專(zhuān)利名稱(chēng)：一種生物標(biāo)志抗體芯片、其制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)芯片領(lǐng)域，具體涉及ー種生物標(biāo)志抗體芯片、其制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗體芯片(Antibody Microarray)是蛋白質(zhì)芯片的ー種主要類(lèi)型,最新發(fā)展的抗體芯片技術(shù)的原理類(lèi)似于常規(guī)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)，即將特異性抗體或抗原固定在載體上，待測(cè)樣本按一定的比例稀釋后與載體上的抗體或抗原進(jìn)行反應(yīng)，再加入熒光標(biāo)記的抗體或抗原，通過(guò)激光共聚焦掃描儀或CCD相機(jī)讀取熒光強(qiáng)度，由計(jì)算機(jī)軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行分析， 得到準(zhǔn)確的定性結(jié)果或定量數(shù)據(jù)。因?yàn)樵诳贵w芯片上可分布成千上萬(wàn)的抗體或抗原，因此可以在一次實(shí)驗(yàn)中比較生物樣品中成百上千的蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度，從而極大促進(jìn)蛋白質(zhì)組的研究和利用?？贵w芯片主要受制于如下技術(shù)關(guān)鍵I、樣本點(diǎn)樣條件的優(yōu)化；2、微陣列載體選擇及其表面化學(xué)修飾；3、芯片設(shè)計(jì)和分析系統(tǒng)；4、樣本制備，處理和檢測(cè)技術(shù)。因此，現(xiàn)有技術(shù)中的抗體芯片一般設(shè)計(jì)不合理，而且未很好的解決抗體芯片生產(chǎn)過(guò)程中點(diǎn)樣條件，載體處理和修飾，抗體固定以及樣本處理等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，故產(chǎn)品檢測(cè)的通量小，產(chǎn)品不穩(wěn)定，特異性不高且可靠性也不強(qiáng)，另外由于涵蓋量少，很易產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供ー種生物標(biāo)志抗體芯片、其制備方法及其應(yīng)用。ー種生物標(biāo)志抗體芯片，將相關(guān)生物標(biāo)志抗體集中在載玻片大小的載體上。 所述生物標(biāo)志抗體芯片為前列腺癌抗體芯片。所述載體為利用納米技術(shù)進(jìn)行化學(xué)修飾的載體。所述的生物標(biāo)志抗體芯片進(jìn)一歩包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照。所述生物標(biāo)志抗體芯片的制備方法，具體包括抗體芯片的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證；載玻片的處理；載玻片的化學(xué)修飾；抗體稀釋液的制備、抗體的預(yù)處理和質(zhì)檢；微陣列點(diǎn)樣儀的設(shè)置，預(yù)冷和試點(diǎn)樣；微陣列點(diǎn)樣抗體芯片；抗體芯片的封閉和固定；抗體芯片的質(zhì)量控制，包裝和入庫(kù)。所述對(duì)載玻片的化學(xué)修飾包括在載玻片表面偶聯(lián)活性基團(tuán)、構(gòu)建三維聚合物涂層并利用分子自組裝技術(shù)形成單分子膜。所述抗體的質(zhì)檢包括特異性抗原、細(xì)胞系和組織的檢測(cè)。
所述微陣列點(diǎn)樣抗體芯片采用拉丁方實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。所述的生物標(biāo)志抗體芯片的制備方法還包括多模型交互驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)策略。所述生物標(biāo)志抗體芯片的應(yīng)用。本發(fā)明提供的生物標(biāo)志抗體芯片克服了抗體芯片產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中的技術(shù)瓶頸，解決了樣品點(diǎn)樣彌散，不均一；載體的處理和化學(xué)修飾不理想而致抗體無(wú)法長(zhǎng)期保存以及活性不穩(wěn)定；檢測(cè)特異性不高、實(shí)用性不強(qiáng)；芯片設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析落后等常見(jiàn)問(wèn)題。與非生物標(biāo)志抗體芯片相比，檢測(cè)通量更高，靈敏度更好，往往ー個(gè)產(chǎn)品可檢測(cè)超過(guò)1300個(gè)的抗體。由于本發(fā)明提供的生物標(biāo)志抗體芯片采用了特有的載體和化學(xué)修飾，使得檢測(cè)的背景更小，特異性更高。利用本發(fā)明提供的樣本處理試劑盒和檢測(cè)試劑盒，使得操作更簡(jiǎn)便，檢測(cè)更容易。


圖I示出了根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)志抗體芯片的制備方法；圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的前列腺癌等腫瘤生物標(biāo)志抗體芯片檢測(cè)エ藝流程圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步的詳細(xì)描述。根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)志抗體芯片將相關(guān)生物標(biāo)志抗體集中在載玻片大小的載體上，可以利用血清或血漿樣品進(jìn)行檢測(cè)，使得無(wú)創(chuàng)傷性、大規(guī)模、快速、準(zhǔn)確的早期診斷成為可能，同時(shí)也疾病的個(gè)體化治療和預(yù)后提供及時(shí)和準(zhǔn)確的參考。本發(fā)明的生物標(biāo)志抗體芯片的基本原理包括按照使用目的的不同，在載玻片大小的載體上點(diǎn)布相同或不同種類(lèi)的抗體，然后再與標(biāo)記了熒光染料的樣本中的蛋白質(zhì)結(jié)合，經(jīng)掃描儀讀出熒光強(qiáng)弱，計(jì)算機(jī)分析檢測(cè)結(jié)果。該方法具有一次性檢測(cè)樣本巨大、相對(duì)低消耗、計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析結(jié)果以及敏感度，特異性高和快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)志抗體芯片適用樣本范圍廣，既可用于冰凍組織，也可用于蠟塊組織和血清等各種體液。隨同產(chǎn)品提供的蛋白抽提試劑以及標(biāo)記溶液，洗脫溶液和檢測(cè)溶液保證了檢測(cè)的低背景，高靈敏度。同時(shí)也維持了樣本制備過(guò)程中的完整性和一致性。根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)志抗體芯片專(zhuān)門(mén)設(shè)置了陽(yáng)性和陰性對(duì)照，從而保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性，避免了假陽(yáng)性或假陰性。整個(gè)操作可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，方法簡(jiǎn)單，可操作性聞。根據(jù)抗體芯片檢測(cè)時(shí)對(duì)樣本要求高這ー技術(shù)難點(diǎn)，為此，本發(fā)明提供相應(yīng)的蛋白質(zhì)提取試劑盒，待測(cè)樣本的處理試劑和標(biāo)記液以及封閉液和結(jié)合液等，上述試劑中含有非常溫和的去垢劑并能在高效抽提蛋白(相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白)的同時(shí)保持蛋白的天然活性(非變性條件)，這樣能夠保證抽提的蛋白的溶解性和代表性，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和原始材料的一致性。提高了檢測(cè)的靈敏度，降低了非特異性表達(dá)?？蛻糁恍杼峁颖竞桐`些基本耗材，就可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成樣本的檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)志抗體芯片的制備方法如圖I所示，具體包括抗體芯片的 設(shè)計(jì)與驗(yàn)證；載玻片的處理；載玻片的化學(xué)修飾；抗體稀釋液的制備、抗體的預(yù)處理和質(zhì)檢；微陣列點(diǎn)樣儀的設(shè)置，預(yù)冷和試點(diǎn)樣；微陣列點(diǎn)樣抗體芯片；抗體芯片的封閉和固定；抗體芯片的質(zhì)量控制，包裝和入庫(kù)。所有優(yōu)化的單克隆抗體在點(diǎn)樣前都經(jīng)過(guò)特異性抗原、細(xì)胞系和組織的檢測(cè)，從而保證了靈敏度(可檢測(cè)到Pg水平的蛋白質(zhì))和特異性。本發(fā)明選擇耐久性好、表面光滑、來(lái)源方便的玻璃載玻片作為主要載體，并利用納米技術(shù)成功的對(duì)載體進(jìn)行有效的化學(xué)修飾，在玻片表面偶聯(lián)活性基團(tuán)、構(gòu)建三維聚合物涂層并利用分子自組裝技術(shù)形成單分子膜，從而保證抗體結(jié)構(gòu)完整，保持與抗原結(jié)合的能力，從而解決了現(xiàn)有技術(shù)中將抗體固定在芯片的表明并保持它的生物學(xué)活性的關(guān)鍵技木。另ー方面，通過(guò)納米技術(shù)處理后的抗體芯片，點(diǎn)樣點(diǎn)不擴(kuò)散，能夠高密度固定抗體；不同批次芯片之間以及同一芯片上各點(diǎn)樣點(diǎn)整齊均一；非特異性吸附較小、信噪比高；抗體結(jié)合牢固， 不易脫落。采用本發(fā)明的納米技術(shù)開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品并經(jīng)過(guò)特殊的化學(xué)處理和修飾，保證了結(jié)合的抗體能保持三維結(jié)構(gòu)和功能，且不易降解和脫落。為避免芯片中點(diǎn)與點(diǎn)之間的變異，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率，本發(fā)明開(kāi)拓性的將拉丁方實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)用于芯片點(diǎn)樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，這樣大大消除了同一芯片上的行間變異和列間變異，減低了抗體結(jié)合樣品間的差異反應(yīng)，從而大幅提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率。根據(jù)本發(fā)明的采用拉丁方設(shè)計(jì)的抗體點(diǎn)樣方法，每個(gè)抗體在芯片中重復(fù)點(diǎn)樣6次以上，從而確保了數(shù)據(jù)的可靠性和持續(xù)性。同時(shí)，發(fā)明中還將多模型交互驗(yàn)證(Multimodel Cross-Validation)統(tǒng)計(jì)策略替代了傳統(tǒng)的單模型交互驗(yàn)證策略，用多個(gè)統(tǒng)計(jì)模型同時(shí)預(yù)測(cè)ー個(gè)樣品，從而使得每ー個(gè)未知樣品得到更加準(zhǔn)確的無(wú)偏估計(jì)(unbiased estimate)。進(jìn)ー步提高了準(zhǔn)確率。根據(jù)本發(fā)明的ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述的生物標(biāo)志抗體芯片示例為前列腺癌抗體芯片。本發(fā)明在收集，研發(fā)已有的和腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物蛋白的同時(shí)，利用高通量的生物抗體芯片，以前列腺癌為切入點(diǎn)，和臨床醫(yī)院通力合作研發(fā)并驗(yàn)證新的前列腺癌生物標(biāo)志蛋白，同時(shí)開(kāi)展對(duì)其他腫瘤生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證，建立各種腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志蛋白信息和抗原庫(kù)。具體包括I)根據(jù)收集到的前列腺癌生物標(biāo)志蛋白以及相關(guān)序列，設(shè)計(jì)并生產(chǎn)鼠單克隆抗體；根據(jù)本發(fā)明的另ー個(gè)方面，從市場(chǎng)上直接購(gòu)買(mǎi)現(xiàn)有的前列腺癌生物標(biāo)志抗體，以保證產(chǎn)品的及時(shí)生產(chǎn)；2)對(duì)生產(chǎn)或購(gòu)買(mǎi)的抗體進(jìn)ー步加以質(zhì)控的檢測(cè)包括特異性，敏感度以及和其他種系的交叉反應(yīng)；3)進(jìn)行芯片的設(shè)計(jì)，在ー張載玻片上除了陽(yáng)性和陰性作為對(duì)照，還將函蓋所有能收集到的跟前列腺癌相關(guān)的生物標(biāo)志抗體；4)載玻片的處理和化學(xué)修飾；5)芯片的制備和質(zhì)檢；6)產(chǎn)品批號(hào)的申報(bào)。根據(jù)本發(fā)明的前列腺癌等腫瘤生物標(biāo)志抗體芯片檢測(cè)エ藝流程圖如圖2所示。根據(jù)本發(fā)明的另ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述的生物標(biāo)志抗體芯片示例為肺癌，乳腺癌，食道癌或腸癌等抗體芯片。根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)志抗體芯片的應(yīng)用包括疾病診斷和治療、新藥開(kāi)發(fā)、分子生物學(xué)、航空航天、司法鑒定、食品衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。以上所述的，是根據(jù)本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的上述實(shí)施例還可以做出各種變化。即凡是依據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的權(quán)利要求書(shū)及說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的簡(jiǎn)單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍。本發(fā)明未詳盡描述的技術(shù)內(nèi)容為本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識(shí)。
權(quán)利要求
1.ー種生物標(biāo)志抗體芯片，其特征在干，將相關(guān)生物標(biāo)志抗體集中在載玻片大小的載體上。
2.如權(quán)利要求I所述的生物標(biāo)志抗體芯片，其特征在于，所述生物標(biāo)志抗體芯片為前列腺癌抗體芯片。
3.如權(quán)利要求I所述的生物標(biāo)志抗體芯片，其特征在于，所述載體為利用納米技術(shù)進(jìn)行化學(xué)修飾的載體。
4.如權(quán)利要求I所述的生物標(biāo)志抗體芯片，進(jìn)一歩包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的生物標(biāo)志抗體芯片的制備方法，具體包括抗體芯片的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證；載玻片的處理；載玻片的化學(xué)修飾；抗體稀釋液的制備、抗體的預(yù)處理和質(zhì)檢；微陣列點(diǎn)樣儀的設(shè)置，預(yù)冷和試點(diǎn)樣；微陣列點(diǎn)樣抗體芯片；抗體芯片的封閉和固定；抗體芯片的質(zhì)量控制，包裝和入庫(kù)。
6.如權(quán)利要求5所述的生物標(biāo)志抗體芯片的制備方法，其特征在于，所述對(duì)載玻片的化學(xué)修飾包括在載玻片表面偶聯(lián)活性基團(tuán)、構(gòu)建三維聚合物涂層并利用分子自組裝技術(shù)形成單分子膜。
7.如權(quán)利要求5所述的生物標(biāo)志抗體芯片的制備方法，其特征在于，所述抗體的質(zhì)檢包括特異性抗原、細(xì)胞系和組織的檢測(cè)。
8.如權(quán)利要求5所述的生物標(biāo)志抗體芯片的制備方法，其特征在于，所述微陣列點(diǎn)樣抗體芯片采用拉丁方實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
9.如權(quán)利要求5所述的生物標(biāo)志抗體芯片的制備方法，還包括多模型交互驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)策略。
10.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的生物標(biāo)志抗體芯片的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生物標(biāo)志抗體芯片，將相關(guān)生物標(biāo)志抗體集中在載玻片大小的載體上。本發(fā)明還提供所述生物標(biāo)志抗體芯片的制備方法，具體包括抗體芯片的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證；載玻片的處理；載玻片的化學(xué)修飾；抗體稀釋液的制備、抗體的預(yù)處理和質(zhì)檢；微陣列點(diǎn)樣儀的設(shè)置，預(yù)冷和試點(diǎn)樣；微陣列點(diǎn)樣抗體芯片；抗體芯片的封閉和固定；抗體芯片的質(zhì)量控制，包裝和入庫(kù)。本發(fā)明還提供所述生物抗體芯片的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的生物標(biāo)志抗體芯片檢測(cè)通量更高，靈敏度更好；檢測(cè)的背景更小，特異性更高；操作更簡(jiǎn)便，檢測(cè)更容易。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102692501SQ20111007120
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日
發(fā)明者范盤(pán)生 申請(qǐng)人:上海安瑞生物科技有限公司