專利名稱：一種抗erbB2人源抗體MIL-5及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗erbB2人源抗體以及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
erbB2基因定位于人17號染色體的17q21位置，該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA全長為4.8kbp，其開放閱讀框架全長為3765 bp，編碼1255個氨基酸。其中，第1~21位氨基酸為信號肽序列，胞外區(qū)有632個氨基酸，跨膜區(qū)由高度疏水的22個氨基酸組成，C-末端的580個氨基酸位于胞質(zhì)內(nèi)。erbB2胞外區(qū)四個結(jié)構(gòu)域分類模式為Dl (第22 195位氨基酸)、D2 (第196 320位氨基酸)、D3 (第321~488位氨基酸)、D4 (第489 632位氨基酸)。其中，Dl和D3主要由疏水性的氨基酸組成，特別是亮氨酸，三個平行的P片層構(gòu)成e螺旋結(jié)構(gòu)。D2和D4由二硫鍵模塊構(gòu)成，1 2個二硫鍵組成小的結(jié)構(gòu)單位，為富含半胱氨酸區(qū)，分別含26和21個半胱氨酸。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)與erbB2高親和力、高特異性結(jié)合的配體。
ErbB2同源或異源二聚體的形成伴隨著細(xì)胞內(nèi)的C末端酪氨酸殘基的磷酸化，引起細(xì)胞內(nèi)含SH2、 SH3和PTB結(jié)構(gòu)域的蛋白活化，募集、激活下游相關(guān)蛋白，通過信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖及分化。臨床研究發(fā)現(xiàn)，ErbB2高表達(dá)的腫瘤患者往往對放化療不敏感，且易發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后不佳。ErbB2在多種腫瘤組織中過表達(dá)，包括乳腺癌(25 30%)、卵巢癌(18 43%)、非小細(xì)胞肺癌(13 55%)、前列腺癌(5-46%)、胃癌(21-64%)、頭頸部腫瘤(16-50%)等上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤[21]，而在成人正常組織中表
達(dá)水平很低或不表達(dá)，因而成為腫瘤免疫治療的理想靶分子，也是目前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。
2003年，臨床用抗erbB2抗體Herceptin與erbB2相互作用復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)得到解析，結(jié)果提示，Herceptin識別erbB2的功能表位位于D4結(jié)構(gòu)域N端557 561、 570-573、 593-603位氨基酸殘基。同時，臨床試驗表明，人源化抗erbB2單抗Herceptin僅用于ErbB2過表達(dá)乳腺癌的臨床治療，而且，單獨(dú)應(yīng)用的療效有限，其有效率僅為11.6~16%。
隨著erbB2晶體結(jié)構(gòu)的精確解析，其結(jié)構(gòu)特征受到人們的廣泛關(guān)注。盡管同屬于EGFR (Epidermal growth factor receptor )超家族，與EGFR、 erbB3結(jié)構(gòu)相比，非激活狀態(tài)時erbB2分子的Dl和D3間接近的程度超過了激活狀態(tài)(即EGFR、erbB3與其配體結(jié)合狀態(tài))下EGFR、 erbB3的Dl和D3的接近程度。由于該結(jié)構(gòu)特征，與EGFR、 erbB3不同，erbB2較難與配體結(jié)合，使其成為"孤受體"。在上述結(jié)構(gòu)特征的維持下，非激活狀態(tài)的erbB2以一種"開放"(open)的結(jié)構(gòu)模擬激活狀態(tài)受體(EGFR、 erbB3)的構(gòu)象，D2區(qū)更為凸出、暴露，使其成為EGFR家族其他成員首選的異源二聚體伴侶分子。大量的實驗表明，D2區(qū)的C末端在形成異源二聚體的過程中發(fā)揮重要的作用。功能性抗體2C4能特異性識別erbB2的D2結(jié)構(gòu)域，阻斷erbB2功能的抗體。目前，該抗體已進(jìn)入臨床前研究。
雖然抗erbB2抗體Herceptin已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療乳腺癌，功能性抗體2C4也已經(jīng)進(jìn)入臨床前研究，但是這些抗體的生物學(xué)活性有待進(jìn)一步提高。
本發(fā)明即基于上面的研究背景，通過人源抗體 篩選高親和力的新型抗erbB2人源抗體，并通過實驗驗證其生物學(xué)活性。本發(fā)明的目的在于提供一種具有臨床應(yīng)用價值的抗erbB2人源抗體。本發(fā)明提供了一種抗erbB2人源抗體，其結(jié)構(gòu)包括人源恒定區(qū)和可變區(qū)；其重鏈可變區(qū)選自SEQ—IDNO: 1、 SEQ—IDNO: 3或SEQ—IDNO: 5;其輕鏈可變區(qū)選自SEQJDNO: 2、 SEQ—IDNO: 4或SEQ—IDNO: 6。
本發(fā)明提供了這種抗體的制備方法，主要包括以下步驟
a、 構(gòu)建天然的人源噬菌體抗體庫；
b、 構(gòu)建表達(dá)人erbB2胞外段全長基因的重組細(xì)胞株；
c、 從人源噬菌體抗體庫中篩選抗erbB2的噬菌體抗體；
d、 利用基因工程手段，獲得人源抗體；
e、 對獲得的抗體的結(jié)合活性、特異性、親和力以及生物學(xué)功能等進(jìn)行鑒定。
上述步驟a中，取正常人外周血，分離淋巴細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增得到人免疫球蛋白G重輕鏈可變區(qū)基因，夠建人免疫球蛋白GFab抗體庫。
上述步驟b中，根據(jù)人erbB2基因(SwissProt注冊號P04626)序列，收集erbB2陽性細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增得到編碼erbB2信號肽、胞外段以及跨膜區(qū)的基因；經(jīng)過DNA克隆技術(shù)將其克隆入載體pEGFP-Nl (Clonetech公司產(chǎn)品)中，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，篩選陽性重組細(xì)胞。
上述步驟c中，將抗體庫用不表達(dá)靶抗原的"空白"細(xì)胞293T細(xì)胞吸附，除去非目的抗體(陰性選擇)；再用經(jīng)陰性選擇的抗體庫與步驟b獲得的表達(dá)耙抗原的陽性重組細(xì)胞結(jié)合，得到與靶細(xì)胞結(jié)合的抗體(陽性篩選)；經(jīng)過3一8輪的"陰性選擇一陽性選擇一擴(kuò)增"，獲得具有較好結(jié)合活性的抗erbB2噬菌體抗體，得到其基因序列。
上述步驟d中，將步驟c中獲得的抗體基因，通過DNA克隆等基因工程
手段，克隆入含有人抗體恒定區(qū)基因的真核表達(dá)載體中，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔等方法轉(zhuǎn)染真核表達(dá)細(xì)胞，培養(yǎng)足夠長時候后收獲上清，其中含有表達(dá)的目的抗體。
上述步驟e中，包括人源抗體的純化以及生物學(xué)功能鑒定，具體包括以
下實驗
實驗1)雙夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA):以合適的抗體包被后作為捕獲抗體，經(jīng)過封閉后，加入待測樣品以及標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行捕獲反應(yīng)；隨后利用合適的酶標(biāo)二抗進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定樣品中目的蛋白的含量。
實驗2)用硫酸銨沉淀法或者親和層析等方法從步驟d獲得的培養(yǎng)上清中直接分離純化抗體。通過十二垸基硫酸納聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析純化產(chǎn)物的純度、分子量。
實驗3)利用間接免疫熒光以及流式細(xì)胞分析鑒定抗體的結(jié)合活性、識別位點(diǎn)以及親和力收集目的細(xì)胞，緩沖液(PBS+2。/。胎牛血清)洗滌后，加入一抗，4。C反應(yīng)30mins;緩沖液洗滌2次，加入相應(yīng)的二抗，4。C避光反應(yīng)30mins，緩沖液洗滌2次后重懸在PBS中直接進(jìn)行流式細(xì)胞分析或者以1%的多聚甲醛固定，4'C避光保存。
實驗4)抑制生長實驗以erbB2陽性細(xì)胞作為靶細(xì)胞，加入不同濃度的抗體作用于靶細(xì)胞，設(shè)立陰性對照、陽性對照及實驗組；作用24h后，以MTT法測定抗體對靶細(xì)胞生長抑制活性。
實驗5)抗體依賴的細(xì)胞毒試驗(ADCC):標(biāo)記erbB2陽性細(xì)胞作為靶細(xì)胞，用淋巴細(xì)胞分離液從外周血中分離出外周血單個核細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞；根據(jù)相應(yīng)比例混合后，加入不等量的抗體，于圓底96孔培養(yǎng)板上進(jìn)行殺傷實
驗，設(shè)立實驗孔、靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔、最大釋放孔及背景孔；37°C孵育2h。 利用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，計算殺傷率。
本發(fā)明通過天然抗體庫篩選獲得抗erbB2人源抗體，通過方法獲得的抗 體是全人源性抗體，避免了鼠源性抗體在人體應(yīng)用時誘發(fā)的人抗鼠抗體的不 良反應(yīng)。
本發(fā)明獲得的抗體具有特異性結(jié)合erbB2陽性細(xì)胞；該抗體能抑制erbB2 陽性細(xì)胞增殖；該抗體能介導(dǎo)ADCC活性殺傷erbB2陽性細(xì)胞。


圖l :重組膜表達(dá)的人erbB2可以被Herceptin (羅氏公司產(chǎn)品，注射用曲妥 珠單抗，又稱赫賽汀，英文名Trastuzumab)識別。調(diào)取人erbB2基因，將編 碼erbB2信號肽、胞外段以及跨膜區(qū)的基因克隆入pEGFP-Nl載體;轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后用Herceptin抗體進(jìn)行間接免疫熒光檢測，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示重 組表達(dá)的人erbB2可被Herceptin抗體特異性識別。(A: 293T細(xì)胞；B: 293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染含erbB2信號肽、胞外段以及跨膜區(qū)基因的pEGFP-Nl載體；C:轉(zhuǎn) 染陽性293T細(xì)胞后用Herceptin抗體進(jìn)行間接免疫熒光檢測(細(xì)線圖形表示 對照；粗線圖形表示實驗結(jié)果))。
圖2:表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析。A圖顯示非還原的SDS-PAGE分析結(jié)果， 表達(dá)產(chǎn)物分子量為155KDa，提示表達(dá)產(chǎn)物與抗體分子量一致；B圖結(jié)果顯示， 表達(dá)產(chǎn)物在還原條件下的SDS-PAGE分析呈現(xiàn)55 KDa及25 KDa兩個條帶，具有典型的抗體特征；提示獲得的表達(dá)產(chǎn)物為抗體。
圖3利用erbB2陽性細(xì)胞系測定抗體的結(jié)合活性。結(jié)果顯示，MIL5-2和 MIL5-3的結(jié)合活性明顯高于陽性對照2C4抗體，而MIL5-1的結(jié)合活性略低 于陽性對照2C4抗體。
圖4:抗體體外抑制erbB2陽性細(xì)胞增殖。A:抗體抑制SK0V3細(xì)胞增殖， B;抗體抑制MCF7細(xì)胞增殖，C:抗體抑制SKBR3細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示， MIL5-2和MIL5-3的抑制活性明顯高于陽性對照2C4抗體，而MIL5-1的抑 制活性與陽性對照2C4抗體相似。
圖5:抗體體外通過介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷erbB2陽性細(xì)胞。A:抗體介導(dǎo)ADCC 效應(yīng)殺傷SKOV3細(xì)胞，B;抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷MCF7細(xì)胞，C:抗體 介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷SKBR3細(xì)胞。結(jié)果顯示，MIL5-2和MIL5-3介導(dǎo)的細(xì) 胞毒作用明顯高于陽性對照2C4抗體，而MIL5-1介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用與陽性 對照2C4抗體相似。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的抗erbB2人源抗體，其結(jié)構(gòu)包括人源恒定區(qū)和可變區(qū)；其重鏈 可變區(qū)選自SEQ—IDNO: 1、 SEQ—IDNO: 3或SEQ—IDNO: 5;其輕鏈可 變區(qū)選自SEQ—IDNO: 2、 SEQ—IDNO: 4或SEQ—IDNO: 6。制備方法為 首先根據(jù)美國Scripps研究所設(shè)計的人免疫球蛋白(Ig)通用引物及簡并引物 序列合成引物，取正常人的血液分離淋巴細(xì)胞，從淋巴細(xì)胞中提取總RNA， 以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用人Ig特異性引物擴(kuò)增所有免疫球蛋白輕鏈和重鏈Fd段基因；常規(guī)制備感受態(tài)細(xì)菌(XLl-blue)，將經(jīng)過純化的輕 鏈PCR產(chǎn)物用Xba I和Sac I限制性內(nèi)切酶消化后進(jìn)行電泳分離純化，將載體 (pComb3)用同樣的酶消化后電泳分離純化，將載體和輕鏈進(jìn)行連接反應(yīng)， 連接產(chǎn)物采用電穿孔的方法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建輕鏈庫；從輕鏈庫中抽提 純化后的輕鏈庫質(zhì)粒DNA和重鏈Fd段PCR產(chǎn)物用Xho I和Spe I酶消化后 進(jìn)行連接反應(yīng)并電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，建立人IgFab抗體庫；抽提含有Ig Fab的重組載體，與輔助噬菌體(VCSM13)共同轉(zhuǎn)染受體菌，建立噬菌體抗 體庫。
根據(jù)人erbB2基因(SwissProt注冊號P04626)序列，收集erbB2陽性 細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增得到編碼erbB2信號肽、胞外 段以及跨膜區(qū)的基因；經(jīng)過DNA克隆技術(shù)將其克隆入載體pEGFP-Nl (Clonetech公司產(chǎn)品)中，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，篩選獲得陽性重組細(xì)胞。將 抗體庫用不表達(dá)耙抗原的"空白"細(xì)胞293T細(xì)胞吸附，除去非目的抗體(陰 性選擇)；再用經(jīng)陰性選擇的抗體庫與表達(dá)靶抗原的陽性重組細(xì)胞結(jié)合，得到 與靶細(xì)胞結(jié)合的抗體(陽性篩選)；經(jīng)過3—8輪的"陰性選擇一陽性選擇一 擴(kuò)增"，獲得具有較好結(jié)合活性的抗erbB2噬菌體抗體，得到其基因序列。
將獲得的陽性抗體基因，通過DNA克隆等基因工程手段，克隆入含有人 抗體恒定區(qū)基因的真核表達(dá)載體中，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔等方法轉(zhuǎn)染表 達(dá)細(xì)胞，培養(yǎng)足夠長時候后收獲上清，通過親和純化等方法獲得人源抗體， 進(jìn)一步對獲得的人源抗體進(jìn)行生物學(xué)活性鑒定。
實施例l.人源噬菌體抗體庫的構(gòu)建
取健康人外周血200份，每份5mL (北京市血液中心)，以人淋巴細(xì)胞分離液(TBD)分離淋巴細(xì)胞，用TRIZOL reagent (Promega)提取總RNA。將 總RNA用MMLV試劑盒(Promega)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以人IgG輕重鏈可 變區(qū)保守序列的上、下游引物進(jìn)行免疫球蛋白輕重鏈基因的PCR擴(kuò)增。引物 序列如下(Invitrogen合成)
重鏈可變區(qū)5'端引物
VHla: 5，-CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GGG-3' (SEQ—NO:7) VHlf: 5，-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3' (SEQ一NO:8 ) VH2f: 5，畫CAG GTG CAG CTA CTC GAG TCG GG-3' ( SEQ—NO:9 ) VH3a: 5，-GAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GGG-3， (SEQ一NO:IO) VH3f: 5 ，-GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3 ， ( SEQ_NO: 11) VH4f: 5，-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3' (SEQ一NO: 12) VH6f: 5 ，-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3' ( SEQ—NO: 13 ) VH6a: 5 ，-CAG GTA CAG CTC GAG CAG TCA GG畫3' ( SEQ一NO: 14 ) 重鏈可變區(qū)3'端引物
IgG!: 5 ，-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG-3 ， ( SEQ_NO: 15 ) IgG2: 5 ，-CTC GAC ACT AGT TTT GCG CTC AAC TGT CTT畫3' ( SEQ一NO: 16 ) IgG3: 5，-TGT GTG ACT AGT GTC ACC AAG TGG GGT TTT-3， (SEQ-—NO:17)
IgG4: 5，-GCA TGA ACT AGT TGG GGG ACC ATA TTT GGA-3' (SEQ-—NO:18)
K鏈可變區(qū)5'端引物
VKla: 5，-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3， ( SEQ_NO: 19 ) VKls: 5'陽GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CC-3， (SEQ_NO:20)
10VK2a: 5'畫GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3， ( SEQ—NO:21) VK3a: 5，-GAAATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA-3' (SEQ_NO:22) VK3b: 5，-GAA ATT GAG CTC AC(G/A) CAG TCT CCA-3， ( SEQ_NO:23 )
人鏈可變區(qū)5，端引物
VL,: 5,-AAT TTT GAG CTC ACT CAG CCC CAC陽3' (SEQ—NO:24) VL2: 5，-TCT GCC GAG CTC CAG CCT GCC TCC GTG-3， (SEQ一NO:25) VL3: 5，-TCT GTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG-3' (SEQ_NO:26) VL4:5 ，-TCT GAA GAG CTC CAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG-3' ( SEQ-—NO:27)
VL5: 5，-CAG TCT GAG CTC ACG CAG CCG CCC-3' (SEQ—NO:28) VL6: 5，-CAG ACT GAG CTC ACT CAG GAG CCC-3， (SEQ一NO:29) VL7: 5'畫CAG GTT GAG CTC ACT CAA CCG CCC-3， (SEQ—NO:30) VL8: 5，-CAG GCT GAG CTC ACT CAG CCG TCT TCC-3' (SEQ一N0:31)
K鏈3'端引物
TTG TGA CGG GCG AAC TCA G畫3 ， ( SEQ—NO:32 ) X鏈3'端引物
CL2: 5，-CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3' (SEQ-一NO:33)
PCR條件為94°C 1分鐘，54°C (或55。C、 56°C、 58°C、 60°C) 1分鐘，72 °C 2分鐘，35循環(huán)，72。C延伸10分鐘，Taq酶為TAKARA公司產(chǎn)品。上述PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠回收(回收試劑盒為promega公司產(chǎn)品) 純化后，將輕鏈產(chǎn)物和重鏈產(chǎn)物分別混合?；旌虾蟮妮p鏈產(chǎn)物用XbaI和Sac I限制性內(nèi)切酶(NEB)消化后進(jìn)行電泳分離純化，將載體pComb3(美國Scripps 研究所)用同樣的酶消化后電泳分離純化，將載體和輕鏈進(jìn)行連接反應(yīng)，連 接產(chǎn)物10^iL釆用電穿孔的方法轉(zhuǎn)入200)aLXLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建輕鏈 庫，電穿孔條件為Bio-Red電轉(zhuǎn)儀，0.2厘米電轉(zhuǎn)杯，2.5kv;從輕鏈庫中抽 提純化后的輕鏈庫質(zhì)粒DNA和混合后的重鏈產(chǎn)物用Xho I和Spe I酶消化后 進(jìn)行連接反應(yīng)并以同樣的方法電穿孔轉(zhuǎn)化XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，電穿孔后加 入10mLSOC培養(yǎng)基，37'C培養(yǎng)1小時，加入80mL SB-A+T+培養(yǎng)基(含有 10(Vg/mL氨芐青霉素及IO昭四環(huán)素)，37r培養(yǎng)2小時，加入輔助噬菌體 VCSM13 (lX1013pfli/mL) (Stratagene公司)37°。感染1小時，加入卡那霉 素(7(Vg/mL) 37。C搖床培養(yǎng)過夜，收集上清，用4% PEG (聚乙二醇)和3% NaCl沉淀噬菌體上清，離心后用0.02mol/LpH7.4 PBS緩沖溶液重懸沉淀， 再次離心得到的上清即為噬菌體抗體庫。
SOC培養(yǎng)配制如下
蛋白胨 20g
酵母提取物 5g
氯化鈉 0.5g
lmol/L氯化鉀 2.5mL
蒸餾水 補(bǔ)足至1L
制備方法搖動容器使得溶質(zhì)完全溶解，高壓滅菌。培養(yǎng)基冷卻到室溫后，再在每lOOmL培養(yǎng)基中加入lmL無菌的lmol/L氯化鎂和2mL無菌的 lmol/L葡萄糖。
SB培養(yǎng)基配制如下
蛋白胨 30g
酵母提取物 10g
MOPS (3-嗎啉丙磺酸)10g
蒸餾水 補(bǔ)足至1L
調(diào)整至pH7.0。
實施例2.表達(dá)人erbB2胞外段全長基因的重組細(xì)胞株的構(gòu)建
收集erbB2陽性細(xì)胞SKBR3,用TRIZOLreagent (Promega)提取總RNA。 將總RNA用MMLV試劑盒(Promega)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)人erbB2基因 (SwissProt注冊號P04626)序列，設(shè)計引物，擴(kuò)增得到編碼erbB2信號肽、 胞外段以及跨膜區(qū)的基因，并且在上下游分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Xho I 和Hind III，引物如下(由Invitrogen公司合成)
erbB2-Pup: ccg etc gag agt gag cac cat g (SEQ一NO:34)
erbB2-Pdown: ccc aag ctt ctg ccg teg ctt gat (SEQ_NO:35 )
PCR條件為94。C l分鐘，58°C l分鐘，72°C 2分鐘，35循環(huán)，72匸延伸10 分鐘，Taq酶為TAKARA公司產(chǎn)品。
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收(回收試劑盒為promega公司產(chǎn)品)純化后， 加入限制性內(nèi)切酶Xho I和Hind III進(jìn)行消化，消化產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后與用相同限制性內(nèi)切酶消化的載體pEGFP-Nl (Clonetech公司產(chǎn)品)進(jìn) 行連接反應(yīng)；室溫連接2h或者4'C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌， 涂布在含有100嗎/mL卡那霉素(終濃度)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的克隆 在含有100叱/mL卡那霉素(終濃度)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取 試劑盒(博大泰克公司)提取陽性克隆質(zhì)粒。利用Iiwitrogen公司的脂質(zhì)體法 試劑盒將獲得的陽性質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞在含有G418的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)5周的選 擇培養(yǎng)后，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行稀釋克隆化培養(yǎng)，獲得的單克隆細(xì)胞繼 續(xù)3輪稀釋克隆化培養(yǎng)。篩選獲得的單克隆細(xì)胞株利用間接免疫熒光檢測， 結(jié)果顯示人erbB2胞外段基因可以在293T細(xì)胞上表達(dá)。用Herceptin抗體以 及GAH-IgG-PE進(jìn)行間接免疫熒光染色，結(jié)果顯示，重組表達(dá)的人erbB2可 以被Herceptin識別。(圖1)
實施例3.噬菌體抗體庫的篩選
將100|iL (106細(xì)胞)不表達(dá)人erbB2的293T細(xì)胞作為空白細(xì)胞加入V 形底的微孔板，加入80^iL抗體庫，混勻，室溫反應(yīng)30分鐘。室溫750g離心 2-3分鐘，將上清轉(zhuǎn)到實施例2中獲得的表達(dá)人erbB2的陽性細(xì)胞lOOpL (106 細(xì)胞)中，混勻，室溫反應(yīng)30分鐘。室溫750g離心2-3分鐘，棄去上清， 用180jiL洗滌液(PBS含20mmol/L Hepes (pH7.4)， 1% BSA， 0.03%疊氮 鈉，過濾除菌)重懸細(xì)胞，反復(fù)洗滌5-8次。用180pL PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)到 試管中，加入lmLPBS，室溫750g離心2-3分鐘。用150nL TBS-胰蛋白酶 (10mg/mL)重懸細(xì)胞，在搖床上200 300轉(zhuǎn)/分鐘37。C搖動30mins以洗脫 噬菌體。將洗脫的噬菌體加入到2mLXLl-Blue (培養(yǎng)至八6()。=1)中，室溫孵育15分鐘后轉(zhuǎn)入200rnL三角燒瓶中，加入10mL SB-A+T+培養(yǎng)基(含有 20^ig/mL氨芐青霉素及IO昭四環(huán)素)，37t培養(yǎng)1小時。再加入SB-A+T+培 養(yǎng)基(含有100昭/mL氨芐青霉素及IO昭四環(huán)素)，37。C培養(yǎng)1小時。加入 輔助噬菌體VCSM13 (lX1012pfWmL)， 37'C反應(yīng)2小時。加入卡那霉素 (70嗎/mL)37。C搖床培養(yǎng)過夜。收集上清，用4。/。PEG(聚乙二醇)和3%NaCl 沉淀噬菌體上清，離心后用0.02mol/LpH7.4PBS緩沖溶液重懸沉淀，再次離 心得到的上清進(jìn)行下一輪篩選。
經(jīng)過4-8輪富集篩選后，獲得陽性克隆三株MIL5-1、 MIL5-2及MIL5-3， 測序翻譯后獲得抗體可變區(qū)序列。MIL5-1重鏈可變區(qū)氨基酸序列為 SEQ—ID:1，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ—ID:2; MIL5-2重鏈可變區(qū)氨基酸 序列為SEQ—ID:3，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ—ID:4; MIL5-3重鏈可變區(qū) 氨基酸序列為SEQ—ID:5，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ—ID:6。這三株抗體 的序列與Herceptin完全不同。MIL5-1及MIL5-2與2C4序列也完成不同；而 MIL5-3的輕鏈與2C4的輕鏈氨基酸序列相同，但其重鏈與2C4的重鏈氨基 酸序列在CDR1區(qū)以及框架區(qū)有3個氨基酸不同。
實施例4.人源抗體的構(gòu)建和表達(dá)
采用PCR反應(yīng)分別給以上三株抗體可變區(qū)基因引入適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)，其 中在抗體輕鏈可變區(qū)基因5'端及3'端分別引入Eo^V和^oI酶切位點(diǎn)； 在抗體重鏈鏈可變區(qū)基因5，端及3，端分別引入iV"II和&活I(lǐng)I酶切位點(diǎn)。 進(jìn)行普通PCR后，將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收(回收試劑盒為promega 公司產(chǎn)品)純化。輕鏈可變區(qū)基因加入限制性內(nèi)切酶Eco/ V和^oI進(jìn)行消收純化后與用相同限制性內(nèi)切酶消化的載體
pTGS-FRT-DHFR (由本公司構(gòu)建并申請國家專利專利，授權(quán)號 ZL200510064335.0)進(jìn)行連接反應(yīng)；室溫連接2h或者4'C連接過夜，連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，涂布在含有100(ig/mL氨芐青霉素(終濃度)的LB 瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的克隆在含有100^ig/mL卡那霉素(終濃度)的LB液體 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒(博大泰克公司)提取陽性克隆質(zhì)粒。陽 性克隆經(jīng)限制性內(nèi)切酶尸vw II和消化后，與用相同限制性內(nèi)切酶消化 的抗體重鏈基因連接，經(jīng)過相同的轉(zhuǎn)化等實驗后，獲得陽性質(zhì)粒pTGS-MIL5-1、 pTGS誦MIL5-2、 pTGS-MIL5-3。
利用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒將獲得的陽性質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞在含有G418的選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)4~8周的選 擇培養(yǎng)后，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行稀釋克隆化培養(yǎng)，獲得的單克隆細(xì)胞繼 續(xù)3輪稀釋克隆化培養(yǎng)。
獲得的單克隆細(xì)胞系在RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，利用羊抗人IgG 以及辣根酶標(biāo)記的羊抗人IgG進(jìn)行雙夾心ELISA法檢測上清中抗體的含量， 以未轉(zhuǎn)染上清作為陰性對照，人IgG純品作為標(biāo)準(zhǔn)品。實驗結(jié)果顯示，表達(dá) 獲得的目的蛋白可以被羊抗人IgG抗體識別，含有人IgG抗體的恒定區(qū)，具 有人IgG抗體特征；并且構(gòu)建的人源抗體具有較高的表達(dá)水平。
采用Protein A親和層析柱從細(xì)胞培養(yǎng)上清中直接分離純化本發(fā)明的人源 抗體MIL5-1、 MIL5-2、 MIL5-3。以非還原的形式進(jìn)行SDS-PAGE實驗，結(jié) 果顯示表達(dá)的目的蛋白約為155KDa，符合抗體的分子量(圖2A)。還原形式 進(jìn)行的SDS-PAGE實驗結(jié)果顯示，目的蛋白在還原條件下呈兩條特異性條帶，分別為55KDa和25KDa (圖2B)，具有典型的抗體特征。提示表達(dá)獲得的蛋 白為抗體分子，具有典型的IgG抗體結(jié)構(gòu)特征。
實施例5.人源抗體的功能鑒定
以2C4抗體為陽性對照(其序列參照PDB: ls78，根據(jù)實施例4中的方 法，對其進(jìn)行表達(dá)純化獲得)，以人IgG為陰性對照，對本發(fā)明獲得的抗erbB2 人源抗體進(jìn)行功能驗證
a) 抗體的識別活性鑒定
SK0V3細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞系，細(xì)胞表面表達(dá)大量的erbB2抗原，利用該 細(xì)胞對獲得的抗體進(jìn)行鑒定。以各人源抗體以及GAH-IgG-FITC對SKOV3 細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光染色后，通過流式細(xì)胞術(shù)對結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示， 本發(fā)明獲得的抗erbB2人源抗體都能特異性結(jié)合靶細(xì)胞，其中MIL5-2和 MIL5-3的結(jié)合活性明顯優(yōu)于陽性對照2C4抗體，而MIL5-1的結(jié)合活性略低 于陽性對照2C4抗體。(圖3)
b) 抗體抑制及殺傷腫瘤細(xì)胞功能鑒定
利用SKV03、 MCF7、 SKBR3等腫瘤細(xì)胞系對獲得的抗體抑制腫瘤細(xì)胞 生長及殺傷腫瘤細(xì)胞的功能進(jìn)行驗證。
利用SKV03、 MCF7、 SKBR3進(jìn)行生長抑制實驗，加入細(xì)胞和抗體后常 規(guī)培養(yǎng)2 4天進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)及MTT檢測。與人IgG對照組相比較，本發(fā)明獲 得的人源抗體具有明顯的抑制SKV03、 MCF7及SKBR3細(xì)胞生長的活性； 其中MIL5-2和MIL5-3的抑制活性明顯高于陽性對照2C4抗體，而MIL5-1 的抑制活性與陽性對照2C4抗體相似(圖4)。
采用PerkinElmer公司的DELFIA EuTDA Cytotoxicity reagents進(jìn)行抗體依賴的細(xì)胞毒實驗，以利用試劑盒中的標(biāo)記試劑標(biāo)記SKV03、 MCF7、 SKBR3
細(xì)胞后作為靶細(xì)胞，以人外周血單個核細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)效耙比為50: 1
時，本發(fā)明獲得的人源抗體都能有效殺傷耙細(xì)胞。其中MIL5-2和MIL5-3介
導(dǎo)的細(xì)胞毒作用明顯高于陽性對照2C4抗體，而MIL5-1介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用
與陽性對照2C4抗體相似(圖5，表1 )。
表l:抗體介導(dǎo)ADCC殺傷靶細(xì)胞
加胎玄IC50 ( ,mL)
瑣服系MIL5畫1MIL5-2MIL5-32C4
SKOV315,988.517.3615.78
MCF713.757.416.4413.6
SKBR317.959.458,4116.54
IC50比較結(jié)果顯示，MIL5-2和MIL5-3介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用明顯高于陽性對照 2C4抗體，而MIL5-1介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用與陽性對照2C4抗體相似。
18序列表
<110>北京天廣實生物技術(shù)有限公司
中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 <120> —種抗erbB2人源抗體MIL-5及其應(yīng)用 <160> 35
<210> 1 <211> 119 <212> PRT
<213> Homo sapiens <220>
<223>抗體M工L5-1重鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 1
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Ala 1 5
Glu 10
Val Lys Gin Pro
Glu Thr Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Ala Tyr Ser Val
20
25
Ser Ser Tyr lie Ser Trp lie Arg Gin Pro Ser Ser Gin Ala
35
40
Gin Ser Met Ser Tyr Val Gin Pro Gin Thr Gly Gly Asn Leu
50
55
Ser Gin Arg Val Gin Ser Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr
65
70
Thr Ser Gin Ala Ser Met Glu Leu Ser Asn Val Thr Ser Ala
80
85
Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Lys Gin lie Gly Pro Thr Tyr
95
100
Ser
15 Ser
30 Leu
45 Phe
60 Ser
75 Asp
90 Ser
105
Tyr Glu Phe Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
110
115<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223>抗體M工L5-1輕鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 2
Asp lie Val Met Ser Glu Thr Pro Ser Ser
15 10 Gly Glu Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala
20 25 Leu Gly Leu Ala Trp Tyr Leu Gin Arg Ser
35 40 Leu Leu Val Tyr Asp Ala Ser Phe Arg Tyx
50 55 Arg Phe Thr Gly Ser Arg Tyr Gly Gin Ser
65 70 Asn Arg Leu Glu Ala Asp Val Leu Ala Val
80 85 Ser Phe lie Tyr His Tyr Ser Phe Gly Ser
95 100
lie Arg 107
Met Pro Val Ser
Ser Gin Ser Val
Gly Gin Ser Pro
Ser Glu Val Pro
Tyx Ser Leu Thr
Tyx Tyr Cys Gin
Gly Thr Lys Leu
Leu
15 Ser
30 Arg
45 Asp
60 lie
75 Gin
90 Glu
105
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223>抗體M工L5-2重鏈可變區(qū)氨基酸序列<鋼> 3
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
15 10 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25 Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gin Ala
35 40 Glu Trp Val Gly Asp Val Asn Pro Asn Ser
50 55 Asn Gin Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr lie
65 70 Lys Asn Thr" Leu Tyx Leu Gin Met Asn Ser
80 85 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu
95 100 Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val
110 115
<210> 4 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens <220>
<223>抗體MIL5-2輕鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 4
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser
15 10 Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala
20 25 lie Gly Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro
35 40
Leu Val Gin Pro
Gly Phe Thr Phe
Pro Gly Lys Gly
Gly Gly Ser lie
Ser Val Asp Arg
Leu Arg Ala Glu
Gly Pro Ser Phe
Thr Val Ser Ser
Gly
15 Ser
30 Leu
45 Tyr
60 Ser
75 Asp
90 Tyr 105
Leu Ser Ala Ser
Ser Gin Asp Val
Gly Lys Ala Pro
Val 15
Ser 30
Lys 45Leu Leu工le Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr
50 55
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
65 70
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr
80 85
Tyr Tyr lie Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin
95 100
lie Lys 107
Thr Gly Val Pro Ser 60
Phe Thr Leu Thr lie 75
Tyr Tyx Cys Gin Gin 90
Gly Thr L>ys Leu Glu 105
<210> 5 <211> 119 <212> PRT
<213> Homo sapiens <220>
<223>抗體MIL5-3重鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 5
Glu Val Gin Leu Leu Gin Ser Gly Ala Glu Val Val Gin Pro Ser 15 10 15
Ala Thr Val Arg Val Thr Cys Lys Val Ser Ala Tyr Ser Phe Thr
20 25 30
Glu Tyr Ser Met Asp Trp工le Arg Thr Pro Ser Gly Arg Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Met Ser Asp lie Gin Pro Gin Ser Gly Gly Ser工le Phe
50 55 60
Ser Asn Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Asp Ser
65 70 75
Thr Ser Gin Ala Phe Met Glu Met Asn Ser Leu Lys Ser Ala Asp
80 85 90Ser Ala Leu Tyx Tyr Cys Val Lys Asn Leu Gly Pro Ser Tyr Tyr
95 100 105
Tyr Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
<210> 6 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens <220>
<223>抗體MIL5-3輕鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 6
Gin Val Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala
Leu Ser !Leu Thr
lie
15 10 Gly Asp Thr lie Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Asn Glu lie
20
25
lie Gly Val Ala Trp Phe Gin Gin Glu Ser Glu Thr Ala lie
35
40
Arg Leu Trp Val Ser Ala Thr Phe Arg Phe Ser Glu Val Pro
50
55
Arg Leu Thr Asp Gly Ala Tyr Arg Thr Ser Tyr Thr Phe Thr
65
70
Ser Arg Met Lys Pro Asp Asn Phe Val 工le Phe Phe Cys Leu
80
85
Tyr Tyr Leu Phe Pro Phe Ser Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
95
100
Val
15 Ser
30 Lys
45 Ser
60 Val
75 His
90 Glu 105
lie Arg 107<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>弓|物
<400> 7
CAGGTGCAGC TCGAGCAGTC TGGG 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>弓|物
<400> 8
CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC TGGG 24
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>弓l物
<400> 9
CAGGTGCAGC TACTCGAGTC GGG 23
<210> 10 <211> 24 <212> DNA<213> Homo <220> <223>引物 <400> 10 GAGGTGCAGC
sapiens
<210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Homo <220> <223>弓l物 <400> 11 GAGGTGCAGC
TCGAGGAGTC TGGG 24
sspisns
TGCTCGAGTC TGGG 24
<210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Homo <220> <223>弓l物 <400> 12 CAGGTGCAGC
<210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Homo
s印isns
TGCTCGAGTC GGG 23<220> <223>弓l物 <400> 13
CAGGTGCAGC TACTCGAGTG GGG 2:3
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens <220> <223>弓l物 <400> 14
CAGGTACAGC TCGAGCAGTC AGG 23
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens <220> <223>弓l物 <400> 15
GCATGTACTA GTTTTGTCAC AAGATTTGGG 3 0
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>弓l物<400> 16 CTCGACACTA
<210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Homo <220> <223>引物 <400> 17 TGTGTGACTA
<210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Homo <220> <223>引物 <400> 18 GCATGAACTA
GTTTTGCGCT CAACTGTCTT 3 0
GTGTCACCAA GTGGGGTTTT 3 0
sspisns
GTTGGGGGAC CATATTTGGA 3 0
<210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Homo <220> <223>引物 <400> 19 GACATCGAGC
sapiens
TCACCCAGTC TCCA 24<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>引物
<400> 20
GACATCGAGC TCACCCAGTC TCC 23
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>弓l物
<400> 21
GATATTGAGC TCACTCAGTC TCCA 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>弓l物
<400> 22
GAAATTGAGC TCACGCAGTC TCCA 2 4
<210> 23 <211> 25
28<212> DNA <213> Homo <220> <223>弓l物 <400> 23 GAAATTGAGC
<210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Homo <220> <223>弓l物 <400> 24 AATTTTGAGC
<210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Homo <220> <223>弓l物 <400> 25 TCTGCCGAGC
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo <220>
TCACGACAGT CTCCA 2 5
TCACTCAGCC CCAC 2 4
S3pisns
TCCAGCCTGC CTCCGTG 2 "7
29<223>引物 <400> 26
TCTGTGGAGC TCCAGCCGCC CTCAGTG 2 "7
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>引物
<400> 27
TCTGAAGAGC TCCAGGACCC TGTTGTGTCT GTG 33
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>弓l物
<400> 28
CAGTCTGAGC TCACGCAGCC GCCC 24
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>引物
<400> 29
CAGACTGAGC TCACTCAGGA GCCC 24<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>弓l物 <400> 30
CAGGTTGAGC TCACTCAACC GCCC 24
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>弓|物
<400> 31
CAGGCTGAGC TCACTCAGCC GTCTTCC 27
<210> 32
<211> 58
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223>引物
<400> 32
GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCTCCCCTGT TGAAGCTCTT TGTGACGGGC GAACTCAG 58
<210> 33 <211> 30<223>引物 <400> 33 CGCCGTCTAG
<210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Homo <220> <223>弓l物 <400> 34 ccgctcg3g3
<210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Homo <220> <223>引物 <400> 35 cccaagcttc
sspiens
AATTATGAAC ATTCTGTAGG 3 0
sapiens
gtgagcacca tg 22
tgccgtcgct tga 2權(quán)利要求
1、一種抗erbB2人源抗體MIL5，它包含重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)；重鏈可變區(qū)具有SEQ_ID NO1、SEQ_ID NO3或SEQ_ID NO5所示的氨基酸序列；它的輕鏈可變區(qū)具有SEQ_ID NO2、SEQ_ID NO4或SEQ_IDNO6所示的氨基酸序列。
2、 權(quán)利要求1所述抗體在表達(dá)erbB2的細(xì)胞不當(dāng)存活或者不當(dāng)增殖相 關(guān)疾病的診斷或治療藥物中的應(yīng)用。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其中不當(dāng)增殖相關(guān)疾病為腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗erbB2人源抗體，它的重鏈可變區(qū)具有SEQ_ID NO1、SEQ_ID NO3或SEQ_ID NO5所示的氨基酸序列；它的輕鏈可變區(qū)具有SEQ_ID NO2、SEQ_ID NO4或SEQ_ID NO6所示的氨基酸序列。該抗體在哺乳動物細(xì)胞中具有較高的表達(dá)量，并且具有明顯的殺傷erbB2陽性腫瘤細(xì)胞等生物學(xué)活性。本發(fā)明還提供該抗體的設(shè)計及制備方法。
文檔編號C07K16/30GK101591396SQ20091013135
公開日2009年12月2日 申請日期2009年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日
發(fā)明者喬春霞, 馮健男, 明 呂, 沈倍奮, 白敏姿, 燕 黎 申請人:北京天廣實生物技術(shù)股份有限公司;中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所