專利名稱：抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域和免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥SCFv的抗體基因及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
擬除蟲菊酯類(Pyrethroids)農(nóng)藥是一類重要的仿生性殺蟲劑，過去一直被認(rèn)為是一種安全的農(nóng)藥。因其在體內(nèi)具有容易被氧化酶系統(tǒng)降解，無蓄積性等優(yōu)點(diǎn)，目前應(yīng)用普遍、用量較大，占?xì)⑾x劑總產(chǎn)量的20%，占整個(gè)殺蟲劑使用面積的25%。但最近有研究表明，大部分?jǐn)M除蟲菊酯類農(nóng)藥屬于環(huán)境激素類物質(zhì)，具有免疫系統(tǒng)毒性、遺傳毒性和心血管毒性，嚴(yán)重影響哺乳類動(dòng)物的正常生理活動(dòng)，即使是低劑量，長期接觸也容易引起慢性疾病，有些還會(huì)有致畸、致癌、致突變等作用。因此，如何有效去除農(nóng)產(chǎn)品中該農(nóng)藥的殘留已成為人們廣泛關(guān)注的問題。因?yàn)檫@類農(nóng)藥殘留物的含量極微，因此要求高度靈敏的檢測(cè)技術(shù)。已報(bào)道的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留量測(cè)定方法有氣相色譜(GC)法、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等。GC法使用高靈敏度的電子捕獲檢測(cè)器，因而對(duì)樣品的凈化要求嚴(yán)格，并增加了分析流程時(shí)間。這就迫切需一種新的快速檢測(cè)的方法；普通的酶聯(lián)免疫法雖靈敏度高、樣品容量大，卻存在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需量大、飼養(yǎng)周期長，不同動(dòng)物個(gè)體對(duì)農(nóng)獸藥敏感程度不同，造成抗體差異大等問題；單克隆抗體作為第二代抗體，由于制備和篩選過程繁瑣，且對(duì)操作技術(shù)要求很高，克隆后的細(xì)胞遺傳容易不穩(wěn)定等原因，不利于廣泛應(yīng)用?；蚬こ炭贵w的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在節(jié)省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)時(shí)間、技術(shù)簡便、易于投入生產(chǎn)、遺傳信息具有可操作性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種針對(duì)性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、制備方便的抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的scFv抗體及編碼該抗體的基因序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種以擬除蟲菊酯類農(nóng)藥為檢測(cè)目標(biāo)的高豐度scFv抗體庫制備方法。本發(fā)明還提供了一種高效的針對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥為目標(biāo)的scFv抗體庫的篩選方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下:一種抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體基因的重鏈基因，所述重鏈基因的序列見序列I。一種抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥SCFv的抗體基因的輕鏈基因，輕鏈基因的基因序列見序列2。一種抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥SCFv的抗體基因，其包括重鏈基因和輕鏈基因，該基因由714個(gè)核苷酸組成，所述重鏈基因的序列見序列1，輕鏈基因的基因序列見序列2。
一種由抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體基因編碼的抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體。而且，重鏈可變區(qū)由116個(gè)氨基酸組成，柔性鏈接區(qū)由15個(gè)氨基酸，輕鏈可變區(qū)由107個(gè)氨基酸組成。由scFv抗體的氨基酸序列經(jīng)特?fù)Q、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的scFv抗體。含有抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體基因的載體。含有抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體基因的基因工程菌。抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體基因在擬除蟲菊酯類農(nóng)藥檢測(cè)及制備抗擬除蟲菊酯scFv抗體中的應(yīng)用。抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體基因的基因工程菌在制備抗擬除蟲菊酯scFv抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下:本發(fā)明制備了抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的噬菌體展示的scFv抗體，基于PCR技術(shù)和噬菌體表面展示技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):⑴本申請(qǐng)通過查閱大量NCBI數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)了兼并引物，該引物能全面地覆蓋鼠源抗體重鏈和輕鏈的多樣性，尤其是輕鏈引物 除了包括一般的kappa輕鏈引物，還包括了lambda輕鏈引物，以防止部分目的基因的丟失；⑵本發(fā)明選用雜交瘤細(xì)胞作為制備抗擬除蟲菊酯類scFv抗體的基因來源，省去了免疫、飼養(yǎng)動(dòng)物帶來的繁瑣，針對(duì)性更強(qiáng)，同時(shí)也免去了用小鼠脾臟免疫庫直接淘選所帶來的大量非目的抗體的干擾，減少了盲目性；⑶因?yàn)槭删w抗體稀釋液中包括一定比例的載體蛋白和封閉液成分，在淘選的親和吸附步驟中，本申請(qǐng)優(yōu)化了噬菌體抗體稀釋緩沖液，以有利于篩選抗體更有針對(duì)性、排除載體蛋白、封閉液帶來的干擾；⑷本申請(qǐng)的制備方法節(jié)省時(shí)間、技術(shù)簡便、易于發(fā)展下游生產(chǎn)、遺傳信息可操作且穩(wěn)定。


圖1:以PBA-cDNA為模板，PCR擴(kuò)增抗體重鏈、輕鏈圖。圖中:M:DL2000核酸分子量Marker, VH:抗體重鏈，VL:抗體輕鏈。圖2:用重鏈、輕鏈和柔性連接肽進(jìn)行重疊延伸PCR，獲得完整scFv抗體。M:DL2000核酸分子量Marker，scFv:完整單鏈抗體。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，申請(qǐng)人利用重組DNA技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)，將針對(duì)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有廣譜特異性的鼠源雜交瘤細(xì)胞株2G2E7的抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)基因進(jìn)行體外擴(kuò)增，再經(jīng)過重疊延伸PCR，用15個(gè)氨基酸(氨基酸序列(GGGGS)3，基因序列GGTGGAGGCG GTTC AGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG))組成的柔性連接肽將重鏈、輕鏈連接成scFv抗體。接著將所得的scFv基因插入到pCANTAB-5E噬菌體展示載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)化至宿主菌中，得到一個(gè)細(xì)胞來源的抗體庫。經(jīng)過5輪固定相淘選和鑒定，獲得了抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的噬菌體展示scFv抗體。其包括的重鏈和輕鏈基因序列分別如SEQ ID N0.1和 SEQ ID N0.2。本發(fā)明還提供了 scFv重鏈、輕鏈的氨基酸序列如序列18和序列19。本發(fā)明還提供了借助NCBI設(shè)計(jì)的兼并引物，用于擴(kuò)增上述基因。其中輕鏈擴(kuò)增引物除了常用的kappa鏈引物還引入了 lambda鏈引物，以覆蓋抗體可變區(qū)的多樣性。本發(fā)明還提供了含有上述基因的載體和載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了上述scFv抗體、編碼該抗體的基因、含有該基因的載體、含有該載體的宿主細(xì)胞在制備抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了淘選抗體庫時(shí)，處理噬菌體抗體所用的、經(jīng)優(yōu)化的去干擾化處理液，以增強(qiáng)淘選的針對(duì)性。以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中使用的試劑材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑供應(yīng)商購買得到。以下實(shí)施例中由于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥通用半抗原在合成時(shí)簡稱為PBA，所以以下相應(yīng)細(xì)胞、基因、菌種等提到有 關(guān)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥時(shí)均簡稱為PBA。實(shí)施例1PBA單克隆細(xì)胞總RNA的提取及cDNA的合成1、PBA單克隆細(xì)胞株2G2E7總RNA的提取取通過本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的新鮮單克隆細(xì)胞株2G2E7,利用Qigen Rneasy MiniKit提總RNA，細(xì)胞株2G2E7可產(chǎn)生抗PBA的單克隆抗體。⑴培養(yǎng)細(xì)胞至3-4X IO6個(gè)，300 Xg離心5min，移去上清；⑵配制裂解液=Buffer RLT: β-巰基乙醇=Iml: 10 μ I ；⑶向離心后的細(xì)胞中加入350μ I Buffer RLT裂解緩沖液，輕彈管壁，用移液槍吹打，使緩沖液與細(xì)胞充分接觸；⑷加入同等體積的70%的乙醇溶液，移液槍輕輕吸打混勻，注意不要離心；(5)取Qigen Rneasy Mini Kit中的娃膠柱,裝入2ml收集管上,轉(zhuǎn)移所有的樣品到柱子中，室溫下12000rpm離心15s,棄去廢液；(6)加入700 μ I Buffer Rffl到柱中，室溫下12000rpm離心15s，棄去流出液；(7)加入500 μ I用乙醇稀釋的RPE緩沖液，洗滌柱子，IOOOOrpm,離心15s，棄上清；(8)加入500 μ I RPE緩沖液移入柱子，輕蓋蓋子，室溫下lOOOOrpm，離心2min，沖洗
柱子;⑶把柱子放入一個(gè)試劑盒提供的新2ml收集管中，全速離心Imin ；(10)把柱子轉(zhuǎn)移至Ij Qigen Rneasy Mini Kit提供的1.5ml離心管中，取50 μ I的無RNA酶水(試劑盒提供)小心懸空滴加到柱子的膜上，靜置3-5min，輕輕蓋上蓋子，室溫下IOOOOrpm 離心 lmin，洗脫 RNA ；(11)洗脫的RNA分裝、標(biāo)記后，凍存于_80°C。2、PBA-cDNA 的合成⑴添加以下組分到1.5ml離心管:
權(quán)利要求
1.種抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥SCFv的抗體基因的重鏈基因，其特征在于:所述重鏈基因的序列見序列I。
2.種抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體基因的輕鏈基因，其特征在于:輕鏈基因的基因序列見序列2。
3.種抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體基因，其特征在于:其包括重鏈基因和輕鏈基因，該基因由714個(gè)核苷酸組成，所述重鏈基因的序列見序列1，輕鏈基因的基因序列見序列2。
4.權(quán)利要求3所述基因編碼的抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體。
5.據(jù)權(quán)利要求4所述的抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體，其特征在于:重鏈可變區(qū)由116個(gè)氨基酸組成，柔性鏈接區(qū)由15個(gè)氨基酸，輕鏈可變區(qū)由107個(gè)氨基酸組成。
6.權(quán)利要求4所述scFv抗體的氨基酸序列經(jīng)特?fù)Q、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的scFv抗體。
7.有權(quán)利要求3所述的抗體基因的載體。
8.有權(quán)利要求3所述的抗體基因的基因工程菌。
9.利要求1、2或3所述的任一項(xiàng)基因在擬除蟲菊酯類農(nóng)藥檢測(cè)及制備抗擬除蟲菊酯scFv抗體中的應(yīng)用。
10.利要求7所述的載體或權(quán)利要求8所述的基因工程菌在制備抗擬除蟲菊酯scFv抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥scFv的抗體基因，涉及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥抗體庫的構(gòu)建、特異性單鏈抗體基因的篩選、特異性單鏈抗體基因的序列測(cè)定、特異性噬菌體展示單鏈抗體的制備，該抗體基因包含編碼重鏈可變區(qū)(116個(gè)氨基酸)、柔性鏈接區(qū)(15個(gè)氨基酸)和輕鏈可變區(qū)(107個(gè)氨基酸)的核苷酸序列，如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，并利用噬菌粒在宿主細(xì)胞中制備了展示在噬菌體表面形式的該抗體。而且該抗體能在噬菌體表面正常表達(dá)和折疊，能夠較好的地識(shí)別擬除蟲菊酯類抗原。本發(fā)明與傳統(tǒng)抗體相比較，該抗體具有穩(wěn)定性高、制備方便等優(yōu)勢(shì)，具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/15GK103088033SQ20131002981
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者杜欣軍, 常繼晨, 王碩 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)