yǎng)并瓦底部分離并離心收集細(xì)胞團(tuán)。將上述細(xì)胞在不含F(xiàn)BS的EMEM中懸浮，將其等分試樣(4xl0"的細(xì)胞加入96-孔板的每個(gè)孔中并在37。C下7%C02中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)24小時(shí)后，用不含血清的新鮮培養(yǎng)基更換原培養(yǎng)基并在如上所述的相同條件下用溶解于10%DMSO的胸腺素(3-4或乙?；?八肽(10ng/mL或1，000ng/mL)培養(yǎng)細(xì)胞72小時(shí)。去除上清液后，用PBS(磷酸緩沖鹽水)洗滌細(xì)胞1次并用SRB溶液(Sigma-Aldrich)培養(yǎng)。用PBS洗滌細(xì)胞并在顯微鏡下觀察尋找細(xì)胞的生存力。此外，測(cè)量在590nm的吸光率以測(cè)試細(xì)胞的增殖(圖7)。圖8是顯示用肽處理72小時(shí)的細(xì)胞的生存力的顯凝:鏡圖像。此外，用本發(fā)明的乙?；?八肽(1叱/mL)處理HaCaT細(xì)胞系并且斥企測(cè)顯示皮膚皺紋改善的指標(biāo)之一原膠原水平(圖9)。用原膠原ELISA試劑盒(Takara)測(cè)量原膠原的水平。為確定對(duì)改善皮膚皺紋的另一個(gè)指標(biāo)透明質(zhì)酸水平的作用，用本發(fā)明的乙?；?八肽(5pmole)培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞系并用透明質(zhì)酸ELISA試劑盒(EchelonBiosciencesInc,美國(guó))測(cè)量透明質(zhì)酸的水平(圖10)。如圖7和8中所示，本發(fā)明的肽比對(duì)照更能促進(jìn)細(xì)胞的生存力。在用本發(fā)明的肽處理的HaCaT角質(zhì)細(xì)胞中，細(xì)胞中的原膠原和透明質(zhì)酸水平以劑量依賴的方式增加(圖9和10)。因此，這些結(jié)果^U吏我們推論本發(fā)明的肽對(duì)改善皮膚皺紋表現(xiàn)顯著功效。試驗(yàn)性實(shí)施例4:測(cè)試肽對(duì)皮膚厚度的作用為評(píng)價(jià)本發(fā)明的肽對(duì)化妝品的適用性和體內(nèi)功效，將其化妝品配方用于小鼠的皮月夫。6周齡BalbC雄性小鼠(CentralLab.Animal,Inc.,韓國(guó))進(jìn)行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)用含巰基乙酸的霜?jiǎng)┎糠秩コ浔巢康拿l(fā)。將小鼠分成2組；對(duì)其中一組局部施用含有含納米體乙?；牡乃?jiǎng)鴮?duì)另一組局部施用包含乙?；穗牡暮{米體的配方實(shí)施例2。每天早上(A.M.8:30)及晚上(P.M.6:00)以lOOmg的劑量進(jìn)行涂敷5天。涂敷后，頸部脫位處死小鼠并將其皮膚組織包蠟。用切片機(jī)將包蠟的組織切片其厚度為8pm并用蘇木精/曙紅染色(hematoxyline/eosin)，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察(圖11)。如圖11中所示，包含本發(fā)明的乙酰基八肽的納米體化妝品能夠促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞層和表皮層的形成和生長(zhǎng)。因此，可以認(rèn)為包含本發(fā)明肽的化妝品發(fā)揮了改善皮膚皺紋和彈性的作用。試驗(yàn)性實(shí)施例5:測(cè)試毛發(fā)生長(zhǎng)的活性用剃毛刀和誘導(dǎo)毛發(fā)脫落的物質(zhì)徹底去除C3H/HeN小鼠背部的毛發(fā)。一天后，將配方實(shí)施例5(化妝水)涂敷于其背部25天然后觀察毛發(fā)生長(zhǎng)。如圖12中所示，結(jié)果，發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明的肽處理的小鼠的毛發(fā)生長(zhǎng)在最初毛發(fā)生長(zhǎng)作用以及毛發(fā)長(zhǎng)度和數(shù)量方面與對(duì)照相比增加了25~30%。描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)該理解的是在本發(fā)明實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)的變化和改變對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，并且本發(fā)明的范圍是由所附權(quán)利要求及其等同物決定的。權(quán)利要求1、一種具有人類胸腺素β-4(Tβ4)活性的肽，所述肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的肽，其中，所述肽的C-末端用羥基(-OH)或氨基(-麗2)修飾。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的肽，其中，所述肽的N-末端用選自由乙酰基、芴基甲氧羰(Fmoc)基、曱?；⒆貦磅；⑷舛罐⒒?、硬脂酰基和聚乙二醇(PEG)組成的組中的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。4、一種用于預(yù)防或治療胸腺素(3-4-有效的紊亂或狀態(tài)的組合物，所述組合物包含如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的具有人類胸腺素P-4(TP4)活性的肽作為活性成分。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中，所述組合物為包含(a)藥用有效量的如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的肽；和(b)可藥用載體的藥物組合物。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中，所述組合物為包含(a)美容有效量的如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的肽；和(b)化妝品可用載體的化妝品組合物。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中，所述組合物顯現(xiàn)出改善皮膚狀態(tài)的功戔文。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中，所述改善皮膚狀態(tài)為改善皺紋或皮膚彈性、預(yù)防皮膚老化、預(yù)防毛發(fā)脫落、促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、治療特異性變態(tài)反應(yīng)、改善皮膚的濕度、去除暗斑或治療痤瘡。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中，所述改善皮膚狀態(tài)為改善皺紋或促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。10、一種用于預(yù)防或治療胸腺素P-4-有效的紊亂或狀態(tài)的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用包含如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的具有人類胸腺素(3-4(T(34)活性的肽作為活性成分的組合物。11、根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中，所述組合物為包含(a)藥用有效量的如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的肽；和(b)可藥用載體的藥物組合物。12、根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中，所述組合物為包含(a)美容有效量的如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的肽；和(b)化妝品可用載體的化妝品組合物。13、根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中，所述組合物顯現(xiàn)出改善皮膚狀態(tài)的功效。14、根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述改善皮膚狀態(tài)為改善皺紋或皮膚彈性、預(yù)防皮膚老化、預(yù)防毛發(fā)脫落、促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、治療特異性變態(tài)反應(yīng)、改善皮膚的濕度、去除暗斑或治療痤瘡。15、根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述改善皮膚狀態(tài)為改善皺紋或促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。16、如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的具有人類胸腺素(3-4(T(34)活性的肽用于制備預(yù)防或治療胸腺素P-4-有效的紊亂或狀態(tài)的組合物的用途。17、根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其中，所述組合物為包含(a)藥用有效量的如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的肽；和(b)可藥用載體的藥物組合物。18、根據(jù)權(quán)利要求IO所述的用途，其中，所述組合物為包含(a)美容有效量的如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的肽；和(b)化妝品可用載體的化妝品組合物。19、根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其中，所述組合物顯現(xiàn)出改善皮膚狀態(tài)的功歲丈。20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，其中，所述改善皮膚狀態(tài)為改善皺紋或皮膚彈性、預(yù)防皮膚老化、預(yù)防毛發(fā)脫落、促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、治療特異性變態(tài)反應(yīng)、改善皮膚的濕度、去除暗斑或治療痤瘡。21、根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中，所述改善皮膚狀態(tài)為改善皺紋或促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。全文摘要本發(fā)明涉及一種包含特定氨基酸序列的具有人類胸腺素β-4(Tβ4)活性的肽及其用途。本發(fā)明的肽具有與人類Tβ4相同或相似的功能或作用，并且其生物學(xué)活性與天然存在Tβ4的幾乎相同。此外，本發(fā)明的肽顯現(xiàn)出比天然存在Tβ4更高的穩(wěn)定性和皮膚滲透性。在此背景下，包含本發(fā)明的肽的組合物可以顯現(xiàn)出對(duì)改善胸腺素β-4-有效的紊亂或狀態(tài)的極好功效。此外，可以有利地將本發(fā)明的肽用于藥物、化妝品、牙膏以及口腔清潔和護(hù)理用，最優(yōu)選地，為化妝品的組合物。具體而言，將本發(fā)明的肽有利地用于促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的化妝品。文檔編號(hào)C07K7/06GK101296939SQ200680039713公開(kāi)日2008年10月29日申請(qǐng)日期2006年10月24日優(yōu)先權(quán)日2005年10月24日發(fā)明者鄭镕池,金忠烈,金榮德申請(qǐng)人:凱爾杰有限公司