抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體及其制備方法及抗腫瘤基因工程藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體及其制備方法及抗腫瘤基因工程藥物，該抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體包括恒定區(qū)以及與恒定區(qū)連接的SIRPα和B7。該抗腫瘤基因工程抗體的制備方法包括：獲取恒定區(qū)基因、SIRPα基因和B7基因；構(gòu)建包括上述三種基因的表達(dá)質(zhì)粒；將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至表達(dá)細(xì)胞株中進(jìn)行培養(yǎng)；分離純化后得到二價(jià)類抗體。本發(fā)明的二價(jià)類抗體同時(shí)具有可分別與腫瘤細(xì)胞上的CD47位點(diǎn)和淋巴細(xì)胞上的CD28位點(diǎn)特異性結(jié)合的SIRPα和B7，特異性結(jié)合作用顯著增強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)雙重抑制機(jī)體腫瘤細(xì)胞的能力；本發(fā)明的制備方法工藝簡(jiǎn)單、切實(shí)可行；具有二價(jià)類抗體的抗腫瘤基因工程藥物可有效作用于腫瘤細(xì)胞，并有效預(yù)防和治療腫瘤疾病。
【專利說(shuō)明】抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體及其制備方法及抗腫瘤基因工程藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及抗腫瘤基因工程抗體，更具體地，涉及抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體及其制備方法及抗腫瘤基因工程藥物。
【背景技術(shù)】
[0002]⑶47又稱整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白(integrinassociated protein, IAP),其配體為信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白 α 鏈(signal regulatory protein alpha, SIRP α )。CD47 通過(guò)與 SIRP α 結(jié)合可產(chǎn)生抑制性信號(hào)來(lái)降低吞噬細(xì)胞(單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞)的吞噬活性，進(jìn)而對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用。在白血病、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌和乳腺癌等惡性疾病的研究中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞存在CD47的升高，且CD47高表達(dá)提示臨床預(yù)后不良，一些類型的腫瘤干細(xì)胞中亦存在⑶47的過(guò)表達(dá)。腫瘤細(xì)胞借⑶47-SIRPa通道，產(chǎn)生“別吃我”信號(hào)，從而逃避免疫系統(tǒng)的自我監(jiān)測(cè)。使用抗⑶47抗體，通過(guò)阻斷⑶47-SIRPa通道抑制細(xì)胞吞噬的作用，能夠顯著增強(qiáng)了機(jī)體免疫系統(tǒng)能力，達(dá)到抗腫瘤的目的。有文獻(xiàn)表明使用抗CD47單克隆抗體治療非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌等腫瘤也獲得了一定的療效。
[0003]共刺激分子B7/CD28在T淋巴細(xì)胞的激活方面有著重要的作用，他們可提供激活T淋巴細(xì)胞的正性信號(hào)來(lái)刺激T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分化，同時(shí)也已證實(shí)⑶28廣泛表達(dá)于T淋巴細(xì)胞。⑶28與APC上的B7結(jié)合后，為T淋巴細(xì)胞提供共刺激信號(hào)。它們的結(jié)合對(duì)初次免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)是必需的，主要涉及樹(shù)突狀細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞相互作用的起始階段，該信號(hào)修飾和補(bǔ)充TCR信號(hào)，并將多種信號(hào)整合后，起著信號(hào)傳遞、增強(qiáng)或放大免疫應(yīng)答的作用，因此可以利用B7/⑶28的這一性質(zhì)來(lái)促進(jìn)免疫反應(yīng)，達(dá)到治療腫瘤的目的。有文獻(xiàn)表明B7-FC融合蛋白同樣可以有效激活、增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的免疫功能。
[0004]目前已經(jīng)出現(xiàn)的一些抗腫瘤抗體主要是通過(guò)單獨(dú)與⑶47結(jié)合，或者單獨(dú)與⑶28結(jié)合，通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)能力，達(dá)到抗腫瘤的目的。但是單一結(jié)合位點(diǎn)與腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合作用有限，對(duì)腫瘤的防治效果不明顯。SIRP α分子具有高度的親嗜性，可選擇性地與腫瘤細(xì)胞CD47分子結(jié)合，共刺激分子B7可選擇性地與T淋巴細(xì)胞CD28分子結(jié)合，本發(fā)明的二價(jià)類抗體同時(shí)具有上述可分別與腫瘤細(xì)胞上的⑶47位點(diǎn)和T淋巴細(xì)胞上的⑶28位點(diǎn)特異性結(jié)合的SIRPa和B7，特異性結(jié)合作用顯著增強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)雙重增強(qiáng)機(jī)體清除腫瘤細(xì)胞的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的抗腫瘤抗體與腫瘤細(xì)胞的特異性結(jié)合作用有限、對(duì)腫瘤的防治效果不明顯的缺陷，提供一種可同時(shí)與腫瘤細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合、有效預(yù)防和治療腫瘤感染的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體及抗腫瘤基因工程藥物。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于，提供一種工藝簡(jiǎn)單、便于實(shí)施的上述抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體的制備方法。
[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn):提供一種抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體，所述二價(jià)類抗體包括兩個(gè)可變區(qū)和將所述兩個(gè)可變區(qū)連接在一起的恒定區(qū)，所述兩個(gè)可變區(qū)分別為SIRPa和B7 ;所述恒定區(qū)為柔性連接肽、或者所述恒定區(qū)為人抗體的恒定區(qū)。
[0008]在上述抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體中，所述柔性連接肽具有序列表中的SEQ IDNo:16所示的氨基酸序列，所述人抗體的恒定區(qū)為具有激活人體免疫功能的抗體Fe片段。
[0009]在上述抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體中，所述人抗體的恒定區(qū)為IgG抗體的恒定區(qū)、IgA抗體的恒定區(qū)或IgM抗體的恒定區(qū)。
[0010]在上述抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體中，所述SIRP α和所述Β7分別通過(guò)柔性連接肽與所述人抗體的恒定區(qū)柔性連接，所述柔性連接肽具有序列表中的SEQ ID Νο:16所示的
氨基酸序列。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種上述抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體的制備方法，其中，所述方法包括以下步驟:
[0012]A:分別獲取恒定區(qū)基因、SIRPa基因和Β7基因；
[0013]B:當(dāng)所述恒定區(qū)基因?yàn)槿丝贵w的恒定區(qū)基因時(shí)，采用真核表達(dá)載體構(gòu)建包括人抗體的恒定區(qū)基因、SIRP α基因和B7基因的表達(dá)質(zhì)粒；
[0014]或者，當(dāng)所述恒定區(qū)基因?yàn)槿嵝赃B接序列時(shí)，采用原核表達(dá)載體或所述真核表達(dá)載體構(gòu)建包含柔性連接序列、SIRP α基因和B7基因的表達(dá)質(zhì)粒；
[0015]C:將步驟B中形成的表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至表達(dá)細(xì)胞株中進(jìn)行培養(yǎng),穩(wěn)定表達(dá)二價(jià)類抗體；
[0016]D:離心收集上清或細(xì)胞進(jìn)行純化后得到所述二價(jià)類抗體。
[0017]在上述抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體的制備方法中，在步驟B中，所述人抗體的恒定區(qū)基因?yàn)镮gG抗體的恒定區(qū)基因、IgA抗體的恒定區(qū)基因或IgM抗體的恒定區(qū)基因；所述柔性連接序列具有以下核苷酸序列:GAA TGT TCC0
[0018]在上述抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體的制備方法中，在步驟B中，所述真核表達(dá)載體為 pCDNA3.1/His C、pCDNA5/FRT/T0 TOPO TA、pEGFP-Nl 或 pBudce4.1 ;所述原核表達(dá)載體為 pET28a、pGEX-4T-l 或 pTrxA。
[0019]在上述抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體的制備方法中，在步驟C中，所述表達(dá)細(xì)胞株為293細(xì)胞、293T細(xì)胞或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種抗腫瘤基因工程藥物，其中，所述抗腫瘤基因工程藥物含有上述抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體。
[0021]實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案，可以獲得以下技術(shù)效果:本發(fā)明的二價(jià)類抗體同時(shí)具有可與腫瘤細(xì)胞上的CD47位點(diǎn)和T淋巴細(xì)胞上的CD28位點(diǎn)特異性結(jié)合的SIRP α和Β7，不僅特異性結(jié)合作用顯著增強(qiáng)，而且可以通過(guò)抑制吞噬細(xì)胞的吞噬活性和激活淋巴細(xì)胞兩種途徑實(shí)現(xiàn)雙重阻止腫瘤細(xì)胞感染宿主細(xì)胞的作用；本發(fā)明的制備方法工藝簡(jiǎn)單、切實(shí)可行；具有本發(fā)明的二價(jià)類抗體的抗腫瘤基因工程藥物可有效作用于腫瘤細(xì)胞，從而有效預(yù)防和治療腫瘤細(xì)胞感染?！揪唧w實(shí)施方式】
[0022]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0023]本發(fā)明的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體(以下簡(jiǎn)稱二價(jià)類抗體)為恒定區(qū)分別同時(shí)與SIRP α和Β7連接形成的類抗體，這樣構(gòu)建的二價(jià)類抗體具有阻止腫瘤細(xì)胞感染宿主細(xì)胞的雙重作用，可有效治療和預(yù)防腫瘤細(xì)胞感染。當(dāng)恒定區(qū)采用柔性連接肽時(shí)，所構(gòu)建的二價(jià)類抗體生物活性高、治療和預(yù)防腫瘤細(xì)胞感染的效果顯著。當(dāng)恒定區(qū)采用人抗體的恒定區(qū)時(shí)，SIRPa和Β7主要是替換了人抗體的可變區(qū)，并通過(guò)柔性連接肽與人抗體的恒定區(qū)連接，這樣構(gòu)建的二價(jià)類抗體的主要部分仍為人抗體的恒定區(qū)，因此減少了異源性抗體的免疫原性，同時(shí)保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。不僅如此，人抗體的恒定區(qū)為具有激活人體免疫功能的抗體Fe片段，其可執(zhí)行病毒清除功能，進(jìn)一步完善該二價(jià)類抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞造成的感染的預(yù)防和治療功效。
[0024]本發(fā)明的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體的制備方法包括以下步驟:Α:分別獲取恒定區(qū)基因、SIRPa基因和Β7基因；Β:當(dāng)所述恒定區(qū)基因?yàn)槿丝贵w的恒定區(qū)基因時(shí)，采用真核表達(dá)載體構(gòu)建包括人抗體的恒定區(qū)基因、SIRP α基因和Β7基因的表達(dá)質(zhì)粒；或者，當(dāng)所述恒定區(qū)基因?yàn)槿嵝赃B接序列時(shí)，采用原核表達(dá)載體或所述真核表達(dá)載體構(gòu)建包含柔性連接序列、SIRPa基因和Β7基因的表達(dá)質(zhì)粒；C、將步驟B中形成的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至表達(dá)細(xì)胞株中進(jìn)行培養(yǎng)，穩(wěn)定表達(dá)二價(jià)類抗體；D、離心收集上清或細(xì)胞進(jìn)行純化后得到二價(jià)類抗體。通過(guò)細(xì)胞株表達(dá)可獲得同時(shí)具有SIRP α和B7的二價(jià)類抗體，該方法操作簡(jiǎn)便、便于實(shí)現(xiàn)上述二價(jià)類抗體的擴(kuò)大化生產(chǎn)。
[0025]進(jìn)一步地，上述步驟A具體包括以下步驟:
[0026]Al:人抗體的恒定區(qū)基因的釣取:
[0027]設(shè)計(jì)合適的引物，從人血細(xì)胞cDNA中釣取人抗體的恒定區(qū)基因。由于恒定區(qū)基因非常保守，人抗體的恒定區(qū)基因的釣取比較容易。在美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)、法國(guó)免疫球蛋白基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)(IMGT)等數(shù)據(jù)庫(kù)中，很容易找到人抗體的恒定區(qū)基因序列以及引物。在選擇人抗體的恒定區(qū)基因時(shí)，本發(fā)明優(yōu)選使用IgG抗體的恒定區(qū)基因、IgA抗體的恒定區(qū)基因或IgM抗體的恒定區(qū)基因(這樣最后制備得到的二價(jià)類抗體分別優(yōu)選具有IgG抗體的恒定區(qū)、IgA抗體的恒定區(qū)和IgM抗體的恒定區(qū))。以下則通過(guò)IgG抗體的恒定區(qū)基因展開(kāi)詳細(xì)敘述。優(yōu)選采用IgGl抗體，特別優(yōu)選地，使用IgGl抗體的亞類K型，以有效發(fā)揮其 生物學(xué)功能并延長(zhǎng)其在人體內(nèi)的半衰期。
[0028]IgGl抗體的恒定區(qū)基因的釣取:在美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)、法國(guó)免疫球蛋白基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)(IMGT)等數(shù)據(jù)庫(kù)中查找人IgGl恒定區(qū)基因序列，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的上游和下游引物，分別為:
[0029]上游引物的引物序列1:5’ -AAT CTC GAG GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG-3，，
[0030]下游引物的引物序列2:5’ -ATC TCT GAG TTTACC CGG AGA CAG GGA GAG-3’，
[0031 ] 分別引入了 Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)。
[0032]A2:SIRPa基因的釣取:
[0033]在美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)、法國(guó)免疫球蛋白基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)aMGT)等數(shù)據(jù)庫(kù)中查找SIRP α基因序列(人SIRP α基因序列)，截取其表達(dá)在胞外的部分功能序列，并設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的上下游引物，其中下游引物中引入柔性連接序列(GAA TGT TCC)，所述上游和下游引物具體為:
[0034]上游引物的引物序列3:5，-GTG GAA TTC ATG GAG CCC GCC GGC CCG GCC-3，，
[0035]下游引物的引物序列4:5’-ATC CTC GAG GGA ACA TTC CTT CCT CGG GAC CTG GACGCT-3，，
[0036]分別引入了 EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)。
[0037]A3:B7基因的釣取:
[0038]在美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)、法國(guó)免疫球蛋白基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)aMGT)等數(shù)據(jù)庫(kù)中查找B7基因序列(人B7基因序列)，選擇其表達(dá)在胞外的最后一個(gè)環(huán)狀區(qū)域及后面部分的功能蛋白序列，并設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的上游和下游引物，其中下游引物中引入柔性連接序列(GAA TGT TCC)，所述上游和下游引物分別為:
[0039]上游引物的引物序列5:5’ -GTG GAA TTC ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG-3，，
[0040]下游引物的引物序列6:5’-ATC CTC GAG GGA ACA TTC TAC AGG GCG TAC ACT TTCCCT-3，，
[0041 ] 分別引入了 EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)。
[0042]A4:柔性連接序列的構(gòu)建:
[0043]為了使重組抗體形成類似天然的抗體結(jié)構(gòu)，引入柔性連接序列，將IgGl抗體的恒定區(qū)基因與SIRPa基因和B7基因連接，可以促進(jìn)重組抗體以二硫鍵的形式形成天然結(jié)構(gòu)的抗體分子。柔性連接序列在美國(guó)國(guó)立生物信息中心(NCBI)、歐洲生物信息中心(EBI)Ji國(guó)免疫球蛋白基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)(MGT)等數(shù)據(jù)庫(kù)中，以人IgGl輕鏈分子與IgGl重鏈分子相結(jié)合的部位，設(shè)計(jì)引物如下:
[0044]上游引物的引物序列7:5’ -GAA GTC ACC CAT CAG GGC-3，；
[0045]下游引物的引物序列8:5’ -ACA CTC TCC CCT GTT GAA-3’
[0046]A5 =IgGl抗體的恒定區(qū)基因、柔性連接序列、SIRP α基因和B7基因的PCR擴(kuò)增:
[0047]從人新鮮血樣中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成人cDNA，以人cDNA為模板，以IgGl抗體的恒定區(qū)基因、柔性連接序列、SIRPa基因和B7基因各自的上游和下游引物分別擴(kuò)增，各自得到約1000bp、60bp、1500bp和800bp大小的基因片段。隨后，將擴(kuò)增得到的基因片段分別裝入T載體，經(jīng)基因測(cè)序分析證實(shí)各基因片段為所需要的目的基因。
[0048]成功獲取所需的各基因片段后，構(gòu)建符合要求的表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至表達(dá)細(xì)胞株中培養(yǎng)。為便于多方面考察本發(fā)明的二價(jià)類抗體的可行性和實(shí)際應(yīng)用方面的可靠性，本發(fā)明采用以下真核表達(dá)載體PCDNA3.1/His C、pCDNA5/FRT/T0 TOPO TA、pEGFP_Nl 或pBudce4.1，以及以下原核表達(dá)載體:pET28a、pGEX-4T-l或pTrxA。另外，由于基因工程抗體的表達(dá)水平主要取決于表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(表達(dá)細(xì)胞株)，因此，適用于本發(fā)明的表達(dá)細(xì)胞株的選取也比較重要。對(duì)于本研究的二價(jià)類抗體，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是最佳的選擇。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有抗體折疊形成正確空間結(jié)構(gòu)所必需的分子伴侶和折疊酶，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為抗體分子正確折疊和鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵的形成提供了有利的氧化還原環(huán)境。此外，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)還擁有完整的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后修飾、信號(hào)肽的剪切以及糖基化等優(yōu)勢(shì)，使表達(dá)的抗體空間結(jié)構(gòu)近似于天然，有利于發(fā)揮其生物學(xué)功能，并延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期。本發(fā)明可選用293細(xì)胞、293T細(xì)胞(又稱為人腎上皮細(xì)胞系Flp-1n T-Rex 293)或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，并優(yōu)選使用293細(xì)胞作為表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，來(lái)建立起SIRP α -Β7- 二價(jià)類抗體穩(wěn)定表達(dá)的293細(xì)胞。考慮到表達(dá)的穩(wěn)定，染色體整合式表達(dá)系統(tǒng)將被采用。
[0049]以下實(shí)施例將詳細(xì)說(shuō)明如何采用獲得的基因片段制備本發(fā)明的二價(jià)類抗體。其中，實(shí)施例1-4為采用人抗體的恒定區(qū)作為恒定區(qū)的具體示例，實(shí)施例5-8為采用柔性連接肽作為恒定區(qū)的具體示例。
[0050]實(shí)施例1:
[0051]將IgGl抗體的恒定區(qū)基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xho I和Xba I酶切后裝入同樣酶切的真核表達(dá)載體P⑶ΝΑ3.1/His C中，構(gòu)建成含有IgGl抗體的恒定區(qū)基因的重組質(zhì)粒P⑶NA3.1/His C-1gG ;將經(jīng)PCR擴(kuò)增的SIRPa基因和B7基因克隆至含有IgGl抗體的恒定區(qū)基因的重組質(zhì)粒PCDNA3.1/His C-1gG中，構(gòu)建成含有IgGl抗體的恒定區(qū)基因與SIRP α基因和B7基因柔性連接的真核表達(dá)質(zhì)粒 pCDNA3.1/His C-SIRP a -1gG 和 pCDNA3.1/His C_B7_IgG。具體地，通過(guò)柔性連接序列(GAA TGT TCC)實(shí)現(xiàn)上述柔性連接。
[0052]采用293細(xì)胞作為表達(dá)細(xì)胞株，提取高質(zhì)量高濃度的真核表達(dá)質(zhì)粒P⑶NA3.1/HisC-SIRPa -1gG和PCDNA3.1/His C_B7_IgG，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，48小時(shí)后用四環(huán)素誘導(dǎo)，收集細(xì)胞并裂解。采用HIS binds進(jìn)行抗體提純，取30 μ IHIS binds，加入TBST洗滌三次，去盡TBST后再加入300 μ I TBST溶液，加入細(xì)胞裂解液50 μ 1，4°C輕輕搖動(dòng)2-3小時(shí)，去盡上清，加入1000 μ I TBST溶液洗滌三次，去盡上清，加入20 μ I TBST和20 μ I蛋白上樣loading buffer于95°C溫度上變性5分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，采用人FC抗體進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)2小時(shí)后，ECL顯色，可以清楚檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。
[0053]實(shí)施例2:
[0054]設(shè)計(jì)引物，引物序列9 為:5’-CTT AAG CTT ACC ATG GGG GGT TCT-3’，從實(shí)施例1的真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3.1/His C-SIRP a-1gG和pCDNA3.1/His C_B7_IgG中擴(kuò)增出真核表達(dá)載體pCDNA3.1/His C帶有選擇標(biāo)簽(6 X His標(biāo)簽和Xpress Epitop標(biāo)簽)的SIRPa-1gG和B7-1gG基因，將這兩個(gè)基因裝入pCDNA5/FRT/T0 TOPO TA的真核載體中，得到真核表達(dá)質(zhì)粒 PCDNA5/FRT/T0 TOPO TA-SIRP a-1gG 和 pCDNA5/FRT/T0 TOPO TA_B7_IgG。
[0055]采用人腎上皮細(xì)胞系Flp-1n T-Rex 293作為表達(dá)細(xì)胞株，建立穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株，提取高質(zhì)量高濃度的真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA5/FRT/T0 TOPO TA-SIRP a -1gG和pCDNA5/FRT/TO TOPO TA-B7-1gG，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到Flp-1n T-Rex 293細(xì)胞中，24小時(shí)后采用抗生素Blasticidin B進(jìn)行抗性篩選，10天后，用96孔板稀釋法篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，并進(jìn)行大量細(xì)胞培養(yǎng)，用四環(huán)素誘導(dǎo)，收集細(xì)胞并裂解，采用HIS binds進(jìn)行抗體提純，取30μ1 HIS binds，加入TBST洗滌三次，去盡TBST，再加入300μ I TBST溶液，加入細(xì)胞裂解液50 μ 1，4°C輕輕搖動(dòng)2-3小時(shí)，去盡上清，加入1000 μ I TBST溶液洗滌三次，去盡上清，加入20 μ I TBST和20 μ I蛋白上樣loading buffer于95°C溫度上變性5分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，采用人FC抗體進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)2小時(shí)后，ECL顯色，可以清楚檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。
[0056]實(shí)施例3:
[0057]設(shè)計(jì)引物，引物序列10 為:5’ -AAT GTC GAC AGA TCT GC GGT CCGGCG CGG AACCAG TTT ACC CGG AGA CAG GGA-3’，將實(shí)施例 2 中的 SIRP a-1gG 和 B7_IgG 基因克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-Nl中，其中引物序列中引入凝血酶蛋白切割位點(diǎn)，以便將目的抗體與熒光蛋白切開(kāi)。利用引物序列9和引物序列10以質(zhì)粒pCDNA3.1/His C-SIRP a-1gG和pCDNA3.1/His C_B7_IgG為模板，擴(kuò)增出帶有選擇標(biāo)簽(6XHis標(biāo)簽和Xpress Epitop標(biāo)簽)的SIRPα-1gG和B7-1gG基因，將這兩個(gè)基因裝入載體pEGFP-Nl中，得到真核表達(dá)質(zhì)粒 pEGFP-Nl-SIRP a -1gG 和 pEGFP_Nl-B7_IgG。
[0058]采用293細(xì)胞作為表達(dá)細(xì)胞株，提取高質(zhì)量高濃度的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Nl-SIRP a -1gG和pEGFP-Nl-B7_IgG，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，24小時(shí)后采用抗生素G418進(jìn)行抗性篩選，10天后，用96孔板稀釋法篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，并進(jìn)行大量細(xì)胞培養(yǎng)，收集細(xì)胞并裂解，采用HIS binds進(jìn)行抗體提純，取30 μ I HIS binds，加入TBST洗滌三次，去盡TBST，再加入300 μ I TBST溶液，加入細(xì)胞裂解液50μ 1，4°C輕輕搖動(dòng)2-3小時(shí)，去盡上清，加入1000 μ I TBST溶液洗滌三次，去盡上清，加入20 μ I TBST和20 μ I蛋白上樣loading buffer于95°C溫度上變性5分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，采用His單抗做為一抗，反應(yīng)2小時(shí)后，TBST洗滌，加上兔抗鼠二抗反應(yīng)一小時(shí)，ECL顯色，可以清楚檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。。
[0059]實(shí)施例4:
[0060]設(shè)計(jì)引物，引物序列11 為:5，-CTT AA GCTT C ATG GGG GGT TCT CAT CAT-3，，引入Hind III和Xba I酶切位點(diǎn)，將實(shí)施例2的SIRP a-1gG基因克隆至真核表達(dá)載體pBudce4.1 中的 CMV 啟動(dòng)子。設(shè)計(jì)引物序列 12:5’ -GCT GCGGCCGC ATG GGG GGT TCT CATCAT-3’，設(shè)計(jì)引物序列 13:5’ -TCG AGA GAT TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG-3’，引入 NotI和Bgl II酶切位點(diǎn)，將實(shí)施例2的B7-1gG基因克隆至真核表達(dá)載體pBudce4.1中的EF-1a啟動(dòng)子。然后利用PCR的方法將含有SIRP a-1gG的CMV啟動(dòng)子區(qū)域及含有B7_IgG的EF-1 α啟動(dòng)子區(qū)域拼接起來(lái)，裝入P⑶NA5/FRT/T0 TOPO TA的真核載體中，得到表達(dá)質(zhì)粒 PCDNA5/FRT/T0 TOPO TA-SIRPa -1gG-B7_IgG。
[0061]采用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞作為表達(dá)細(xì)胞株，建立穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株，提取高質(zhì)量高濃度的真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA5/FRT/T0 TOPOTA-SIRP a -1gG-B7_IgG，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中，24小時(shí)后采用抗生素Blasticidin B進(jìn)行抗性篩選，10天后，用96孔板稀釋法篩選得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，并進(jìn)行大量細(xì)胞培養(yǎng)，用四環(huán)素誘導(dǎo)，收集細(xì)胞并裂解，采用HIS binds進(jìn)行抗體提純，取30 μ I HIS binds，加入TBST洗滌三次，去盡TBST，再加入300 μ I TBST溶液，加入細(xì)胞裂解液50 μ 1，4°C輕輕搖動(dòng)2-3小時(shí)，去盡上清，加入1000 μ I TBST溶液洗滌三次，去盡上清，加入20 μ I TBST和20 μ I蛋白上樣loading buffer于95°C溫度上變性5分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)，采用人FC抗體進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)2小時(shí)后，ECL顯色，可以清楚檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。
[0062]實(shí)施例5:
[0063]設(shè)計(jì)引物，引物序列14為:5，-GTG CTC GAG ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG-3，，下游引物的引物序列 15:5，-ATC TC T GAG GGA ACA TTC TAC AGG GCG TAC ACT TTC CCT-3，，引入Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)，將SIRP α基因和Β7基因克隆至真核表達(dá)載體ρ⑶ΝΑ3.1/His C中，得到pCDNA3.1/His C-SIRP a-B7表達(dá)質(zhì)粒，SIRP α基因和Β7基因以柔性連接序列(GAA TGT TCC)連接。
[0064]采用293細(xì)胞作為表達(dá)細(xì)胞株，建立穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株，提取高質(zhì)量高濃度的真核表達(dá)質(zhì)粒P⑶NA3.1/His C-SIRP α -Β7 ;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將上述表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，48小時(shí)后收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，采用HISbinds進(jìn)行抗體提純，取30 μ I HISbinds，加入TBST洗滌三次，去盡TBST，再加入300 μ I TBST溶液，加入細(xì)胞裂解液50 μ 1，4°C輕輕搖動(dòng)2-3小時(shí)，去盡上清，加入1000 μ I TBST溶液洗滌三次，去盡上清，加入20 μ ITBST和20 μ I蛋白上樣loading buffer于95°C溫度上變性5分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，采用His單抗做為一抗，反應(yīng)2小時(shí)后，TBST洗滌，加上兔抗鼠二抗反應(yīng)一小時(shí)，ECL顯色，可以清楚檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。
[0065]除了采用實(shí)施例5的P⑶NA3.1/His C表達(dá)載體外，也可采用上述實(shí)施例2_3中的真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA5/FRT/T0 TOPO TA、pEGFP_Nl和pBudce4.1中，具體真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染過(guò)程與實(shí)施例5相同。
[0066]實(shí)施例6:
[0067]利用原核表達(dá)系統(tǒng)，使用分別引入了 EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)的SIR Pa基因、分別引入了 EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)的B7基因、以及分別引入了 EcoRI和Xba I酶切位點(diǎn)的SIRPa-B7基因；以EcoR I和Xho I雙酶切SIRP α基因和B7基因，同時(shí)以EcoR I和Xho I雙酶切pET28a載體，構(gòu)建pET28a-SIRPa原核表達(dá)質(zhì)粒和pET28a_B7原核表達(dá)質(zhì)粒；以EcoR I和Xba I雙酶切SIRP α -Β7基因，同時(shí)以EcoR I和Xba I雙酶切pET28a載體，構(gòu)建pET28a_SIRP α -Β7原核表達(dá)質(zhì)粒。將上述原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a_SIRP α、pET28a_B7和pET28a_SIRP α -Β7轉(zhuǎn)化于表達(dá)菌株Rosstta中，培養(yǎng)細(xì)菌OD值達(dá)0.6時(shí)，采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集細(xì)胞并裂解，采用HIS binds進(jìn)行抗體提純，取30 μ I HIS binds，加入TBST洗滌三次，去盡TBST，再加入300 μ I TBST溶液，加入細(xì)胞裂解液50 μ 1，4°C輕輕搖動(dòng)2-3小時(shí)，去盡上清，加入1000 μ I TBST溶液洗滌三次，去盡上清，加入20 μ I TBST和20 μ I蛋白上樣loading buffer于95°C溫 度上變性5分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行WesternBlot檢測(cè)，采用His單抗做為一抗，反應(yīng)2小時(shí)后，TBST洗滌，加上兔抗鼠二抗反應(yīng)一小時(shí)，ECL顯色，可以清楚檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。
[0068]實(shí)施例7:
[0069]利用原核表達(dá)系統(tǒng)，使用分別引入了 EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)的SIR Pa基因、分別引入了 EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)的B7基因、以及分別引入了 EcoRI和Xba I酶切位點(diǎn)的SIRP α-Β7基因；以EcoR I和Xho I雙酶切SIRP α基因和Β7基因，同時(shí)以EcoR I和XhoI雙酶切PGEX-4T-1載體，構(gòu)建pGEX-4T-l-SIRP α原核表達(dá)質(zhì)粒和pGEX_4T-l_B7原核表達(dá)質(zhì)粒；以EcoR I和Xba I雙酶切SIRP a-B7基因，同時(shí)以EcoR I和Xba I雙酶切pGEX_4T_l載體，構(gòu)建pGEX-4T-l_SIRPa -B7原核表達(dá)質(zhì)粒。將上述原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T_l_SIRP a、PGEX-4T-1-B7和pGEX_4T-l_SIRP a -B7轉(zhuǎn)化于表達(dá)菌株Rosstta中，培養(yǎng)細(xì)菌OD值達(dá)0.6時(shí)，采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集細(xì)胞并裂解，采用GCT binds進(jìn)行抗體提純，取30 μ I HISbinds,加入TBST洗滌三次，去盡TBST，再加入300 μ ITBST溶液，加入細(xì)胞裂解液50 μ 1，4°C輕輕搖動(dòng)2-3小時(shí)，去盡上清，加入1000 μ I TBST溶液洗滌三次，去盡上清，加入20 μ ITBST和20 μ I蛋白上樣loading buffer于95°C溫度上變性5分鐘后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，采用GST單抗做為一抗，反應(yīng)2小時(shí)后，TBST洗滌，加上兔抗鼠二抗反應(yīng)一小時(shí)，ECL顯色，可以清楚檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。
[0070]實(shí)施例8:
[0071]利用原核表達(dá)系統(tǒng)，使用分別引入了 EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)的SIR Pa基因、分別引入了 EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)的B7基因、以及分別引入了 EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)的SIRPa-B7基因；以EcoR I和Xho I雙酶切SIRP α基因和B7基因，同時(shí)以EcoR I和Xho I雙酶切pTrxA載體，構(gòu)建pTrxA-SIRP α原核表達(dá)質(zhì)粒和pTrxA_B7原核表達(dá)質(zhì)粒；以EcoR I和Xba I雙酶切SIRP α -Β7基因，同時(shí)以EcoR I和Xba I雙酶切pTrxA載體，構(gòu)建pTrxA-SIRP α -Β7原核表達(dá)質(zhì)粒。將上述原核表達(dá)質(zhì)粒pTrxA-SIRP α、pTrxA_B7和pTrxA-SIRP α -Β7轉(zhuǎn)化于表達(dá)菌株Rosstta中，培養(yǎng)細(xì)菌OD值達(dá)0.6時(shí)，采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，以SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白表達(dá)，后續(xù)提取蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。
[0072]上述步驟D中，對(duì)實(shí)施例1-8的二價(jià)類抗體進(jìn)行純化包括通過(guò)離心收集上清或細(xì)胞，然后通過(guò)G蛋白柱層析分離出IgGl抗體，最后通過(guò)SIRPa或B7的親和層析分離出SIRPa -B7-二價(jià)類抗體。
[0073]本發(fā)明所制備得到的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體可制成抗腫瘤基因工程藥物，然后用于人對(duì)腫瘤感染的預(yù)防和治療?；蛘咭部梢酝ㄟ^(guò)特定載體將本發(fā)明所制備得到的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體導(dǎo)入人體中，在人體內(nèi)表達(dá)，從而產(chǎn)生預(yù)防和治療腫瘤感染的效果。另外，由于所述二價(jià)類抗體內(nèi)還包含有抗體Fe片段。因此，除了上述對(duì)腫瘤感染的預(yù)防和治療外，還具有腫瘤感染的診斷功能。 [0074]綜上所述，本發(fā)明的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體由于同時(shí)具有可與腫瘤細(xì)胞上的⑶47位點(diǎn)和T淋巴細(xì)胞上的⑶28位點(diǎn)特異性結(jié)合的SIRP α和B7，特異性結(jié)合作用顯著增強(qiáng)，并因此可以實(shí)現(xiàn)雙重阻止腫瘤細(xì)胞感染宿主細(xì)胞的作用；本發(fā)明的制備方法工藝簡(jiǎn)單、切實(shí)可行；具有本發(fā)明的二價(jià)類抗體的抗腫瘤基因工程藥物可有效作用于腫瘤細(xì)胞，從而有效預(yù)防和治療腫瘤細(xì)胞感染。
【權(quán)利要求】
1.一種抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體，包括兩個(gè)可變區(qū)和將所述兩個(gè)可變區(qū)連接在一起的恒定區(qū)，其特征在于，所述兩個(gè)可變區(qū)分別為SIRPa和B7 ;所述恒定區(qū)為柔性連接肽、或者所述恒定區(qū)為人抗體的恒定區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體，其特征在于，所述柔性連接肽具有序列表中的SEQ ID No: 16所示的氨基酸序列,所述人抗體的恒定區(qū)為具有激活人體免疫功能的抗體Fe片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體，其特征在于，所述人抗體的恒定區(qū)為IgG抗體的恒定區(qū)、IgA抗體的恒定區(qū)或IgM抗體的恒定區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體，其特征在于，所述SIRPα和所述Β7分別通過(guò)所述柔性連接肽與所述人抗體的恒定區(qū)柔性連接，所述柔性連接肽具有序列表中的SEQ ID No: 16所示的氨基酸序列。
5.一種權(quán)利要求1或2中抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: A:分別獲取恒定區(qū)基因、SIRPa基因和Β7基因； B:當(dāng)所述恒定區(qū)基因?yàn)槿丝贵w的恒定區(qū)基因時(shí)，采用真核表達(dá)載體構(gòu)建包括人抗體的恒定區(qū)基因、SIRP a基因和B7基因的表達(dá)質(zhì)粒； 或者，當(dāng)所述恒定區(qū)基因?yàn)槿嵝赃B接序列時(shí)，采用原核表達(dá)載體或所述真核表達(dá)載體構(gòu)建包含柔性連接序列 、SIRP a基因和B7基因的表達(dá)質(zhì)粒； C:將步驟B中形成的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至表達(dá)細(xì)胞株中進(jìn)行培養(yǎng)，穩(wěn)定表達(dá)二價(jià)類抗體；以及 D:離心收集上清或細(xì)胞進(jìn)行純化后得到所述二價(jià)類抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體的制備方法，其特征在于，在步驟B中，所述人抗體的恒定區(qū)基因?yàn)镮gG抗體的恒定區(qū)基因、IgA抗體的恒定區(qū)基因或IgM抗體的恒定區(qū)基因；所述柔性連接序列具有以下核苷酸序列:GAA TGT TCC0
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體的制備方法，其特征在于，在步驟 B 中，所述真核表達(dá)載體為 pCDNA3.1/His C、pCDNA5/FRT/T0 TOPO TA、pEGFP-Nl 或pBudce4.1 ;所述原核表達(dá)載體為 pET28a、pGEX_4T_l 或 pTrxA。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體的制備方法，其特征在于，在步驟C中，所述表達(dá)細(xì)胞株為293細(xì)胞、293T細(xì)胞或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。
9.一種抗腫瘤基因工程藥物，其特征在于，所述抗腫瘤基因工程藥物含有權(quán)利要求1或2中的抗腫瘤基因工程二價(jià)類抗體。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK103804495SQ201210440978
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月7日
【發(fā)明者】周兆平, 易俊波, 王玉樹(shù), 雷明軍, 蘇慶寧 申請(qǐng)人:深圳大學(xué)