專利名稱：高效表達含有人恒定區(qū)全抗體基因的重組空殼腺病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學領(lǐng)域，具體涉及一種能高效表達治療疾病含有人恒定區(qū)全抗體的重組空殼腺病毒及其用途。
背景技術(shù)：
Kohler和Milstein在1975年創(chuàng)立的單克隆抗體制備技術(shù)，為疾病的治療提供一種新的方法——導向治療法。在導向治療研究初期，人們給予極大的熱情和不切合實際的期望，但早期的臨床研究的療效十分不理想。其主要原因為1.在早期的臨床試驗中應(yīng)用的是鼠源性抗體，在人體內(nèi)會產(chǎn)生針對鼠源性抗體的抗體(HAMA)，它會中和治療性的鼠源性抗體，使其被快速清除，因此鼠源性抗體在人體內(nèi)半衰期很短，故療效不確切，同時鼠源性抗體段會導致人體過敏反應(yīng)，從而產(chǎn)生毒副作用；2.抗體的親和力和特異性不高，多數(shù)抗體特別是一些基因工程小分子抗體或人源化抗體自身親和力較低，特異性不高，從而不能有效靶向細胞，因此其臨床上療效不確切。近5年來隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，抗體技術(shù)兩個關(guān)鍵性技術(shù)獲得突破，1.人鼠嵌合抗體、人源化抗體和人抗體技術(shù)及制備技術(shù)的成熟，基本上可以克服了鼠源性抗體人體應(yīng)用時產(chǎn)生抗抗體的問題；同時由于在人鼠嵌合抗體、人源化抗體和人抗體中采用人的Fc片段(可結(jié)晶的片段，是指用木瓜酶消化免疫球蛋白所得的片段，其分子量大約為50 000)，在人體內(nèi)的半衰期從鼠源性抗體小于20小時到人源化抗體和人抗體的半衰期為數(shù)天、甚至到21天之久；另外在人的Fc片段的改造可進一步提高對腫瘤的殺傷。2.抗體庫的建立和篩選以及多價重組抗體制備技術(shù)的發(fā)展使人們能夠直接獲得特異性強和親和力高的單克隆抗體，如SLAM法(Selected Lymphocyte AntibodyMethod)制備的抗體的親和力比雜交瘤技術(shù)制備的提高1000倍?？贵w技術(shù)的發(fā)展終于使導向治療研究走出低谷，并在近幾年取得了突破性進展，應(yīng)用抗體治療疾病初顯曙光。
但目前對于抗體治療疾病仍存在著兩個難題1.由于治療疾病的抗體需要量極多，目前的生物工程生產(chǎn)比較困難；同時由于需要量極多，要求其產(chǎn)品純度極高，因此其產(chǎn)品生產(chǎn)成本及價格均非常昂貴。2.對于很多疾病而言，需要抗體長期應(yīng)用，才能達到治療疾病的目的。
基因治療是近年興起的一種新的治療惡性腫瘤方法。其基因轉(zhuǎn)染方法分病毒法及非病毒法兩種。病毒法通常采用逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒及痘苗病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒在體外具有較高的轉(zhuǎn)染率，但病毒滴度偏低，在體內(nèi)轉(zhuǎn)染率較低，而且只能感染分裂期的細胞，同時具有整合至染色體，存在癌變的可能性的缺點。非病毒法包括脂質(zhì)體及基因槍等方法，其轉(zhuǎn)染基因表達時間較短，轉(zhuǎn)染率較低。腺相關(guān)病毒具有轉(zhuǎn)染分裂及靜止細胞的能力，能持久的表達，但表達量較低。腺病毒目前基因治療中最常見病毒載體，已廣泛地應(yīng)用于人體基因治療方案中，腺病毒具有容易生產(chǎn)及純化的特點，它在體內(nèi)及體外均能有效轉(zhuǎn)染分裂及靜止細胞，無致癌性，但第一代腺病毒與第二代腺病毒系統(tǒng)由于存在著微量腺病毒蛋白表達，因此具有強免疫源性，其目的基因表達時間短的缺點。
重組空殼腺病毒(gutless or gutted adenovirus vectors)或(hdAd，helper-dependent adenovirus vector)載體是第三代腺病毒，它有不同叫法，如空殼病毒、高容量，去除或無基因組的載體，完全刪除的假腺病毒載體，有關(guān)這種腺病毒載體的設(shè)想來源于對一些無感染能力的腺病毒顆粒的觀察。研究發(fā)現(xiàn)，盡管這些無感染能力腺病毒顆粒的基因組成千差萬別，但是它們都共同含有腺病毒基因組最左端的一段序列，即包裝信號(ψ)。因此人們設(shè)想構(gòu)建一種腺病毒載體，僅保留包括左右端ITR以及包裝信號的約500bp的順式作用元件，去除腺病毒基因組中全部的反式作用元件，而這部分功能由輔助病毒提供。這無疑是防止腺病毒晚期蛋白表達最簡單、直接也是最有效的方法。它在保留了第一代新病毒載體基因轉(zhuǎn)在效率高等一些優(yōu)點的同時，外源基因的裝載容量擴大到約37kb。由于去除了全部的腺病毒蛋白編碼序列，安全性進一步提高，引起機體免疫反應(yīng)的可能性降低。由于腺病毒的本身病毒基因表達即使在很低水平也可能導致轉(zhuǎn)基因表達的消失，空殼腺病毒雖然載體不能阻止天然免疫反應(yīng)，很多研究已證實它明顯減少毒性和延長轉(zhuǎn)基因表達，例如在小鼠模型中，高脂血癥得到終身改善。在這個實驗中，檢測到表達時間長達2.5年。在一個鼠血友病模型中，表達VIII因子，糾正血友病時間超過9個月。另外，由于空殼腺病毒的特征之一是載體的血清型是由輔助病毒決定的，只需采用不同的輔助病毒，就很容易包裝出不同血清型的空殼載體，實現(xiàn)血清型轉(zhuǎn)換(serotype switching)，因此空殼腺病毒可以反復經(jīng)系統(tǒng)途徑給藥，而無需擔心機體抗腺病毒中和含有人恒定區(qū)全抗體的影響。
雖然有很多應(yīng)用空殼腺病毒在體內(nèi)表達各種治療性蛋白質(zhì)，但在體內(nèi)血清中蛋白質(zhì)濃度為0.5-10μg/ml，而全抗體的血清中治療濃度通常需要40-60μg/ml，因此人們普遍認為應(yīng)用重組空殼腺病毒攜帶含有人恒定區(qū)全抗體基因治療不能達到有效的抗體治療濃度。故迄今為止，尚未見到應(yīng)用重組空殼腺病毒攜帶含有人恒定區(qū)全抗體基因治療疾病獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種高效低毒的編碼治療疾病并含有人恒定區(qū)全抗體基因的重組空殼腺病毒。
本發(fā)明的目的在于提供一種含有上述重組空殼腺病毒的藥物組合物。
人腺病毒是DNA腫瘤病毒家族成員，能造成人類良性呼吸道感染，人腺病毒分為A、B、C、D、E及F共6種及1-47個血清型。人腺病毒在人體內(nèi)不會引起癌癥，但A與B種在嚙齒類動物中有一定致癌性，而其它人腺病毒致癌作用弱或無。目前應(yīng)用于基因治療腺載體絕大多數(shù)采用C種的2及5血清型腺病毒，均無致癌性。感染時病毒在細胞核中保持游離狀態(tài)，能有效地轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細胞。
所有腺病毒載體均有轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細胞的能力，轉(zhuǎn)染率較高，它是非整合型載體，無致癌性。腺病毒載體的缺點在于運輸?shù)幕虿荒艹掷m(xù)表達，通常只表達5～20天，其基因短期表達是由于腺病毒蛋白激發(fā)的免疫反應(yīng)所致。
腺病毒很容易進行臨床應(yīng)用規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)，其病毒滴度很容易達到1012vp/ml，其病毒儲藏及運送條件均十分清楚，目前它在腫瘤基因治療中占主導地位。
空殼腺病毒是第三代腺病毒，除了保留病毒DNA復制和包裝所必須的順式作用序列外，它缺失了其它所有的病毒基因，這樣的病毒載體從理論上能夠裝載大小約為37kb的多個外源基因。
空殼腺病毒載體生產(chǎn)需要一個提供必要病毒功能但包裝信號已被刪除而不能被包裝的輔助病毒。典型的刪除是由識別在必需的包裝區(qū)兩側(cè)的loxP位點的噬菌體P1 Cre重組酶介導。另一個應(yīng)用的方法是酵母重組酶(FLPe)，這時loxP位點被酵母重組酶(FLPe)重組的靶位FRT所代替。Umana等報道用酵母重組酶具有極高的效率，應(yīng)用色譜病毒純化技術(shù)可大批量生產(chǎn)空殼病毒載體。
抗體(Ab)是一種對特異抗原的結(jié)合特異性的糖蛋白。天然含有人恒定區(qū)全抗體約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。輕鏈與重鏈通過一個共價二硫鍵與其相連。每條重鏈是由一個可變區(qū)(VH)和多個恒定區(qū)組成。每條輕鏈是由一個可變區(qū)(VL)和一個恒定區(qū)組成；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相對，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對。
抗體的可變區(qū)中較為保守的區(qū)域稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個FR區(qū)(分別是FR1、FR2、FR3和FR4)，在4個框架區(qū)中間夾了3個高變區(qū)，它們大致上成β-折疊構(gòu)型，由三個高變區(qū)相連。每條鏈中的高變區(qū)通過FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的高變區(qū)一起形成了抗體的抗原結(jié)合部位。
抗體的高變區(qū)(CDR)指抗體中負責抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)包括來自“互補決定區(qū)”即“CDR”的氨基酸殘基。
恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)子功能，例如參與含有人恒定區(qū)全抗體的依賴于含有人恒定區(qū)全抗體的細胞毒性。
木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生了兩個相同的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段，每個片段有單個抗原結(jié)合位點)以及一個殘余的“Fc”片段(該名稱反映了其容易結(jié)晶的能力)。用胃蛋白酶處理產(chǎn)生了一個F(ab’)2片段，該片段有兩個抗原結(jié)合位點，并仍能與抗原交聯(lián)。
“Fv”是最小的抗體片段，它含有全部抗原識別和結(jié)合位點。該區(qū)域由非共價緊密結(jié)合的一個重鏈和一個輕鏈可變區(qū)的二聚物組成。在該構(gòu)型中，各可變區(qū)中的三個高變區(qū)相互作用，在VH-VL二聚物表面上界定了抗原結(jié)合位點。6個高變區(qū)共同組成抗體抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)(或Fv的一半，它只包含對抗原有特異性三個可變區(qū))，也能識別并結(jié)合抗原，只是其親和力比完整的結(jié)合位點低。
Fab片段還含有輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一個恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段與Fab片段的不同之處在于，在重鏈CH1區(qū)的羧基端多幾個殘基(包括來自鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸)。Fab’-SH在本發(fā)明表示恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶了游離巰基的Fab’。F(ab’)2抗體片段最初是以Fab’片段對的形式產(chǎn)生的，在其間有鉸鏈半胱氨酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“抗體片段”包括完整抗體的一部分，通常是完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二體(diabody)；線性抗體；單鏈抗體分子；由抗體片段形成的多特異性抗體。
脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯不同兩類(稱為kappa(κ)和lambda(λ)中一類。
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgGT和IgM，其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-1和IgA-2。對應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)稱為α、β、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“抗體”應(yīng)理解為可以是IgA、IgD、IgE、IgGT或IgM，包括天然人恒定區(qū)全抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒，該重組空殼腺病毒基因組中至少包含編碼一個含有人恒定區(qū)全抗體基因。
本發(fā)明中含有人恒定區(qū)全抗體可選自1)人鼠嵌合抗體的核苷酸序列；2)人源化全抗體的核苷酸序列；3)人的全抗體的核苷酸序列。
人鼠嵌合抗體是最早研究的含有人恒定區(qū)全抗體。抗體與抗原的結(jié)合完全取決于抗體的可變區(qū)，抗體的恒定區(qū)與抗原結(jié)合無關(guān)，但恒定區(qū)是抗體分子免疫原性的主要部位，因此通過用人的恒定區(qū)取代鼠單抗的恒定區(qū)，即人鼠嵌合抗體。它可消除抗體在人體中大部分異源性，并保留親本鼠單抗結(jié)合抗原的特異性和親和力，由于抗體各功能區(qū)形成相對獨立的空間構(gòu)象，使得恒定區(qū)的置換操作較為簡單，目前已構(gòu)建了多個人鼠嵌合抗體，分別為ReoPro(抗血小板受體IIbIIIa的人鼠嵌合抗體，用于治療冠心病)、Rituxan(抗CD20的人鼠嵌合抗體，用于治療淋巴瘤)、Simulect(抗CD25的人鼠嵌合抗體，用于治療移植排斥)及Remicade(抗TNF-α的人鼠嵌合抗體，用于治療炎癥性腸病、類風濕性關(guān)節(jié)炎)，并在臨床應(yīng)用中取得良好療效。
由于僅將鼠單抗的恒定區(qū)替換成人的抗體恒定區(qū)，不能完全消除單抗的異源性，可變區(qū)中存在的鼠源性序列仍然可以誘導人體產(chǎn)生針對鼠源性抗體的抗抗體(HAMA)，它會中和治療抗體，使其被快速清除?？贵w輕、重鏈可變區(qū)的6個高變區(qū)(CDR)形成CDR平面直接接觸抗原，決定了抗體的特異性，抗體的可變區(qū)中框架區(qū)(FR)只是作為支持CDR的支架，其立體構(gòu)象極為保守，因此人鼠嵌合抗體的鼠源性FR改變成人源性的FR區(qū)，從而最大限度地減少鼠單抗的異源性，這種單抗稱之為人源化的抗體。目前，美國已正式批準6個人源化抗體上市，分別為Zanapax(抗CD25的人源化抗體，用于治療移植排斥)、Herceptin(抗Her2的人源化抗體，用于治療乳腺癌)、synagis(抗呼吸道合胞病毒F蛋白的人源化抗體，用于治療呼吸道合胞病毒感染)、mylotarg(抗CD33的人源化抗體，用于治療急性髓性白血病)及CAMPATH(抗CD52的人源化抗體，用于治療慢性淋巴細胞性白血病)并在臨床應(yīng)用中取得良好療效。
人的抗體是指完全來源于人的單克隆抗體，它的可變區(qū)及恒定區(qū)均為人源性。它來源于轉(zhuǎn)基因小鼠及抗體庫技術(shù)。目前已有多個人的抗體進入臨床試驗。
在本發(fā)明中，所述的含有人恒定區(qū)全抗體可以選自下表中之一種治療性抗體批準日期或抗體名稱靶向抗原抗體種類公司名稱 適應(yīng)證臨床試驗治療腫瘤的抗體Panorex EpCam 鼠源性單抗 GlaxoSmithKline， Dukes’1995(德國)
Centocor結(jié)腸癌(Edrecolomab)(17-IA)Rituxan 人-鼠嵌合CD20 Genentech 淋巴瘤 1997抗體(rituximab)HerceptinHER-2人源化抗體 Genentech 乳腺癌 1998(Trastuzumab)人源化抗體 Wyeth 急性髓性Mylotarg CD332000(偶聯(lián)毒素) Laboratories白血病慢性淋巴MillenniumCampath CD52 人源化抗體 細胞性白 2001Pharmaceuticals血病人-鼠嵌合 頭頸部腫IMC-C225 EGFR ImClone System III抗體瘤TitanCeaVac 抗id(CEA)* 鼠源性單抗 大腸癌 IIIPharmaceuticalsImClone SystemBEC2 抗id(GD3)* 鼠源性單抗 肺癌 IIIMerck KGaAAvastin人源化鼠單VEGF Genentech 腫瘤 III(Bevacizumab) 抗EpratuzumabCD22 人源化單抗 Immunomedics淋巴瘤 III(LymphoCide)Smart M195人源化鼠單 Protein Design 急性髓性CD33III(Zamyl) 抗 Labs白血病Medarex，ImmunoHER-2/CD64MDX-210 雙功能抗體 Designed卵巢癌 III(FcγRI)MoleculesOvaRex CA125鼠源性單抗 Altarex 卵巢癌 III
人源化鼠單TheraCIMh-R3 EGFR 不詳 頭頸部癌II抗鼠源性單抗-SGN-15 不詳 Seattle Genetics 前列腺癌II化療藥TitanTriGem 抗id(GD2)*鼠源性單抗黑色素瘤IIPharmaceuticalsProtein DesignSmart ID10 HLA DR人源化抗體淋巴瘤 IILabs人源化鼠單C242 CanAgSB-408075 抗-化療藥交 ImmunoGen 實體瘤 I/IIantigen聯(lián)物αVβ3人源化鼠單 Applied Molecular 大腸癌，Vitaxin I/IIintegrin 抗 Evolution 肉瘤4B5 抗id(GD2) 人源抗體Viventia Biotech 黑色素瘤I/IISS1(dsFv)PE38mesothelindsFv-PE38 NeoPharm 實體瘤 I/IIABX-EGF EGFR 人的抗體Abgenix 實體瘤 I/IICEA、放射性 IBCPentacea 雙特異抗體腫瘤I/II核素 Pharmaceuticals2C4(OmnitaragTM，P HER2 人源化抗體 Genentech 腫瘤IIertuzumab)BrevaRex MUC1 鼠源性單抗 AltaRex 腫瘤I治療牛皮癬的抗體ABX-IL8 IL8 人的抗體Abgenix 牛皮癬 IIAnti-CD11a CD11a 人源化抗體 Genentch/Xoma 牛皮癬 IIIICM3 ICAM-3人源化抗體 ICOS Pharm牛皮癬 I
IDECIDEC-114 CD80Primatized 牛皮癬 IPharm/MitsubishiMedimmune/BioMEDI-507 CD2 人源化抗體 牛皮癬 ITransplantProtein DesignSmartanti-CD3 CD3 人源化抗體 牛皮癬 I/IILabSmart Protein Design 牛皮癬炎IFN-γ 人源化抗體 I/IIanti-IFN-γLabs癥性腸病治療類風濕關(guān)節(jié)炎抗體類風濕關(guān)5G1.1 Complement 人源化抗體 Alexiom Pharm II節(jié)炎類風濕關(guān)D2E7 TNF-α 人的抗體 CAT/BASFI節(jié)炎類風濕關(guān)人源化抗體CDP870 TNF-α Celltech節(jié)炎II(Fab)類風濕關(guān)人-鼠嵌合Infliximab TNF-α Centocor節(jié)炎1998抗體類風濕關(guān)IDEC節(jié)炎IDEC-151 CD4 Primatized Pharm/SmithKline IIBeecham類風濕關(guān)Medarex/Eisai/GeMDX-CD4CD4 人的抗體 節(jié)炎 IInmab治療過敏性疾病單抗過敏性疾Xolair IgE 人源化抗體 GenentechIII病過敏性疾SCH55700 IL-5人源化抗體 Celltech II病SB-240563 IL-5人源化抗體 SmithKline 過敏性疾 II
Beecham病SmithKline 過敏性疾SB-240683 IL-4 人源化抗體IIBeecham病過敏性疾CAT-213eotaxin人源化抗體CAT I病靈長類化鼠 過敏性疾IDEC-152 CD23 IDECI抗體 病同種免疫抑制治療性單抗同種免疫OKT3 CD3鼠單抗Ortho Biotech 1986抑制同種免疫ZanapaxCD25 人源化抗體PDL 1997抑制人-鼠嵌合抗 同種免疫Simulect CD25 Novartis Pharm 1998體 抑制同種免疫ABX-CBLCD147 鼠單抗Abgenix III抑制同種免疫Anti-LFA-1 CD18 鼠F(ab’) Pasteur-Merieux III抑制同種免疫OKT4A CD4人源化抗體Ortho Biotech II抑制同種免疫BTI-322CD2大鼠單抗 Medimmune II抑制同種免疫Smartanti-CD3 CD3人源化抗體PDL I/II抑制同種免疫MEDI-507 CD2人源化抗體Medimmune I/II抑制LDP-01β2整合素 人源化抗體LeukoSite 同種免疫 I/II
抑制同種免疫Anti-CD11a CD11a 人源化抗體 不詳I/II抑制同種免疫Antova CD40L 人源化抗體 Biogen I/II抑制感染性疾病治療單抗人-鼠嵌合抗 呼吸道合Synsgis RSV F蛋白 Medimmune 1998體胞病毒Progenics/GenzymPRO542 Gp120 不詳 愛滋病IIetransgenicsXTL001 HepB人源化抗體 XTL 乙型肝炎 IIProtein DesignOstavir HepB人源抗體 乙型肝炎 IILab/NovartisProtein Design巨細胞病ProtovirCMV 人源化抗體 IIILab/Novartis 毒XTL002 HepC人源抗體XTL 乙型肝炎 I系統(tǒng)性紅斑狼瘡系統(tǒng)性紅5G1.1 C5 人源化抗體 Alexion Pharm I斑狼瘡系統(tǒng)性紅Antova CD40L 人源化抗體 Biogen II斑狼瘡系統(tǒng)性紅IDEC-131CD40L 人源化抗體 IDEC Pharm/EisaiII斑狼瘡Complement系統(tǒng)性紅5G1.1 人源化抗體 Alexion Pharm I/II(C5) 斑狼瘡其它血小板受體 人-鼠嵌合ReoPro Centocor/Lilly 冠心病 1994IIbIIIa (Fab)人源化Anti-CD18 CD18 Genentech 心肌梗塞IIF(ab)2人源化 冠心病術(shù)CDP860PDGFβR Celltech IIF(ab)2后人-鼠嵌合抗Corsevin MVII因子 Centocor 抗凝血 I體休克、移植LDP-01β2整合素 人源化抗體 LeukoSite I/II排斥中毒性休MAK-195 TNF-α 鼠F(ab)2Knoll Pharma/BASF III克中毒性休IC-14 CD14不詳 ICSO Pharm I克眼部術(shù)后CAT-152 TGF-β2 人源抗體 Cambride Ab Tech I/II瘢痕形成器官纖維CAT-192 TGF-β1 人源抗體 Cambride Ab Tech I化多發(fā)性硬VLA-4 Antegren人源化抗體 Elan II化病InfliximabTNF-α 嵌合抗體 Centocor 克隆病 1998CDP571TNF-α 人源化抗體 Celltech 克隆病 IILeukoSite/Genent 潰瘍性結(jié)LDP-02α4β7人源化抗體 IIech腸炎抗獨特型單抗，擴號中為其所模擬的抗原絕椽子(insulator)眾所周知，哺乳類動物的基因組是由不連續(xù)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的，這些染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域是一些獨立的基因表達調(diào)控單位，它們不受鄰近區(qū)域順式元件的影響，這些結(jié)構(gòu)域的功能和結(jié)構(gòu)上的獨立性由邊界元件(boundary element)界定。Udvardy等人在對果蠅多線染色體87A7座位hsp70基因兩端的邊界元件進行研究后發(fā)現(xiàn)，其中的核酸酶高度敏感區(qū)scs和scs′能使其界定的染色體結(jié)構(gòu)域內(nèi)的基因免受區(qū)域外其它調(diào)控元件(正調(diào)控或負調(diào)控)的影響，當將其插入到啟動子與增強子之間時，可以有效抑制增強子對啟動子的活性。因其功能類似于電學中的絕緣效應(yīng)，故稱之為絕緣子。此后，在諸多果蠅染色體基因座(如，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子gpysy、hairy wing抑制子以及Fab-7)的邊界元件中也發(fā)現(xiàn)有絕緣子存在。在脊椎動物的染色體中(如雞的β-珠蛋白基因座以及T細胞受體基因座)也找到了絕緣子。另外，研究表明將牛生長激素轉(zhuǎn)錄終止信號(BGHpA，bovine growth hormone transcription stop singal)加在基因表達盒的兩側(cè)也可以起到絕緣子的效果。由于人們對β-珠蛋白基因座的了解比較充分，而且其染色體結(jié)構(gòu)非常保守，因此目前絕大部分關(guān)于絕緣子的研究是以雞的β-珠蛋白基因座絕緣子為基礎(chǔ)進行的。該絕緣子是位于雞β-珠蛋白基因座5′端邊界元件中的一段長約1,200bp的DNA片斷。進一步的研究表明，該片段近一半的絕緣活性是由其5′端一段長約250bp包含有DNA酶I超敏位點(5′HS4)的CpG島樣結(jié)構(gòu)(即所謂核心元件)決定的。該核心元件的G+C含量在70％左右，CpG雙核苷酸序列的密度非常高(有22處之多)。這樣的結(jié)構(gòu)是否是真核生物絕緣子所共有的特點尚有待于其它一些絕緣子的發(fā)現(xiàn)以及更加深入的研究。
絕緣子是一種具有順式調(diào)控功能的邊界元件，可以阻斷鄰近的調(diào)控元件(增強子或沉默子)對其所界定基因的啟動子的增強或抑制作用，還可以保護整合到基因組中得基因表達盒，使其不受染色體位置效應(yīng)(chromosomal position effect)的影響。關(guān)于絕緣子的作用機制，人們提出了多種模型或假說，概括起來主要有兩大類，即空間模型(steric models)和軌跡模型(tracking models)。前者認為，兩個絕緣子間相互作用，在空間上形成一個與外界隔絕的襻狀結(jié)構(gòu)，阻抑其外面其它因子的影響；軌跡模型說認為，絕緣子是作為一種抑制增強子復合物沿DNA向啟動子移動的信號來起作用的。目前尚缺乏足夠的證據(jù)以認定其中任何一種是正確的，當然絕緣子也完全有可能并非是通過單一的機制起作用。另外，最近的研究表明絕緣子的功能會受到其兩側(cè)的DNA序列的影響，這進一步說明了絕緣子作用機制是非常復雜的。雖然如此，經(jīng)過過去數(shù)年的研究還是獲得了許多非常有益的發(fā)現(xiàn)。首先，利用DNA酶足跡分析的方法，Gary等人在雞β-珠蛋白絕緣子核心元件內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一段長約49bp的序列單獨也可以在一定程度上產(chǎn)生絕緣效應(yīng)，并以此為基礎(chǔ)進一步證實了一種已知的帶有鋅指結(jié)構(gòu)的調(diào)控蛋白CTCF可以與該段DNA序列緊密結(jié)合，并阻斷增強子的活性。其次，同一個工作小組通過染色體免疫沉淀實驗(ChIP)發(fā)現(xiàn)5′HS4上游的組氨酸乙?；潭群艿?，形成異染色質(zhì)，與其下游形成鮮明的對比，并推測這可能是絕緣子能夠有效防止整合基因免受染色體位置效應(yīng)影響的關(guān)鍵所在。
關(guān)于絕緣子作用特點的研究也有許多突破，概括起來主要有以下幾個方面首先，絕緣子具有位置特異性，即只有當位于增強子與啟動子之間時，絕緣子才具有阻斷增強子活性的功能；其次，絕緣子抑制增強子功能有極性特點，即只抑制處于絕緣子所在邊界另一側(cè)的增強子的作用，而對處于同一染色體結(jié)構(gòu)域的增強子沒有作用，被某一結(jié)構(gòu)域絕緣子所抑制的增強子仍可對處于同一結(jié)構(gòu)域的啟動子起作用；再次，絕緣子具有方向性，Lieber等人在對多種不同的組合方式進行研究后發(fā)現(xiàn)當兩側(cè)的絕緣子與報告基因表達盒其呈同向排列時，其絕緣功能可以發(fā)揮到最大；最后，絕緣子活性具有數(shù)量依賴性，兩個絕緣子核心元件的活性即與整個1.2Kb絕緣子相當，而且隨著數(shù)量的增加其活性也進一步增強。
本發(fā)明的重組空殼腺病毒基因組中含有人恒定區(qū)全抗體基因表達盒的上下游區(qū)至少含有一個絕椽子(insulater)的核苷酸序列。從而使抗體表達盒能夠在空殼腺病毒中重復進行。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒中所含絕椽子(insulater)的核苷酸序列可以是雞的β球蛋白的絕椽子的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒，該重組空殼腺病毒基因組中至少包含編碼兩個相同的含有人恒定區(qū)全抗體基因。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒，該重組空殼腺病毒基因組中至少包含編碼兩個不同的含有人恒定區(qū)全抗體基因。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒，本發(fā)明所述的重組空殼腺病毒中，編碼治療腫瘤的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有治療腫瘤作用并含有人恒定區(qū)全抗體基因，均可被用于本發(fā)明。其編碼治療腫瘤的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種編碼抗新生血管生成的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗腫瘤細胞生長因子受體的含有人恒定區(qū)全抗體核苷酸序列，編碼抗腫瘤細胞膜抗原的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗腫瘤抗原的獨特型單克隆含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒，所述治療腫瘤的含有人恒定區(qū)全抗體為編碼抗新生血管生成的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，本發(fā)明所述的重組空殼腺病毒中，編碼治療腫瘤的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有抗新生血管生成的含有人恒定區(qū)全抗體蛋白，均可被用于本發(fā)明。其所述編碼抗新生血管生成的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種抗血管內(nèi)皮生長因子的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，抗血管內(nèi)皮生長因子受體2的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，抗整合素的αvβ3的含有人恒定區(qū)的核苷酸序列，抑制新生血管內(nèi)皮生成的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在血管生成中起關(guān)鍵作用，它通過促進血管生成從而在腫瘤生成及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用?？寡軆?nèi)皮生長因子的含有人恒定區(qū)全抗體可阻斷血管內(nèi)皮生長因子與其受體(特別血管內(nèi)皮生長因子受體2)結(jié)合，抑制腫瘤新生血管的生成，從而抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。美國Genentech公司的抗血管內(nèi)皮生長因子的嵌合性含有人恒定區(qū)全抗體(Avastin，另一個名稱為Bevacizumab)在結(jié)腸癌的III期臨床試驗取得明顯療效。美國ImClone Systems公司的針對抗血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR)的抗體IMC-1C11已進入腫瘤的I期臨床試驗。整合素的αvβ3通過細胞間基質(zhì)與內(nèi)皮細胞之間信號傳遞從而參予新生血管的生成，抗整合素的αvβ3的含有人恒定區(qū)全抗體可抑制新生血管生成，從而抑制腫瘤的形成。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒，所述治療腫瘤的含有人恒定區(qū)全抗體為編碼抗腫瘤細胞生長因子受體的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，本發(fā)明所述的重組空殼腺病毒中，編碼抗腫瘤細胞生長因子受體的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有抗腫瘤細胞生長因子受體的含有人恒定區(qū)全抗體蛋白，均可被用于本發(fā)明。其所述編碼抗腫瘤細胞生長因子受體的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種抗表皮生長因子受體1的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，抗表皮生長因子受體2的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor)在多種惡性腫瘤細胞轉(zhuǎn)化上起關(guān)鍵作用，它在多種腫瘤細胞中過表達。人表皮生長因子受體也被稱為ErbB受體，目前已有四個成員被識別，分別為表皮生長因子受體1(HER1，又稱為ErbB1或EGFR)、表皮生長因子受體2(HER2，又稱為ErbB1或Neu)、表皮生長因子受體3(HER3，又稱為ErbB3)及表皮生長因子受體4(HER4，又稱為ErbB4)。阻斷表皮生長因子受體信號傳導可抑制腫瘤細胞生長。美國ImClone Systems公司的針對表皮生長因子受體1嵌合抗體IMC-C225對多種晚期腫瘤有明顯的治療作用，目前該含有人恒定區(qū)全抗體已在III及IV期臨床試驗。美國另一家生物公司Abgenix公司的針對表皮生長因子受體1的人的抗體ABX-EGF對多種晚期腫瘤有明顯的治療作用，目前該抗體已在II期臨床試驗。美國Genentech公司的針對表皮生長因子受體2的人源化抗體Herceptin(又稱為Trastuzumab)已于1998年美國FDA批準進行臨床應(yīng)用，它與化療聯(lián)合產(chǎn)生明顯的臨床療效。該公司的另一個針對表皮生長因子受體2的人源化抗體2C4亦已進入I期臨床試驗。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒，所述治療腫瘤的含有人恒定區(qū)全抗體為編碼抗腫瘤細胞膜抗原的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，本發(fā)明所述的重組空殼腺病毒中，編碼抗腫瘤細胞膜抗原的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有抗腫瘤細胞膜抗原的含有人恒定區(qū)全抗體蛋白，均可被用于本發(fā)明。其所述編碼抗腫瘤細胞膜抗原的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種抗CD20的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，抗CD52的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，抗MUC1的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
由于CD20存在于所有的B淋巴細胞中，抗CD20含有人恒定區(qū)全抗體可殺滅所有的B淋巴細胞，從而大大降低針對腺病毒載體含有人恒定區(qū)全抗體的產(chǎn)生，從而使腺病毒載體重復使用成為可能。同時由于B細胞淋巴瘤本身亦存在著含有人恒定區(qū)全抗體產(chǎn)生障礙，這也可導致針對腺病毒載體抗體減少。因此應(yīng)用含有腺病毒攜帶抗CD20的全含有人恒定區(qū)全抗體，具有明顯的治療B細胞淋巴瘤的作用。美國Genentech公司的抗CD20的嵌合Rituxan(又稱為Rituximab)用于治療B-細胞淋巴瘤，已于1997年批準臨床正式應(yīng)用。
CD52在大多數(shù)正常和惡性成熟淋巴細胞(包括T淋巴細胞和B淋巴細胞)表面具有高表達，而不表達于造血干細胞，抗CD52含有人恒定區(qū)全抗體可殺滅所有的成熟淋巴細胞，從而大大降低針對腺病毒載體抗體及T細胞免疫的產(chǎn)生，從而使腺病毒載體重復使用成為可能。因此應(yīng)用含有腺病毒攜帶的抗CD52的全含有人恒定區(qū)全抗體，具有明顯的治療淋巴瘤的作用?？笴D20的人源化抗體Campath用于治療慢性淋巴細胞性白血病，已于2001年批準臨床正式應(yīng)用。
MUC1廣泛存于多種腫瘤中，美國Antisoma公司抗MUC1人源化抗體已進入臨床試驗。
本發(fā)明提供一類重組重組空殼腺病毒，所述治療腫瘤的含有人恒定區(qū)全抗體為編碼抗腫瘤抗原的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列，本發(fā)明所述的重組空殼腺病毒中，編碼抗腫瘤抗原的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有抗腫瘤抗原的獨特型單克隆全抗體的蛋白，均可被用于本發(fā)明。其所述編碼抗腫瘤抗原的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種抗17-1A的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列，抗癌胚抗原的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列，抗GD3的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列，抗MUC1的獨特型單克隆全抗體的核苷酸序列。
抗獨特型單克隆抗體(anti-idiotypic mAb，也可用Ab2表示)又稱之抗個體基因型抗體，它模擬腫瘤細胞表面的抗原，可引起細胞毒T細胞和輔助T細胞反應(yīng)，從而達到治療腫瘤的目的。17-1A在上皮來源的腫瘤細胞內(nèi)高表達，德國于1997年已批準由Glaxo Wellcome/Centocor公司生產(chǎn)的抗17-1A獨特型單克隆抗體(Panorex)用于治療結(jié)腸癌。美國ImClone Systems公司的針對抗GD3的獨特型單克隆抗體BEC2抗體IMC-1C11已進入腫瘤的III期臨床試驗。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒，本發(fā)明所述的重組空殼腺病毒中，編碼治療微生物感染的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有治療微生物感染作用含有人恒定區(qū)全抗體基因，均可被用于本發(fā)明。其編碼治療微生物感染的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種編碼治療病毒含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼治療細菌含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼治療支原體含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒，本發(fā)明所述的重組空殼腺病毒中，編碼治療病毒的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有治療病毒的含有人恒定區(qū)全抗體基因，均可被用于本發(fā)明。其編碼治療病毒的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種編碼治療乙肝病毒的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼治療愛滋病病毒的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼治療呼吸道合胞病毒的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗狂犬病病毒的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼治療巨細胞病毒的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼治療丙型肝炎病毒的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒，本發(fā)明所述的重組空殼腺病毒中，編碼治療自身免疫性疾病的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列包括，但不限于選自編碼的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有治療自身免疫性疾病的含有人恒定區(qū)全抗體基因，均可被用于本發(fā)明。其編碼治療自身免疫性疾病的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種編碼抗腫瘤壞死因子α含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗IgE含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗CD11a含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗CD80含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗CD4含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗CD2含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗CD25含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗CD40L含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗VLA-4含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗α4β7含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗CD64含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗IL-5含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗IL-6含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗補體C5含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗eotaxin含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，編碼抗CD23含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
本發(fā)明提供一類的重組重組空殼腺病毒，所述編碼治療疾病的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種Ig G的核苷酸序列或Ig M的核苷酸序列。
脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯不同兩類(稱為kappa(κ)和lambda(λ)中一類。
根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgGT和IgM，其中一些還可進一步分成亞類(同種型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG4、IgA-1和IgA-2。對應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)稱為α、β、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒， 其中編碼治療疾病的含有人恒定區(qū)全抗體的-核苷酸序列受啟動子控制。只要能夠啟動子功能，均可被用于本發(fā)明。其啟動子可以為以下啟動子之一猴重組空殼腺病毒40(Simian virus40，按常規(guī)簡稱為SV40)啟動子，勞斯氏肉瘤重組空殼腺病毒(Rous Sarcoma Virus，按常規(guī)簡稱為RSV)LTR啟動子，人巨細胞重組空殼腺病毒(按常規(guī)簡稱為HCMV)IE啟動子，鼠巨細胞重組空殼腺病毒(按常規(guī)簡稱為MCMV)IE啟動子及人腺病主要晚期表達啟動子(按常規(guī)簡稱為MLP)。
本發(fā)明提供一類重組空殼腺病毒，該重組空殼腺病毒是腺病毒體時，在控制編碼治療疾病的含有人恒定區(qū)全抗體表達的啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點與含有人恒定區(qū)全抗體的翻譯起始位點中插入內(nèi)含子，插入內(nèi)含子后可使含有人恒定區(qū)全抗體表達量大大增加。這種內(nèi)含子包括，但不限于選自的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，只要能夠具有增加含有人恒定區(qū)全抗體的表達的內(nèi)含子，均可被用于本發(fā)明。其所述的內(nèi)含子可以為雜合內(nèi)含子，雜合內(nèi)含子可以選下述之一含有腺病毒主要晚期mRNA的第三個引導順序的5’剪接位點和一個免疫球蛋白的3’剪接位點的雜合內(nèi)含子，含有腺病毒主要晚期mRNA的第一個引導順序的5’剪接位點和一個免疫球蛋白的3’剪接位點的雜合內(nèi)含子。
本發(fā)明在上述這種修飾重組空殼腺病毒基因組中插入編碼治療疾病的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。隨著重組空殼腺病毒感染細胞，使細胞高效表達治療疾病的含有人恒定區(qū)全抗體，從而治療疾病的目的。
本發(fā)明的又一方面，提供了一種利用本發(fā)明的重組空殼腺病毒應(yīng)用于腫瘤的治療，其包括如下步驟1)將該重組空殼腺病毒體外或體內(nèi)感染細胞，2)在細胞內(nèi)表達治療疾病的含有人恒定區(qū)全抗體，從而達到治療疾病的目的，本發(fā)明中所述的哺乳動物包括但不限于人，猴，牛，羊，豬，犬，貓等等。
本發(fā)明的又一方面，提供了一種利用本發(fā)明的重組空殼腺病毒應(yīng)用于腫瘤治療藥物，其包括如下步驟1)將該重組空殼腺病毒體外或體內(nèi)感染正常細胞，2)在正常細胞內(nèi)表達治療疾病的含有人恒定區(qū)全抗體，從而達到治療疾病的目的。本發(fā)明中所述的哺乳動物包括但不限于人，猴，牛，羊，豬，犬，貓等等。
本發(fā)明還包括內(nèi)含本文所述重組空殼腺病毒的組合物，如藥物組合物。這類組合物可體內(nèi)給藥。優(yōu)選地，這些組合物更進一步包含藥物學上可接受的賦形劑。這些可包含有效量的本發(fā)明重組空殼腺病毒于藥物學上可接受的賦形劑中的組合物適于以單位劑量形式、無菌的胃腸道外溶液或懸浮液、無菌的非胃腸道外溶液或口服液或懸浮液，水包油或油包水乳液等全身性給藥于個體。非胃腸道外和胃腸道外藥物送遞配方為本領(lǐng)域已知，可參見Remington’s藥物科學，18版，Mack Publishing(1990)。藥物組合物還包括本發(fā)明重組空殼腺病毒的凍干形式和/或重建形式(包括包裝成重組空殼腺病毒的那些)。
本發(fā)明還提供治療方法，其中將有效量的本文所述重組空殼腺病毒施用于個體。應(yīng)用重組空殼腺病毒的治療方法可用于疾病的患者。還可用于疾病高危人群，如那些有此類病的家族史和/或有已切除或以其它形式(如化療)治療過的疾病的個體。決定是否適于施用本發(fā)明的重組空殼腺病毒將特別依據(jù)可評估的臨床參數(shù)，如血清學指標及組織活檢樣品的組織學檢查。通常施用含重組空殼腺病毒的藥物組合物。藥物組合物如上述。
重組空殼腺病毒的用量取決于多種因素，如具體的重組空殼腺病毒類型，給藥途徑，個體的身體狀況，疾病發(fā)展程度，所用的具體腫瘤治療基因。
若施用包裝的重組腺病毒，則用量為約104至約1014，優(yōu)選約104至約1012，更優(yōu)選約104至約1010?？赏瑫r或先后施用不止一種重組空殼腺病毒。通常是周期性給藥，同時監(jiān)控任何反應(yīng)?？山?jīng)如皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明提供一類治療腫瘤的重組空殼腺病毒，動物實驗證明，這種重組空殼腺病毒藥物可用于治療疾病。
本發(fā)明提供一類高效表達治療疾病的含有人恒定區(qū)全抗體的重組空殼腺病毒的構(gòu)建方法。該方法通常易行可用于構(gòu)建高效表達治療疾病的含有人恒定區(qū)全抗體的細胞內(nèi)的重組空殼腺病毒。
本發(fā)明提供一種在體內(nèi)及體外治療體內(nèi)及體外腫瘤細胞內(nèi)高效表達治療疾病的含有人恒定區(qū)全抗體，達到高效低毒應(yīng)用于治療疾病的目的。
人類腺病毒有6個不同亞屬，分為A、B、C、D、E及F。它們對宿主細胞的親嗜性、致瘤性及疾病性史并不相同。本發(fā)明以腺病毒C亞屬中的5型(Ad5)作為例證，對本發(fā)明加以進一步具體說明，本發(fā)明構(gòu)建手段均是現(xiàn)有技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)。
本發(fā)明創(chuàng)造性地提供了用重組空殼腺病毒攜帶治療抗體對疾病進行治療，即采用重組空殼腺病毒攜帶治療疾病的并含有人恒定區(qū)全抗體基因，將該重組空殼腺病毒轉(zhuǎn)染細胞，使細胞表達大量治療疾病并含有人恒定區(qū)全抗體。本發(fā)明攜帶治療疾病并含有人恒定區(qū)全抗體基因的重組空殼腺病毒，可在細胞或組織中使抗體基因長期高水平的表達，由于含有人恒定區(qū)的全抗體基因在體內(nèi)較穩(wěn)定，本發(fā)明結(jié)果令人驚奇發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用攜帶含有人恒定區(qū)的全抗體基因的重組空殼腺病毒治療疾病，在體內(nèi)血清中抗體濃度能達到50-150μg/ml，其濃度達到抗體蛋白血清水平，明顯高于應(yīng)用重組空殼腺病毒攜帶戴其它基因的水平。通常應(yīng)用重組空殼腺病毒表達蛋白在體內(nèi)蛋白濃度為0.5-10μg/ml，因此它能夠在體內(nèi)避免反復給予的麻煩。同時由于攜帶治療疾病的含有人恒定區(qū)全抗體基因的重組空殼腺病毒生產(chǎn)成本低廉，從而解決了治療抗體生產(chǎn)成本高的難題，因而從療效及經(jīng)濟上均優(yōu)于抗體治療法。這種攜帶含有人恒定區(qū)全抗體基因的重組空殼腺病毒系統(tǒng)的抗體治療方法還可用于腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)，尤其腺相關(guān)病毒1型載體系統(tǒng)，也可用于其它能在體內(nèi)長期高水平表達載體系統(tǒng)。


圖1.空殼腺病毒載體SGG示意2.重組腺病毒SGG002及對照腺重組空殼腺病毒Ad5-Lac Z體外感染的WI-38、BJ及SK-Br-3后，WI-38、BJ及SK-Br-3細胞上清中人源化抗體的表達量圖3.重組腺病毒SGG002體外感染的WI-38及SK-Br-3后，WI-38及SK-Br-3細胞上清分泌人源化抗體與Herceptin對人表皮生長因子受體2(Her2)陽性的乳腺癌細胞SK-Br-3增殖抑制作用。細胞增殖率＝治療細胞數(shù)/對照細胞數(shù)×100％圖4.重組腺病毒SGG002及對照腺重組空殼腺病毒Ad5-Lac Z分別按5×1010VP、1×1011VP及2×1011VP尾靜脈給予Balb/c nu裸鼠治療后裸鼠血清中人源化抗體的表達量圖5.重組腺病毒SGG002及對照腺重組空殼腺病毒Ad5-Lac Z的2×1011VP尾靜脈給予Balb/c裸鼠治療1周后小鼠血清中人源化抗體的蛋白印跡雜交6.重組腺病毒SGG004感染的正常肝細胞L02上清中人鼠嵌合抗體的純化后的抗體親和常數(shù)測定曲線圖7.重組腺病毒SGG004及對照腺重組空殼腺病毒Ad5-Lac Z分別按1×1011VP及5×1011VP尾靜脈給予Balb/c nu裸鼠治療后裸鼠血清中人鼠嵌合抗體的表達量圖8.重組腺病毒SGG004及對照腺重組空殼腺病毒Ad5-Lac Z的5×1011VP尾靜脈給予Balb/c裸鼠治療1周后小鼠血清中人鼠嵌合抗體的蛋白印跡雜交圖
具體實施例方式
例1.分別攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因、抗人表皮生長因子受體(EGFR)的人的抗體SG-EGFR基因、抗人CD20的人嵌合抗體SG-CD20基因及抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗體SG-anti HBV preS2基因的表達載體的構(gòu)建pShuttle-CMV購于美國Qbiogene，含有人巨細胞病毒啟動子(CMV IE)及SV40 poly A加尾信號，應(yīng)用PCR技術(shù)克隆人巨細胞病毒啟動子(CMV IE)及SV40poly A加尾信號，并在上下游位置中分別加入Bgl II酶切位點，在其人巨細胞病毒啟動子(CMV IE)及SV40 poly A加尾信號之間插入多克隆位點，分別為EcoRI、Sal I、Hind III、Xho I及BamH I酶切位點，其方法采用定位突變雙次PCR技術(shù)(方法參見PCR Protools Current Methods and Applications，White BA主編，Humana Press Inc.1993年出版-文獻1)。其引物分別為應(yīng)用引物1與引物2對pShuttle-CMV進行PCR，其產(chǎn)物長度為621bp。
引物1GGG GTA CCT AGA TCT TAG TAA TCA ATT ACG GGG TCA引物2GAG AAG CTT GTC GAC GAA TTC CTA GCG GAT CTG ACG GTT CAC應(yīng)用引物3與引物4對pShuttle-CMV進行PCR，其產(chǎn)物長度為293bp。
引物3GAA TTC GTC GAC AAG CTT CTC GAG GGA TCC ATC TAG ATA ACT GATCAT A引物4ATA GTT TAG CGG CCG CTA AGA TCT AAG ATA CAT TGA TGA GTT TG應(yīng)用引物1與引物4對上述片斷進行PCR，其產(chǎn)物長度為893bp應(yīng)用Kpn I與Not I雙酶切后，插入pBluescript(購于美國ATCC公司)中.進行測序，正確者命名為pClonel，其Bgl II酶切后長度為861bp。
腦心肌炎病毒(EMCV)的多順反子(IRES)來源于pIRES-EYFP，該質(zhì)粒購于美國Clontech公司。應(yīng)用引物5與引物6對其進行PCR，其擴增長度為624bp引物5CCG GAA TTC ATC GAT TCT GTC GAC CTG CAG GAA TTG CCC CTC TCCCTC
引物6TGC TCT AGA CCC GGG CTC GAG GGA TCC TTA ATC ATC GTG TTT TTCAAA G用EcoR I+Xba I雙酶切插入pUC19的EcoR I+Xba I酶切位點中，進行測序，命名為pUC19-IRES用EcoR I+Xba I雙酶切分別插入pClonel的EcoR I+Xba I酶切位點中，命名為pClone2。
質(zhì)粒pClone2為含有腦心肌炎病毒(EMCV)的多順反子(IRES)的雙基因表達載體，其啟動子為人巨細胞病毒啟動子(CMV IE)，含有兩個多克隆位點，第一個多克隆位點的酶切位點依次為EcoR I、Cla I、Sal I及Pst I，第二個多克隆位點的酶切位點依次為BamH I、Xho I、Xma I及Xba I。
抗人表皮生長因子受體1(EGFR)的人的抗體SG-EGFR由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司進行全長基因合成，其輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)與美國Abgenix公司的針對表皮生長因子受體1的人的抗體ABX-EGF的輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)相同。含有SG-EGFR重鏈基因并在重鏈上游區(qū)引入BamH I酶切位點和重鏈下游區(qū)引入Xba I酶切位點的pUC19質(zhì)粒命名為pUC-SG-EGFRH。含有SG-EGFR輕鏈基因并在輕鏈上游區(qū)引入EcoR I和輕鏈下游區(qū)引入Sal I酶切位點的pUC19質(zhì)粒為pUC-SG-EGFRL。
SG-EGFR的重鏈基因的核苷酸序列CGCGGATCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAGTGGTGATTACTACTGGACCTGGATTCGGCAGTCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGACACATCTATTACAGTGGGAACACCAATTATAACCCCTCCCTCAAGAGTCGACTCACCATATCAATTGACACGTCCAAGACTCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCATTTATTACTGTGTGCGAGATCGAGTGACTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCC
ACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAATCTAGAAAGCTTGGG→SG-EGFR的輕鏈基因的核苷酸序列CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATCAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTTCTGTCAACACTTTGATCATCTCCCGCTCGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAC→→應(yīng)用BamH I+Xba I將pUC-SG-EGFRH切下，定向插入pClone2載體BamHI+Xba I中，命名為pCtone2-SG-EGFRH。應(yīng)用EcoR I+Sal I將pUC-SG-EGFRL切下，定向插入pClone2-SG-EGFRH載體EcoR I+Sal I中，命名為pClone2-SG-EGFR。
抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司進行全長基因合成，其輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)與美國Genentech公司的針對表皮生長因子受體2的人源化抗體Herceptin的輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)相同。含有SG-HER重鏈基因并在重鏈上游區(qū)引入BamH I酶切位點和重鏈下游區(qū)引入Xho I酶切位點的pUC19質(zhì)粒命名為pUC-SG-HERH。含有SG-HER輕鏈基因并在輕鏈上游區(qū)引入EcoR I和輕鏈下游區(qū)引入Sal I酶切位點的pUC19質(zhì)粒為pUC-SG-HERL。
SG-HER的重鏈基因的核苷酸序列GGATCCACCATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAGAGGTTCAGCTGGTGGAGTCTGGCGGTGGCCTGGTGCAGCCAGGGGGCTCACTCCGTTTGTCCTGTGCAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATACACTGGGTGCGTCAGGCCCCGGGTAAGGGCCTGGAATGGGTTGCAAGGATTTATCCTACGAATGGTTATACTAGATATGCCGATAGCGTCAAGGGCCGTTTCACTATAAGCGCAGACACATCCAAAAACACAGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGCGTGCTGAGGACACTGCCGTCTATTATTGTTCTAGATGGGGAGGGGACGGCTTCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCGGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAACTCGAG
SG-HER的輕鏈基因的核苷酸序列CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGATATCCAGATGACCCAGTCCCCGAGCTCCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGATAGGGTCACCATCACCTGCCGTGCCAGTCAGGATGTGAATACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGAAAAGCTCCGAAACTACTGATTTACTCGGCATCCTTCCTCTACTCTGGAGTCCCTTCTCGCTTCTCTGGATCCAGATCTGGGACGGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTCTGCAGCCGGAAGACTTCGCAACTTATTACTGTCAGCAACATTATACTACTCCTCCCACGTTCGGACAGGGTACCAAGGTGGAGATCAAAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAC→應(yīng)用BamH I+Xho I將pUC-SG-HERH切下，定向插入pClone2載體BamH I+XhoI中，命名為pClone2-SG-HERH。應(yīng)用EcoR I+Sal I將pUC-SG-HERL切下，定向插入pClone2-SG-HERH載體EcoR I+Sal I中，命名為pClone2-SG-HER。
抗人CD20的人鼠嵌合抗體SG-CD20基因由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司進行全長基因合成，其輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)與美國IDEC公司的針對CD20的人鼠嵌合抗體IDEC-C2B8(Rituximab)的輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)相同。含有SG-CD20重鏈基因并在重鏈上游區(qū)引入BamH I酶切位點和重鏈下游區(qū)引入Xba I酶切位點的pUC19質(zhì)粒命名為pUC-SG-CD20H。含有SG-CD20輕鏈基因并在輕鏈上游區(qū)引入EcoR I和輕鏈下游區(qū)引入Sal I酶切位點的pUC19質(zhì)粒為pUC-SG-CD20L。
SG-CD20的重鏈基因的核苷酸序列CGCGGATCCACCATGGAGTTTTGGCTGAGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTCAGGTACAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGTCGGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCCGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACT
CTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGACTTACTACGGCGGTGACTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAGTAATCTAGASG-CD20的輕鏈基因的核苷酸序列CCGGAATTCACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGACAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACTTCTTACTCTCTCACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGATAAGTCGAC應(yīng)用BamH I+Xba I將pUC-SG-CD20H切下，定向插入pClone2載體BamHI+Xba I中，命名為pClone2-SG-CD20H。應(yīng)用EcoR I+Sal I將pUC-SG-CD20L切下，定向插入pClone2-SG-CD20H載體EcoR I+Sal I中，命名為pClone2-SG-CD20。
抗人HBV pres2的人鼠嵌合抗體SG-anti HBV preS2基因由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司進行全長基因合成，其輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)與韓國的生物科學與研所的針對HBV pres2的人鼠嵌合抗體H8的輕鏈基因與重鏈基因的可變區(qū)相同(參見文獻Park SS，Ryu CJ，Gripon P，Guguen-guillouzo C and HongHJ.Generation and characterization of a humanized antibody withspecificity for preS2 surface antigen of hepatitis B virus.Hybrdoma1996，15435-441)。含有SG-anti HBV preS2重鏈基因并在重鏈上游區(qū)引入BamHI酶切位點和重鏈下游區(qū)引入Xba I酶切位點的pUC19質(zhì)粒命名為pUC-SG-antiHBV preS2。含有SG-anti HBV preS2輕鏈基因并在輕鏈上游區(qū)引入EcoR I和輕鏈下游區(qū)引入Sal I酶切位點的pUC19質(zhì)粒為pUC-SG-anti HBV preS2。
SG-anti HBV preS2的重鏈基因的核苷酸序列g(shù)gatccACCATGTACTTGGGACTGAACTATGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTGTCCAGAGTGAAGTGAAGCTCGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGGTGAAATTAGAAGCAAAGCTAATAATCATGCAACATACTATGCTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCCCCATTACTACGGGCGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAAAGCTTGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGATACCCTTATGATTTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAAGTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCTGCGGG
AGGAGCAGTACAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAtctagaSG-anti HBV preS2的輕鏈基因的核苷酸序列GaattcACCATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTATGTTACTGCTGCTATGGGTATCTGGTACCTGTGGGGACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTAGCTGTGTCAGTTGGAGAGAAGGTTACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTATATAGTAGCATTCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGAGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATAACTATCCGTCCACGTTCGGAGGGGGGACCTACCTGGAAATAAAACGTACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGAGTCGAC應(yīng)用BamH I+Xba I將pUC-SG-anti HBV preS2H切下，定向插入pClone2載體BamH I+Xba I中，命名為pClone2-SG-anti HBV preS2H。應(yīng)用EcoR I+SalI將pUC-SG-anti HBV preS2L切下，定向插入pClone2-SG-anti HBV preS2H載體EcoR I+Sal I中，命名為pClone2-SG-anti HBV preS2。
合有雞珠蛋白絕緣子的表達載體pSGEI構(gòu)建，將pUC19(購于美國ATCC公司)應(yīng)用EcoR I及HindIII酶切，合成兩個DNA寡核苷酸片段做一個連接頭，其DNA寡核苷酸序列為primer7 AATTGACCGGTAGCTAprimer8 GCTTAGCTACCGGTC
將兩個DNA寡核苷酸片段各0.1μg混合，100℃變性5分鐘，然后緩慢降溫復性，復性后應(yīng)用T4噬菌體多核苷酸激酸進行磷酸化。將該磷酸化后的連接頭與pUC19應(yīng)用EcoR I及HindIII載體片段進行連接，命名為pCLON3(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版社1992出版)，pCLON3的多克隆位點為Age I與Hind III。
雞β-珠蛋白基因座絕緣子位于雞β-珠蛋白基因座5′端邊界元件中的一段長約1,200bp的DNA片斷。進一步的研究表明，該片段近一半的絕緣活性是由其5′端一段長約250bp包含有DNA酶I超敏位點(5′HS4)的CpG島樣結(jié)構(gòu)(即所謂核心元件)決定的。其雞珠蛋白絕緣子的序列根據(jù)Genebank中Gallusgallus beta-globin insulator sequence(基因號為U78775，參見網(wǎng)站為http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ent-rez/querv.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝nucleotide&list uids＝7981030&dopt＝GenBank&term＝chicken+insulator&qty＝1)的cDNA序列1-239bp作為絕緣子。將PDC315小鼠巨細胞病毒啟動子、多克隆點及SV40 poly A的兩側(cè)各含有兩個上述絕緣子的序列至上海捷倍思基因技術(shù)有限公司進行全長合成，序列如下Actagt(Spe I)GAGCTCACGGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGATACGGGGAAAAtctagtGAGCTCACGGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGATACGGGGAAAA(Insulator×2)(小鼠CMV啟動子)GATATACTGAGTCATTAGGGACTTTCCAATGGGTTTTGCCCAGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAATCAACAGGAAAGTCCCATTGGAGCCAAGTACACTGAGTCAATAGGGACTTTCCATTGGGTTTTGCCCAGTACAAAAGGTCAATAGGGGGTGAGTCAATGGGTTTTTCCCATTATTGGCACGTACATAAGGTCAATAGGGGTGAGTCATTGGGTTTTTCCAGCCATTTAATTAAAACGCCATGTACTTTCCCACCATTGACGTCAATGGGCTATTGAAACTAATGCAACGTGACCTTTAAACGGTACTTTCCCATAGCTGATTA
ATGGGAAAGTACCGTTCTCGAGCCAATACACGTCAATGGGAAGTGAAAGGGCAGCCAAAACGTAACACCGCCCCGGTTTTCCCCTGGAAATTCCATATTGGCACTCATTCTATTGGCTGAGCTGCGTTCTACGTGGGTATAAGAGGCGCGACCAGCGTCGGTACCGTCGCAGTCTTCGGTCTGACCACCGTAGAACGCAGATC(小鼠CMV啟動子)(多克隆位點)GAATTCAAGCTGCTAGCAAGGATCCAGCTTGTCGACT(多克隆位點)(SV40 poly A)TCGAGCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCGTCTAGCATCGAAGATCC(SV40 poly A)(Insulator×2)GAGCTCACGGGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGATACGGGGAAAAtctagtGAGCTCACGGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGATACGGGGAAAAtctaga(Xba I)用Age I加Hind III將其插入pClon3的Age I加Hind III中，命名為雞珠蛋白絕緣子的表達載體pSGEI，其多克隆位點分別EcoR I、Nhe I、BamH I和SalI。
將pClone2-SG-EGFR、pClone2-SG-CD20和pClone2-SG-anti HBV preS2質(zhì)粒用EcoR I+Xba I雙酶切插入pSGEI的EcoR I+Nhe I的酶切位點中，分別命名為pSGEI-SG-EGFR、pSGEI-SG-CD20及pSGEI-SG-anti HBV preS2。pClone2-SG-HER質(zhì)粒用EcoR I+Xho I雙酶切插入pSGEI的EcoR I+Sal I的酶切位點中，分別命名為pSGEI-SG-HER。
例2.分別攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因、抗人表皮生長因子受體(EGFR)的人的抗體SG-EGFR基因、抗人CD20的人嵌合抗體SG-CD20基因及抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗體SG-anti HBV preS2基因的空殼腺病毒載體的構(gòu)建及重組空殼腺病毒輔助病毒(FL Helper)及含有酵母重組酶FLPe的293(203-FLPe6)由美國Cedars-Sinai醫(yī)學中心(Las Angeles CA 90048-1860)的Lowenstein PR教授惠贈(參見文獻Umana P，Gerdes CA， Stone D，Davis JRE，Ward D，CastroMG，Lowenstein PR.Efficient FLPe recombinase enables scalable productionof helper-dependent adenoviral vectors with negligible helper-viruscontamination.Nature Biotechnology 2001 19 582-585)。
空殼腺病毒載體pSGG的構(gòu)建，將下列序列上海捷倍思基因技術(shù)有限公司進行全長合成。
ACCGGT(Age I)TCGCCATTCAGGATCGAATTAATTCTTTAATTAA(1nt)CATCATCAATAATATACCTTAITTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGG(191nt)GAAGTTCCIATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC(FRT)(192NT)TGIACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTIAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGIAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTIACTCAIAGCGCGTAATA(342NT)CTGAATTCTCGAGACTAGTGGATCCGCGGCCGCATCTAGAGATCTGTCGAC(35570nt)CACTCGACACGGCACCAGCTCAAICAGTCACAGTGTAAAAAAGGGCCAAGTGCAGAGCGAGTATATTATAGGACTAAAAAATGACGTAACGGTTAAAGTCCACAAAAAACACCCAGAAAACCGCACGCGAACCTACGCCCAGAAACGAAAGCCAAAAAACCCACAACTTCCTCAAATCGTCACTTCCGTTTTCCCACGTTACGTAACTTCCCATTTIAAGAAAACTACAATTCCCAACACATACAAGTTACTCCGCCCTAAAAC(35832nt)E4Promotor(35833nt)CTACGTCACCCGCCCCGTTCCCACGCCCCGCGCCACGTCACAAACTCCACCCCCTCATTATCATATTGGCTTCAATCCAAAATAAGGIATATTATTGATGATG(35935nt)TTAATTAACATGCAAGCTT(Hind III)其序列由上海捷倍思基因技術(shù)有限公司進行全長合成，其結(jié)構(gòu)見圖1將pSGEI-SG-EGFR、pSGEI-SG-HER、pSGEI-SG-CD20及pSGEI-SG-anti HBVpreS2。分別用Spe I+Xba I雙酶切，分別獲包含2×絕緣子、小鼠CMV啟動子、抗體輕鏈、腦心肌炎病毒(EMCV)的多順反子(IRES)、抗體重鏈、SV40-PolyA及2×絕緣子全長片段，分別正向插入pSGG的Xba I酶切位點，以后再重復插入3次，共4考貝，分別命名為pSGG-SG-EGFR、pSGG-SG-HER、pSGG-SG-CD20及pSGG-SG-anti HBV preS2。
將pSGG-SG-EGFR、pSGG-SG-HER、pSGG-SG-CD20及pSGG-SG-anti HBVpreS2通過Lipofectamine轉(zhuǎn)染含有酵母重組酶FLPe的293(203-FLPe6)。轉(zhuǎn)染后16小時后加入空殼腺病毒輔助病毒(FL Helper)，4天后獲得分別攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因、抗人表皮生長因子受體(EGFR)的人的抗體SG-EGFR基因、抗人CD20的人嵌合抗體SG-CD20基因及抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗體SG-anti HBV preS2基因的重組空殼腺病毒，分另命名為Ad-SGG-EGFR、Ad-SGG-HER、Ad-SGG-CD20及Ad-SGG-anti-HBV preS2，分別記為SGG001、SGG002、SGG003及SGG004。
由上述方法構(gòu)建的重組空殼腺病毒的列表如下重組空殼腺病毒 名稱空殼腺病毒載體 輔助腺病毒Ad-SGG-EGFRSGG001 pSGG-SG-EGFR FL helperAd-SGG-HER SGG002 pSGG-SG-HERFL helperAd-SGG-CD20SGG003 pSGG-SG-CD20 FL helperAd-SGG-anti-HBV preS2 SGG004 pSGG-anti-HBV preS2FL helper重組腺空殼腺病毒與空殼腺病毒輔助病毒(FL Helper)在293-F1Pe細胞中大量繁殖，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法大量純化重組腺空殼腺病毒(方法參見Gene Transfer and Expression Protocols，Murray EJ主編，Humana Press 1991出版-文獻2)。
例3攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組空殼腺病毒(SGG002)的體外及體內(nèi)表達人源化抗體正常細胞株肺成纖維細胞WI-38、正常細胞株肺成纖維細胞BJ及人表皮生長因子受體2(Her2)陽性的腫瘤細胞SK-Br-3購于美國ATCC公司，將上述細胞株按5×105細胞/孔鋪在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO2培養(yǎng)，第二天換無血清液體1ml，然后，分別加入對照腺病毒Ad5-Lac Z或攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組空殼腺病毒SGG002。其病毒量為5×108VP/孔，培養(yǎng)90分鐘后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，將病毒洗去，與加入5％胎牛血清的培養(yǎng)液3ml培養(yǎng)，分別在72小時收集上清，應(yīng)用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測其上清的表達量。結(jié)果可見重組空殼腺病毒SGG002體外感染的WI-38、BJ及SK-Br-3后，WI-38、BJ及SK-Br-3均分泌大量人源化抗體，而對照腺病毒Ad5-Lac Z則陰性。結(jié)果見圖2。
其經(jīng)SGG002體外感染的WI38及SK-Br-3分泌的人源化抗體與美國Genentech公司的Herceptin分別按10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.1μg/ml及0μg/ml加入人表皮生長因子受體2(Her2)陽性的乳腺癌細胞SK-Br-3，其殺傷作用相似，見圖3。說明經(jīng)SGG002體外感染的MAC-5及SK-Br-3分泌的人源化抗體與美國Genentech公司的Herceptin作用相同。
將對照腺病毒Ad5-Lac Z或攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組空殼腺病毒(SGG002)分別以5×1010Vp、1×1011VP及2×1011VP在尾靜脈給予Balb/c裸鼠治療，1周后的應(yīng)用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測其小鼠血清的表達量，結(jié)果可見應(yīng)用攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組空殼腺病毒(SGG002)體內(nèi)感染后，其小鼠血清有大量人源化抗體表達，其表達水平與給予的病毒劑量成正比，其體內(nèi)人源化抗體的血清濃度高于文獻中Herceptin的治療濃度，而對照腺病毒Ad5-Lac Z則陰性。結(jié)果見圖4。其小鼠血清應(yīng)用羊抗人IgG進行蛋白質(zhì)印跡分析(Western Blot)，其攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組空殼腺病毒(SGG002)治療的小鼠血清中可見兩條與Herceptin相同的雜交帶，而對照腺病毒Ad5-Lac Z則無，見圖5。
例4攜帶抗人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組空殼腺病毒(SGG002)在裸鼠體內(nèi)治療移植乳腺癌腫瘤的治療作用進行了攜帶人表皮生長因子受體2(Her2)的人源化抗體SG-HER基因的重組腺病毒(SGG002)在裸鼠體內(nèi)研究，治療人表皮生長因子受體2(Her2)陽性的腫瘤細胞移植瘤。
乳腺癌細胞株BT-474購于美國ATCC公司，將4-5周齡的裸鼠皮下接種乳腺癌細胞株BT-474細胞1×107，八周后形成100mm3腫瘤，分為末治療組、對照腺病毒(Ad-Lac Z)及治療組(SGG002)，末治療組不加任何治療，對照腺病毒及治療組在鼠尾靜脈分別給予1×1011VP對照腺病毒Ad5-Lac Z或用相同劑量的治療重組空殼腺病毒SGG002，其未治療組及對照腺病毒治療組4周后腫瘤體增加3倍以上，而治療組則腫瘤增大不明顯，部分完全消褪。
例5攜帶抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗體SG-anti HBV preS2基因重組空殼腺病毒(SGG004)的體外及體內(nèi)表達人嵌合抗體正常肝細胞株L02購于中科院細胞庫，將上述細胞株按5×105細胞/孔鋪在6-孔板中，在37℃孵箱5％CO2培養(yǎng)，第二天換無血清液體1ml，然后，分別加入對照腺病毒Ad5-Lac Z或攜帶人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗體SG-anti HBVpreS2基因重組空殼腺病毒(SGG004)。其病毒量為5×108VP/孔，培養(yǎng)90分鐘后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，將病毒洗去，與加入5％胎牛血清的培養(yǎng)液3ml培養(yǎng)，分別在72小時收集上清，應(yīng)用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測其上清的表達量。結(jié)果可見重組空殼腺病毒SGG004體外感染的L02分泌420±35ng/ml/5×105嵌合抗體，而對照腺病毒Ad5-Lac Z則陰性。將其上清用Protein G柱子(Pharmacia公司)純化，進行乙型肝炎病毒表面前S2抗原抗體親和力的檢測，以重組乙肝表面前S蛋白(中科院生化所汪垣惠贈)1ug/ml、0.4ug/ml、0.1ug/ml包被酶標反應(yīng)板。參照Beaty測抗體親和常數(shù)方法，設(shè)兩種包被濃度為[Ag]和[Ag，]，[Ag]/[Ag，]＝n，以log[Ab]為橫坐標每種抗體得出兩條S型曲線，曲線的最高平臺為A100，取A100的一半即A50所對應(yīng)的抗體濃度分別為[Ab][Ab，]，則抗體親和力常數(shù)為Kaff＝(n-1)/2(n[Ab，]-[Ab])，抗體分子量約為166Kd。根據(jù)相應(yīng)抗原的濃度及A450值作出抗體親和常數(shù)曲線如圖6。根據(jù)抗體親和力常數(shù)公式Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]-[Ab])計算出抗體親和力常數(shù)為2.16±0.20×108L/mol(方法參見文獻Bertty JD，Beatty BG andVlahos WG.Measurement of monoclal antibody affinity by non-competitive enzymeimmunoassay.I Immunol Methods 1983，100173-179)。
將對照腺病毒Ad5-Lac Z或攜帶抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗體SG-anti HBV preS2基因重組空殼腺病毒(SGG004)分別以1×1011VP及5×1011VP在尾靜脈給予Balb/c nu裸鼠治療，1周后的應(yīng)用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測其裸鼠血清的表達量，結(jié)果可見應(yīng)用攜帶抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗體SG-anti HBV preS2基因重組空殼腺病毒(SGG004)體內(nèi)感染后，其小鼠血清有大量人源化抗體表達，其表達水平與給予的病毒劑量成正比，而對照腺病毒Ad5-Lac Z則陰性。結(jié)果見圖7。其小鼠血清應(yīng)用羊抗人IgG進行蛋白質(zhì)印跡分析(Western Blot)，攜帶抗人乙肝病毒前S2的人鼠嵌合抗體SG-anti HBV preS2基因重組空殼腺病毒(SGG004)治療的小鼠血清中可見兩條與人抗體相同的雜交帶，而對照腺病毒Ad5-Lac Z則無，見圖8。
權(quán)利要求
1.一種重組空殼腺病毒，其特征在于所述空殼腺病毒基因組中至少包含編碼一種含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列，該含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列可選自下述之一種1)人鼠嵌合抗體的核苷酸序列；2)人源化抗體的核苷酸序列；3)人抗體的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述空殼腺病毒基因組中含有人恒定區(qū)全抗體基因表達盒的上下游區(qū)至少含有一個絕椽子術(shù)語即insulater的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述絕椽子即insulater的核苷酸序列為雞的β球蛋白的絕椽子的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述編碼含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列為編碼治療腫瘤的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述編碼治療腫瘤的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列為抗表皮生長因子受體1含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述編碼治療腫瘤的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列為抗表皮生長因子受體2含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述編碼治療腫瘤的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列為抗CD20含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述編碼含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列為編碼治療微生物感染的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述編碼治療微生物感染的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列為治療病毒含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述編碼抗病毒的含有人恒定區(qū)的核苷酸序列為治療乙肝病毒含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述編碼含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列為編碼治療自身免疫性疾病的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述編碼治療自身免疫性疾病的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列為編碼抗腫瘤壞死因子α含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述編碼含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列是IgG或IgM。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組空殼腺病毒，其特征在于編碼的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列的表達受啟動子控制，所述啟動子可選自下述之一種SV40啟動子，RSV LTR啟動子，人巨細胞病毒IE啟動子，腫瘤細胞特異性激活的順式作用元件，鼠巨細胞重組空殼腺病毒IE啟動子，人腺病毒主要晚期表達啟動子。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組空殼腺病毒，其特征在于所述病毒為腺病毒，其中在控制所述含有人恒定區(qū)全抗體的啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點與含有人恒定區(qū)全抗體的翻譯起始位點之間可操作連接了內(nèi)含子，所述啟動子可選自下述之一種含有腺病毒主要晚期mRNA的第三個引導順序的5’剪接位點和一個免疫球蛋白的3’剪接位點的雜合內(nèi)含子，含有腺病毒主要晚期mRNA的第一個引導順序的5’剪接位點和一個免疫球蛋白的3’剪接位點的雜合內(nèi)含子。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組空殼腺病毒，其特征在于編碼治療腫瘤的含有人恒定區(qū)全抗體的核苷酸序列可操作連接了編碼分泌型信號肽的核苷酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的重組空殼腺病毒，其特征在于該分泌型信號肽可以是下述中的一種含有人恒定區(qū)全抗體自身信號肽，M-成瘤蛋白信號肽，腫瘤壞死因子α的信號肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17所述的重組空殼腺病毒的應(yīng)用，是將該重組空殼腺病毒用于體外感染細胞，導致細胞表達含有人恒定區(qū)全抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-17所述的重組空殼腺病毒用于制備治療哺乳類動物尤其是人類疾病的藥物，該藥物(1)重組空殼腺病毒感染體外或體內(nèi)細胞，(2)在細胞內(nèi)表達含有人恒定區(qū)全抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種高效表達含有人恒定區(qū)全抗體基因的重組空殼腺病毒及其用途。本發(fā)明通過將編碼含有人恒定區(qū)全抗體基因的核苷酸序列插入重組空殼腺病毒基因組中，從而在細胞內(nèi)或體內(nèi)高效表達含有人恒定區(qū)全抗體，從而達到治療疾病的目的。
文檔編號A61K39/235GK1632109SQ20031012269
公開日2005年6月29日 申請日期2003年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月24日
發(fā)明者錢其軍, 楊琴 申請人:錢其軍