人源化的抗-d因子抗體的制作方法
【專利說(shuō)明】人源化的抗-D因子抗體
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年10月31日、申請(qǐng)?zhí)枮?00780048936.X、名稱為"人源 化的抗-D因子抗體"的發(fā)明申請(qǐng)的分案。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 補(bǔ)體系統(tǒng)在免疫復(fù)合物的清除以及在對(duì)感染試劑、外來(lái)抗原、病毒-感染細(xì)胞和 腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答中起著重要作用。然而，補(bǔ)體還參與病理性的炎癥以及自身免疫疾病。 因此，對(duì)過(guò)度或不受控制的補(bǔ)體級(jí)聯(lián)激活加以抑制可以對(duì)患有這樣的疾病和病情的患者提 供臨床益處。
[0004] 補(bǔ)體系統(tǒng)包括兩個(gè)不同激活途徑：經(jīng)典途徑和旁路途徑（V.M.Holers，In ClinicalImmunology:PrinciplesandPractice,R.R.Rich編輯,MosbyPress； 1996, 363-391)。經(jīng)典途徑為鈣/鎂-依賴的級(jí)聯(lián)，其通常由抗原-抗體復(fù)合物的形成激 活。旁路途徑為鎂-依賴的級(jí)聯(lián)，其通過(guò)某些易感表面（例如酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁多糖以 及某些生物聚合物材料）上C3的沉積和活化而被激活。補(bǔ)體途徑的激活產(chǎn)生補(bǔ)體蛋白質(zhì) 的生物活性片段，例如C3a、C4a和C5a過(guò)敏毒素以及C5b-9膜攻擊復(fù)合物（MAC)，它們介導(dǎo) 炎癥活動(dòng)，包括白細(xì)胞趨化反應(yīng)，巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的 活化，血管通透性，細(xì)胞溶解以及組織損傷。
[0005]D因子為旁路補(bǔ)體途徑激活必不可缺的高特異性絲氨酸蛋白酶。其裂解結(jié)合C3b 的B因子，產(chǎn)生C3b/Bb酶，其為旁路途徑C3/C5蛋白轉(zhuǎn)化酶的活性組分。D因子可能是 用于抑制的合適靶，因?yàn)樵谌酥衅溲獫{濃度非常低（I. 8yg/ml)，并且已經(jīng)證明其為旁路 補(bǔ)體途徑激活的限速酶（P.H.Lesavre和H.J.Muller-Eberhard.J.Exp.Med.，1978 ; 148 : 1498-1510J.E.Volanakis等，NewEng.J.Med.，1985 ;312 :395-401) 〇
[0006] 在動(dòng)物模型和體外研究中已經(jīng)顯示，下調(diào)補(bǔ)體活性對(duì)治療一些疾病 指征有效，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腎小球腎炎（Y.Wang等，Proc.Natl.Acad. Sci. ; 1996,93:8563-8568)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Y.Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.; 1995, 92:8955-8959)、心肺體外循環(huán)和血液透析（C.S.Rinder,J.Clin.Invest.，1995 ; 96:1564-1572)、器官移植中的超急性排斥（T.J.Kroshus等，Transplantation, 1995 ; 60:1194-1202)、心肌梗死（J.W.Homeister等，J.Immunol. ,1993;150:1055-1064; H.F.Weisman等，Science, 1990 ;249:146-151)、再灌注損傷（E.A.Amsterdam等，Am. J.Physiol.，1995 ;268:H448-H457)、以及成人呼吸窘迫綜合征（R.Rabinovici等，了. Immunol.，1992 ; 149:1744-1750)。此外，其他炎性病癥和自身免疫/免疫復(fù)合物疾病也 與補(bǔ)體激活緊密相關(guān)（V.M.Holers，ibid.，B.P.Morgan.Eur.J.Clin.Invest.，1994 :24 : 219-228)，包括燙傷、嚴(yán)重哮喘、過(guò)敏性休克、腸炎、蕁麻疹、血管性水腫、脈管炎、多發(fā)性硬 化、重癥肌無(wú)力、膜增殖性腎小球腎炎和干燥綜合癥（Sjogren's綜合癥）。
[0007] 在補(bǔ)體-介導(dǎo)的病癥領(lǐng)域需要抗體療法，而本發(fā)明人源化的抗體提供了有效滿足 該需求的高親和力抗體。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] -般地，本發(fā)明涉及包含小鼠抗體166-32的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列的抗體，小鼠 抗體166-32是能夠抑制與D因子有關(guān)的生物活性的抗體。例如，在18yg/ml濃度時(shí)（相 當(dāng)于血液中人D因子摩爾濃度的約1.5倍；抗-D因子抗體與D因子的摩爾比約1.5 :1)，可 以觀察到該抗體顯著抑制旁路補(bǔ)體的活性（參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)6, 956, 107)。
[0010] 本發(fā)明還涉及小鼠Mab166-32的人源化抗體。本發(fā)明包括這些抗體的可變重鏈 和輕鏈的氨基酸序列以及其相應(yīng)的核酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括這些抗體的 ⑶R序列。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括包含本發(fā)明抗體的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供了含有本發(fā)明抗體序列的細(xì)胞系和載體。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括制備和使用 本發(fā)明抗體和組合物的方法。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是這些人源化抗體在制備治療與過(guò)度或不受控制的補(bǔ) 體激活有關(guān)的病癥的藥物或組合物中的應(yīng)用。所述病癥包括心肺體外循環(huán)期間的補(bǔ)體 激活，由急性心肌梗塞、動(dòng)脈瘤、中風(fēng)、出血性休克、擠壓傷、多器官衰竭、低血容量性休克 (hypobolemicshock)、腸局部缺血或引起局部缺血的其他事件后的缺血-再灌注而引起的 補(bǔ)體激活。還顯示補(bǔ)體激活與炎性病癥有關(guān)，如嚴(yán)重?zé)齻?、?nèi)毒素血癥、膿毒性休克、成人呼 吸窘迫綜合征、血液透析、過(guò)敏性休克、嚴(yán)重哮喘、血管性水腫、克羅恩氏病、鐮刀形紅細(xì)胞 貧血病、鏈球菌感染后腎小球腎炎和胰腺炎。病癥可以是不良藥物反應(yīng)、藥物過(guò)敏、IL-2誘 導(dǎo)的血管滲漏綜合癥或放射攝影造影劑過(guò)敏的結(jié)果。它還包括自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅 斑狼瘡、重癥肌無(wú)力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默氏病和多發(fā)性硬化。補(bǔ)體激活還與移植 排斥有關(guān)。此外，補(bǔ)體激活與眼病如年齡-相關(guān)的黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病有關(guān)。
[0013] 附圖簡(jiǎn)述
[0014] 圖IA和IB描述了小鼠MAb166-32可變重鏈（圖1A)和可變輕鏈（圖1B)的氨 基酸序列。
[0015] 圖2A和2B描述了小鼠MAb166-32可變重鏈（圖2A)和可變輕鏈（圖2B)的核 酸序列。
[0016] 圖3描述了小鼠MAb166-32重鏈的比對(duì)。
[0017] 圖4描述了小鼠MAb166-32輕鏈的比對(duì)。
[0018] 圖5描述了每一個(gè)人源化抗體克隆#56、#111、#250和#416的可變重鏈和可變輕 鏈的氨基酸序列。
[0019] 圖6描述了人源化抗體Fab克隆#56、#111、#250和#416的溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0020] 圖7描述了人源化抗體Fab克隆#56、#111、#250和#416對(duì)旁路補(bǔ)體激活的抑制。
[0021 ] 圖8A-B(可變重鏈（VH)共有框架）和圖9A-B(可變輕鏈（VL)共有框架）描述了 示例性的受者人共有框架序列，其可用于實(shí)施本發(fā)明并具有如下序列標(biāo)識(shí)符：（圖8A-B)人VH亞組I共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:28)、人VH亞組I共有框架減去延伸的高變 區(qū)（SEQIDNO:29-31)、人VH亞組II共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:32)、人VH亞 組II共有框架減去延伸的高變區(qū)（SEQIDNO:33-35)、人VH亞組III共有框架減去Kabat CDR(SEQIDNO: 36)、人VH亞組III共有框架減去延伸的高變區(qū)（SEQIDNO: 37-39)、人VH 亞組VII共有框架減去KabatCDR(SEQIDNO:55)、人VH亞組VII共有框架減去延伸的高 變區(qū)（SEQIDNO:56-58)、人VH受體框架減去KabatCDR(SEQIDNO:40)、人VH受體框架 減去延伸的高變區(qū)（SEQIDNO:41-42)、人VH受體2框架減去KabatCDR(SEQIDNO:43) 和人VH受體2框架減去延伸的高變區(qū)（SEQIDNO:44-46)以及（圖9A-B)人VLK亞組I共有框架（3￡〇10勵(lì)：47)、人￥1^亞組11共有框架（3￡〇10勵(lì)：48)、人1〇亞組111共有 框架（SEQIDNO:49)和人K亞組IV共有框架（SEQIDNO:50)。
[0022] 發(fā)明詳述
[0023] 定義
[0024] 本文全篇中所用的術(shù)語(yǔ)應(yīng)解釋為具有對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言常規(guī)和典型的 意義。然而，申請(qǐng)人希望給予下列術(shù)語(yǔ)如下特定定義。
[0025] 短語(yǔ)"基本一致"相對(duì)于抗體鏈多肽序列而言可以被解釋為抗體鏈與參考多肽序 列有至少約70%、80%、90%或95%的序列一致性。對(duì)于核酸序列，該術(shù)語(yǔ)可以被解釋為核 苷酸序列與參考核酸序列有至少約85%、90%、95%或97%的序列一致性。
[0026] 術(shù)語(yǔ)"一致性"或"同源性"應(yīng)解釋成是指，在比對(duì)序列并引入空隙（如果需要，以 使整個(gè)序列達(dá)到最大的序列一致性百分比）之后，并且不考慮保守替代作為序列一致性的 一部分時(shí)，候選序列中和與其比較的對(duì)應(yīng)序列中的殘基相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。N端或 C端延伸或插入不應(yīng)被理解成是減少了一致性或同源性。用于比對(duì)的方法和計(jì)算機(jī)程序是 本領(lǐng)域所熟知的。用序列分析軟件可以測(cè)定序列一致性。
[0027] 術(shù)語(yǔ)"抗體"以其最廣的意義使用，并且特定地包括：?jiǎn)慰寺】贵w（包括全長(zhǎng)的 單克隆抗體）、多克隆抗體和多特異性抗體（例如雙特異性抗體）?？贵w（Ab)和免疫球蛋 白（Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w對(duì)特定靶表現(xiàn)出結(jié)合特異性，而免疫球蛋白 則包括抗體以及缺乏靶特異性的其它抗體樣分子。天然抗體和天然免疫球蛋白通常是約 150, 000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由兩個(gè)相同的輕鏈（L)和兩個(gè)相同的重鏈（H)組成。 每條重鏈的一端有可變區(qū)（VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)（VL)，另一 端是恒定區(qū)。
[0028] 此處所用的"抗-人D因子抗體"指以抑制或基本上降低補(bǔ)體激活的方式特異性 結(jié)合人D因子的抗體。
[0029] 在抗體可變區(qū)語(yǔ)境中所用的術(shù)語(yǔ)"可變"指：在抗體之間可變區(qū)的某些部分在序列 上有很大的不同，并且這些部分在每個(gè)特定抗體對(duì)其特定靶的結(jié)合和特異性中有作用。然 而，可變性并非均勻地分布在抗體可變區(qū)中。它集中在輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補(bǔ)決定 區(qū)（CDR)(也稱為高變區(qū)（HVR))的三個(gè)節(jié)段中?？勺儏^(qū)中更高度共有的部分稱為框架（FR)。 天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包含四個(gè)FR區(qū)，它們大多數(shù)采取折疊構(gòu)型，由三個(gè)CDR連 接，該三個(gè)⑶R連接形成環(huán)連接且在某些情況下形成P折疊的一部分。每條鏈中的多個(gè)CRD 通過(guò)FR區(qū)連接在相鄰近的位置，并且和另一條鏈的CDR-起形成抗體的靶結(jié)合部位（參見(jiàn) Kabat等）。除非另外指明，如此處所用的，免疫球蛋白氨基酸殘基的編號(hào)是根據(jù)Kabat等 (SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，NationalInstituteofHealth, Bethesda，Md. 1987)的免疫球蛋白氨基酸殘基編號(hào)系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行的。
[0030] 術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"、"HVR"或"HV"在此使用時(shí)指其序列高度可變的和/或形成結(jié)構(gòu)限 定環(huán)的抗體可變區(qū)的區(qū)域。通常，抗體包括6個(gè)高變區(qū)：3個(gè)在VH中〇11、112、113)，3個(gè)在￥1 中（L1、L2、L3)。本發(fā)明使用并包括許多高變區(qū)描述。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)是基于序列 可變性的且最常用（Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第 五版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD. (1991)) 〇 而Chothia指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置（Chothia和LeskJ.Mol.Biol. 196 :901-917 (1987))。AbM高 變區(qū)代表KabatQ)R和Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，并且為OxfordMolecyIar的AbM抗 體模型軟件所使用。"接觸"高變區(qū)是基于可獲得的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)分析。來(lái)自每個(gè)這些高變 區(qū)的殘基記錄如下。
[0031]
[0032]Kabat編號(hào)
[0033]HlH31-H35H26-H35H26-H32H30-H35
[0034]Chothia編號(hào)
[0035]
[0036] 高變區(qū)可包括如下"延伸的高變區(qū)" ：VL中的24-36或24-34 (LI)、46-56或 5〇-56(12)和89-97(1^3)以及￥11中的 26-35〇11)、5〇-65或49-65〇12)和93-102、94-102 或 95-102 (H3)。每個(gè)這些定義的可變區(qū)殘基根據(jù)上文的Kabat進(jìn)行編號(hào)。
[0037] "框架"或"FR"殘基為此處定義的除高變區(qū)殘基或CDR殘基以外的可變區(qū)殘基。
[0038] 術(shù)語(yǔ)"如Kabat編號(hào)的可變區(qū)殘基"或"如Kabat編號(hào)的氨基酸位點(diǎn)"及其變體，指 Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，PublicHealth Service,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD. (1991)中用于抗體編譯的重鏈 可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的編號(hào)系統(tǒng)。利用該編號(hào)系統(tǒng)，事實(shí)上線性的氨基酸序列相應(yīng)于對(duì)可 變區(qū)FR或CDR的截短或插入可包含更少的或額外的氨基酸。例如，重鏈可變區(qū)可包括H2 的殘基52后的單個(gè)氨基酸插入（根據(jù)Kabat為殘基52a)以及重鏈FR殘基82后插入的殘 基（例如根據(jù)Kabat為殘基82a、82b和82c等等）。對(duì)于給定的抗體，可通過(guò)將該抗體序列 的同源區(qū)域與"標(biāo)準(zhǔn)的"Kabat編號(hào)序列進(jìn)行比對(duì)來(lái)確定其Kabat殘基編號(hào)。
[0039]Kabat編號(hào)系統(tǒng)通常在提及可變區(qū)中的殘基（大約輕鏈的殘基1-107以及重鏈 的殘基 1_113)時(shí)使用（例如，Kabat等，SequencesofImmunologicalInterest,第五 版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md. (1991))〇 "EU編號(hào)系統(tǒng)"或"EU索引"通常在提及免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)中的殘基時(shí)使用（例如， 上文Kabat等中報(bào)道的EU索引；重鏈恒定區(qū)中的鉸鏈區(qū)大約為重鏈的殘基216-230 (EU編 號(hào)））。"如Kabat中的EU索引"指人IgGlEU抗體的殘基編號(hào)。除非此處另有說(shuō)明，抗體可 變區(qū)中的殘基編號(hào)的參照物指通過(guò)Kabat編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)的殘基。除非此處另有說(shuō)明，抗體 恒定區(qū)中的殘基編號(hào)的參照物指通過(guò)EU編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)的殘基（例如，參見(jiàn)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?60/640, 323,EU編號(hào)的圖）。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"抗體片段"指全長(zhǎng)抗體的一部分，通常是靶結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例 子包括？ &13、？&13'、？(&13'）2和？7片段。短語(yǔ)抗體的"功能性片段或類似物"為具有與全長(zhǎng) 抗體相同的定性生物學(xué)活性的化合物。例如，抗-人D因子抗體的功能性片段或類似物為 可以以阻止或基本上降低補(bǔ)體激活的方式結(jié)合D因子的一種化合物。如此處所用的，對(duì)于 抗體"功能性片段"是指Fv、F(ab)和F(ab'）2片段。"Fv"片段是含有全部靶識(shí)別和結(jié)合位 點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共價(jià)關(guān)聯(lián)的一個(gè)重鏈可變區(qū)和一個(gè)輕鏈可變區(qū)的二 聚物（VH_\二聚物）組成。在該構(gòu)型中，各可變區(qū)中的三個(gè)CDR相互作用，從而形成VH-\ 二聚物表面上的靶結(jié)合位點(diǎn)。6個(gè)CDR共同