專利名稱：：一種蒽醌類化合物及其賴氨酸鹽的制備方法及醫(yī)藥用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種蒽醌類化合物楸皮酸及其衍生物賴氨楸皮酸，同時還公開了它們的制備方法，以及它們的醫(yī)學用途，屬于中藥新藥研發(fā)領域。
背景技術：
：惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病。目前藥物治療仍然是癌癥的主要治療方法之一，但現(xiàn)有的化療藥物由于存在耐藥性和毒副作用等諸多問題，致使癌癥藥物治療的效果并不理想，因此尋找高效、低毒的抗癌藥物成為人們關注的焦點。近幾十年來，從天然產物中尋找理想的抗腫瘤藥物或藥物前體已成為研究的熱點，并且很多來源于天然產物的腫瘤治療藥物已經上市。核桃楸(JuglansmandshuricaMaxim)，又名胡桃楸、楸子樹、山核桃(東北)，為胡桃科胡桃屬植物，是我國重要的藥源植物之一，多年來在中國、韓國的民間用于治療癌癥。本發(fā)明涉及的蒽醌類化合物一l，5-二羥基-3-羧基-9，10-蒽醌(以下稱為楸皮酸)，是采用活性追蹤分離的方法，從核桃楸中分離得到的化合物，此化合物為首次從天然植物中提取出來的化合物，我們的研究結果顯示，此化合物具有較好的抗腫瘤活性。楸皮酸為含有一個游離羧基的芳香類化合物，水溶性不是很好，導致藥品的生物利用度低，為增加楸皮酸的水溶性，提高其生物利用度，本發(fā)明制備了水溶性更好的楸皮酸的賴氨酸鹽，即賴氨楸皮酸。我們進一步的研究結果表明，賴氨楸皮酸亦具有較好的抗腫瘤活性。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的之一是提供一種通式為(1)的化合物楸皮酸及其衍生物賴氨楸皮酸。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式(1)其中R可為COOH，亦可為COO—+NH3(CH2)4CH(NH2)C00H當R為C00H時，此化合物為楸皮酸，其結構式如式(2)所示OOH所述化合物為粉末狀物質，分子式為(:1511806，分子量為284，為新的天然化合物。當R為COO—+NH3(CH2)4CH(NH2)C00H時，此化合物為賴氨楸皮酸，其結構式如式(3)所示》OOH所述化合物為一種結晶狀物質，分子式為(:211122^08，分子量為430，系楸皮酸的羧基與賴氨酸的氨基結合形成的穩(wěn)定鹽的結構，是一種新的化合物。本發(fā)明的目的之二是提供一種提取純化楸皮酸的方法。其主要技術特征如下(a)取核桃楸(JuglansMandshuricaMaxim.)莖皮、枝葉、花、果實、根或根皮的干燥粗粉；(b)用所取原料質量的8-10倍的濃度為1095%(V/V)醇溶液連續(xù)回流提取24次，每次2-4小時，合并提取液，減壓濃縮得黑色浸膏；(c)將浸膏懸浮于去離子水中得混懸液，將該混懸液依次用等體積的石油醚、氯仿各萃取3-5次，分別合并各萃取層，減壓濃縮。將所得氯仿萃取物再經過減壓硅膠柱層析，反復重結晶得到楸皮酸。所得產品通過核磁共振等方法進行結構鑒定。本發(fā)明的目的之三是提供一種制備新化合物賴氨楸皮酸的方法，其特征在于(a)向反應容器中加入楸皮酸和賴氨酸，楸皮酸與賴氨酸的摩爾比控制在1:(25);(b)再向容器中加入質量為楸皮酸100300倍的水，攪拌反應，至反應液變?yōu)槌吻逋该鞯囊后w；反應溫度控制在204(TC之間，反應時間在360小時范圍內；(c)反應完畢后將反應容器置入冰水混合物中，邊攪拌邊向反應液中緩慢滴加無水乙醇或丙酮，滴加時間控制在3070分鐘，直至溶液出現(xiàn)紫紅色晶體，停止加入無水乙醇或丙酮以使反應液析出晶體，最終加入的析晶溶液無水乙醇或丙酮的體積為整個反應體系的6090%;(d)將反應容器置入-80Ot:冰箱中1248小時析出晶體，并用無水乙醇或丙酮洗滌晶體數(shù)次，直至洗液無色，干燥，保存。所得產物通過核磁共振等方法進行結構鑒定。采用本發(fā)明合成出的賴氨楸皮酸純度高，水溶性好，在水中的溶解度為1.39g，而楸皮酸微溶于水；另外賴氨楸皮酸的晶體穩(wěn)定性好，不加任何穩(wěn)定劑就可以達到作為商品使用和儲存的要求。本發(fā)明的目的之四是提供一種通式為(I)的化合物及其衍生物在制備藥物方面的用途，尤其是在制備抗腫瘤藥物方面的用途。本發(fā)明的楸皮酸及賴氨楸皮酸在腫瘤治療中的用途是通過以下方式證明的1.楸皮酸的體外抗腫瘤活性研究采用MTT方法進行楸皮酸的體外抗腫瘤活性研究。分別各腫瘤細胞于96孔板中，細胞密度為5Xl()4個/ml;次日加入楸皮酸，濃度分別為lOOiig/ml、10iig/ml、liig/ml藥物用匿SO進行稀釋，同時設匿SO對照組，每組設3復孔，給藥容積為100ii1/孔；細胞在含5%C02的37。C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)44h后，每孔加20y1MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h;吸棄上清，每孔加入100ii1DMS0，在酶標儀上，振動600s，檢測570nm處的0D值；獨立實驗重復三次以上。結果顯示，本發(fā)明所提到的楸皮酸對多種腫瘤細胞株，包括人肝癌細胞H印G2、人肝癌耐藥細胞(H印G2/A匿)、人白血病細胞K562、人結腸癌細胞HCT-8細胞、人乳腺癌細胞MCF-7、人肺癌細胞A549、人胃癌細胞SGC7901、宮頸癌Hela和前列腺癌PC-3均有不同程度的增殖抑制作用，在楸皮酸為10i!g/ml時對人肝癌細胞(H印G2)、人肝癌耐藥細胞(H印G2/ADM)、人結腸癌細胞(HCT-8)、人肺癌細胞(A549)的抑制率均達到50%以上，而在此濃度下對正常細胞L02的影響較小，表明楸皮酸在一定安全范圍內，對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞有增殖抑制作用，結果見表l。表1楸皮酸對實驗用腫瘤細胞的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>1057.55±5.212.8±3.9HCT-810091.21074.7111.6A54910088.71059.516.4K56210085.5±8.061029.65±12.7917.25±5.7MCF-710083.1±7.011030.5±5.2318.2±4.21SGC7卯110090.2±10.311040.3±6.34115.3±2.41Hela10081.3±10.311038.1±7.21118.1±1.28PC-310079.2±9.311037.6±6.47114.2±4.21L0210040.8±1.481017.7±10.812.8±0.28&賴氨楸皮酸的體外抗腫瘤活性研究采用MTT方法進行體外抗腫瘤活性研究。分別各腫瘤細胞于96孔板中，細胞密度為5Xl()4個/ml;次日加入賴氨楸皮酸，濃度分別為lOOiig/ml、10iig/ml、liig/ml藥物用匿SO進行稀釋，同時設匿SO對照組，每組設3復孔，給藥容積為1001/孔；細胞在含5%C02的37。C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)44h后，每孔加20y1MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h;吸棄上清，每孔加入100ii1DMSO，在酶標儀上，振動600s，檢測570nm處的OD值；獨立實驗重復三次以上。結果顯示，本發(fā)明所提到的賴氨楸皮酸對多種腫瘤細胞株，包括人肝癌細胞H印G2、人肝癌耐藥細胞(H印G2/A匿)、人白血病細胞K562、人結腸癌細胞HCT-8細胞、人乳腺癌細胞MCF-7、人肺癌細胞A549、人胃癌細胞SGC7901、宮頸癌Hela和前列腺癌PC_3均有不同程度的增殖抑制作用。在賴氨楸皮酸為lOyg/ml時，對人肝癌細胞(H印G2)、人肝癌耐藥細胞(H印G2/ADM)、人結腸癌細胞(HCT-8)、人肺癌細胞(A549)的抑制率略優(yōu)于楸皮酸，而對正常細胞L02的影響較小，表明賴氨楸皮酸在一定安全范圍內，對體外培養(yǎng)的腫瘤細胞有增殖抑制作用。賴氨楸皮酸在高、中、低三個濃度下對H印G2、H印G2/ADM、HCT_8、A549、K562及L02的抑制率見表2.表2賴氨楸皮酸對實驗用腫瘤細胞的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.楸皮酸及賴氨楸皮酸的體內抗腫瘤活性研究將5X106個腫瘤細胞接種于BALB/c(皿/皿)裸鼠背部皮下。于腫瘤接種后10天開始靜脈注射楸皮酸或賴氨楸皮酸0.3mg/kg/天，共注射15天，對照組則注射等體積的生理鹽水。30天后處死動物，剝取腫瘤稱重，計算抑瘤率，抑瘤率(％)=[腫瘤對照組平均瘤重-治療組平均瘤重]/腫瘤對照組平均瘤重X100%。結果顯示，注射楸皮酸及賴氨楸皮酸均具有明顯的體內抑瘤作用。表3.楸皮酸對H印G2移植瘤生長的影響_分組動物數(shù)體重(克)對照組1221.1±1.5楸皮酸組1220.8±2.18瘤重(克)抑瘤率(％)P值1.5±0.2賴氨楸皮酸組1221.3±1.70.5±0.166.67<0.01_表4.楸皮酸對H印G2/ADM移植瘤生長的影響_分組對照組楸皮酸組賴氨楸皮酸組_表5.楸皮酸對HCT-8移植瘤生長的影響_分組對照組楸皮酸組賴氨楸皮酸組_表6.楸皮酸對A549移植瘤生長的影響_分組對照組楸皮酸組賴氨楸皮酸組_表7.楸皮酸對K562荷瘤鼠生存期的影響_分組對照組楸皮酸組賴氨楸皮酸組_表8.楸皮酸對MCF-7移植瘤生長的影響_分組對照組楸皮酸組賴氨楸皮酸組_表9.楸皮酸對SGC7901移植瘤生長的影響分組動物數(shù)體重(克)瘤重(克)抑瘤率(％)P值動物數(shù)體重(克)瘤重(克)抑瘤率(％)P值1220.2±1.11.6±0.11219.5±1.80.8±0.350.00<0.011221.3±1.30.6±0.162.50<0.01動物數(shù)體重(克)1220.4±1.11220.6±1.41221.4±1.3瘤重(克)抑瘤率2.3±0.2l.O士O.l56.520.9±0.360.87P值<0.01<0.01動物數(shù)體重(克)瘤重(克)抑瘤率(％)p值1220.2±1.31.9±0.21221.1±1.11.1±0.142.10<0.011221.4±1.30.9±0.152.10<0.01動物數(shù)平均生存時期(天)生命延長率(％)P值126.2±2.11210.5±2.269.35<0.011212.1±1.395.16<0.01動物數(shù)121212體重(克)20.1±1.519.9±1.221.3±1.3瘤重(克)抑瘤率1.9±0.21.3±0.131.581.2±0.336.84P值<0.01<0.019對照組1220.1±1.21.8±0.2楸皮酸組1221.1±2.11.2±0.133.33<0.01賴氨楸皮酸組1220.8±1.51.1±0.238.89<0.01表IO.楸皮酸對Hela移植瘤生長的影響分組動物數(shù)體重(克)瘤重(克)抑瘤率(%)p值對照組1220.5±1.22.2±0.2楸皮酸組1221.1±1.31.4±0.136.36<0.01賴氨楸皮酸組1220.8±1.11.3±0.340.90<0.01表11.楸皮酸對PC3移植瘤生長的影響分組動物數(shù)體重(克)瘤重(克)抑瘤率(%)p值對照組1221.l士l.O1.8±0.2楸皮酸組1220.4±1.31.2±0.133.33<0.01賴氨楸皮酸組1221.3±1.11.1±0.338.89<0.01本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果在于從天然植物中首次分離得到一種蒽醌類化合物一楸皮酸，并發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤活性。我們進一步將其衍生化得到新化合物賴氨楸皮酸，更好地改善了化合物的水溶性，增加其生物利用度，以使其充分發(fā)揮抗腫瘤作用。另外賴氨楸皮酸的制備工藝簡單，成本廉價，符合環(huán)保要求，利于批量生產，從而為進一步開發(fā)利用提供了良好條件。藥物組合物和治療方法藥物組合物以及治療腫瘤的方法亦在本發(fā)明的范圍之內。所述藥物組合物包括治療有效量的本發(fā)明的楸皮酸及賴氨楸皮酸以及可藥用載體。"可藥用載體"包括溶劑、分散劑(dispersionmedium)、包衣(acoating)、抗細菌和抗真菌劑以及等張劑(isotonicagent)、吸收延遲劑(absorptiondelayingagent)禾口吸收促進劑等。本發(fā)明的藥物組合物可通過傳統(tǒng)方法制成各種適應于不同給藥途徑的藥物劑型。例如，它可制成口服的膠囊、gelseal或片劑。膠囊劑可包含任何標準的可藥用物質如明膠、纖維素等。片劑可按傳統(tǒng)方法即將藥物組合物與固相載體以及潤滑劑壓縮制得。所述固相載體包括淀粉和糖斑脫土(sugarbentonite)。本發(fā)明的藥物組合物還可制成硬殼片劑(hardshelltablet)或包含捆綁劑(binder)如乳糖或甘露醇、常規(guī)填充劑以及tabletingagent的膠囊。本發(fā)明的藥物組合物還可通過非腸道途徑給藥。非腸道途徑給藥劑型包括本發(fā)明的藥物組合物的水劑、等張鹽溶液或5%的糖溶液以及與其他本領域公知的可藥用賦形劑形成的制劑。環(huán)式糊精或其他本領域技術人員所公知的促溶劑均可作為藥用賦形劑來遞呈本發(fā)明的藥物組合物。概括地講，本發(fā)明的楸皮酸及賴氨楸皮酸可懸溶于可藥用載體(如生理溶液)中，通過口服或靜脈輸液，或通過皮下、肌內、胸腔內、腹腔內、直腸內、陰道內、鼻內、胃內、氣道10內、肺內注射或輸液及氣霧吸入、噴霧吸入、滴入及灌注等途徑給藥。劑型的選擇受到給藥途徑、制劑類型、患者(病種、病情、體形、體重、體表面積、年齡、性別)、藥物相互影響以及收治醫(yī)師的診斷等諸多因素的影響。適用的制劑用量范圍為0.01100.00mg/kg。用量范圍可隨病人情況與給藥途徑的不同而做相應的調整。其將主要取決于收治醫(yī)師的診斷。例如，口服劑量一般要高于靜脈注射劑量。所述劑量可通過本領域公知的經驗優(yōu)化方法進行調整。將本發(fā)明的藥物組合物包裹于適宜的藥物遞呈載體(如聚合微粒體或輸入設備)可提高給藥，特別是口服給藥的效率。本發(fā)明的藥物組合物的活性可通過體外(invitro)和體內(invivo)實驗進行評價。簡而言之，本發(fā)明的藥物組合物的藥理活性反映在抗腫瘤活性上。在體內實驗中，所述藥物組合物被注射入動物(如小鼠模型)體內以評價其藥理活性。在此基礎上，合適的劑量范圍和給藥途徑遂得以確定。為了便于理解本發(fā)明，特列舉以下實施例。其作用應被理解為是對本發(fā)明的闡釋而非對本發(fā)明的任何形式的限制。具體實施例方式以下實施例僅為幫助本領域技術人員更好的理解本發(fā)明，但不要以任何方式限制本發(fā)明。實施例1楸皮酸的制備取核桃楸莖皮干燥粗粉5kg，用體積分數(shù)為30%的乙醇溶液連續(xù)回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓濃縮得黑色浸膏，再將其懸浮于去離子水中得2L混懸液，將該混懸液依次用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，分別合并各萃取層，減壓濃縮。取氯仿萃取物(54g)進行減壓硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫得到I-III3個流份，流份II(PetroleumEther:EtOAc/70:30)中析出黃綠色無定形粉末，于甲醇中重結晶得到楸皮酸，其結構鑒定數(shù)據見表12。表12實施例1所得楸皮酸的紫外，紅外，質譜及核磁數(shù)據<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>向反應瓶中加入20mg楸皮酸(取自實施例1)和32mg賴氨酸(購自北京市慶盛達化工技術有限公司)，再加入5ml雙蒸水，攪拌反應20小時，溫度控制在3(TC，最終反應液變?yōu)槌吻逋该鞯囊后w。之后將反應瓶放入冰浴中，邊攪拌邊向反應液中緩慢滴加無水乙醇，大約6滴/分鐘，同時觀察反應液的變化，待溶液中有紫紅色結晶出現(xiàn)時停止加入無水乙醇，此時共加入無水乙醇15.8ml，加入時間30分鐘，然后把反應瓶放入4t:冰箱中過夜，次日觀察到瓶壁上析出了一層紫紅色晶體，將反應液倒在一個燒杯中備用，之后將反應容器真空干燥，用刮刀刮下結晶，并用無水乙醇洗滌3次，每次采用離心的方式除去洗液，洗滌三次后，洗液近乎無色。將產物在干燥器中干燥過夜，稱重得產物5.7mg，在干燥器中保存?zhèn)溆谩Ｈ缓髮⒈Ａ舻姆磻悍湃?2(TC冰箱中過夜，次日同樣出現(xiàn)紫紅色結晶，按照上述分離純化的方法得產物2.5mg。之后再將反應液放入_401:冰箱中過夜，同法處理得產物1.9mg。前后共得到產物10.lmg，產率為33.4%，該實施例得到的賴氨楸皮酸的結構鑒定數(shù)據見表14。表14實施例3所得賴氨楸皮酸的紫外，紅外，質譜及核磁數(shù)據<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>楸皮酸的體外抗腫瘤實驗采用MTT方法進行體外抗腫瘤實驗。分別各腫瘤細胞于96孔板中，細胞密度為5X104個/ml;次日加入楸皮酸，濃度分別為100iig/ml、10yg/ml、1yg/ml藥物用DMSO進行稀釋，同時設匿SO對照組，每組設3復孔，給藥容積為1001/孔；細胞在含5%C02的37t:培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)44h后，每孔加20iaMTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h;吸棄上清，每孔加入100illDMS0，在酶標儀上，振動600s，檢測570nm處的0D值；獨立實驗重復三次以上，結果見表1。實驗例2賴氨楸皮酸的體外抗腫瘤實驗采用MTT方法進行體外抗腫瘤實驗。分別各腫瘤細胞于96孔板中，細胞密度為5Xl()4個/ml;次日加入賴氨楸皮酸，濃度分別為100iig/ml、10iig/ml、liig/ml藥物用匿SO進行稀釋，同時設匿SO對照組，每組設3復孔，給藥容積為100ii1/孔；細胞在含5%C02的37。C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)44h后，每孔加20y1MTT(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h;吸棄上清，每孔加入100ii1DMSO，在酶標儀上，振動600s，檢測570nm處的OD值；獨立實驗重復三次以上，結果見表2.實驗例3楸皮酸及賴氨楸皮酸的體內抗腫瘤實驗取36只雄性BALB/c(皿/皿)裸鼠，平均分為3組，每組12只。將5X106個腫瘤細胞接種于裸鼠背部皮下。于腫瘤接種后10天開始靜脈注射楸皮酸或賴氨楸皮酸0.3mg/kg/天，共注射15天，對照組則注射等體積的生理鹽水。30天后處死動物，剝取腫瘤稱重，計算抑瘤率，抑瘤率(％)=(腫瘤對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/腫瘤對照組平均瘤重X100，結果見表3-11。權利要求一種蒽醌類化合物楸皮酸及其結構修飾物賴氨楸皮酸，其結構通式如式(1)所示；其中R為COOH，則此化合物為楸皮酸，其結構如式(2)所示；或R為COO-+NH3(CH2)4CH(NH2)COOH，則此新化合物為賴氨楸皮酸，其化學結構如式(3)所示FSA00000015453100011.tif,FSA00000015453100012.tif,FSA00000015453100013.tif2.制備權利要求1所述的楸皮酸的方法，其特征在于(a)以核桃楸的莖皮、枝葉、花、果實、根或根皮為原料；(b)用8-10倍量的1095%(V/V)醇-水溶劑連續(xù)回流提取3-4次；(c)所得浸膏通過石油醚、氯仿分步萃取后，所得氯仿萃取部分再經硅膠減壓柱層析，反復重結晶的方法得到化合物。3.制備權利要求1所述的賴氨楸皮酸的方法，其特征在于(a)將楸皮酸與賴氨酸按摩爾比1:21:5的比例在容器中混合；(b)向反應容器中加入質量為楸皮酸100300倍的水，反應溫度控制在2040°C，反應時間360小時；(c)將反應容器放入冰水混合物中攪拌，緩慢滴加無水乙醇或丙酮，滴加時間控制在3070分鐘，最終使無水乙醇或丙酮的體積分數(shù)為整個反應體系的6090%;(d)將反應液置入-800t:冰箱中1248小時析出晶體，收集結晶并用無水乙醇反復洗滌晶體，干燥，保存?zhèn)溆谩?.權利要求l中所述的楸皮酸及其鹽或衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用。5.權利要求l中所述的賴氨楸皮酸及其鹽或衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用。6.權利要求4及5中所述的腫瘤為肝癌、肺癌、結腸癌、白血病、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌。7.以權利要求1所述的楸皮酸和賴氨楸皮酸及其鹽或衍生物為活性成分，單獨或結合一種或幾種藥學上可接受的賦形劑或載體組成的藥物組合物。8.權利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物可以是注射劑、口服齊U、霜劑、噴劑。全文摘要本發(fā)明涉及一種蒽醌類化合物楸皮酸及其結構修飾物賴氨楸皮酸，其結構通式如式(1)所示。本發(fā)明提供了上述兩種化合物的制備方法，蒽醌類化合物楸皮酸為從核桃楸中提取所得，賴氨楸皮酸是將楸皮酸進行結構修飾和改造所得。同時本發(fā)明還涉及這兩種化合物作為藥物，尤其是作為抗腫瘤藥物的用途。文檔編號C07C229/26GK101786952SQ20101011052公開日2010年7月28日申請日期2010年2月10日優(yōu)先權日2010年2月10日發(fā)明者烏垠,于春雷,孟祥穎,張玉偉,李玉新,林華,鄭麗華,鮑永利申請人:東北師范大學