專利名稱：高效表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)全抗體基因的重組病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種能高效表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的重組病毒及其用途。
背景技術(shù)：
Kohler和Milstein在1975年創(chuàng)立的單克隆抗體制備技術(shù)，為腫瘤的治療提供一種新的方法——腫瘤的導(dǎo)向治療法。在腫瘤導(dǎo)向治療研究初期，人們給予極大的熱情和不切合實際的期望，但早期的臨床研究的療效十分不理想。其主要原因為1.在早期的臨床試驗中應(yīng)用的是鼠源性抗體，在人體內(nèi)會產(chǎn)生針對鼠源性抗體的抗抗體(HAMA)，它會中和治療性的鼠源性抗體，使其被快速清除，因此鼠源性抗體在人體內(nèi)半衰期很短，故療效不確切，同時鼠源性抗體會導(dǎo)致人體過敏反應(yīng)，從而產(chǎn)生毒副作用；2.抗體的親和力和特異性不高，多數(shù)抗體特別是一些基因工程小分子抗體或人源化抗體自身親和力較低，特異性不高，從而不能有效靶向腫瘤細胞，因此其臨床上抗腫瘤療效不確切；3.腫瘤自身抗原表達的差異及抗原的調(diào)變也是影響抗體治療成功的因素。近5年來隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，抗體技術(shù)兩個關(guān)鍵性技術(shù)獲得突破，1.人鼠嵌合抗體、人源化抗體和人抗體技術(shù)及制備技術(shù)的成熟，基本上可以克服鼠源性抗體人用產(chǎn)生抗抗體的問題；同時由于在人鼠嵌合抗體、人源化抗體和人抗體中采用人的Fc片段(可結(jié)晶的片段，是指用木瓜酶消化免疫球蛋白所得的片段，其分子量大約為50000)，在人體內(nèi)的半衰期從鼠源性抗體小于20小時到人源化抗體和人抗體的半衰期為數(shù)天、甚至到21天之久；另外在人的Fc片段的改造可進一步提高對腫瘤的殺傷。2.抗體庫的建立和篩選以及多價重組抗體制備技術(shù)的發(fā)展使人們能夠直接獲得特異性強和親和力高的單克隆抗體，如SLAM法(SelectedLymphocyte Antibody Method)制備的抗體的親和力比雜交瘤技術(shù)制備的提高1000倍。抗體技術(shù)的發(fā)展終于使導(dǎo)向治療研究走出低谷，并在近幾年取得了突破性進展，應(yīng)用抗體治療腫瘤初顯曙光。
但目前對于抗體治療實體瘤仍存在著兩個難題1.由于實體腫瘤的細胞被致密的基質(zhì)包裹，抗體難以穿透這一屏障而到達腫瘤細胞；大多數(shù)實體腫瘤有淋巴回流障礙，導(dǎo)致間質(zhì)內(nèi)壓力升高，因而阻止了抗體由血液中進入腫瘤實質(zhì)小部分進入腫瘤內(nèi)部的抗體，首先遇到血管周圍的腫瘤細胞而被結(jié)合，使得抗體無法到達距離血管較遠的腫瘤細胞。2.由于治療腫瘤的抗體需要量極多，目前的生物工程生產(chǎn)比較困難；同時由于需要量極多，要求其產(chǎn)品純度極高，因此其產(chǎn)品生產(chǎn)成本及價格均非常昂貴。故目前應(yīng)用抗體治療大體積的實體腫瘤的療效仍不理想，很多研究建議對于實體腫瘤的抗體治療主要應(yīng)用于腫瘤的微小殘留或微轉(zhuǎn)移灶中，但這種疾病的治療需要長時間及大規(guī)模的多中心臨床試驗才能評估其療效，這也使抗體在實體瘤的臨床應(yīng)用及推廣產(chǎn)生一定的限制作用。
基因治療是近年興起的一種新的治療惡性腫瘤方法。其基因轉(zhuǎn)染方法分病毒法及非病毒法兩種。病毒法通常采用逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒及痘苗病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒在體外具有較高的轉(zhuǎn)染率，但病毒滴度偏低，在體內(nèi)轉(zhuǎn)染率較低，而且只能感染分裂期的細胞，同時具有整合至染色體，存在癌變的可能性的缺點。非病毒法包括脂質(zhì)體及基因槍等方法，其轉(zhuǎn)染基因表達時間較短，轉(zhuǎn)染率較低。腺病毒及腺相關(guān)病毒是目前腫瘤基因治療中最常見病毒載體，已廣泛地應(yīng)用于人體基因治療方案中，腺病毒具有容易生產(chǎn)及純化的特點，它在體內(nèi)及體外均能有效轉(zhuǎn)染分裂及靜止細胞，無致癌性。腺相關(guān)病毒具有轉(zhuǎn)染分裂及靜止細胞的能力，能持久的表達。應(yīng)用重組病毒攜帶單鏈抗體或Fab抗體治療腫瘤已有文獻報道。但由于單鏈抗體或Fab抗體在體內(nèi)半衰期很短，無抗體介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)，故療效不理想。而含人恒定區(qū)的全基因抗體包括人鼠嵌合抗體、人源化抗體及人的抗體，由于這三種抗體均同時含有人的輕鏈恒定區(qū)及人的重鏈恒定區(qū)，其半衰期大大延長，可為數(shù)天、甚至到21天之久，同時具有明顯的抗體介導(dǎo)的細胞毒效應(yīng)。
但迄今為止，尚未見到應(yīng)用重組病毒攜帶治療腫瘤區(qū)并含有人恒定區(qū)的全抗體的報告。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種高效低毒的治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體基因的重組病毒。
本發(fā)明的目的在于提供了一種用于抑制腫瘤細胞生長的并含有人恒定區(qū)的全抗體基因的重組病毒。
本發(fā)明的目的在于提供一種的治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體基因的重組病毒。
本發(fā)明的目的在于提供一種含有上述重組病毒的藥物組合物。
本發(fā)明人創(chuàng)造性地提供了用重組病毒攜帶治療腫瘤并含人恒定區(qū)的全基因抗體對腫瘤進行治療，即采用重組病毒攜帶治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體基因，將該重組病毒轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，使腫瘤細胞表達大量治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體，從而抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。本發(fā)明攜帶治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體基因的重組病毒在腫瘤組織中高效表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體，因此克服了全抗體難以進入實體瘤組織的困難；同時攜帶治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體基因的重組病毒生產(chǎn)成本低廉，從而解決了治療全抗體大量生產(chǎn)成本高的難題，因而從療效及經(jīng)濟上均優(yōu)于腫瘤的抗體治療法。
抗體(Ab)是一種對特異抗原的結(jié)合特異性的糖蛋白。天然抗體約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。輕鏈與重鏈通過一個共價二硫鍵與相連。每條重鏈是由一個可變區(qū)(VH)和多個恒定區(qū)組成。每條輕鏈是由一個可變區(qū)(VL)和一個恒定區(qū)組成；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相對，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對。
抗體的可變區(qū)中較為保守的區(qū)域稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個FR區(qū)(分別是FR1、FR2、FR3和FR4)，在4個框架區(qū)中間夾了3個高變區(qū)，它們大致上成β-折疊構(gòu)型，由三個高變區(qū)相連。每條鏈中的高變區(qū)通過FR區(qū)緊密的靠在一起并與另一鏈的高變區(qū)一起形成了抗體的抗原結(jié)合部位。
抗體的高變區(qū)(CDR)指抗體中負責抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來自“互補決定區(qū)”即“CDR”的氨基酸殘基。
恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)子功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細胞毒性。
木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生了兩個相同的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段，每個片段有單個抗原結(jié)合位點)以及一個殘余的“Fc”片段(該名稱反映了其容易結(jié)晶的能力)。用胃蛋白酶處理產(chǎn)生了一個F(ab’)2片段，該片段有兩個抗原結(jié)合位點，并仍能與抗原交聯(lián)。
“Fv”是最小的抗體片段，它含有全部抗原識別和結(jié)合位點。該區(qū)域由非共價地緊密結(jié)合的一個重鏈和一個輕鏈可變區(qū)的二聚物組成。在該構(gòu)型中，各可變區(qū)中的三個高變區(qū)相互作用，在VH-VL二聚物表面上界定了抗原結(jié)合位點。6個高變區(qū)共同組成抗體抗原結(jié)合特異性。然而。即使是單個可變區(qū)(或Fv的一半，它只包含對抗原有特異性三個可變區(qū))，也能識別并結(jié)合抗原，只是其親和力比完整的結(jié)合位點低。
Fab片段還含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一個恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段與Fab片段的不同之處在于，在重鏈CH1區(qū)的羧基端多幾個殘基(包括來自鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸)。Fab’-SH在本文表示恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶了游離巰基的Fab’。F(ab’)2抗體片段最初是以Fab’片段對的形式產(chǎn)生的，在其間有鉸鏈半胱氨酸。
人鼠嵌合抗體是最早研究的含有人恒定區(qū)的抗體?？贵w與抗原的結(jié)合完全取決于抗體的可變區(qū)，抗體的恒定區(qū)與抗原結(jié)合無關(guān)，但恒定區(qū)是抗體分子免疫原性的主要部位，因此通過用人的恒定區(qū)取代鼠單抗的恒定區(qū)，即人鼠嵌合抗體。它可消除抗體在人體中大部分異源性，并保留親本鼠單抗結(jié)合抗原的特異性和親和力，由于抗體各功能區(qū)形成相對獨立的空間構(gòu)象，使得恒定區(qū)的置換操作較為簡單，目前已構(gòu)建了多個人鼠嵌合抗體，美國已正式批準4個人鼠嵌合抗體上市，分別為ReoPro(抗血小板受體IIb IIIa的人鼠嵌合抗體，用于治療冠心病)、Rituxan(抗CD20的人鼠嵌合抗體，用于治療淋巴瘤)、Simulect(抗CD25的人鼠嵌合抗體，用于治療移植排斥)及Remicade(抗TNF-α的人鼠嵌合抗體，用于治療炎癥性腸病、類風濕性關(guān)節(jié)炎)，并在臨床應(yīng)用中取得良好療效。
由于僅將鼠單抗的恒定區(qū)替換成人的抗體恒定區(qū)，不能完全消除單抗的異源性，可變區(qū)中存在的鼠源性序列仍然可以誘導(dǎo)人體產(chǎn)生針對鼠源性抗體的抗抗體(HAMA)，它會中和治療抗體，使其被快速清除?？贵w輕、重鏈可變區(qū)的6個高變區(qū)(CDR)形成CDR平面直接接觸抗原，決定了抗體的特異性，抗體的可變區(qū)中框架區(qū)(FR)只是作為支持CDR的支架，其立體構(gòu)象極為保守，因此為人鼠嵌合抗體的鼠源性FR改變成人源性的FR區(qū)，從而最大限度地減少鼠單抗的異源性，這種單抗稱之為人源化的抗體。目前，美國已正式批準6個人鼠嵌合抗體上市，分別為Zanapax(抗CD25的人源化抗體，用于治療移植排斥)、Herceptin(抗Her2的人源化抗體，用于治療乳腺癌)、synagis(抗呼吸道合胞病毒F蛋白的人源化抗體，用于治療呼吸道合胞病毒感染)、mylotarg(抗CD33的人源化抗體，用于治療急性髓性白血病)及CAMPATH(抗CD52的人源化抗體，用于治療慢性淋巴細胞性白血病)并在臨床應(yīng)用中取得良好療效。
人的抗體是指完全來源于人的單克隆抗體，它的可變區(qū)及恒定區(qū)均為人源性。它來源于轉(zhuǎn)基因小鼠及抗體庫技術(shù)。目前已有多個人的抗體進入臨床試驗。
本發(fā)明中含有人恒定區(qū)的全抗體選自1)人鼠嵌合抗體的核苷酸序列；2)人源化的抗體的核苷酸序列；3)人的抗體的核苷酸序列。
基因治療出于安全原因的考慮，病毒載體是通過缺失病毒本身的部分基因，通常缺失基因是病毒增殖與復(fù)制的關(guān)鍵基因，從而成為增殖能力缺失的缺陷型病毒。將這種病毒增殖與復(fù)制的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)染細胞建立病毒包裝細胞株，包裝細胞株內(nèi)和病毒載體聯(lián)合可產(chǎn)生缺陷型病毒，該缺陷型病毒對靶細胞具有感染能力，但由于病毒缺失病毒增殖與復(fù)制的關(guān)鍵基因，因而不能在靶細胞內(nèi)復(fù)制及增殖，這是一個終末感染。因此，增殖能力缺失的病毒載體是一種基因運輸工具，它利用了病毒對細胞的高感染率，從而將目的基因轉(zhuǎn)入靶細胞中。
人腺病毒是DNA腫瘤病毒家族成員，能造成人類良性呼吸道感染，人腺病毒分為A、B、C、D、E及F共6種及1-47個血清型。人腺病毒在人體內(nèi)不會引起癌癥，但A與B種在嚙齒類動物中有一定致癌性，而其它人腺病毒致癌作用弱或無。目前應(yīng)用于基因治療腺載體極大多數(shù)采用C種的2及5血清型腺病毒，均無致癌性。感染時病毒在細胞核中保持游離狀態(tài)，能有效地轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細胞。
所有腺病毒載體均有轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細胞的能力，轉(zhuǎn)染率較高，它是非整合型載體，無致癌性。腺病毒載體的缺點在于運輸?shù)幕虿荒艹掷m(xù)表達，通常只表達5～20天，其基因短期表達是由于腺病毒蛋白激發(fā)的免疫反應(yīng)所致。
腺病毒很容易進行臨床應(yīng)用規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)，其病毒滴度很容易達到1012vp/ml，其病毒儲藏及運送條件均十分清楚，目前它在腫瘤基因治療中占主導(dǎo)地位。
本發(fā)明提供一類重組病毒，該病毒為增殖能力缺陷的重組腺病毒。
第一代腺病毒為E1缺失(有時還加上E3缺失)。E1區(qū)位于大小為36kb的基因組的左側(cè)末端，編碼其它早期和晚期基因表達所必須的蛋白質(zhì)，在這一區(qū)域可以有最大為3150bp的缺損。E1區(qū)的產(chǎn)物是病毒生長所必須的，因此E1區(qū)缺失的腺病毒只能在某些能夠提供E1區(qū)蛋白的輔助細胞株如293、911或PER.C6中復(fù)制增殖，而在極大多數(shù)體細胞中均不能復(fù)制。E3區(qū)編碼產(chǎn)物可以抵抗宿主的防御機制，這些產(chǎn)物不是病毒體外復(fù)制所必需的，因此并不要輔助細胞株。然而，在一些項目中，希望保存甚至增加一些E3區(qū)產(chǎn)物的表達。例如，腺病毒“死亡蛋白”(death protein)E3-11.6K，它可以促進被感染的細胞釋放病毒顆粒。還有g(shù)p19K，它參與的表達產(chǎn)物可以減少宿主的細胞毒性T細胞對載體的免疫反應(yīng)，并且增加其下游外源基因表達的持續(xù)性，但可能不是增加整個E3區(qū)的持續(xù)表達。E3區(qū)最大插入容量為3.1kb。由于腺病毒能夠包裝成38kb的大小而不影響生長速度和病毒滴度，因此E1區(qū)能夠裝載5.1kb，而E1/E3同時去除后插入容量為8.2kb。
本發(fā)明提供一類重組病毒，該腺病毒E1區(qū)缺失并伴有E3缺失或E3不缺失，該腺病毒仍具有感染能力但缺失了增殖能力。
第一代腺病毒載體在體內(nèi)能引起明顯的免疫反應(yīng)，其原因主要是病毒蛋白的重新合成引起的，由此產(chǎn)生了第二代腺病毒載體。已經(jīng)構(gòu)建了許多不同的細胞株，它們能夠表達E2a DNA結(jié)合蛋白、E2b編碼末端蛋白和病毒DNA聚合酶，所有/大部分E4的產(chǎn)物。相應(yīng)的病毒基因組缺損可以允許最大可插入14kb的表達盒。
本發(fā)明提供一類重組病毒，該病毒E1區(qū)缺失并伴有E2缺失。
本發(fā)明提供一類重組病毒，該病毒E1區(qū)缺失并伴有E4缺失。
第三代腺病是空殼腺病毒，除了保留病毒DNA復(fù)制和包裝所必須的順式作用序列外，它缺失了其他所有的病毒基因，這樣的病毒載體從理論上能夠裝載大小約為37kb的多個外源基因。
本發(fā)明提供一類重組病毒，該病毒為空殼重組病毒。
腺相關(guān)病毒(AAV)是一種小的、非致病的、單鏈DNA病毒。它的復(fù)制需要依賴于腺病毒或皰疹病毒等。腺相關(guān)病毒本身有兩個基因，但不同的剪切可編碼七個蛋白質(zhì)rep基因編碼病毒的復(fù)制、整合功能，包括Rep78，Rep6，Rep52及Rep40；cap基因編碼病毒的結(jié)構(gòu)組分，包括VP1、VP2及VP3。rep和cap的兩端各有一個反向末端重復(fù)序列(ITRs)。
病毒載體是用治療基因替代rep和cap基因來構(gòu)建的。Rep蛋白和Cap蛋白由包裝細胞產(chǎn)生，故病毒復(fù)制還需要腺病毒蛋白的幫助。AAV能通過Rep蛋白定點特異性整合到19號染色體。然而，由于載體不編碼Rep基因，進入靶細胞后并不能特異性整合到19號染色體。
AAV病毒對多種細胞具有高親和力，因此AAV載體適用范圍廣泛。同時由于AAV的Cap基因容易改造，因此不少研究者通過對Cap的改造以設(shè)計靶向性轉(zhuǎn)染的病毒載體。在多種動物試驗中，肌肉、肝臟、腦等長周期細胞的AAV載體基因表達持續(xù)存在。長期表達緣于載體隨機整合和一些載體DNA以染色體外DNA形式存在。目前，基因表達起源于整合的DNA和染色體外DNA的比例尚不清楚。同時AAV非常穩(wěn)定，易于保存及運輸。目前作為基因治療最常用的AAV病毒載體是2型AAV病毒載體及1型AAV病毒載體，對于目的基因的表達，后者比前者高數(shù)百倍，甚至上千倍。
本發(fā)明提供一類重組病毒，當所用其中所述病毒為增殖能力缺陷的重組腺相關(guān)病毒。
本發(fā)明提供一類重組重組病毒，本發(fā)明所述的重組病毒中，編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有治療腫瘤作用并含有人恒定區(qū)的全抗體蛋白，均可被用于本發(fā)明。其編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種編碼抗新生血管生成并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，編碼抗腫瘤細胞生長因子受體或抗體片段的核苷酸序列，編碼抗腫瘤細胞膜抗原并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，編碼抗腫瘤抗原的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類重組病毒，所述治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體為編碼抗新生血管生成并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，本發(fā)明所述的重組病毒中，編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有抗新生血管生成并含有人恒定區(qū)的全抗體蛋白，均可被用于本發(fā)明。其所述編碼抗新生血管生成并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種抗血管內(nèi)皮生長因子并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抗血管內(nèi)皮生長因子受體2并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抗整合素的αvβ3并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抑制新生血管內(nèi)皮生成并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在血管生成中起關(guān)鍵作用，它通過促進血管生成從而在腫瘤生成及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用?？寡軆?nèi)管生長因子的抗體及抗體片段可阻斷血管內(nèi)皮生長因子與其受體(特別血管內(nèi)皮生長因子受體2)結(jié)合，抑制腫瘤新生血管的生成，從而抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。美國Genentech公司的抗血管內(nèi)皮生長因子的嵌合性抗體(Avastin，另一個名稱為Bevacizumab)已處于晚期實體瘤的III期臨床試驗階段。美國ImCloneSystems公司的針對抗血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR)的抗體IMC-1C11已進入腫瘤的I期臨床試驗。整合素的αvβ3通過細胞間基質(zhì)與內(nèi)皮細胞之間信號傳遞從而參予新生血管的生成，抗整合素的αvβ3的抗體可抑制新生血管生成，從而抑制腫瘤的形成。
本發(fā)明提供一類重組病毒，所述治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體為編碼抗腫瘤細胞生長因子受體并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，本發(fā)明所述的重組病毒中，編碼抗腫瘤細胞生長因子受體并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有抗腫瘤細胞生長因子受體并含有人恒定區(qū)的全抗體蛋白，均可被用于本發(fā)明。其所述編碼抗腫瘤細胞生長因子受體并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種抗表皮生長因子受體1并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抗表皮生長因子受體2并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列。
人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor)在多種惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)化上起關(guān)鍵作用，它在多種腫瘤細胞中過表達。人表皮生長因子受體也被稱為ErbB受體，目前已有四個成員被識別，分別表皮生長因子受體1(HER1，又稱為ErbB1或EGFR)、表皮生長因子受體2(HER2，又稱為ErbB1或Neu)、表皮生長因子受體3(HER3，又稱為ErbB3)及表皮生長因子受體4(HER4，又稱為ErbB4)。阻斷表皮生長因子受體信號傳導(dǎo)可抑制腫瘤細胞生長。美國ImClone Systems公司的針對表皮生長因子受體1嵌合抗體IMC-C225對多種晚期腫瘤有明顯的治療作用，目前該抗體已在III及IV期臨床試驗。美國另一家生物公司Abgenix公司的針對表皮生長因子受體1的人的抗體ABX-EGF對多種晚期腫瘤有明顯的治療作用，目前該抗體已在II期臨床試驗。美國Genentech公司的針對表皮生長因子受體2的人源化抗體Herceptin(又稱為Trastuzumab)已于1998年美國FDA批準進行臨床應(yīng)用，它與化療聯(lián)合產(chǎn)生明顯的臨床療效。該公司的另一個針對表皮生長因子受體2的人源化抗體2C4亦已進入I期臨床試驗。
本發(fā)明提供一類重組病毒，所述治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體為編碼抗腫瘤細胞膜抗原并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，本發(fā)明所述的重組病毒中，編碼抗腫瘤細胞膜抗原并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有抗腫瘤細胞膜抗原并含有人恒定區(qū)的全抗體蛋白，均可被用于本發(fā)明。其所述編碼抗腫瘤細胞膜抗原并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種抗CD20并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抗CD52并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抗MUC1并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列。
由于CD20存在于所有的B淋巴細胞中，抗CD20抗體可殺滅所有的B淋巴細胞，從而大大降低針對腺病毒載體抗體的產(chǎn)生，從而使腺病毒載體重復(fù)使用成為可能。同時由于B細胞淋巴瘤本身亦存在著抗體產(chǎn)生障礙，這也可導(dǎo)致針對腺病毒載體抗體減少。因此應(yīng)用含有腺病毒攜帶治療腫瘤區(qū)并含有人恒定區(qū)的抗CD20的全抗體，具有明顯的治療B細胞淋巴瘤的作用。美國Genentech公司的抗CD20的嵌合抗體Rituxan(又稱為Rituximab)用于治療B-細胞淋巴瘤，已于1997年批準臨床正式應(yīng)用。
CD52在大多數(shù)正常和惡性成熟淋巴細胞(包括T淋巴細胞和B淋巴細胞)表面具有高表達，而不表達于造血干細胞，抗CD52抗體可殺滅所有的成熱淋巴細胞，從而大大降低針對腺病毒載體抗體及T細胞免疫的產(chǎn)生，從而使腺病毒載體重復(fù)使用成為可能。因此應(yīng)用含有腺病毒攜帶治療腫瘤區(qū)并含有人恒定區(qū)的抗CD52的全抗體，具有明顯的治療淋巴瘤的作用?？笴D20的人源化抗體Campath用于治療慢性淋巴細胞性白血病，已于2001年批準臨床正式應(yīng)用。
MUC1廣泛存于多種腫瘤中，美國Antisoma公司抗MUC1人源化抗體已進入臨床試驗。
本發(fā)明提供一類重組重組病毒，所述治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體為編碼抗腫瘤抗原的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列，本發(fā)明所述的重組病毒中，編碼抗腫瘤抗原的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有抗腫瘤抗原的獨特型單克隆全抗體的蛋白，均可被用于本發(fā)明。其所述編碼抗腫瘤抗原的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種抗17-1A的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列，抗癌胚抗原的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列，抗GD3的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列，抗MUC1的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列。
抗獨特型單克隆抗體(anti-idiotypic mAb，也可用Ab2表示)又稱之抗個體基因型抗體，它模擬腫瘤細胞表面的抗原，可引起細胞毒T細胞和輔助T細胞反應(yīng)，從而達到治療腫瘤的目的。17-1A在上皮來源的腫瘤細胞內(nèi)高表達，德國于1997年已批準由GlaxoWellcome/Centocor公司生產(chǎn)的抗17-1A獨特型單克隆抗體(Panorex)用于治療結(jié)腸癌。美國ImClone Systems公司的針對抗的GD3的獨特型單克隆抗體BEC2抗體IMC-1C11已進入腫瘤的III期臨床試驗。
本發(fā)明提供一類的重組重組病毒，所述編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種Ig G的核苷酸序列或Ig M的核苷酸序列。
脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯不同兩類(稱為kappa(κ)和lambda(λ)中一類。
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgGT和IgM，其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-1和IgA-2。對應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)稱為α、β、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。
本發(fā)明提供一類重組重組病毒，所述編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列可與抗癌基因的核苷酸序列產(chǎn)生融合基因的核苷酸序列，該抗癌基因只要能夠具有治療腫瘤作用的基因，均可被用于本發(fā)明。其編碼治療腫瘤基因可選自下述之一種為血管抑制基因、細胞因子基因、前藥轉(zhuǎn)換酶基因及細胞毒性基因之一種。
其抗癌基因可以是血管抑制基因，血管抑制基因抑制腫瘤新生血管形成，可阻斷腫瘤細胞的營養(yǎng)供應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤細胞因營養(yǎng)不足而死亡，腫瘤明顯萎縮乃至完全消褪。同時抑制腫瘤新生血管的形成，也達到阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移的通路的目的。本發(fā)明所述的重組病毒中，其中所述的血管抑制基因的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有血管抑制的基因，均可被用于本發(fā)明。其所述的血管抑制基因的核苷酸序列可選自下述之一種內(nèi)皮抑素基因，血管生成抑素基因，血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-4結(jié)構(gòu)、Kringle1-5結(jié)構(gòu)、Kringle1-3結(jié)構(gòu)、Kringle1-3加上Kringle5結(jié)構(gòu)、血小板反應(yīng)蛋白基因、血小板因子4基因、纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)基因及纖維結(jié)合素基因。
其抗癌基因可以是細胞因子基因，細胞因子基因具有激活免疫細胞，增加造血功能等，本發(fā)明所述的重組病毒中，其中所述的細胞因子基因的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有細胞因子功能的基因，均可被用于本發(fā)明。其所述的細胞因子基因的核苷酸序列可選自下述之一種白細胞介素2、白細胞介素12、粒-單集落刺激因子、腫瘤壞死因子、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、Light及Flt3配體。
其抗癌基因可以是前藥轉(zhuǎn)換酶基因，前藥轉(zhuǎn)換酶基因可使無毒性藥物轉(zhuǎn)變成毒性藥物，從而增強對腫瘤細胞的殺傷。本發(fā)明所述的重組病毒中，其中所述的前藥轉(zhuǎn)換酶基因的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有前藥轉(zhuǎn)換酶基因，均可被用于本發(fā)明。其所述的前藥轉(zhuǎn)換酶基因的核苷酸序列可選自下述之一種單純皰疹重組病毒胸腺嘧啶激酶、細菌β-內(nèi)酰胺酶及大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶；本發(fā)明所述的重組病毒中，其中所述的毒素基因的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有毒素基因，均可被用于本發(fā)明。其所述的毒素基因的核苷酸序列可選自下述之一種，可以是綠膿桿菌外毒片段。
本發(fā)明提供一類重組病毒，其中編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列受啟動子控制。只要能夠啟動子功能，均可被用于本發(fā)明。其啟動子可以為以下啟動子之一猴重組病毒40(Simian virus40，按常規(guī)簡稱為SV40)啟動子，勞斯氏肉瘤重組病毒(Rous Sarcoma Virus，按常規(guī)簡稱為RSV)LTR啟動子，人巨細胞重組病毒(按常規(guī)簡稱為HCMV)IE啟動子，鼠巨細胞重組病毒(按常規(guī)簡稱為MCMV)IE啟動子及人腺病主要晚期表達啟動子(按常規(guī)簡稱為MLP)。
本發(fā)明提供一類重組病毒，該重組病毒是腺病毒體時，在控制編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體表達的啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點與抗體的翻譯起始位點中插入內(nèi)含子，插入內(nèi)含子后可使抗體表達量大大增加。這種內(nèi)含子包括，但不限于選自的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有增加抗體的表達的內(nèi)含子，均可被用于本發(fā)明。其所述的內(nèi)含子可以為雜合內(nèi)含子，雜合內(nèi)含子可以選下述之一含有腺病毒主要晚期mRNA的第三個引導(dǎo)順序的5’剪接位點和一個免疫球蛋白的3’剪接位點的雜合內(nèi)含子，含有腺病毒主要晚期mRNA的第一個引導(dǎo)順序的5’剪接位點和一個免疫球蛋白的3’剪接位點的雜合內(nèi)含子。
本發(fā)明在上述這種修飾重組病毒基因組中插入編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，本發(fā)明所述的編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列為編碼抗新生血管生成并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，編碼抗腫瘤細胞生長因子受體或抗體片段的核苷酸序列，編碼抗腫瘤細胞膜抗原并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列。隨著重組病毒感染腫瘤細胞，使腫瘤細胞高效表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體，從而抑制腫瘤血管形成，抑制腫瘤形成、生長及轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明在上述這種修飾重組病毒基因組中插入編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，本發(fā)明所述的編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列為編碼抗新生血管生成并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，編碼抗腫瘤細胞生長因子受體或抗體片段的核苷酸序列，編碼抗腫瘤細胞膜抗原并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列。隨著重組病毒感染正常細胞，使正常細胞高效表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體，從而抑制腫瘤血管形成，抑制腫瘤形成、生長及轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的又一方面，提供了一種利用本發(fā)明的重組病毒應(yīng)用于腫瘤的治療，其包括如下步驟1)將該重組病毒體外或體內(nèi)感染腫瘤細胞，2)在腫瘤細胞內(nèi)表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體，抑制腫瘤形成、生長及轉(zhuǎn)移。本發(fā)明中所述的哺乳動物包括但不限于人，猴，牛，羊，豬，犬，貓等等。
在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種利用本發(fā)明的重組病毒治療哺乳動物尤其是人類腫瘤的方法，其中還包括在本發(fā)明所述重組病毒感染腫瘤細胞之前、同時和/或之后施用化學(xué)抗腫瘤藥物。
本發(fā)明的又一方面，提供了一種利用本發(fā)明的重組病毒應(yīng)用于腫瘤的治療，其包括如下步驟1)將該重組病毒體外或體內(nèi)感染正常細胞，2)在正常細胞內(nèi)表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體，抑制腫瘤形成、生長及轉(zhuǎn)移。。本發(fā)明中所述的哺乳動物包括但不限于人，猴，牛，羊，豬，犬，貓等等。
在本發(fā)明的又一方面，還提供了一種利用本發(fā)明的重組病毒治療哺乳動物尤其是人類腫瘤的方法，其中還包括在本發(fā)明所述重組病毒感染正常細胞之前、同時和/或之后施用化學(xué)抗腫瘤藥物。
為了進一步提高治療效果，本發(fā)明提出的高效表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的重組病毒可以與常規(guī)化療藥物(如順鉑、5-氟脲嘧啶絲裂霉素C等)、生物毒素(如蛇毒素)、單克隆治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體一起用于治療腫瘤，其作為抗腫瘤藥物效果更好。在本發(fā)明的又一實施方案中，本發(fā)明的重組病毒與X-線聯(lián)合應(yīng)用，可產(chǎn)生更為有效的抗腫瘤效應(yīng)。
本發(fā)明提供一類重組病毒，所述重組病毒本身通過在腫瘤細胞中的復(fù)制和增殖，可以特異性抑制腫瘤細胞的生長。
本發(fā)明再一方面，提供了本發(fā)明所述的重組病毒用于抑制腫瘤細胞的生長的用途。
重組病毒向靶細胞的送遞有多種方式，包括但不限于脂質(zhì)體，本領(lǐng)域熟知的常規(guī)轉(zhuǎn)染方法(如磷酸鈣沉淀或電穿孔)，直接注射，及靜脈內(nèi)灌注。送遞方法主要取決于特定重組重組病毒(包括其形態(tài))以及靶細胞的類型和位置(即細胞在體外還是在體內(nèi))。
若使用包裝的重組病毒，則其可在適當?shù)纳韺W(xué)上可接受載體中以劑量約104至約1014給予。感染復(fù)數(shù)通常范圍是約0.001至100。若所給予的是多核苷酸(即未包裝成重組病毒)，則其劑量可以是約0.01μg至約1000μg。具體的給藥量可根據(jù)該重組病毒的有關(guān)常識(可方便地得自如已公布的文獻)而定，亦可憑經(jīng)驗確定。重組病毒的給予可以是一次，也可以是多次，這取決于其目的用途和宿主的免疫應(yīng)答能力，還可多重地同時注射給藥。若不期望產(chǎn)生免疫應(yīng)答，則可用各種免疫抑制劑減少免疫應(yīng)答，以便能重復(fù)給藥而不產(chǎn)生強免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還包括內(nèi)含本文所述重組病毒的組合物，如藥物組合物。這類組合物可體內(nèi)給藥。優(yōu)選地，這些組合物更進一步包含藥物學(xué)上可接受的賦形劑。這些可包含有效量的本發(fā)明重組病毒于藥物學(xué)上可接受的賦形劑中的組合物適于以單位劑量形式、無菌的胃腸道外溶液或懸浮液、無菌的非胃腸道外溶液或口服液或懸浮液，水包油或油包水乳液等全身性給藥于個體。非胃腸道外和胃腸道外藥物送遞配方為本領(lǐng)域已知，可參見Remington’s藥物科學(xué)，18版，Mack Publishing(1990)。藥物組合物還包括本發(fā)明重組病毒的凍干形式和/或重建形式(包括包裝成重組病毒的那些)。
本發(fā)明還提供治療方法，其中將有效量的本文所述重組病毒施用于個體。應(yīng)用重組病毒的治療方法可用于腫瘤(如肝細胞癌)患者。還可用于腫瘤高危人群，如那些有此類病的家族史和/或有已切除或以其它形式(如化療)治療過的疾病的個體。決定是否適于施用本發(fā)明的重組病毒將特別依據(jù)可評估的臨床參數(shù)，如血清學(xué)指標及組織活檢樣品的組織學(xué)檢查。通常施用含重組病毒的藥物組合物。藥物組合物如上述。
重組病毒的用量取決于多種因素，如具體的重組病毒類型，給藥途徑，個體的身體狀況，疾病發(fā)展程度，所用的具體腫瘤治療基因。
若施用包裝的重組腺病毒，則用量為約104至約1014，優(yōu)選約104至約1012，更優(yōu)選約104至約1010。若施用多核苷酸，則用量為約0.01μg至約100μg，優(yōu)選0.1μg至約500μg，更優(yōu)選約0.5μg至約200μg?？赏瑫r或先后施用不止一種重組病毒。通常是周期性給藥，同時監(jiān)控任何反應(yīng)?？山?jīng)如腫瘤內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。
與現(xiàn)有的腫瘤治療方法相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明提供一類治療腫瘤的重組病毒，動物實驗證明，這種重組病毒可用于治療腫瘤。
本發(fā)明提供一類高效表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的腫瘤細胞內(nèi)特異性增殖的重組病毒的構(gòu)建方法。該方法通常易行可用于構(gòu)建高效表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的腫瘤細胞內(nèi)特異性增殖的重組病毒。
本發(fā)明提供一種在體內(nèi)及體外殺滅腫瘤細胞、而基本上不影響正常細胞，并在體內(nèi)及體外腫瘤細胞內(nèi)高效表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體，與化學(xué)抗腫瘤藥物結(jié)合，更有效地殺滅腫瘤細胞，達到高效低毒應(yīng)用于治療腫瘤的目的。
人類腺病毒有6個不同亞屬，分為A、B、C、D、E及F。它們對宿主細胞的親嗜性、致瘤性及疾病性史并不相同。本發(fā)明以腺病毒C亞屬中的5型(Ad5)作為例證，對本發(fā)明加以進一步具體說明，本發(fā)明構(gòu)建手段均是現(xiàn)有技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)。


圖1是重組腺病毒SG002、SG102及對照腺重組病毒Ad5-Lac Z體外感染的WI-38、BJ及SK-Br-3后，WI-38、BJ及SK-Br-3細胞上清中人源化抗體的表達量圖。
圖2是重組腺病毒SG002體外感染的WI-38及SK-Br-3后，WI-38及SK-Br-3細胞上清分泌人源化抗體與Herceptin對人表皮生長因子受體2(Her2)陽性的乳腺癌細胞SK-Br-3增殖抑制作用圖。細胞增殖率＝治療細胞數(shù)/對照細胞數(shù)×100％圖3是重組腺病毒SG002及對照腺重組病毒Ad5-Lac Z分別按1×109及5×109pfu尾靜脈給予Balb/c小鼠治療1周后小鼠血清中人源化抗體的表達量圖。
圖4是實施例2構(gòu)建的重組病毒圖。
具體實施例方式
例1.分別攜帶抗人表皮生長因子受體1(EGFR)的人的抗體SG-EGFR基因、抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因及抗人CD20的人鼠嵌合抗體SG-CD20基因的表達載體的構(gòu)建pShuttle-CMV購于美國Qbiogene，含有人巨細胞病毒啟動子(CMV IE)及SV40 poly A加尾信號，應(yīng)用PCR技術(shù)克隆人巨細胞病毒啟動子(CMV IE)及SV40 poly A加尾信號，并在上下游位置中分別加入Bgl II酶切位點，在其人巨細胞病毒啟動子(CMV IE)及SV40poly A加尾信號之間插入多克隆位點，分別為EcoR I、Sal I、Hind III、Xho I及BamHI酶切位點，其方法采用定位突變雙次PCR技術(shù)(方法參見PCR Protools Current Methodsand Applications，White BA主編，Humana Press Inc.1993年出版-文獻1)。其引物分別為應(yīng)用引物1與引物2對pShuttle-CMV進行PCR，其產(chǎn)物長度為621bp。
引物1GGG GTA CCT AGA TCT TAG TAA TCA ATT ACG GGG TCA
引物2GAG AAG CTT GTC GAC GAA TTC CTA GCG GAT CTG ACG GTT CAC應(yīng)用引物3與引物4對pShuttle-CMV進行PCR，其產(chǎn)物長度為293bp。
引物3GAA TTC GTC GAC AAG CTT CTC GAG GGA TCC ATC TAG ATA ACT GAT CAT A引物4ATA GTT TAG CGG CCG CTA AGA TCT AAG ATA CAT TGA TGA GTT TG應(yīng)用引物與引物4對上述片斷進行PCR，其產(chǎn)物長度為893bp應(yīng)用Kpn I與Not I雙酶切后，插入pBluescript中.進行測序，正確者命名為pClone1，其Bgl II酶切后長度為861bp。
腦心肌炎病毒(FMCV)的多順反子(IRES)來源于pIRES-EYFP，該質(zhì)粒購于美國Clontech公司。應(yīng)用引物5與引物6對其進行PCR，其擴增長度為624bp引物5CCG GAA TTC ATC GAT TCT GTC GAC CTG CAG GAA TTG CCC CTC TCC CTC引物6TGC TCT AGA CCC GGG CTC GAG GGA TCC TTA ATC ATC GTG TTT TTC AAA G用EcoR I+Xba I雙酶切插入pUC19的EcoR I+Xba I酶切位點中，進行測序，命名為pUC19-IRES用EcoR I+Xba I雙酶切分別插入pClone1的EcoR I+Xba I酶切位點中，命名為pClone2。
質(zhì)粒pClone2為含有腦心肌炎病毒(EMCV)的多順反子(IRES)的雙基因表達載體，其啟動子為人巨細胞病毒啟動子(CMV IE)，含有兩個多克隆位點，第一個多克隆位點的酶切位點依次為EcoR I、Cla I、Sal I及Pst I，第二個多克隆位點的酶切位點依次為BamH I、Xho I、Xma I及Xba I。
抗人表皮生長因子受體1(EGFR)的人的抗體SG-EGFR由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司進行全長基因合成，其輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)與美國Abgenix公司的針對表皮生長因子受體1的人的抗體ABX-EGF的輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)相同。含有SG-EGFR重鏈基因并在重鏈上游區(qū)引入BamH I酶切位點和重鏈下游區(qū)引入Xba I酶切位點的pUC19質(zhì)粒命名為pUC-SG-EGFRH。含有SG-EGFR輕鏈基因并在輕鏈上游區(qū)引入EcoR I和輕鏈下游區(qū)引入Sal I酶切位點的pUC19質(zhì)粒為pUC-SG-EGFRL。
SG-EGFR的重鏈基因的核苷酸序列CGCGGATCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGTCTC
TGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTGATTACTACTGGACCTGGATTCGGCAGTCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACACATCTATTACAGTGGGAACACCAATTATAACCCCTCCCTCAAGAGTCGACTCACCATATCAATTGACACGTCCAAGACTCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCATTTATTACTGTGTGCGAGATCGAGTGACTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAATCTAGAAAGCTTGGG→SG-EGFR的輕鏈基因的核苷酸序列CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATCAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTTCTGTCAACACTTTGATCATCTCCCGCTCGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAC→→應(yīng)用BamH I+Xba I將pUC-SG-EGFRH切下，定向插入pClone2載體BamH I+Xba I中，命名為pClone2-SG-EGFRH。應(yīng)用EcoR I+Sal I將pUC-SG-EGFRL切下，定向插入pClone2-SG-EGFRH載體EcoR I+Sal I中，命名為pClone2-SG-EGFR。
抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司進行全長基因合成，其輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)與美國Genentech公司的針對表皮生長因子受體2的人源化抗體Herceptin的輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)相同。含有SG-HER重鏈基因并在重鏈上游區(qū)引入BamH I酶切位點和重鏈下游區(qū)引入Xho I酶切位點的pUC19質(zhì)粒命名為pUC-SG-HERH。含有SG-HER輕鏈基因并在輕鏈上游區(qū)引入EcoR I和輕鏈下游區(qū)引入Sal I酶切位點的pUC19質(zhì)粒為pUC-SG-HERL。
SG-HER的重鏈基因的核苷酸序列GGATCCACCATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAACTCGAG
SG-HER的輕鏈基因的核苷酸序列CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAC→應(yīng)用BamH I+Xho I將pUC-SG-HERH切下，定向插入pClone2載體BamH I+Xho I中，命名為pClone2-SG-HERH。應(yīng)用EcoR I+Sal I將pUC-SG-HERL切下，定向插入pClone2-SG-HERH載體EcoR I+Sal I中，命名為pClone2-SG-HER。
抗人CD20的人鼠嵌合抗體SG-CD20基因由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司進行全長基因合成，其輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)與美國IDEC公司的針對CD20的人鼠嵌合抗體IDEC-C2B8(Rituximab)的輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)相同。含有SG-CD20重鏈基因并在重鏈上游區(qū)引入BamH I酶切位點和重鏈下游區(qū)引入Xba I酶切位點的pUC19質(zhì)粒命名為pUC-SG-CD20H。含有SG-CD20輕鏈基因并在輕鏈上游區(qū)引入EcoR I和輕鏈下游區(qū)引入SalI酶切位點的pUC19質(zhì)粒為pUC-SG-CD20L。
SG-CD20的重鏈基因的核苷酸序列CGCGGATCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTCAGGTACAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGTCGGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCCGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGACTTACTACGGCGGTGACTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCG
AACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAATCTAGASG-CD20的輕鏈基因的核苷酸序列CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACTTCTTACTCTCTCACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAC應(yīng)用BamH I+Xba I將pUC-SG-CD20H切下，定向插入pClone2載體BamH I+Xba I中，命名為pClone2-SG-CD20H。應(yīng)用EcoR I+Sal I將pUC-SG-CD20L切下，定向插入pClone2-SG-CD20H載體EcoR I+Sal I中，命名為pClone2-SG-CD20。
例2.分別攜帶抗人表皮生長因子受體1(EGFR)的人的抗體SG-EGFR基因、抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因及抗人CD20的人鼠嵌合抗體SG-CD20基因的增殖缺陷腺病毒的重組。
腺病毒載體pDC315、pBHGlox(delta)ElCre及pBHGlox(delta)E1，3Cre購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)。
將pClone2-SG-EGFFR用EcoR I+Xba I切下，定向插入pDC315載體EcoR I+Nhe I中，命名為pDC315-SG-EGFR。將pClone2-SG-HER用EcoR I+Xho I切下，定向插入pDC315載體EcoR I+Sal I中，命名為pDC315-SG-HER。將pClone2-SG-CD20用EcoR I+Xba I切下，定向插入pDC315載體EcoR I+Nhe I中，命名為pDC315-SG-CD20。
為進一步提高抗體表達量，在啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點與抗體的翻譯起始位點中插入內(nèi)含子，該內(nèi)含子為腺病毒主要晚期mRNA的第三個引導(dǎo)順序的5’剪接位點和一個免疫球蛋白的3’剪接位點的雜合內(nèi)含子。雜合內(nèi)含子核苷酸序列由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司進行全長合成，并在內(nèi)含子上游區(qū)引入Spe I酶切位點和內(nèi)含子下游區(qū)引入EcoR I酶切位點的pUC19質(zhì)粒命名為pUC-Intron。
雜合內(nèi)含子的核苷酸序列ACTAGTTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGTCTTGAGACGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACCGAATTC合成兩個DNA寡核苷酸片段做一個連接頭，其DNA寡核苷酸序列為引物7 AAT TAC TAG TCA GGA ATT CAA GCT TAG ATC TG引物8 CTA GCA GAT CTA AGC TTG AAT TCC TGA CTA GT將兩個DNA寡核苷酸片段各0.1μg混合，100℃變性5分鐘，然后緩慢降溫復(fù)性，復(fù)性后應(yīng)用T4噬菌體多核苷酸激酸進行磷酸化。將該磷酸化后的連接頭插入pDC315載體的EcoR I和Nhe I位點，命名為pDC315-Linker，該載體的多克隆位點分別Spe I、EcoR I、Hind III、Bgl II、Nhe I、BamH I、Sal I積AccI。
應(yīng)用Spe I+EcoR I酶切pUC-Intron，其片段插入PDC315-linker的Spe I+EcoR I酶切位點中，命名為pYQ10，該載體的多克隆位點分別EcoR I、Hind III、Bgl II、Nhe I、BamH I、Sal I積AccI。將pClone2-SG-HER用EcoR I+Xho I切下，定向插入pYQ10載體EcoR I+Sal I中，命名為pYQ10-SG-HER。
293細胞株購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎細胞而成，它含有及表達5型腺病毒E1區(qū)，腺病毒DNA對其具有高轉(zhuǎn)染率。將含有5型腺病毒左臂的質(zhì)粒聯(lián)合含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞，通過同源重組可產(chǎn)生具有感染力的腺病毒。我們將PDC315-SG-EGFR含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHGlox(delta)ElCre通過Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細株。PDC315-SG-EGFR、PDC315-SG-EGFR及pYQ10-SG-HER分別與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1，3Cre通過Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細株。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)重組病毒空斑，經(jīng)過三次重組病毒空斑純化，分別得到攜帶抗人表皮生長因子受體1(EGFR)的人的抗體SG-EGFR基因的增殖缺陷腺病毒Ad-SG-EGFR、抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的增殖缺陷腺病毒Ad-SG-HER、抗人CD20的人鼠嵌合抗體SG-CD20基因的增殖缺陷腺病毒Ad-SG-CD20及抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因并在MCMV啟動子下游插入雜合內(nèi)含子的增殖缺陷腺病毒Adi-SG-HER，分別記為SG001、SG002、SG003及SG102。
由上述方法構(gòu)建的重組病毒見圖4。
腺重組病毒在293細胞中大量繁殖，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法大量純化重組腺病毒(方法參見Gene Transfer and Expression Protocols，Murray EJ主編，Humana Press 1991出版-文獻2)。Ad-SG-EGFR(SG001)為5型腺病毒，E1區(qū)(腺病毒的bp342-bp3523缺失)缺失，插入含有鼠巨細胞病毒(MCMV)IE啟動子、含有抗人表皮生長因子受體1的人的抗體SG-EGFR的輕鏈及重鏈基因及腦心肌炎病毒多順反子、SV40 poly A加尾信號基因序列，重組病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad-SG-HRE(SG002)為5型腺病毒，E1區(qū)(腺病毒的bp342-bp3523缺失)缺失，插入含有鼠巨細胞病毒(MCMV)IE啟動子、含有抗人表皮生長因子受體2的人的抗體SG-HER的輕鏈及重鏈基因及腦心肌炎病毒多順反子、SV40poly A加尾信號基因序列，同時伴有bp28133-bp30818(E3區(qū)部分序列)缺失，重組病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad-SG-CD20(SG003)為5型腺病毒，E1區(qū)(腺病毒的bp342-bp3523缺失)缺失，插入含有鼠巨細胞病毒(MCMV)IE啟動子、含有抗人表皮生長因子受體1的人的抗體SG-CD20的輕鏈及重鏈基因及腦心肌炎病毒多順反子、SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有bp28133-bp 30818(E3區(qū)部分序列)缺失，重組病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Adi-SG-HRE(SG102)為5型腺病毒，E1區(qū)(腺病毒的bp342-bp3523缺失)缺失，插入含有鼠巨細胞病毒(MCMV)IE啟動子、含有腺病毒主要晚期mRNA的第三個引導(dǎo)順序的5’剪接位點和一個免疫球蛋白的3’剪接位點的雜合內(nèi)含子、含有抗人表皮生長因子受體2的人的抗體SG-HER的輕鏈及重鏈基因及腦心肌炎病毒多順反子、SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有bp28133-bp30818(E3區(qū)部分序列)缺失，重組病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
例3.攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的增殖缺陷腺相關(guān)病毒的重組。
2型腺相關(guān)病毒載體pTR美國俄亥俄州醫(yī)學(xué)院石文芳博士贈送，pSH3載體由美國俄亥俄州醫(yī)學(xué)院生化及分子生物學(xué)系James P.Trempe教授贈送。載體pTR含有2型腺相關(guān)病毒的兩個未端重復(fù)序列ITR及包裝信號序列ψ，pSH3含有5型腺病毒的E4、E2a、VA以及2型腺相關(guān)病毒的cap及rep。
將pClone2-SG-HER用EcoR I+Xho I切下，定向插入pTR載體EcoR I+Sal I中，命名為pTR-SG-HER。
將pTR-SG-HER與pSH3通過Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細株。共轉(zhuǎn)染72小時后，收集細胞與上清，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法純化重組腺相關(guān)病毒(具體方法參見前述文獻2)，得到攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的增殖缺陷腺相關(guān)病毒AAV-SG-HER、例4攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組腺病毒(SG002)的體外及體內(nèi)表達人源化抗體正常細胞株肺成纖維細胞WI-38、正常細胞株肺成纖維細胞BJ及人表皮生長因子受體2(Her2)陽性的腫瘤細胞SK-Br-3購于美國ATCC公司，將上述細胞株按5×105細胞/孔鋪在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO2培養(yǎng)，第二天換無血清液體1ml，然后，分別加入對照腺病毒Ad5-Lac Z或攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組腺病毒SG002或攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因并在MCMV啟動子下游插入雜合內(nèi)含子的增殖缺陷腺病毒SG102。其病毒量為5×106/孔，培養(yǎng)90分鐘后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，將病毒洗去，與加入5％胎牛血清的培養(yǎng)液3ml培養(yǎng)，分別在72小時收集上清，應(yīng)用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測其上清的表達量。結(jié)果可見重組腺病毒SG002及SG102體外感染的WI-38、BJ及SK-Br-3后，WI-38、BJ及SK-Br-3均分泌大量人源化抗體，其SG102表達量明顯高于SG002。而對照腺病毒Ad5-Lac Z則陰性。結(jié)果見圖1。
其經(jīng)SG002體外感染的WI38及SK-Br-3分泌的人源化抗體與美國Genentech公司的Herceptin分別按10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.1μg/ml及0μg/ml加入人表皮生長因子受體2(Her2)陽性的乳腺癌細胞SK-Br-3，其殺傷作用相似，見圖2。說明經(jīng)SG002體外感染的MAC-5及SK-Br-3分泌的人源化抗體與美國Genentech公司的Herceptin作用相同。
將對照腺病毒Ad5-Lac Z或攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組腺病毒(SG002)分別以1×109pfu及5×109pfu在尾靜脈給予Balb/c小鼠治療，1周后的應(yīng)用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測其小鼠血清的表達量，結(jié)果可見應(yīng)用攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組腺病毒(SG002)體內(nèi)感染后，其小鼠血清有大量人源化抗體表達，其表達水平與給予的病毒劑量成正比，其體內(nèi)人源化抗體的血清濃度高于文獻中Herceptin的治療濃度，而對照腺病毒Ad5-Lac Z則陰性。結(jié)果見圖3。
例5攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組腺病毒(SG002)在裸鼠體內(nèi)治療移植乳腺癌腫瘤的治療作用進行了攜帶人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組腺病毒(SG002)在裸鼠體內(nèi)研究，以治療人表皮生長因子受體2(Her2)陽性的腫瘤細胞移植瘤。
乳腺癌細胞株BT-474購于美國ATCC公司，將4-5周齡的裸鼠皮下接種乳腺癌細胞株BT-474細胞1×107，八周后形成100mm3腫瘤，分為末治療組、對照腺病毒(Ad-Lac Z)及治療組(SG002)，末治療組不加任何治療，對照腺病毒及治療組在鼠尾靜脈分別給予1×109pfu對照腺病毒Ad5-Lac Z或用相同劑量的治療重組病毒SG002，其未治療組及對照腺病毒治療組4周后腫瘤體增加3倍以上，而治療組則腫瘤增大不明顯，部分完全消褪。
SEQUENCE LISTING<110>上海新霽生物科技有限公司<120>高效表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)全抗體基因的重組病毒及其用途<130>12<140>03116733.0<141>2003-04-30<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1(SG-EGFR重鏈基因)<211>1368<212>DNA<213>重組病毒<400>1cgcggatcca ccatggagtt ttggctgagc tgggttttcc ttgttgctat tttaaaaggt60gtccagtgtg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtgatt actactggac ctggattcgg 120cagtccccag ggaagggact ggagtggatt ggacacatct attacagtgg gaacaccaat 180tataacccct ccctcaagag tcgactcacc atatcaattg acacgtccaa gactcagttc 240tccctgaagc tgagttctgt gaccgctgcg gacacggcca tttattactg tgtgcgagat 300cgagtgactg gtgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttcagcc 360tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa 660tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
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gagtgacaat gacatccact ttgcctttct ctccacaggt gtccactccc aggtccaacc 240gaattc 24權(quán)利要求
1.一種重組病毒，其特征在于該重組病毒基因組中包含一種編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，該含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列選自1)人鼠嵌合抗體的核苷酸序列；2)人源化抗體的核苷酸序列；3)人抗體的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒，其特征在于所述重組病毒為增殖能力缺陷的腺病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組病毒，其特征在于所述病毒為腺病毒，該腺病毒E1區(qū)缺失并伴有E3缺失或E3不缺失。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組病毒，其特征在于所述病毒為腺病毒，該腺病毒E1區(qū)缺失并伴有E2缺失。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組病毒，其特征在于所述病毒為腺病毒，該腺病毒E1區(qū)缺失并伴有E4缺失。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組病毒，其特征在于所述病毒為腺病毒，該腺病毒為空殼重組病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒，其特征在于所述重組病毒是增殖能力缺陷的腺相關(guān)病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組病毒，其特征在于所述編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種編碼抗新生血管生成并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，編碼抗腫瘤細胞生長因子受體并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，編碼抗腫瘤細胞膜抗原并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，編碼抗腫瘤抗原的獨特型單克隆并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組病毒，其特征在于所述編碼抗新生血管生成并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種抗血管內(nèi)皮生長因子并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抗血管內(nèi)皮生長因子受體2并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抗整合素的αvβ3并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抑制新生血管內(nèi)皮生成并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組病毒，其特征在于所述編碼抗腫瘤細胞生長因子受體并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種抗表皮生長因子受體1并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抗表皮生長因子受體2并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組病毒，其特征在于所述編碼抗腫瘤細胞膜抗原并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種抗17-1A并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抗CD20并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抗CD52并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列，抗MUC1并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組病毒，其特征在于所述編碼抗腫瘤抗原的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種抗17-1A的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列，抗癌胚抗原的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列，抗GD3的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列，抗MUC1的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組病毒，其特征在于所述編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種IgG的核苷酸序列，IgM的核苷酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組病毒，其特征在于所述編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體的核苷酸序列可與抗癌基因的核苷酸序列產(chǎn)生融合基因的核苷酸序列，該抗癌基因為血管抑制基因、細胞因子基因、前藥轉(zhuǎn)換酶基因及細胞毒性基因之一種；其中所述的血管抑制基因可以是內(nèi)皮抑素基因，血管生成抑素基因，血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-4結(jié)構(gòu)、Kringle1-5結(jié)構(gòu)、Kringle1-3結(jié)構(gòu)、Kringle1-3加上Kringle5結(jié)構(gòu)、血小板反應(yīng)蛋白基因、血小板因子4基因、纖溶酶原激活因子抑制劑PAI基因及纖維結(jié)合素基因；所述的細胞因子基因可以是白細胞介素2、白細胞介素12、粒-單集落刺激因子、腫瘤壞死因子、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、Light及Flt3配體；所述的前藥轉(zhuǎn)換酶基因可以是單純皰疹重組病毒胸腺嘧啶激酶、細菌β-內(nèi)酰胺酶及大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶；所述的細胞毒性基因可以是綠膿桿菌外毒片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組病毒，其特征在于編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體核苷酸序列的表達受啟動子控制，所述啟動子可選自下述之一種SV40啟動子，RSV LTR啟動子，人巨細胞重組病毒IE啟動子，鼠巨細胞重組病毒IE啟動子，人腺病主要晚期表達啟動子。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組病毒，其特征在于所述病毒為腺病毒，該腺病毒中控制編碼治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體表達的啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點與抗體的翻譯起始位點中含有內(nèi)含子，所述啟動子可選自下述之一種含有腺病毒主要晚期mRNA的第三個引導(dǎo)順序的5’剪接位點和一個免疫球蛋白的3’剪接位點的雜合內(nèi)含子，含有腺病毒主要晚期mRNA的第一個引導(dǎo)順序的5’剪接位點和一個免疫球蛋白的3’剪接位點的雜合內(nèi)含子。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項所述的重組病毒的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于體外感染腫瘤細胞，導(dǎo)致腫瘤細胞表達含人恒定區(qū)的全抗體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項所述的重組病毒的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于體外感染正常細胞，導(dǎo)致正常細胞表達含人恒定區(qū)的全抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項所述的重組病毒用于治療哺乳動物尤其是人類腫瘤的方法，其包括如下步驟1)將該重組病毒體外或體內(nèi)感染腫瘤細胞，2)在腫瘤細胞內(nèi)表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體，抑制腫瘤形成、生長及轉(zhuǎn)移。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其還包括在權(quán)利要求1-16任一項所述重組病毒感染腫瘤細胞之前、同時或之后施用化學(xué)抗腫瘤藥物的步驟。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-16任一項所述的重組病毒用于治療哺乳動物尤其是人類腫瘤的方法，其包括如下步驟1)將該重組病毒體外或體內(nèi)感染正常細胞，2)在正常細胞內(nèi)表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體，抑制腫瘤形成、生長及轉(zhuǎn)移。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其還包括在權(quán)利要求1-16任一項所述重組病毒感染正常細胞之前、同時或之后施用化學(xué)抗腫瘤藥物的步驟。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-16所述的重組病毒，其還包括用于抑制腫瘤細胞的生長的用途。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-16所述的重組病毒，其還包括在制備可用于治療腫瘤的藥物中的用途。
25.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-16任一項所述的重組病毒以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了高效表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)全抗體的重組病毒及其用途。迄今為止，尚未有應(yīng)用重組病毒攜帶治療腫瘤區(qū)并含有人恒定區(qū)的全抗體的研究報告。本發(fā)明通過將編碼治療腫瘤的并同時含有人恒定區(qū)的輕鏈及含有人恒定區(qū)的重鏈的全抗體基因的核苷酸序列插入重組病毒基因組中，從而在腫瘤細胞內(nèi)高效表達治療腫瘤并含有人恒定區(qū)的全抗體，抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。
文檔編號C12N15/28GK1542132SQ0311673
公開日2004年11月3日 申請日期2003年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月30日
發(fā)明者楊琴, 琴 楊 申請人:上海新霽生物科技有限公司