專利名稱：基于erbB2蛋白胞外區(qū)C-端功能表位特征設(shè)計(jì)抗erbB2功能抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于erbB2蛋白胞外區(qū)C-端功能表位結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì) 獲得新型抗erbB2人源抗體。具體而言，即利用erbB2晶體結(jié)構(gòu)模型 以及其功能抗體Herceptin⑧識(shí)別的表位(erbB2蛋白胞外區(qū)C-端)特 征，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)方法獲得一種抗erbB2人源抗體；經(jīng)生 物信息學(xué)相關(guān)手段進(jìn)行反向翻譯確定其合適的基因結(jié)構(gòu)，應(yīng)用分子生 物學(xué)技術(shù)進(jìn)行基因全合成，并通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)抗體的功能進(jìn)行 評(píng)價(jià)。
背景技術(shù)：
作為表皮生長(zhǎng)因子受體家族(ErbB家族)成員，erbB2 (HER2， HER2/neu)是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白。erbB2的分子結(jié)構(gòu) 可分為胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域三部分，其中胞外域又可分為D1、 D3兩個(gè)極相似的由卩片層圍成的桶狀結(jié)構(gòu)域和D2、 D4兩個(gè)富含半 胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)部分具有酪氨酸激酶活性。
大量研究結(jié)果顯示，erbB2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、 肺癌等多種上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)。免疫組化染色可見(jiàn)乳 腺癌細(xì)胞的erbB2水平較正常乳腺細(xì)胞高10-100倍。因此erbB2是
4腫瘤免疫治療的理想靶分子。
1998年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)由Genetech公 司開(kāi)發(fā)的靶向erbB2的人源化單克隆抗體Herceptii^(羅氏公司產(chǎn)品， 注射用曲妥珠單抗，又稱赫賽汀，英文名Trastuzumab)上市，應(yīng)用于 ErbB2過(guò)表達(dá)的乳腺癌患者的臨床治療。目前，Herceptii/己成為廣 泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的一線臨床治療藥物。
然而， 一系列臨床試驗(yàn)表明，Herceptir^的療效有限，單獨(dú)應(yīng)用 其有效率僅為11.6~16%，與化療藥物聯(lián)合治療的有效率可達(dá)50%， 不過(guò)，聯(lián)合用藥可導(dǎo)致明顯的心臟毒性；與此同時(shí)，Herceptii^昂貴 的治療費(fèi)用也令第三世界國(guó)家的普通患者難以承受。因此，研發(fā)新的 耙向erbB2人源抗體具有重要的臨床和研究意義。
伴隨著計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)方法的不斷完善以及本單位提出的 "基于抗原一抗體相互識(shí)別立體結(jié)構(gòu)信息設(shè)計(jì)新功能分子"方案，在 獲得的erbB2晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，本項(xiàng)發(fā)明通過(guò)erbB2胞外區(qū)C-端結(jié) 構(gòu)域的構(gòu)象特征，從理論上獲得了一系列抗erbB2抗體分子，并通過(guò) 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容
為了提供新的抗erbB2抗體分子，本發(fā)明公開(kāi)了一組抗erbB2人 源抗體，其特征在于重鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ—ID NO: 1、 SEQIDNO: 2、 SEQ一IDNO: 3、 SEQIDNO: 4、 SEQ一IDNO: 5 或SEQ—IDNO: 6;其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQJDNO: 7、SEQ—IDNO: 8、 SEQ—IDNO: 9、 SEQ—ID NO: 10、 SEQJDNO: ll或SEQJDNO: 12。
本發(fā)明公開(kāi)的抗erbB2抗體是基于erbB2蛋白胞外區(qū)C-端功能表 位特征利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)獲得的抗體。
本發(fā)明公開(kāi)的抗體的一個(gè)特征是能特異性識(shí)別靶抗原設(shè)計(jì)獲得 的抗體能夠與重組蛋白erbB2特異性結(jié)合。
本發(fā)明獲得的抗體的一個(gè)特征是能夠特異性識(shí)別抗原表位結(jié)合 erbB2胞外區(qū)含有C-端功能表位的N-端缺失突變體erbB2-C，而與 erbB2胞外區(qū)含有N-端功能表位的C-端缺失突變體erbB2-N不反應(yīng)。
本發(fā)明公開(kāi)的抗體的一個(gè)特征是設(shè)計(jì)獲得的抗體能特異性地抑 制erbB2陽(yáng)性的SKOV3、 MCF7以及SKBR3等腫瘤細(xì)胞增殖。
本發(fā)明公開(kāi)的抗體的一個(gè)特征是設(shè)計(jì)獲得的抗體能介導(dǎo)ADCC 活性，特異性殺傷erbB2陽(yáng)性的SKOV3、 MCF7以及SKBR3等靶細(xì) 胞。
本發(fā)明還公開(kāi)了通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)獲得的抗erbB2人源 抗體的設(shè)計(jì)流程(圖16)。
6具體實(shí)施過(guò)程如下-
1) 抗原erbB2晶體結(jié)構(gòu)及C-端功能表位結(jié)構(gòu)特征分析；
2) 利用計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)獲得的人源抗erbB2抗體可變區(qū) 結(jié)構(gòu)；
3) 抗erbB2抗體與erbB2作用復(fù)合物結(jié)構(gòu)模擬；
4) 利用全合成PCR技術(shù)合成抗erB2抗體基因；
5) 抗體的表達(dá)及鑒定
6 )抗erbB2抗體生物學(xué)活性鑒定。
下面參照上述步驟詳細(xì)描述抗erbB2人源抗體的設(shè)計(jì)及制備過(guò) 程。設(shè)計(jì)及制備本發(fā)明抗體的方法僅僅是說(shuō)明相關(guān)方法，并非是限制 性的；也可以采用其他已知的方法，或者采用修改的方法。
1)抗原erbB2晶體結(jié)構(gòu)及C-端功能表位結(jié)構(gòu)特征分析基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB提供的erbB2胞外區(qū)晶體結(jié)構(gòu)(PDB code: ln8y)，在CVFF、 Amber力場(chǎng)下，依次選擇最陡下降(收斂 判據(jù)0.05kCal/mol，優(yōu)化步長(zhǎng)10000步)、共軛梯度(收斂判據(jù) 0.02kCal/mol，優(yōu)化步長(zhǎng)20000步)，獲得抗原erbB2胞外區(qū)理論空間 構(gòu)象。
利用erbB2與Herceptin⑧(羅氏公司產(chǎn)品，注射用曲妥珠單抗，又 稱赫賽汀，英文名Trastuzumab)相互作用的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB code: ln8z)，在CVFF、 Amber力場(chǎng)下，依次選擇最陡下降(收斂判 據(jù)0.05kCal/mol ，優(yōu)化步長(zhǎng)20000步)、共軛梯度(收斂判據(jù) 0.02kCal/mol，優(yōu)化步長(zhǎng)35000步)，獲得erbB2與Hercepti,相互作 用的理論空間構(gòu)象。
通過(guò)計(jì)算機(jī)圖形學(xué)、距離幾何學(xué)以及分子間氫鍵理論，合理確定 Herceptii^識(shí)別erbB2胞外區(qū)的功能表位。
2)利用計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)獲得的人源抗erbB2抗體可變區(qū)
結(jié)構(gòu)
在確定erbB2胞外區(qū)功能表位基礎(chǔ)上，利用計(jì)算機(jī)虛擬篩選及計(jì) 算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)拮抗erbB2功能的短肽(長(zhǎng)度為10 15)， 并將獲得的一系列功能短肽作為抗體可變區(qū)的CDR區(qū)儲(chǔ)備；借助源 自TrEMBL、 SwissProt、 Kabat、 IMGT等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)提供的抗體序 列構(gòu)建的人源抗體序列信息數(shù)據(jù)庫(kù)；通過(guò)同源模建、力學(xué)優(yōu)化技術(shù)將 人源抗體序列信息數(shù)據(jù)庫(kù)中人源抗體可變區(qū)框架與前面儲(chǔ)備的CDR 進(jìn)行合理拼接構(gòu)建合理的抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)。3) 抗erbB2抗體與erbB2作用復(fù)合物結(jié)構(gòu)模擬 借助分子對(duì)接、常溫動(dòng)力學(xué)模擬方法，合理評(píng)價(jià)構(gòu)建的抗體可變
區(qū)與erbB2相互作用模式，從理論上確定能夠特異性識(shí)別erbB2的抗 體可變區(qū)結(jié)構(gòu)。
4) 利用全合成PCR技術(shù)合成抗erB2抗體基因 根據(jù)獲得的抗體序列，選擇在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中常用的密碼子進(jìn)行
反向翻譯，獲得相應(yīng)的抗體基因。利用基因全合成PCR技術(shù)(見(jiàn)圖1 示意)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，通過(guò)重疊PCR的方法獲得全長(zhǎng)基因；克隆 入克隆載體，進(jìn)行序列測(cè)定。
5) 抗體的表達(dá)及鑒定
a) 抗體的表達(dá)將抗體基因構(gòu)建至真核表達(dá)載體中，通過(guò)脂質(zhì) 體轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)等方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核表達(dá)細(xì)胞，培養(yǎng)足夠長(zhǎng)時(shí)候后收獲 上清，其中含有表達(dá)的目的抗體。
b) 雙夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA):以合適的抗體包被后作 為捕獲抗體，經(jīng)過(guò)封閉后，加入待測(cè)樣品以及標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行捕獲反應(yīng)； 隨后利用合適的酶標(biāo)二抗進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定樣品中目的蛋白的含
c) SDS-PAGE:依據(jù)目的蛋白的大小配制合適濃度的聚丙烯酰胺 凝膠，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要制備還原電泳樣品或非還原電泳樣品進(jìn)行聚丙烯 酰胺凝膠電泳，分離蛋白；經(jīng)過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色后，確定目的蛋白分
6) 抗erbB2抗體生物學(xué)活性鑒定a) 流式細(xì)胞分析收集目的細(xì)胞；緩沖液(PBS+2。/。胎牛血清) 洗滌后，加入一抗，4。C反應(yīng)30mins;緩沖液洗滌2次，加入相應(yīng)的 二抗，4'C避光反應(yīng)30mins,緩沖液洗滌2次后重懸在鞘液中直接進(jìn) 行流式細(xì)胞分析或者以1%的多聚甲醛固定，4"C避光保存。
b) 間接免疫熒光檢測(cè)將目的細(xì)胞接種至平皿中，37°C 5%C02 貼壁培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)染erbB2胞外區(qū)基因及其突變體基因(erbB2基 因SwissProt注冊(cè)號(hào):P04626，胞外區(qū)為23位氨基酸到652位氨基酸， 突變體構(gòu)建參看圖9A所示N端缺失突變體erbB2-C為erbB2胞外 區(qū)基因缺失含Dl及D2結(jié)構(gòu)域的23到302位氨基酸，C端缺失突變 體erbB2-N為erbB2胞外區(qū)基因缺失含D3及D4結(jié)構(gòu)域的306到652 位氨基酸；目的基因通過(guò)酶切位點(diǎn)Xho I和Hind III構(gòu)建到pEGFP-Nl
(Ckmetech公司產(chǎn)品)載體上，獲得的載體分別命名為 pEGFP-Nl-erbB2、 pEGFP隱Nl-erbB2-N、 pEGFP-Nl-erbB2-C)。繼續(xù) 培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞。緩沖液(PBS+2。/。胎牛血清)洗滌后，加入 一抗，4"C反應(yīng)30mins;緩沖液洗滌2次，加入相應(yīng)的二抗，4t:避 光反應(yīng)30mins，緩沖液洗滌2次后利用流式細(xì)胞分析，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié) 果。
c) 抑制生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)以erbB2陽(yáng)性細(xì)胞作為靶細(xì)胞，加入不同濃 度的抗體作用于靶細(xì)胞，設(shè)立陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照及實(shí)驗(yàn)組；作用 24h后，以MTT法測(cè)定抗體對(duì)靶細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性。
d) 抗體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)(ADCC):標(biāo)記erbB2陽(yáng)性細(xì)胞作為 靶細(xì)胞，用淋巴細(xì)胞分離液從外周血中分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞；根據(jù)相應(yīng)比例混合后，加入不等量的抗體，于圓底96孔
培養(yǎng)板上進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，設(shè)立實(shí)驗(yàn)孔、靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔、最大釋放
孔及背景孔；37°C孵育2h。利用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算殺傷率。


圖l基因全合成PCR技術(shù)示意圖。
圖2基于erbB2胞外區(qū)晶體結(jié)構(gòu)(PDB code:ln8y)，依次選擇CVFF、 Amber力場(chǎng)，利用力學(xué)優(yōu)化方法通過(guò)分子模擬獲得的erbB2胞外區(qū)理 論空間構(gòu)象飄帶結(jié)構(gòu)。
圖3利用erbB2與Herceptin作用晶體結(jié)構(gòu)，通過(guò)力學(xué)優(yōu)化、常溫動(dòng) 力學(xué)模擬獲得的抗原(erbB2)與抗體(Herceptin)相互作用復(fù)合物 理論空間結(jié)構(gòu)。
圖4合理確定的erbB2胞外區(qū)C-端功能表位分布結(jié)構(gòu)。
圖5 利用計(jì)算機(jī)分子設(shè)計(jì)及虛擬篩選獲得的抗體HF1與抗原
erbB2相互作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。
圖6重疊PCR技術(shù)全合成抗體基因。M:標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照；VH表 示抗體的重鏈可變區(qū)基因，分子量約為350bp; VL表示抗體的輕鏈 可變區(qū)基因，分子量大小約為320bp。
圖7表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析。A圖顯示非還原的SDS-PAGE分析 結(jié)果，表達(dá)產(chǎn)物分子量為155KDa，提示表達(dá)產(chǎn)物與抗體分子量一致;B圖結(jié)果顯示，表達(dá)產(chǎn)物在還原條件下的SDS-PAGE分析呈現(xiàn)55 KDa 及25KDa兩個(gè)條帶，具有典型的抗體特征；提示獲得的表達(dá)產(chǎn)物為 抗體。
圖8抗體親和力分析。利用流式細(xì)胞分析技術(shù)測(cè)定抗體的親和力， 結(jié)果提示HF1高親和力地結(jié)合靶細(xì)胞，并且抗體的親和力優(yōu)于 Hercepin。
圖9抗體識(shí)別特異性的鑒定?？贵wHF1可特異性結(jié)合erbB2陽(yáng)性腫 瘤細(xì)胞SKOV3、 MCF7、 SKBR3，其結(jié)合的活性與上市抗體Herceptin 類似(陰影圖形表示對(duì)照，空白圖形表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。 圖10抗體HF識(shí)別表位的鑒定。A: erbB2以及缺失突變體的構(gòu)建， B:與Herceptin —致，HF1能特異性識(shí)別erbB2以及N端缺失突變 體erbB2-C，而與erbB2胞外區(qū)C端缺失突變體erbB2-N不反應(yīng)；提 示設(shè)計(jì)篩選獲得的抗體HF可以特異地結(jié)合erbB2胞外區(qū)C端表位(圖 中細(xì)線表示對(duì)照結(jié)果，粗線表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果；)。
圖11 抗體HF1體外抑制erbB2陽(yáng)性細(xì)胞增殖。A:抗體抑制SKOV3 細(xì)胞增殖，B;抗體抑制MCF7細(xì)胞增殖，C:抗體抑制SKBR3細(xì)胞增殖。
圖12抗體HF1體外通過(guò)介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷erbB2陽(yáng)性細(xì)胞，A: 抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷SKOV3細(xì)胞，B;抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺 傷MCF7細(xì)胞，C:抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷SKBR3細(xì)胞。 圖13目的抗體的親和力與Herceptin相近。
圖14抗體體外抑制erbB2陽(yáng)性細(xì)胞增殖。A:抗體抑制SKOV3細(xì)胞增殖，B;抗體抑制MCF7細(xì)胞增殖，C:抗體抑制SKBR3細(xì)胞增殖。
圖15抗體體外通過(guò)介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷erbB2陽(yáng)性細(xì)胞，A:抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷SKOV3細(xì)胞，B:抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷SKBR3細(xì)胞，C:抗體介導(dǎo)ADCC效應(yīng)殺傷MCF7細(xì)胞。圖16計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)獲得的抗erbB2人源抗體的設(shè)計(jì)流程。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一抗erbB2抗體的合理設(shè)計(jì)
一、材料
InsightII 2005程序包(MSI分子模擬，San Diego)，該程序包
包括
Homology同源模建；Discover力學(xué)優(yōu)化；Discover—3常溫動(dòng)力學(xué)模擬；Docking分子對(duì)接；Delphi表觀靜電勢(shì)能分析。Ludi分子設(shè)計(jì)程序(1995);IBM圖形工作站；
PDB 2008數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)絡(luò)www.rcsb.org下載)；SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)(2008，網(wǎng)絡(luò)下載)；Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)(2001，網(wǎng)絡(luò)下載)；
13IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)(2008，網(wǎng)絡(luò)下載)。
二、方法結(jié)果
1、 抗原erbB2胞外區(qū)空間構(gòu)象模擬
利用已有的erbB2胞外區(qū)晶體結(jié)構(gòu)(PDB code: ln8y)，在同源模建方法的基礎(chǔ)上，合理加氫并附合適的力場(chǎng)參數(shù)，依次選擇最陡下降、共軛梯度對(duì)erbB2胞外區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，獲得常溫穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)參數(shù)合理的理論空間構(gòu)象(圖2)。
借助主鏈碳原子均方根位移評(píng)判方法，將理論獲得的erbB2胞外區(qū)結(jié)構(gòu)與其晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)疊合，計(jì)算獲得的RMSD (Root MeanSquare Distance,均方根位移)值為0.028nm，提示優(yōu)化獲得的結(jié)構(gòu)是合理的。
2、 erbB2胞外區(qū)C-端功能表位的合理確定
借助已有的erbB2胞外區(qū)與Hercepti,相互作用晶體結(jié)構(gòu)(PDBcode:ln8z)，選擇CVFF、 Amber力場(chǎng)經(jīng)最陡下降、共軛梯度對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行力學(xué)優(yōu)化，獲得復(fù)合物穩(wěn)定理論構(gòu)象(圖3)。
利用距離幾何學(xué)、計(jì)算機(jī)圖形學(xué)技術(shù)，通過(guò)分子間氫鍵形成理論、VanderWaals相互作用，對(duì)獲得的復(fù)合物穩(wěn)定構(gòu)象進(jìn)行理論分析，確定erbB2胞外區(qū)C-端功能表位(圖4)。
3、 新型抗erbB2抗體分子設(shè)計(jì)
利用確定的erbB2胞外區(qū)C-端功能表位的結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)Ludi程序經(jīng)片段生長(zhǎng)方法設(shè)計(jì)能夠識(shí)別該特征表位的短肽序列；利用從頭搭建與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)連用模擬拮抗短肽的空間構(gòu)象。借助源自網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB、 SwissProt、 TrEMBL、 Kabat、 IMGT
獲得的抗體序列信息構(gòu)成的人源抗體可變區(qū)框架結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)，與上述拮抗短肽合理組合拼接構(gòu)成新型人源抗體可變區(qū)。利用設(shè)計(jì)的抗體可變區(qū)序列經(jīng)同源模建技術(shù)搭建其空間構(gòu)象。
利用分子對(duì)接方法構(gòu)建抗體可變區(qū)與抗原erbB2相互作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。在考慮溶劑效應(yīng)的前提下，通過(guò)常溫動(dòng)力學(xué)模擬獲得抗體與抗原相互作用的復(fù)合物模型，通過(guò)相互作用能確定能夠作用于抗原erbB2的抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步優(yōu)化獲得的新型人源抗體可變區(qū)氨基酸序列，最終獲得六條耙向erbB2的重鏈氨基酸序列(SEQ一IDNO:1、 SEQ—IDNO: 2、 SEQ—IDNO: 3、 SEQ—IDNO: 4、 SEQ—IDNO:5和SEQ_IDNO: 6)以及六條輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQ—ID NO:7、 SEQ一IDNO: 8、 SEQ_IDNO: 9、 SEQ—ID NO: 10、 SEQJDNO:11禾卩SEQ—ID NO: 12)。
實(shí)施例二抗erbB2抗體HF1的制備及其功能驗(yàn)證
一、材料-
引物設(shè)計(jì)軟件為biosim軟件，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；Pyrobest DNA polymerase為T(mén)AKARA公司產(chǎn)品；dNTP為T(mén)AKARA公司產(chǎn)品；pGEM-T Easy vector system為Invitrogen公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；基因測(cè)序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成；抗體真核表達(dá)載體pTGS-FRT-DHFR由本公司構(gòu)建并申請(qǐng)國(guó)家專利(專利授權(quán)號(hào)ZL200510064335.0);脂質(zhì)體、MTT為Invitrogen公司產(chǎn)品，羊抗人IgG、及辣根酶標(biāo)記的羊抗人IgG及人IgG為本公司制備；pEGFP-Nl載體為Clonetech公司產(chǎn)品；內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品；SKV03、 MCF7、 SKBR3購(gòu)自ATCC; DELFIAEuTDA細(xì)胞毒作用試劑盒為PE公司產(chǎn)品；其他試劑為市購(gòu)產(chǎn)品。
二、方法結(jié)果
1、 抗體與抗原相互作用的復(fù)合物模型搭建
隨機(jī)選擇SEQJD NO: 1及SEQ一ID NO: 7分別作為抗體HF1的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，經(jīng)同源模建技術(shù)搭建其空間構(gòu)象。利用分子對(duì)接方法構(gòu)建抗體可變區(qū)與抗原erbB2相互作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。在考慮溶劑效應(yīng)的前提下，通過(guò)常溫動(dòng)力學(xué)模擬獲得抗體與抗原相互作用的復(fù)合物模型，通過(guò)相互作用能確定能夠作用于抗原erbB2的抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)。圖5給出了抗體HF1與抗原erbB2相互作用的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。
2、 抗體基因全合成
2. 1抗體氨基酸序列通過(guò)反向翻譯獲得核苷酸序列
選擇在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用頻率較高的密碼子，將計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)篩選獲得的抗體輕重鏈可變區(qū)氨基酸序列反向翻譯，獲得抗體的可變區(qū)核苷酸序列。根據(jù)構(gòu)建抗體真核表達(dá)載體需要，在抗體輕鏈可變區(qū)基因5'端及3'端分別引入EcoRV和XhoI酶切位點(diǎn)；在抗體重鏈鏈可變區(qū)基因5，端及3，端分別引入PvuII和BstEII酶切位點(diǎn)。2. 2引物設(shè)計(jì)
根據(jù)基因全合成的原理，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)引物，考慮引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)、GC含量等相關(guān)參數(shù)。每條基因設(shè)計(jì)10條引物，分另IJ編號(hào)為P1、 P2、 P3、 P4、 P5、 P6、 P7、 P8、 P9及PIO，用于基因全合成。2. 3全基因合成1)引物合成后以無(wú)菌水稀釋，方法如下
a) 取引物管12000RPM離心2mins，引物按100liM的濃度稀釋，-20。C保存；
b) 取少量引物P2 P9混合成終濃度為IOUM作為使用液；
c) 取少量引物P1和P10混合稀釋成終濃度為10uM作為使用
液P1/P10;
2)基因全合成，采用PyrobestDNApolymerase,方法如下
a) 取1 u LP2 P9混合引物作為模板，配制如下重疊PCR體系P2 P9混合引物 lyL
dNTP 3 u L
10 X Buffer 5uLPyrobest DNA polymerase 0.3 P LPl/P10引物 4iiL (引物先不加)
無(wú)菌水補(bǔ)足總體積為50 "L
b) 將以上PCR體系進(jìn)行如下反應(yīng)95 °C
94 °C
62 °C
72 °C
72 。C
5mins
30s
30s
30s j
7mins
7個(gè)循環(huán)
反應(yīng)結(jié)束后，降到室溫。加入引物P1/P10，進(jìn)行如下PCR反應(yīng):
95 °C
94 °C
5mins
30s
62°C 30s > 25個(gè)循環(huán)
72 °C
72 。C
30s ,
7mins
反應(yīng)結(jié)束后，降到室溫。
c ) 1 ~2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，抗體重鏈基因回收350bp大小片段，輕鏈基因回收320bp大小片段。
d)回收加尾(Pyrobest DNA polymerase不能在PCR產(chǎn)物3'端加尾A，所以不能直接連接T載體)，作如下10"L體系回收片段 8.2pL
10 X Buffer
dNTP 0.5 jxL
普通Taq酶 0.3 |iL反應(yīng)條件如下72°C 20mins，反應(yīng)結(jié)束后，降到室溫(e)取加尾產(chǎn)物，連接pGEM-TEasy載體加尾產(chǎn)物 4.2 PL2X連接Buf 5"T載體 0單T4連接酶 0.3pL室溫連接2h或者4'C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，涂布在含有100|ig/mL氨卞青霉素(終濃度)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的克隆在含有100嗎/mL氨卞青霉素(終濃度)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒(博大泰克公司)提取質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒進(jìn)行核酸測(cè)序鑒定。
重疊PCR擴(kuò)增后經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得特異大小的目的條帶(圖6);產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收、加尾、克隆等分子生物學(xué)技術(shù)，成功克隆入pGEM-TEasy載體；經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定，合成的基因與目的序列一致，獲得的載體分別命名為pGEM-T- HF1VL和pGEM-T-HF1VH。
3、抗體的表達(dá)
3. 1抗體真核表達(dá)載體的構(gòu)建
選擇本公司獲得的含有人IgGl抗體恒定區(qū)基因的表達(dá)載體pTGS-FRT-DHFR (專利授權(quán)號(hào)ZL200510064335.0)作為本發(fā)明抗體的表達(dá)載體。將實(shí)施例一所述獲得的抗體輕重鏈可變區(qū)基因克隆載體用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化(重鏈可變區(qū)基因用PvuII和BstEII消化，輕鏈可變區(qū)基因用EcoRV和Xhol消化)后，與經(jīng)相同內(nèi)切酶消化 的載體連接。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)常用技術(shù)，構(gòu)建獲得真核表達(dá)載
體。具體實(shí)施如下
a) 取pGEM-T-HFlVL用EcoRV禾卩Xho I消化；
b) 取l昭pTGS-FRT-DHFR載體，用EcoRV禾n Xhol消化。用 DNA連接酶T4連接所得的經(jīng)EcoR V及Xho I消化的 pTGS-FRT-DHFR載體和用EcoRV及Xho I消化的抗體輕鏈可變區(qū) 基因。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，涂布在含有100pg/mL氨卞青 霉素(終濃度)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的克隆在含有100|ag/mL 氨卞青霉素(終濃度)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒
(博大泰克公司)提取質(zhì)粒。所提取的質(zhì)粒經(jīng)EcoRV和Xhol消化 后，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，選擇一個(gè)攜帶有抗體輕鏈可變區(qū)基 因的克隆。作為上述程序的結(jié)果，獲得的攜帶抗erbB2人源抗體輕鏈 可變區(qū)基因的質(zhì)粒pTGS-HFlVL。
d) 取pGEM-T-HFlVH用Pvu II和BstE II消化；
e) 取l嗎pTGS-HFlVL載體，用Pvu II和BstE II消化。用DNA 連接酶T4連接所得的經(jīng)Pvu11禾B BstEII消化的pTGS-HFlVL載體 和用Pvu II和BstE II消化的抗體重鏈可變區(qū)基因。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 JM109大腸桿菌，涂布在含有l(wèi)OOpg/mL氨卞青霉素(終濃度)的LB 瓊脂培養(yǎng)基上。獲得的克隆在含有100^ig/mL氨卞青霉素(終濃度) 的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒(博大泰克公司)提取 質(zhì)粒。所提取的質(zhì)粒經(jīng)PvuII和BstEII消化后，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，選擇一個(gè)攜帶有抗體重鏈可變區(qū)基因的克隆。
作為上述程序的結(jié)果，在pTGS-HFlVL基礎(chǔ)上獲得的攜帶抗 erbB2人源抗體重鏈可變區(qū)基因的質(zhì)粒pTGS-HFl 。
3. 2抗體表達(dá)
將獲得的真核表達(dá)載體，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至 CHO細(xì)胞，48h后收獲上清，通過(guò)雙夾心ELISA法以及SDS-PAGE 等實(shí)驗(yàn)分析目的抗體的表達(dá)情況。
利用羊抗人IgG以及辣根酶標(biāo)記的羊抗人IgG進(jìn)行雙夾心ELISA 法檢測(cè)上清中抗體的含量，以未轉(zhuǎn)染上清作為陰性對(duì)照，人IgG純品 作為標(biāo)準(zhǔn)品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)獲得的目的蛋白可以被羊抗人IgG 抗體識(shí)別，含有人IgG抗體的恒定區(qū)，具有人IgG抗體特征。以非還 原的形式進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示表達(dá)的目的蛋白約為 155KDa，符合抗體的分子量(圖7A)。還原形式進(jìn)行的SDS-PAGE 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，目的蛋白在還原條件下呈兩條特異性條帶，分別為 55KDa和25KDa (圖7B)，具有典型的抗體特征。提示獲得的抗體 序列經(jīng)過(guò)反向翻譯得到的基因在真核細(xì)胞中可成功表達(dá)，表達(dá)獲得的 蛋白為抗體分子，具有典型的IgG抗體特征。
4、 抗體的功能鑒定
4. 1 HF1單克隆抗體的識(shí)別鑒定
SKV03細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞系，細(xì)胞表面表達(dá)大量的erbB2抗原， 利用該細(xì)胞對(duì)獲得的抗體HF1進(jìn)行功能鑒定。流式細(xì)胞分析結(jié)果(圖8)顯示，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)獲得的耙向erbB2抗原的HF1可以特 異性識(shí)別SKV03細(xì)胞，并且抗體的親和力優(yōu)于Hercepin。
進(jìn)一步鑒定HF1的識(shí)別活性，流式細(xì)胞分析結(jié)果(圖9)顯示， 該抗體可以特異性地識(shí)別SKV03、 MCF7、 SKBR3等腫瘤細(xì)胞系。
將erbB2胞外區(qū)及跨膜區(qū)基因構(gòu)建在pEGFP-Nl載體上，與EGFP 融合表達(dá)；同時(shí)構(gòu)建erbB2胞外區(qū)N端缺失突變體erbB2-C以及erbB2 胞外區(qū)C端缺失突變體erbB2-N。將這些載體分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后， 通過(guò)間接免疫熒光觀察抗體HF1對(duì)其識(shí)別功能。結(jié)果顯示(圖IO)， HF1能特異性識(shí)別erbB2以及N端缺失突變體erbB2-C，而與erbB2 胞外區(qū)C端缺失突變體erbB2-N不反應(yīng)；提示設(shè)計(jì)篩選獲得的抗體 HF可以特異地結(jié)合erbB2胞外區(qū)C端表位。 4. 2抑制及殺傷腫瘤細(xì)胞功能
利用SKV03、 MCF7、 SKBR3等腫瘤細(xì)胞系對(duì)獲得的抗體抑制 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及殺傷腫瘤細(xì)胞的功能進(jìn)行驗(yàn)證。
利用SKV03、 MCF7、 SKBR3進(jìn)行生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)(圖11)，與人 IgG對(duì)照組相比較，目的抗體具有明顯的抑制SKV03、 MCF7及 SKBR3細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，并且抑制活性與陽(yáng)性對(duì)照Hercetpin類似； 同時(shí)，與erbB2在SKV03、 MCF7及SKBR3細(xì)胞上表達(dá)的豐度呈正 相關(guān)性，抗體HF對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率SKV03〉SKBR3〉MCF7。
ADCC實(shí)驗(yàn)中以標(biāo)記的SKV03、 MCF7、 SKBR3細(xì)胞為靶細(xì)胞， 以人外周血單個(gè)核細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)效靶比為50: 1時(shí)，抗體都能 有效殺傷靶細(xì)胞；抗體濃度為20嗎/mL時(shí)，殺傷率可達(dá)50%左右(圖12)，對(duì)于erbB2低表達(dá)的MCF7細(xì)胞，抗體介導(dǎo)的殺傷率(約30%) 明顯低于SKBR3及SKV03細(xì)胞；結(jié)果與陽(yáng)性對(duì)照Hercetpin類似。
實(shí)施例三抗erbB2抗體HF2、 HF3、 HF4、 HF5、 HF6的制備及其
功能驗(yàn)證
根據(jù)實(shí)施例二所述的方法，隨機(jī)選擇SEQ—IDNO: 2及SEQ一ID NO: 8分別作為抗體HF2的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ一ID NO: 3及SEQ—ID NO: 9分別作為抗體HF3的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨 基酸序列；SEQ—ID NO: 4及SEQJDNO: 10分別作為抗體HF4的 重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQ—ID NO: 5及SEQ_ID NO: 11 分別作為抗體HF5的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列；SEQJDNO: 6 及SEQ_ID NO: 12分別作為抗體HF6的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序 列；利用計(jì)算機(jī)輔助分析，考察這些抗體與靶抗原erbB2的復(fù)合物作 用模式的合理性。利用實(shí)施例二所述的方法，對(duì)抗體的氨基酸序列進(jìn) 行反向翻譯、全基因合成，進(jìn)而對(duì)抗體進(jìn)行表達(dá)以及功能鑒定。
獲得的靶向erbB2抗原的抗體均可以特異性識(shí)別SKV03細(xì)胞， 并且抗體的親和力與Hercepin相近(圖B:)。
利用SKV03、 MCF7、 SKBR3等腫瘤細(xì)胞系對(duì)獲得的抗體抑制 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及殺傷腫瘤細(xì)胞的功能進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與人IgG 對(duì)照組相比較，目的抗體均具有明顯的抑制SKV03、MCF7及SKBR3 細(xì)胞生長(zhǎng)的活性，并且抑制活性與陽(yáng)性對(duì)照Herc鄰in類似(圖14)。ADCC實(shí)驗(yàn)中，以標(biāo)記的SKV03、 MCF7、 SKBR3細(xì)胞為靶細(xì)胞， 以人外周血單個(gè)核細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，當(dāng)效靶比為50: l時(shí)，抗體都能 有效殺傷靶細(xì)胞；抗體濃度為20pg/mL時(shí)，殺傷率可達(dá)50%左右(圖 15);對(duì)于erbB2低表達(dá)的MCF7細(xì)胞，抗體介導(dǎo)的殺傷率略低于 SKBR3及SKV03細(xì)胞，約為40%;結(jié)果與陽(yáng)性對(duì)照Hercetpin類似。序列表
<110>北京天廣實(shí)生物技術(shù)有限公司
中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 <120>基于erbB2蛋白胞外區(qū)C-端功能表位特征設(shè)計(jì)抗erbB2功能抗體 <160> 12
<210> 1 <211> 121 <212> PRT
<213>人工序歹lj <220>
<223>抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Ser
1 5 Glu Ala Met Lys Val Thr Cys Ala 20
Glu Thr Phe lie His Trp Val Arg 35
Glu Trp Val Gly Trp lie Phe Pro 50
Ala Asp Ser Val Lys Ser Gln Val 65
Ser Lys Asn Gln Ala Ser Met Glu 80
Thr Thr Ala Val Tyx Tyx Cys Thr 95
Tyx Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 110
Ala 121
Ala Glu Val Lys Lys Pro Ser
10 15 Ala Tyx Glu Tyx Thr lie Ser
25 30 Gln Pro Pro Ser Gln Ala Leu
40 45 Ser Gln Ala Phe Ser Arg Phe
55 60 lie Met Ser Thr Val Asn Thr
70 75 Leu Asn Ser Leu Arg Ala Ala
85 90 Lys Tyr Ala Phe Glu Ser Tyx 100 105 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
115 120
<210> 2 <211> 120<212> PRT <213>人工序歹l」 <220>
<223>抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 2
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Ser Ala Glu 15 10 Gly Ser Met Ser Leu Ser Cys Lys Val Tyr
20 25 Asp Ser Tyr lie His Trp lie Arg Thr Ala
35 40 Glu Trp Met Ser Trp lie Tyr His Thr Asn
50 55 Asn Pro Pro Val Lys Ser Gin工le Ala Val
65 70 lie Lys Gin Ala Phe Leu Gin Met Ser Ser
80 85 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gin Ser
95 100 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu 110 115
Leu Val Lys Lys Thr 15
Gly Phe Asn工le Ser
30
Pro Ser Gin Gly Leu
45
Ala Tyr Ser Arg Tyr
60
Ser Ala Asp Asn Ser
75
Leu Lys Ser Asp Asp 90
Gly Glu Phe Ser Tyx 105
Val Thr Val Ser Ala 120
<210> 3 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 3
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Ser Ala Gly 15 10 Glu Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser
20 25 Asn Ser Phe工le His Trp Val Arg Thr Ala
35 40 Glu Trp Met Gly Arg Leu Phe His Ser Gin
Val Val Gin Ala Gly 15
Ala Tyr Gin Leu Arg
30
Pro Gly Lys Ala Leu
45
Gly Phe Asn Arg Phe
2650 55 60
Asn Pro Pro Val Lys Gly Arg Ser Met Ser Ser Arg Asp Asn Ser
65 70 75
lie Asn Gin Ala Tyx Met Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Ala Asp
80 85 90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Ala Glu Asp Ala Tyr Tyr
95 100 105
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
110 115 120
<210> 4 <211> 120 <212> PRT
<213>人工序歹lj <220>
<223>抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 4
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 15 10 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25 Asp Thr Tyr lie His Trp Val Arg Gin Ala
35 40 Glu Trp Val Gly Arg lie Tyr Pro Thr Asn
50 55 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie
65 70 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser
80 85 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly
95 100 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 110 115
Leu Val Lys Pro Gly
15
Gly Phe Asn lie Lys
30
Pro Gly Lys Gly Leu
45
Gly Tyx Thr Arg Tyr
60
Ser Arg Asp Thr Ser
75
Leu Arg Ala Glu Asp
90
Gly Asp Gly Phe Tyx 105
Val Thr Val Ser Ser 120
<210> 5 <211> 119<212> PRT
<213>人工序歹U <220>
<223>抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 5
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Gly Ala 15 10 Gin Thr Leu Ser Val Thr Cys Lys Val Ser
20 25 Ser Ser Thr Tyr工le Ala Trp Leu Arg Gin
35 40 Leu Glu Ser Met Ser Arg Thr Ser Tyx Ser
50 55 Tyx Ser Gin Lys Phe Gin Ser Arg Val Thr
65 70 Ser Thr Ser Thr Phe Met Met Lys Met Arg
80 85 Asp Gly Gly Leu Tyr Tyr Cys Val Lys Phe
95 100 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 110 115
Leu Lys Glu Pro Tyr Glu Tyr Ser Pro Pro Gly Lys Asp Gly Ser Thr Met Thr Ala Asp Ser Val Lys Ala Gly Ala Asp Gly Thr工le Ser Ser
Ser
15 Val
30 Gly
45 Tyx
60 Asp
75 Asp
90 Tyr 105
<210> 6 <211> 120 <212> PRT
<213>人工序歹U <220>
<223>抗體重鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 6
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly
1 5 Glu Ala Met Arg Leu Thr Cys Ala 20
Ser Ser Tyr lie Gin Trp Val Arg 35
Glu Trp Val Gly Arg Gly Tyr His
Gly Gly Val Val Gin Pro Gly 10 15
Ala Tyr Gly Tyr Ser lie Arg 25 30
Thr Ala Pro Ser Lys Gly Leu 40 45
Ser Gin Ala Phe Ser Arg TyrSer Gin Pro Val 工le Lys Gin Leu Gly Gly Val Tyr Ala Met Asp Tyr
50 55 Gin Ser Arg Phe Ala Val
65 70 Tyx Leu Gin Leu Asn Ser
80 85 Tyr Cys Val Arg Trp Ala
95 100 Trp Gly Ser Gly Thr !Leu 110 115
60
Thr Ala Asp Thr Ser
75
Leu Arg Ala Ala Thr
90
Gly Glu Gly Tyr Tyr 105
Val Thr Val Ser Ala 120
<210> 7 <211> 108 <212> PRT <213>人工序歹U <220>
<223>抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 7
Gin工le Gin Leu Thr Gin Thr Pro Ala lie Met Pro Val Ser Pro
15 10 15
Gly Asp Lys Ala Thr Met Thr Cys Lys Ser Asn Se:r Ser Asp lie
20 25 30
Val Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Leu Gin Lys Ser Asp Thr Pro Val
35 40 45
Arg Arg Trp Val His Tyr Ala Ser Asn Leu Ala Ser Glu工le Ser
50 55 60
Ser Ser Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Arg Gin Asp Tyr Ser Leu Thr
65 70 75
Val Asn Arg Leu Gin Pro Glu Asp Ala Gly Val Phe Phe Cys Phe
80 85 90
Asn Ser Phe Ser Tyr Pro Pro Ser Phe Gly Ala Gly Ser Lys Val
95 100 105
Val lie JLys 108
<210> 8 <211> 106 <212> PRT<213>人工序歹lj <220>
<223>抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 8
Asp Val Gin Thr Gin Thr Pro Ala Ser Leu Pro
15 10 Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gin
20 25 Ala Thr Val Trp Tyr Gin His Arg Pro Glu Gin
35 40 Leu Val Tyr Asp Gly Thr Phe lie Tyr Thr Gly
50 55 Phe Lys Gly Ser Arg Tyr Gly Thr Ser Phe Ser
65 70 Arg Leu Glu Gin Asp Asp Phe Gly Val Tyr Phe
80 85 Phe Thr Ser Pro Ser Ser Phe Gly Ser Gly Thr
95 100
Arg 106
Ala Thr Leu Thr lie Asn Pro Val Lys Val Pro Glu Phe Thr Val Cys Phe Gin Lys Lieu Glu
Gly
15 Ser
30 Arg
45 Arg
60 Asn
75 His
90 Lieu 105
<210> 9 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 9
Gin lie Gin Thr Gin Gin Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Pro
15 10 15
Gly Asp Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Asn Ser 工le Thr
20 25 30
Thr Ala Val Ala Trp Phe Leu Gin Arg Gin Asp Gin Pro Val Lys
35 40 45
Arg Leu Val Tyr Asp Gly Ser Phe Leu Tyr Thr Gly Val Pro Glu
50 55 60
Ser Leu Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val65
Asn Arg Leu Glu Gin Asp Asp Ala 80
Ser Phe Ser Thr Ser Ser Thr Phe 95
工le Arg 107
70 75 Gly Val Tyr Phe Cys Gin Gin
85 90 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
100 105
<210> 10 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220>
<223>抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列 <400> 10
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro
1
Gly Glu Arg Val
Thr Ala Val Ala
Leu Leu lie Tyx
Axg Phe Ser Gly
Ser Ser Val Glu
His Tyx Ser Thr
lie Lys 107
5
Thr lie Ser Cys 20
Trp Tyr Gin Gin 35
Ser Ala Ser Tyr 50
Ser Gly Ser Gly 65
Ala Glu Asp Ala 80
Pro Pro Thr Phe 95
Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu
10 15 Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser
25 30 Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys
40 45 Leu Phe Ser Gly Val Pro Asp
55 60 Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie
70 75 Ala Thr Tyr Ty:r Cys Gin Gin
85 90 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 100 105
<210> 11 <211> 106 <212> PRT
<213>人工序歹'J <220>
31<223>抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列 <楊> 11
Gin Val Val Met Thr Gin Thr Pro Ala Ser 15 10 Gly Asp Arg Ala Thr lie Thr Cys Lys Ser
20 25 Gin Ala lie Thr Trp Tyr Gin Gin Arg Pro
35 40 Leu Leu Val Tyr Asp Gly Thr Phe lie Tyr
50 55 Ser Leu Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
65 70 Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ala Ala Val
80 85 Ser Phe Tyr Ser Pro Ser Thr Phe Gly Gly
95 100
Axg 106
Met Ser Ala Thr Leu 15
Thr Asn Ser lie Ser 30
Glu Gin Pro Val Lys 45
Thr Gly Val Pro Ser 60
Tyr Thr Phe Thr Val 75
Tyr Phe Cys Gin Gin 90
Gly Thr Leu Glu lie 105
<210> 12 <211> 107 <212> PRT <213>人工序歹lj <220>
<223>抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸序列 <權(quán)> 12
Met Thr Gin Thr Pro Ser Ser
Gin lie Val
1 5 Gly Glu Lys Ala Thr Met
Ser Ala Thr Ala
20 Trp 35 Ser 50 Ser 65
Ser Ser Leu Gin Pro Asp
Leu Leu Val
Arg Phe Ser
Tyr Gly
Tyr Gly Gly
10
Ser Cys Arg Ala 25
Leu Gin Lys Ser 40
Thr Tyr lie Phe 55
Ser Gly Gin Asp 70Asp Phe Gly Val
Leu Ser Val Ser Leu
15
Thr Asn Ser Val Ser
30
Gly Thr Ser Pro Arg
45
Ser Gly lie Pro Glu
60
Phe Thr Phe Thr Val
75
Tyr Tyr Cys Phe AsnHis Phe Thr Ser Pro Pro Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105lie Arg 10權(quán)利要求
1.一種抗erbB2人源抗體，其特征在于重鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ_ID NO1、SEQ_ID NO2、SEQ_ID NO3、SEQ_ID NO4、SEQ_ID NO5或SEQ_ID NO6；其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ_ID NO7、SEQ_ID NO8、SEQ_ID NO9、SEQ_ID NO10、SEQ_ID NO11或SEQ_ID NO12。
2. 權(quán)利要求1所述的抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ—ID NO: 1;輕鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQJDNO: 7。
3. 權(quán)利要求1所述的抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ—ID NO: 2;輕鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ—IDNO: 8。
4. 權(quán)利要求1所述的抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQJD NO: 3;輕鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ—IDNO: 9。
5. 權(quán)利要求1所述的抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ一ID NO: 4;輕鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ—IDNO: 10。
6. 權(quán)利要求1所述的抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ—ID NO: 5;輕鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ—IDNO: 11。
7. 權(quán)利要求1所述的抗體，其重鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ—ID NO: 6;輕鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ一IDNO: 12。
8. 權(quán)利要求1所述抗體在表達(dá)erbB2的細(xì)胞不當(dāng)存活或者不當(dāng)增殖 相關(guān)疾病的診斷或治療藥物中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，其中不當(dāng)增殖相關(guān)疾病為腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于erbB2蛋白胞外區(qū)C-端功能表位結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)獲得新型抗erbB2人源抗體。其特征在于重鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ_ID NO1、SEQ_ID NO2、SEQ_ID NO3、SEQ_ID NO4、SEQ_ID NO5或SEQ_ID NO6；其輕鏈可變區(qū)氨基酸序列選自SEQ_ID NO7、SEQ_ID NO8、SEQ_ID NO9、SEQ_ID NO10、SEQ_ID NO11或SEQ_ID NO12。本發(fā)明提供的抗體可以特異性識(shí)別靶抗原及靶細(xì)胞；可以體外抑制靶細(xì)胞的增殖并介導(dǎo)ADCC活性殺傷靶細(xì)胞。
文檔編號(hào)C07K16/18GK101633695SQ20091013135
公開(kāi)日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2009年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月15日
發(fā)明者喬春霞, 馮健男, 明 呂, 沈倍奮, 白敏姿, 燕 黎 申請(qǐng)人:北京天廣實(shí)生物技術(shù)股份有限公司;中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所