專利名稱：抗人cd20人源化抗體、其制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種抗體、其制備方法和用途。
背景技術：
非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)是最常見的淋巴系統惡性腫瘤，好發(fā)于青壯年，其中絕 大多數為B細胞來源，約占85%。在未治療狀態(tài)下，低度和部分中度惡性NHL如小淋巴細胞 性淋巴瘤和濾泡型淋巴瘤的生長形式往往呈惰性過程，中位生存期為5 9年。它們對首 次化療敏感，但很容易復發(fā)或耐藥，當再次化療或放療時，療效明顯降低，因而被認為是難 以治愈的惡性腫瘤。而一些高度惡性的NHL則死亡率極高。近年來，針對細胞表面分子的抗原靶向性治療已取得了巨大進展并成為一種非 常有發(fā)展前途的治療方法，其中被廣泛使用且富有成效的是抗CD20的單抗制劑[Maloney DG. Immunotherapy for non-Hodgkin' s lymphoma monoclonal antibody and vaccines. J Clin Oncol. 2005Sep 10 ；23 (26) :6421-6428]。CD20抗原是非結合性單抗療法的一個理想靶點，因為該抗原具有克隆特異性，僅 表達于所有的前B細胞和成熟B細胞，而不表達于造血干細胞、漿細胞和其他造血細胞系； 同時，CD20分子在B淋巴瘤細胞表面的表達量異常增高，磷酸化增加，與B細胞淋巴瘤的發(fā) 生密切相關。⑶20分子在超過95%的B細胞性NHL中均有表達，且抗原分子在膜上比較暴 露，容易接近，與單抗結合后無顯著內化和脫落，也不會因與抗體的結合而發(fā)生抗原調變， 因此成為治療B細胞淋巴瘤的理想靶點。⑶20單抗療法在治療B細胞淋巴瘤中已取得了令人滿意的效果，目前抗⑶20抗 體主要有以下幾種，按照其發(fā)揮抗腫瘤作用的不同功能分為兩大類(1)主要通過CDC、 ADCC(CDCC)作用發(fā)揮功能的C2B8、1F5、2H7、2F2(2)主要通過凋亡、ADCC(CDCC)作用發(fā)揮 功能的B1、11B8。美國IDEC phamaceutical公司針對B細胞淋巴瘤生產的人鼠嵌合抗CD20 單克隆抗體Rituximab-C2B8是第一個經美國FDA批準用于治療淋巴瘤的抗體。1997年批 準上市。美羅華是一種嵌合型IgGl免疫球蛋白，它是通過轉染相關基因結構到倉鼠卵細胞 后表達的基因產物。美羅華含13 個氨基酸，分子量約144KD，由鼠抗CD20單克隆抗體的 可變區(qū)Fab和人IgGl抗體穩(wěn)定區(qū)Fc片段構成。雜交瘤技術生產的鼠源單克隆抗體進入人體后可能引起人抗鼠抗體免疫應 答 human antimouse antibody response (HAMA)[Winter G, Harris WJ. Humanized antibodies. Immunol Today. 1993 Jun ； 14 (6) :243-6]。因此，如何通過基因工程技術來構 建抗降低鼠源抗體的免疫原性的抗體，有效地減少HAMA反應的發(fā)生率是本領域的技術人 員急于解決的問題。人源化抗體[Ishida T，Tmai K. The expression technology of chimeric and humanized antibody. Nippon Rinsho，2002，60 (3) :439-444 Ishida T，Tmai K.The expression technology of chimeric and humanized antibody. Nippon Rinsho,2002, 60(3) :439-444]是為了克服鼠源單抗在臨床應用中的缺陷而發(fā)展起來的新型基因工程抗體。第一代人源化抗體是將鼠單抗的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)組成嵌合抗體，由于抗體的 抗原親和力是由其可變區(qū)決定的，因此嵌合抗體的親和力保持得很好，同時免疫原性也得 到了一定程度的降低?？贵w的可變區(qū)是由超變區(qū)(CDR)區(qū)和框架區(qū)(FR)區(qū)組成的，CDR是 高度可變的區(qū)域，直接介導抗體與抗原的結合。FR區(qū)相對保守，作為支架維持著CDR區(qū)的 空間位置，它是可變區(qū)中產生免疫原性的主要區(qū)域。由于嵌合抗體上還保留著鼠可變區(qū)， 臨床應用時仍常常會有強烈的HAMA反應。因此，為了盡可能降低嵌合抗體的免疫原性，人 們考慮將鼠CDR區(qū)直接移植到人源抗體可變區(qū)中的FR區(qū)上，得到CDR移植抗體，也就是人 源化抗體。但是，單純的⑶R移植往往降低甚至喪失原抗體的親和力，這是因為FR區(qū)不僅 提供了⑶R的空間構象環(huán)境，有時還直接參與抗原抗體的相互結合，只有將FR中某些重要 殘基回復突變成鼠源殘基才能恢復抗體的活性。(C，Queen, W，P，Schneider, H，Ε, Selick, P, W, Payne, N, F, Landolfi, J, F, Duncan, N, M, Avdalovic, M, Levitt, R, P, Junghans, T, A, ffaldmann, A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033. V. L. Pulito, V. A. Roberts, J. R. Adair, A. L. Rothermel, A. M. Collins, S. S. Varga, C. Martocello, M. Bodmer, L. K. Jolliffe, R. A.Zivin, Humanization and molecular modeling of the anti_CD4 monoclonal antibody, 0KT4A, J. Immunol. 156(1996)2840-2850. K. Nakamura, Y.Tanaka, K. Shitara, N. Hanai, Construction of humanized anti-ganglioside monoclonal antibodies with potent immune effector functions, Cancer Immunol. Immunother. 50(2001)275-284.)
綜上所述，得到活性高的鼠源單抗并利用其CDR進一步得到恢復抗體活性的人源 化抗體一直是本領域的技術人員著力解決的問題。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明提供了一種抗人⑶20人源化抗體，其重鏈超變區(qū)氨基酸序列為 CDRl SYNMH, CDR2 :AIYPENGDTSYNQKFKD 和 CDR3 :WHYYGNGGALDY，輕鏈超變區(qū)氨基酸序列為 CDRl :RASGNIHNYLA ；CDR2 :NAKTLPD 和 CDR3 =QQFffSNPffT ；本發(fā)明提供的抗人⑶20人源化抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO :10， 輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO :12，更具體地，本發(fā)明提供的抗⑶20人源化抗體，其 重鏈氨基酸序列為SEQ ID NO :6，輕鏈氨基酸序列為SEQ ID NO :8。進一步地，本發(fā)明所述的抗人⑶20人源化抗體，由重鏈和輕鏈組成，其中重鏈包 括重鏈可變區(qū)和人免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)或其片段；蛋白輕鏈包括輕鏈可變區(qū)和人免疫球 蛋白輕鏈恒定區(qū)或其片段。人免疫球蛋白恒定區(qū)可以從各種類型的免疫球蛋白中選擇，優(yōu)選的人免疫球蛋白 重鏈恒定區(qū)或其片段為Y型(IgGh)，氨基酸序列如SED ID N0. 2所示；人免疫球蛋白輕鏈 恒定區(qū)或其片段為κ型或λ型，優(yōu)選的人免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SED ID Ν0. 4所示。本發(fā)明的另一目的在于提供編碼上述抗人CD20人源化抗體的核苷酸分子，其中 編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO :9，編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO :11，編碼重鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO :5，編碼輕鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO :7，由 該核苷酸分子轉化的宿主也包含在本發(fā)明中。4
本發(fā)明進一步提供上述抗人CD20的人源化抗體的制備方法，包括通過計算機輔 助設計出人源化抗體hu8E4的氨基酸序列，全基因合成hu8E4的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因并 經基因重組分別與人免疫球蛋白重、輕鏈恒定區(qū)基因拼接，克隆到真核表達載體中，分別構 建人源化抗體的輕、重鏈表達載體，然后將輕、重鏈表達載體用脂質體法共轉染CHO細胞， 然后進行篩選、培養(yǎng)純化即得本發(fā)明的抗人CD20的人源化抗體hu8E4。本發(fā)明利用得到的抗體進行了一系列實驗，體外抗原結合活性測定結果表明 hu8E4都能很好地與高表達⑶20的Burkitt淋巴瘤細胞系Raji特異性結合。競爭抑制實 驗結果表明hu8E4保留了原鼠源抗體的親和力和特異性，體外生物學功能檢測其具有一定 得生物學功能，生存率試驗表明注射hu8E4組的小鼠的生存時間得到顯著延長，hu8E4可用 于治療高表達⑶20的淋巴瘤，更優(yōu)選的，hu8E4可用于非霍奇金氏淋巴瘤的治療。


圖1 :8E4單克隆抗體的分子模擬結構示意圖FR區(qū)殘基用灰色(淺色)條帶表示， ⑶R區(qū)殘基用黑色(深色)條帶表示，11個位于⑶R區(qū)周圍5 A距離內的FR區(qū)殘基用球棒 狀表示；圖2 人源化抗體hu8E4的重鏈(圖2_1)和輕鏈(圖2_2)氨基酸序列與相關序 列的比對圖，其中8E4VH和8E4VL分別表示鼠源單克隆抗體8E4的重鏈和輕鏈的可變區(qū)； 選擇人免疫球蛋白重鏈III亞組的重鏈可變區(qū)和人抗體IgK鏈I亞組的輕鏈可變區(qū)分 別作為人源化抗體hu8E4重鏈和輕鏈的框架區(qū)；hu8E4VHa和hu8E4VHb表示不同的人源化 抗體重鏈可變區(qū)，hu8E4VLa和hu8E4VLb分別表示不同的人源化抗體輕鏈可變區(qū)；破折號 表示與人免疫球蛋白重鏈III亞組或IgK鏈I亞組對應殘基相同的氨基酸，括弧里表示 的是CDR區(qū)；氨基酸的按照Kabat的編號方式進行編號[E. A. Kabat, Τ. T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, C. Foeller,Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth ed. , United States Departmentof Health and Human Services, Bethesda, MD,1991.]；圖3 :8E4的人源化抗體的抗原結合活性實驗結果；圖4:競爭抑制實驗結果；圖5 :CDC實驗結果，圖5-1對Dauli細胞，圖5-2對Raji細胞；圖6 抗體對Dauli和Raji細胞的ADCC作用結果，圖6_1對Dauli細胞，圖6_2對 Raji細胞；圖7 抗體誘導Dauli和Raji細胞凋亡實驗結果，圖7_1對Dauli細胞，圖7_2對 Raji細胞；圖8 雌性BALB/C小鼠的生存率曲線。
具體實施例方式以下實施例僅僅對本發(fā)明進行進一步說明，不應理解為對本發(fā)明的限制Raji (人 B 淋巴瘤細胞，ATCC，CCL-86)pGEM-T載體，美國Promega公司產品pcDNA3. 1 (+)，美國 hvitrogen 公司產品T4DNA連接酶，美國hvitrogen公司產品
pcDNA3. 1/ZE0(+)載體，美國 hvitrogen 公司產品C0S-1 細胞(ATCC CRL 1650)CHO-Kl 細胞(ATCC CRL-9618)pGEM-T easy 載體，Promega 公司產品Human myeloma IgGl, κ , Sigma 公司產品HRP-羊抗人 kappa, Southern Biotechnology Associates 公司產品Human IgG為抗人her2的人源化抗體trastuzumab，Roche公司產品Rituximab，Roche 公司產品Daudi (人 β 淋巴瘤細胞，ATCC, CCL-213)人抗體輕、重鏈恒定區(qū)基因的克隆用淋巴細胞分離液(鼎國生物技術發(fā)展公司產品)分離健康人淋巴細胞，用 Trizol試劑anvitrogen公司產品)提取總RNA，根據文獻(Cell，1980，22 :197-207)和文 獻(Nucleic Acids Research, 1982,10 :4071-4079)報道的序列分別設計引物采用 RT-PCR 反應擴增抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到 pGEM-Τ載體中，測序驗證后確認獲得了正確的克隆。SEQ ID NO=I和SEQ ID NO 2分別顯 示了重鏈恒定區(qū)(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4分別顯 示了輕鏈恒定區(qū)(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正確克隆記作pGEM-T/CH和 pGEM-T/CL。實施例1抗人CD20單克隆抗體8E4的制備-細胞融合雜交瘤制備單克隆抗體用高表達⑶20的Raji細胞免疫BALB/c小鼠(購自購自上海實驗動物中心)，使 其脾臟中的B淋巴細胞能產生抗人CD20的抗體，取免疫后小鼠的脾細胞與NS-I (BALB/c小 鼠骨髓瘤細胞)融合，經HAT選擇性培養(yǎng)，經過培養(yǎng)，篩選出抗人⑶20陽性克隆，再經克隆 化后篩選出亞克隆，以確保抗體是由單個克隆細胞產生，然后收集單個克隆細胞培養(yǎng)上清 經ftOtein G柱純化后，就得到抗人⑶20的單克隆抗體8E4。實施例2嵌合抗體c8E4的構建抗人⑶20單抗8E4可變區(qū)基因的克隆按“Trizol Reagent”試劑盒(美國Gibco BRL公司產品)說明書提取2 X IO6分泌 抗人⑶20單抗的雜交瘤細胞8E4的總RNA。選擇抗體(IgG2a，κ )重鏈和輕鏈恒定區(qū)的適當 位置分別設計3條基因特異性引物GSP1、GSP2、GSP3，其中GSPl距離可變區(qū)基因最遠，用于 逆轉錄反應，GSP2用于首輪PCR擴增，GSP3用于巢式擴增。引物由上海生工生物工程公司合 成，序列如下 GSP1-H，5，-AGC TGG GAA GGT GTG CAC ACC ACT-3，;GSP2_H，5，-CAG AGT TCC AGG TCA AGG TCA-3，；GSP3_H，5，-CTT GAC CAG GCA TCC TAG AGT-3，· GSP1-L，5，-TTG CTG TCC TGA TCA GTC CAA CT-3，；GSP2_L，5，-TGT CGT TCA CTG CCA TCA ATC TT-3，；GSP3-L， 5，-TTG TTC AAG AAG CAC ACG ACT GA-3，.按照 5，RACE 試劑盒(美國 Gibco BRL 公司 產品)說明書以GSPl為引物將總RNA逆轉錄成cDNA，然后給第一鏈cDNA的3’末端加上 poly(C)尾，加尾后用GSP2和AAP為引物進行PCR擴增，將擴增產物稀釋100倍再以AUAP 和GSP3為引物進行巢式PCR擴增。兩次PCR反應均采用熱啟動，反應條件94°C 5分鐘； 940C 45秒，60°C 45秒，72°C 1分10秒，30個循環(huán)；72°C 7分鐘。巢式PCR產物經1 %瓊脂 糖凝膠電泳分離后回收純化目的片斷并克隆到pGEM-T easy載體中，篩選陽性克隆測序，對測序結果進行分析。然后以測序正確的pGEM-T/VH*模板，設計引物正義AAG CTT GCC GCC ACC ATG GGA TGG AGT TGT ATC AT 禾口 H 反義 GCT AGC TGA GGA GAC GGT GAC，采用 Onestep RT-PCR反應擴增VH鏈可變區(qū)基因并使其5'端含有限制酶位點HindIII，3'端含有限制 酶位點 Nhe I，反應條件為50°C 30 分；95°C 15 分鐘；94°C 50 秒，58°C 50 秒，72°C 50 秒，30 個循環(huán)；72°C 10分鐘。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體中，篩選 陽性克隆測序驗證，結果證明該序列與5’ RACE的序列完全一致。本例中的正確克隆記作 pGEM-T/VHo以測序正確的pGEM-T/Vl為模板，設計引物L正義AAG CTT GCC GCC ACC ATG AGT GTG CTC ACT CA 和 L 反義 CCG CTT GAT TTC CAG TTT GGT 采用 Onest印 RT-PCR 反應擴增 VL基因并使其5'端含有限制酶位點HindIII，3'端含有人抗體輕鏈恒定區(qū)5'端的互補 序列，反應條件為94°C 5分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 1分鐘，30個循環(huán)；72°C 10分 鐘。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體中，篩選陽性克隆測序驗證， 結果證明該序列與5’ RACE的序列完全一致。本例中的正確克隆記作pGEM-T/VL。構建嵌合抗體c8E4將上述Onest印RT-PCR測序正確的質粒pGEM_T/VH用Hindi11和Nhe I雙酶切， 經瓊脂糖凝膠電泳純化回收獲得約440bp的酶切片斷，與同酶切的質粒pGEM-T/CH連接，挑 選正確克隆后以HindIII和EcoR I酶切，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收目的片段，與同酶切 的質粒pcDNA3. 1 (+)用T4 DNA連接酶進行連接，構建成真核表達載體pcDNA3. 1 (+) (VHCH)。采用Overlapping PCR將上述Onest印RT-PCR測序正確的克隆pGEM-T/VL直接與 輕鏈恒定區(qū)的正確克隆pGEM-T/CL融合，反應條件為50°C 30分；95°C 15分鐘；94°C 50秒， 580C 50秒，720C 50秒，30個循環(huán)；72°C 10分鐘，得到PCR產物VLCL,其5 ‘端含有限制酶位 點HindIII，3'端含有限制酶位點EcoR I。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到 PGEM-T載體中，篩選陽性克隆測序。將測序正確的VLCL基因用HindIII和EcoR I雙酶消 化從pGEM-T載體中切下，克隆到pcDNA3. 1/ZE0(+)載體中，構建成真核表達載體pcDNA3. 1/ ZEO(+)(VLCL)。于3. 5cm組織培養(yǎng)皿中接種3 X IO5CHO-Kl細胞，細胞培養(yǎng)至90% -95%融合時進 行轉染取質粒 10 μ g (質粒 pcDNA3. 1 (+) (VHCH) 4 μ g，質粒 pcDNA3. 1/ZE0 (+) (VLCL) 6 μ g) 禾口 2μ1 Lipofectamine2000 Reagent (Invitrogen Γ ^a)分別溶于 500μ1 無血清 DMEM培養(yǎng)基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質體復 合物形成，其間用3ml無血清的DMEM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)皿中的含血清培養(yǎng)基，然后將形成的 DNA-脂質體復合物加入到板中，(X)2孵箱培養(yǎng)4小時后補加2ml含10%血清的DMEM完全培 養(yǎng)基，置于(X)2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉染進行24h后細胞換含600 μ g/ml G418和250 μ g/ml Zeocin的選擇培養(yǎng)基篩選抗性克隆。取細胞培養(yǎng)上清用ELISA檢測篩選高表達克隆羊抗 人IgG(Fc)包被于ELISA板，4°C過夜，用2% BSA-PBS于37°C封閉濁，加入待測的抗性克 隆培養(yǎng)上清或標準品(Human myeloma IgGl, κ )，37°C溫育2h，加入HRP-羊抗人IgG( κ ) 進行結合反應，37°C溫育lh，加入TMB于37°C作用5min，最后用H2SO4終止反應，測A45tl值。 將篩選得到的高表達克隆用無血清培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，用I^rotein A親和柱(GE公司產品) 分離純化嵌合抗體c8E4。將純化抗體用PBS進行透析，最后以紫外吸收法定量。實施例3 8E4人源化抗體的構建7
鼠源8E4單抗可變區(qū)(Fv)三維結構的同源模建利用Accelrys公司的hsight II程序包來模擬8E4鼠源單抗可變區(qū)的三維結構。 首先，用BLAST程序在蛋白質結構數據庫(Protein Data Bank, PDB)中分別搜索8E4重鏈 和輕鏈可變區(qū)蛋白的模板蛋白。選取同源性最高的抗體(PDB N0.20SL)和(PDB NO. 1WEJ) 分別作為8E4重鏈和輕鏈的模建模板，同源性分別為84%和94%，利用hsight II程序模 建出8E4的三維結構，如圖1所示。8E4人源化抗體的設計與構建分別選擇人免疫球蛋白重鏈III亞組(heavy chain subgroupIII (humIII))和 IgK鏈I亞組(light chain k subgroup I (humkl))分別作為8E4抗體輕重鏈的人源化模 板.我們首先將8E4的重鏈和輕鏈CDR區(qū)分別直接移植到人源模板人免疫球蛋白重鏈III 亞組和IgK鏈I亞組上，構成CDR移植抗體，重鏈為hu8E4Ha，輕鏈為hu8E4La。hu8E4Ha 和hu8E4La的可變區(qū)氨基酸序列如圖2所示。全基因合成人源化抗體重、輕鏈可變區(qū)基因 (hu8E4VHa和hu8E4VLa)，然后以hu8E4VHa基因和pGEM_T/CH載體為模板通過重疊PCR合 成人源化抗體重鏈基因，反應條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒， 30個循環(huán)；72°C 10分鐘。并使此人源化重鏈基因的5'端含有限制酶位點HindIII和信 號肽基因序列，3'端含有翻譯終止密碼TAA和限制酶位點EcoR I。信號肽基因序列AAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGAGTTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGCGTCCAC TCC。最后瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產物，回收目的條帶并克隆到PGEMT載體中，篩選陽 性克隆測序。挑選測序正確的克隆用HindIII和EcoR I酶切，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收 人源化抗體重鏈片段hu8E4VHaCH，與用HindIII和EcoR I酶切的質粒pcDNA3. 1 (+)進行連 接，構建成人源化重鏈真核表達載體pcDNA3. 1 (+) (hu8E4VHaCH)。以hu8E4VLa基因和pGEM_T/CL載體為模板通過重疊PCR合成人源化抗體輕鏈基 因，反應條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個循環(huán)；72°C 10分 鐘，得到PCR產物hu8E4VLaCL，其5'端含有限制酶位點HindIII和信號肽基因序列，，3' 端含有翻譯終止密碼TAA和限制酶位點EcoR I。信號肽基因序列見AAGCTTGCCGCCACCATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGCGTTGCTGCTGCTGTGGCTTACAGGTGCC AGATGT0挑選測序正確的克隆用HindIII和EcoR I酶切，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收人源 化抗體輕鏈片段hu8E4VLaCL，與用HindIII和EcoR I酶切的質粒pcDNA3. 1/ZE0(+)載體進 行連接，構建成人源化輕鏈真核表達載體pcDNA3. 1/ZE0(+) (hu8E4VLaCL)。于M孔組織培養(yǎng)板中接種0. 8 X IO5/孔的C0S-1細胞，用10% FCS的RPMI1640/ DMEM混合培養(yǎng)基(16/DM培養(yǎng)基)培養(yǎng)至90-95 %融合度時進行轉染取質粒1 μ g(輕鏈 表達載體0. 6yg;重鏈表達載體0. 4yg)和2 μ lLipofectamine2000 Reagent分別溶于 50 μ 1無血清16/DM培養(yǎng)基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使 DNA-脂質體復合物形成，其間用0. 5ml無血清的16/DM培養(yǎng)基替換M孔板中的含血清培 養(yǎng)基，然后將形成的DNA-脂質體復合物加入到孔中，CO2孵箱培養(yǎng)4小時后補加0. 5ml含 20% FCS的16/DM培養(yǎng)基，置于(X)2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，72小時后取培養(yǎng)上清進行分析，采用 ELISA確定培養(yǎng)上清中抗體的含量Goat anti-human IgG(Fc)包被于ELISA板，4°C過夜， 用2% BSA-PBS于37°C封閉2小時，加入待測的培養(yǎng)上清和標準品(Human myeloma IgGl, κ )，37°C孵育2小時，加入HRP-goat anti-human kappa進行結合反應，37°C孵育1小時，加入TMB于37°C作用5分鐘，最后用H2SO4終止反應，測OD45tl值。將人Raji細胞用2% FCS-PBS重懸成1 X 106cellS/ml，分別加入不同稀釋度的轉 染人源化抗體的C0S-1細胞培養(yǎng)上清，表達后置于4°C孵育60min，用2% FCS-PBS洗細胞2 遍，再加入FITC-goat anti-human IgG(H+L)于4°C孵育60min，洗細胞后用FCM分析并計 算細胞的熒光強度。結果發(fā)現與c8E4嵌合抗體相比，hu8E4Ha和huSE4La組成的人源化抗 體(hU8E4Ha/hU8E4La)的活性幾乎完全喪失(圖幻。因此，為了獲得高親和力的人源化抗 體，我們還需對可能影響8E4抗體結合活性的FR區(qū)鼠源殘基進行分析和回復突變。通過分析模建的8E4單抗可變區(qū)的三維結構(圖1)，我們發(fā)現在⑶R區(qū)周圍5 A 的空間范圍內可能影響原抗體CDR構象而又與人源模板中相應位置不同的FR區(qū)殘基有 11 個，分別為 L48Val，L49His, H30Thr, H48Ile, H49Gly, H67Ala, H69Leu, H70Thr, H71Ala, H73Lys和H78Ala。將這些鼠源氨基酸殘基保留在構建的⑶R移植抗體中可得到人源化抗 體(hu8E4Hb/hu8E4Lb)。hu8E4Hb和hu8E4Lb的可變區(qū)氨基酸序列如圖2所示，SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10分別顯示了 hu8E4Hb重鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID N0:11和SEQ ID NO 12分別顯示了 hu8E4Lb輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6分別顯示了 hu8E4Hb的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO 7 和SEQ ID NO 8分別顯示了 hu8E4Lb的核苷酸序列和氨基酸序列。hu8E4Hb的三個⑶R區(qū) 氨基酸序列分別為(可參見圖 2-1 的HU8E4VHb) =HCDRl :SYNMH、HCDR2 :AIYPENGDTSYNQKFKD 和HCDR3 :WHYYGNGGALDY ；hu8E4Lb的三個CDR區(qū)氨基酸序列分別為(可參見圖2_2的 HU8E4VLb) =LCDRl :RASGNIHNYLA ；LCDR2 :NAKTLPD 和 LCDR3 :QQFWSNPWT。采用重疊 PCR 的 方法分別合成人源化抗體重、輕鏈可變區(qū)基因(hu8E4VHb/hu8E4VLb)，并按與人源化抗體 (hu8E4Ha/hu8E4La)相同的方法構建輕鏈表達載體pcDNA3. 1/ZE0(+) (hu8E4VLbCL)和重鏈 表達載體pcDNA3. 1 (+) (hu8E4VHbCH)。然后將輕、重表達載體共轉染C0S-1細胞，用流式細 胞術測定抗體的抗原結合活性，發(fā)現其與Raji的結合活性與8E4嵌合抗體相似，將這個人 源化抗體 0iu8E4Hb/hu8E4Lb)命名為 hu8E4。實施例4人源化抗體的穩(wěn)定表達與純化于3. 5cm組織培養(yǎng)皿中接種3 X IO5CHO-Kl細胞，細胞培養(yǎng)至90% -95%融合時 進行轉染取質粒 10 μ g (質粒 PCDNA3. 1 (+) (hu8E4VHbCH) 4 μ g，質粒 pcDNA3. 1/ZE0 (+) (hu8E4VLbCL) 6 μ g)禾口 2 μ lLipofectamine2000 Reagent (Invitrogen ^^Γ^α )分另O溶于 500 μ 1無血清DMEM培養(yǎng)基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使 DNA-脂質體復合物形成，其間用3ml無血清的DMEM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)皿中的含血清培養(yǎng)基， 然后將形成的DNA-脂質體復合物加入到板中，(X)2孵箱培養(yǎng)4小時后補加2ml含10%血清 的DMEM完全培養(yǎng)基，置于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉染進行24h后細胞換含600yg/ml G418 和250 μ g/ml Zeocin的選擇培養(yǎng)基篩選抗性克隆。取細胞培養(yǎng)上清用ELISA檢測篩選高 表達克隆羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4°C過夜，用2% BSA-PBS于37°C封閉濁，加入 待測的抗性克隆培養(yǎng)上清或標準品(Human myeloma IgGl, κ )，37°C溫育濁，加入HRP-羊 抗人kappa進行結合反應，37°C溫育lh，加入TMB于37°C作用5min，最后用H2SO4終止反應， 測A450值。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，用ftOtein A親和柱(GE 公司產品)分離純化人源化抗體hu8E4。將純化抗體用PBS進行透析，最后以紫外吸收法定 量。
實施例5競爭抑制實驗用透析標記法標記抗體用0. 025M pH9. 5的碳酸鹽緩沖液將預標記的抗體8E4稀 釋成濃度，裝入透析袋中。用同一緩沖液將FITC配成0. lmg/ml的溶液盛于小燒杯中， 使透析袋浸沒于FITC溶液中，在4°C避光攪拌Mh。取出透析袋中標記液，用kphadex G-50 過柱，去除游離熒光素，收集熒光抗體FITC-8E4備用。將固定的亞飽和濃度的熒光標記抗 體FITC-8E4和系列稀釋的未標記純化抗體分別混合后加入到靶細胞Raja (1 X 106/ml)中， 4°C孵育60min，FCS-PBS洗細胞2遍，流式細胞儀檢測并用Cellquest軟件分析。Human IgG作為對照。競爭抗體的每個濃度設3個復管，計算半數抑制濃度IC5tl值，最大熒光強度 表示在沒有競爭抗體時獲得的平均熒光強度。實驗結果見圖4，結果表明抗體hu8E4能完全阻斷熒光標記抗體FITC-8E4與Raja 細胞的結合，它們的IC5tl值接近，表明人源化抗體具有與原鼠源抗體相似的特異性和親和 力(競爭抑制分析結果見表1)。表1.競爭抑制分析結果抗體類型IC5(^g/ml)aSDη8Ε41.300.153c8E41.160.113hu8E41.360.173實施例6補體介導的細胞殺傷(⑶C)實驗收集細胞后用無酚紅RPMI 1640培養(yǎng)液洗兩遍，重懸于無酚紅RPMI 1640培養(yǎng)液， 調整細胞密度至IX 106/ml，按100 μ 1/孔將細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板。用無酚紅 RPMI 1640 培養(yǎng)液將 rituximab 和 c8E4，hu8E4 分別稀釋至 100 μ g/ml、20 μ g/ml、4 μ g/ml、 0.8yg/ml和0. 16 μ g/ml, 1 % Triton-X 100作為陽性對照，human IgG作為無關抗體對照， PBS作為陰性對照，空白培養(yǎng)液作為空白對照。然后將稀釋好的抗體樣品及對照加入上述 96孔細胞培養(yǎng)板，20μ 1/孔，同時按50μ 1/ml細胞懸液的比例加入新鮮人血清，補充無酚 紅RPMI1640培養(yǎng)液至總體積200 μ 1/孔。以上每組各設3個復孔，C02培養(yǎng)箱作用4小時。 4小時后將96孔細胞培養(yǎng)板200g離心5分鐘，每孔吸取50 μ 1上清至另一 96孔板相應孔 中。按照!Iomega公司CytoTox 96 非同位素法細胞殺傷檢測試劑盒中的方法加入混合好 的顯色液50 μ 1//孔至96孔板中，室溫，避光作用30分鐘。酶標儀讀490nm的光吸收值。實驗結果見圖5，試驗結果表明在CD20高表達的細胞株Daudi (ATCC)和Raji中， c8E4和hu8E4已具有很強的⑶C活性，在10 μ g/ml的濃度時殺傷強度最強，c8E4和hu8E4 的CDC作用均強于Rituximab ；而對照抗體human IgG不能誘導Dauli細胞的CDC作用。實施例7抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)實驗外周血單個核細胞(PBMC)的分離無菌采集靜脈血，注入含有肝素20U/ml的離心管中，輕輕混勻。在生物安全柜中 用無菌吸管加入等體積PBS溶液，使血液稀釋以提高分離效果。取15ml離心管，每管加入 6ml室溫的淋巴細胞分離液，傾斜離心管，沿管壁緩慢加入稀釋后的抗凝外周血6ml/管。動10作輕柔，以防破壞界面。20°C，800g離心30min。將剎車關閉，自然降速。管內分為三層，從 上至下依次為血漿層、細胞分離液、紅細胞及粒細胞層。血漿層與細胞分離液交界處毛玻璃 樣的白色層即為淋巴細胞及單核細胞層。用吸管輕輕插入毛玻璃樣層，緩慢吸出外周血單 個核細胞，放入另一 15ml離心管中。在吸出的細胞中加入PBS稀釋后離心，200g,離心5min， 共洗2遍。用無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)液調整細胞密度為6X 106/ml，懸于15ml離心管中，加 入160U/ml的IL-2預激活，置于37°C，5% C02細胞培養(yǎng)箱備用。靶細胞懸液的準備對數生長期的細胞懸液吸至15ml離心管中，200g，離心5min，棄去上清，用PBS洗 2遍，無酚紅的RPMI-1640重懸細胞，計數，調整細胞密度為3 X 105/ml備用。細胞與抗體的作用設定培養(yǎng)基背景孔、效應細胞+靶細胞自發(fā)釋放值孔、效應細胞+靶細胞最大釋 放值孔及實驗孔，每種情況都設3個平行孔，用無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基將c8E4，hu8E4稀 釋至濃度分別為100μ g/ml、20y g/ml、4y g/ml、0. 8μ g/ml和0. 16 μ g/ml，每管加入調整 好細胞密度的靶細胞，4°C作用30min后，200g離心5min，PBS洗2遍，懸于300 μ 1無酚紅 RPMI1640培養(yǎng)液，將上述與抗體作用后的細胞懸液加入96孔板中，100 μ 1/孔，加入效應細 胞IOOyl/孔，以40 1的效、靶比加入96孔板中，37°C，5%C02細胞培養(yǎng)箱12h 24h 后顯色。顯色、讀數將96孔板20(^離心51^11后，每孔吸取5(^1上清至另一 96孔板相應孔中，根據 Promega公司CytoTox 96 非同位素法細胞殺傷檢測試劑盒中的方法加入混合好的顯色液 50 μ 1//孔至96孔板中，室溫，避光作用30min，酶標儀讀490nm的光吸收值。實驗結果見圖6，試驗結果表明，c8E4和hu8E4在低濃度時的作用時不明顯，在 10 μ g/ml的濃度時能引起明顯的ADCC作用，c8E4和hu8E4的ADCC作用與Rituximab相比 無明顯差別.而對照抗體human IgG不能誘導Raji的ADCC作用。
實施例8細胞凋亡實驗在96孔培養(yǎng)板中加入數目相等的細胞，5X IO5/孔，將抗體分別以10 μ g/ml、 2 μ g/ml、0. 4 μ g/ml和0. 08 μ g/ml的終濃度加至相應細胞孔中，37°C作用18 24h后，加 入5μ1 Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫，避光反應15min，PBS重懸后上機，流式細胞儀檢 測分析染色情況。陰性對照為PBS，無關抗體對照為Human IgG。實驗結果見圖7，試驗結 果表明，c8E4和hu8E4在低濃度時的作用時不明顯，在10 μ g/ml的濃度時能引起一定量的 細胞凋亡，c8E4和hu8E4的凋亡作用與Rituximab相比無明顯差別，而對照抗體human IgG 不能誘導Dauli細胞凋亡。實施例9生存率實驗用3. 5X IO6Raji細胞尾靜脈注射免疫8_10周齡雌性BALB/C小鼠，接種腫瘤細胞 五天后，注射100 μ g相關抗體(C8E4、Rituximab、Human IgG和hu8E4)抗體，每天觀察小鼠 的存活狀態(tài)。實驗結果見圖8，試驗結果表明在同等劑量下，與注射Rituximab的小鼠相比，注 射抗體c8E4和hu8E4組小鼠的生存時間得到了顯著延長(P < 0. 05)。序列表
<110>上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司<120>抗人⑶20人源化抗體、其制備方法及用途<130>human antimouse antibody response (HAMA) [Winter G, Harris WJ. Humanized antibodies. Immunol Today. 1993 Jun ； 14 (6) :243-6]0090]<160>120091]<170>PatentIn version3. 20092]<210>10093]<211>9900094]<212>DNA0095]<213>人抗體重鏈恒定區(qū)(CH)的核苷酸序列0096]<400>10097]gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg600098]ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg1200099]tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca1800100]ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc2400101]tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagccc3000102]aaatcttgtg￡lC￡l￡l￡l￡lCtC￡lcacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggggga3600103]ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccct4200104]gaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactgg4800105]tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaagagcagtacaac5400106]agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaag6000107]gagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc6600108]aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgag7200109]ctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatc7800110]gccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg8400111]ctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg9000112]cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg9600113]cagaagagcctctccctgtctcccggtaaa9900114]<210>20115]<211>3300116]<212>PRT0117]<213>人抗體重鏈恒定區(qū)(CH)的氨基酸序列0118]<400>20119]Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser ValPhe Pro Leu Ala ProSer Ser Lys0120]1510150121]Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala AlaLeu Gly Cys Leu Val」ys Asp Tyr0122]2025300123]Phe Pro Glu Pro Val Thr Val SerTrp Asn Ser Gly Ala」eu Thr Ser0124]354045
GlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSer505560LeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThr65707580TyrlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLys859095LysValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys100105110ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro115120125LysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCys130135140ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp145150155160TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu165170175GluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu180185190HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn195200205LysAlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGly210215220GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgAspGlu225230235240LeuThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr245250255ProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn260265270AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe275280285LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn290295300ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr305310315320GlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys325330<210>3<211>318<212>DNA0164]<213>人抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)的核苷酸序列0165]<400>30166]actgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagtt gaaatctgga600167]actgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaa agtacagtgg1200168]aaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacaga gcaggacagc1800169]aaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga ctacgagaaa2400170]cacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgt cacaaagagc3000171]ttcaacaggggagagtgt3180172]0173]0174]0175]0176]0177]0178]0179]0180] 0181] 0182]0183]0184]0185]0186]0187]0188]0189]0190]0191]0192]0193]0194]0195]0196]0197]0198]0199]0200] 0201] 0202]<210>4<211>106<212>PRT<213>人抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)的氨基酸序列 <400>4Val Ala Ala Pro Ser Val Phe IleThr 1Leu LysPro ArgGly Asn50 Tyr Ser 65 HisSer Gly 20 Ala5Thr Ala Ser ValGlu35SerLys Val GlnGln Glu SerVal55LeuTrp40ThrVal25LysPhe 10 CysPro Pro Ser AspGlu15PheGlnTyrVal Asp Asn Glu Gln AspLeu Leu Asn Asn 30Leu Gln SerThr Leu SerLeu Ser Ser Thr 70Cys Glu Val ThrLys Val Tyr Ala 85Phe Asn Arg GlyVal Thr LysSer 100Glu 105His90CysLys75GlnSer 60 AlaAla 45Lys Asp Ser Thr Asp Tyr GluGly Leu SerSer 95Lys80Pro<210>5<211>1353<212>DNA<213>人源化抗體h8E4重鏈核苷酸序列 <400>5gaggtccagc tggtcgagtc aggaggagga ctggtccagc tcgtgtgctg ccagtggatt cactttcacc agttacaata cccggaaagg gactggagtg gattggggcc atttacccag aaccagaagt ttaaggatag ggccaccctc acagccgata ctccagatga acagcctccg tgccgaagat acagcagtgt tactacggga acgggggggc actggattac tgggggcaag agtgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcacccggaggatc gctgaggctg tgcactgggt gaggcaggcc agaacgggga caccagctac aaagcaaaaa cacagcctac actactgtgc acgttggcac ggacgctggt gacggtgagc cctcctccaa gagcacctct60 120 180 240 300 360 420
權利要求
1.一種抗人⑶20人源化抗體，其重鏈超變區(qū)氨基酸序列為⑶Rl =SYNMH,⑶R2 AIYPENGDTSYNQKFKD 和 CDR3 :WHYYGNGGALDY，輕鏈超變區(qū)氨基酸序列為 CDRl :RASGNIHNYLA ； CDR2 NAKTLPD 和 CDR3 :QQFWSNPWT。
2.權利要求1所述的抗人⑶20人源化抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQID NO 10，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID N0:12。
3.權利要求2所述的抗人⑶20人源化抗體，其重鏈氨基酸序列為SEQID N0:6，輕鏈 氨基酸序列為SEQ ID NO :8ο
4.一種核苷酸分子，編碼權利要求1 3任一所述的抗人CD20人源化抗體。
5.權利要求4所述的核苷酸分子，其中編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQID NO :9， 編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列為SEQ ID NO=Il0
6.權利要求5所述的核苷酸分子，其中編碼重鏈的核苷酸序列為SEQID Ν0:5，編碼輕 鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO :7。
7.權利要求1 3任一所述的抗人CD20的人源化抗體的制備方法，包括通過計算機輔 助設計出人源化抗體的氨基酸序列，全基因合成的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因并經基因重組分 別與人免疫球蛋白重、輕鏈恒定區(qū)基因拼接，克隆到真核表達載體中，分別構建人源化抗體 的輕、重鏈表達載體，然后將輕、重鏈表達載體用脂質體法共轉染CHO細胞，然后進行篩選、 培養(yǎng)純化即得。
8.權利要求1 3任一所述的抗人⑶20的人源化抗體在制備治療高表達⑶20的淋巴 瘤藥物中的用途。
9.權利要求8所述的用途，其中高表達⑶20的淋巴瘤為非霍奇金氏淋巴瘤。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術領域，更具體地，本發(fā)明公開了一種抗人CD20人源化抗體hu8E4、其制備方法及用途，其中，本發(fā)明公開的抗人CD20人源化抗體hu8E4重鏈超變區(qū)氨基酸序列為CDR1SYNMH、CDR2AIYPENGDTSYNQKFKD和CDR3WHYYGNGGALDY，輕鏈超變區(qū)氨基酸序列為CDR1RASGNIHNYLA；CDR2NAKTLPD和CDR3QQFWSNPWT；本發(fā)明公開的抗人CD20人源化抗體hu8E4保留了原鼠源抗體的親和力和特異性，并具有一定的生物學功能，可用于制備治療高表達CD20的淋巴瘤藥物。
文檔編號C07K16/28GK102050877SQ200910207820
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權日2009年10月30日
發(fā)明者張大鵬, 張彥, 李博華, 李彩輝, 郭亞軍 申請人:上?？贵w藥物國家工程研究中心有限公司