專利名稱：識(shí)別cd3或4－1bb的抗體或基因介導(dǎo)的腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞活化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的方法，腫瘤疫苗及其相關(guān)組合物，制備這類疫苗及其相關(guān)組合物的方法，以及使用這些疫苗及其相關(guān)組合物的方法，例如體內(nèi)治療應(yīng)用。
背景技術(shù)：
以下的說明書包括了對(duì)理解當(dāng)前這項(xiàng)發(fā)明有用的信息。這并不是承認(rèn)此處提供的任何信息為現(xiàn)有技術(shù)，或者與當(dāng)前描述或要求的發(fā)明有關(guān)，或者明確引用的或無意間引用的任何出版物或者文件為現(xiàn)有技術(shù)。
人體腫瘤會(huì)表達(dá)多種腫瘤抗原，其中大多數(shù)抗原也存在于一些正常的組織中，盡管其表達(dá)水平很低(Hellstrom and Hellstrom，AdvCancer Res，12，167-223，1969；Cheever et al.，Immunol Rev，145，33-59，1995；Finn et al.，Immunol Rev，145，61-89，1995；Boon et al.，ImmunolToday，18，267-8，1997；Hellstrom and Hellstrom，Handbook ofExperimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。許多這些抗原在患腫瘤患者體內(nèi)是具有免疫原性的。例如，SEREX技術(shù)可以檢測(cè)多種腫瘤相關(guān)抗原的IgG抗體(Old and Chen，J.Exp.Med.，187，1163-1167，1998)，通過使用四聚物法能證實(shí)T細(xì)胞識(shí)別腫瘤抗原(Cassian et al.，J.Immunol.，162，1999)，通過在體外產(chǎn)生腫瘤選擇性T細(xì)胞克隆同樣可以證實(shí)這種識(shí)別(Boon，Coulie et al.，Immunol Today，18，267-8，1997)。這便為患者提供了進(jìn)行多種免疫治療的機(jī)會(huì)，包括給患者使用在體外擴(kuò)增的免疫T淋巴細(xì)胞(Rosenberg，Biologic Therapy of Cancer(Chapter 19)，487，1995)和治療性的腫瘤疫苗(Nestle et al.，Nat Med，4，328-32，1998；Rosenberget al.，Nat Med，4，321-7，1998；Greenberg，Adv Immunol，49，281-355，1991；Melief and Kast，Immunol Rev，145，167-77，1995；Pardoll，Curr Opin Immunol，8，619-21，1996；Hellstrom and Hellstrom，Handbook of Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。
小鼠腫瘤為開發(fā)更加有效的免疫治療提供了實(shí)用的疾病模型。它們會(huì)表達(dá)腫瘤破壞性免疫應(yīng)答的反應(yīng)對(duì)象，盡管這需要通過特定的實(shí)驗(yàn)操作來獲得能夠抵抗多數(shù)自發(fā)腫瘤的有效免疫應(yīng)答。(Greenberg，Adv Immunol，49，281-355，1991；Ken-and Mule，J.Leuko.Biol.，56，210-214，1994；Cheever，Disis et al.，Immunol Rev，145，33-59，1995；Finn，Jerome et al.，Immunol Rev，145，61-89，1995；Meliefand Kast，Immunol Rev，145，167-77，1995；Pardoll，Cun-Opin Immunol，8，619-21，1.996；Boon，Coulie et al.，Immunol Today，18，267-8，1997；Hellstrom and Hellstrom，Handbook of Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。
T淋巴細(xì)胞(CD8+和CD4+)在腫瘤破壞性的免疫應(yīng)答產(chǎn)生(通常也在完成)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，自然殺傷細(xì)胞和抗體，巨噬細(xì)胞也同樣參與了這個(gè)過程(Hellstrom and Hellstrom，Adv CancerRes，12，167-223，1969；Greenberg，Adv Immunol，49，281-355，1991；Meliefand Kast.Immunol Rev，145，167-77，1995；Hellstrom andHellstrom，Handbook of Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。由骨髓中的造血干細(xì)胞和血液中的單核細(xì)胞分化而來的樹狀突細(xì)胞(DC)的抗原遞呈是正常的(Huangct al..Science，264，961-5，1994)，在特定的情況下，這種抗原遞呈也可以由腫瘤細(xì)胞自身來完成(Chen et al..Cell，71，1093-102，1992；Schoenberger et al..Cancer Res，58，3094-100，1998)。促進(jìn)樹狀突細(xì)胞(DC)表達(dá)腫瘤抗原的操作步驟對(duì)獲得有效的腫瘤免疫至關(guān)重要，最近的數(shù)據(jù)表明，這種免疫使得對(duì)特定的人類腫瘤進(jìn)行更有效的治療成為了可能(參見，例如，(Kugler et al..Nature Medicine，6，332-，2000))。有著體外細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性的CD8+T淋巴細(xì)胞，與生成淋巴因子的輔助性T細(xì)胞的結(jié)合，對(duì)多數(shù)腫瘤的清除都是必要的(Hellstrom and Hellstrom，Handbook of ExperimentalPharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。盡管Th1和Th2應(yīng)答都是有利的(Rodolfo et al.，T Immunol，163，1923-8，1999)，但是Th1應(yīng)答在腫瘤的免疫清除方面仍舊扮演著主要的角色(Hu etal.，J Immunol，161，3033-41，1998)。
要誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，就要進(jìn)行共刺激，特別是通過抗原遞呈細(xì)胞(APC)上的CD80和/或CD86，和T淋巴細(xì)胞上的CD28之間的相互作用，是這種誘導(dǎo)過程所必需的(Schwartz，Cell，57，1073-81，1989；June et al.，Immunol Today，11.211-6，1990；Linsley and Ledbetter，Annu Rev Immunol，11，191-212，1993)。這導(dǎo)致白介素-2，干擾素-γ和其他促進(jìn)免疫應(yīng)答的淋巴因子持續(xù)生成(Thompson et al.，Proc NatiAcad Sci USA，86，1333-7，1989)，用編碼淋巴因子的基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞可以達(dá)到上述相同的目的(Pardoll，Curr Opin Immunol，8，619-21，1996)。沒有通過CD28產(chǎn)生的二級(jí)信號(hào)，即便T細(xì)胞受體(TCR)與抗原相接觸，也不會(huì)誘發(fā)免疫應(yīng)答，甚至?xí)?dǎo)致無反應(yīng)。多數(shù)腫瘤不表達(dá)CD80或CD86(Chen，Ashe et al.，Cell，71，1093-102，1992；Yang et al.，J Immunol，154，2794-800，1995)，在抗原達(dá)到腫瘤轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，并被表達(dá)CD80和CD86的樹狀突細(xì)胞(DC)識(shí)別、加工并遞呈之前，不會(huì)誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答(Huang，Golumbek et al..Science，264，961-5，1994；Yang et al.，J Immunol，158，851-8，1997)。這便可以解釋為什么腫瘤在長(zhǎng)成團(tuán)塊之前通常在“在不被察覺的情況下通過”免疫系統(tǒng)的監(jiān)控。CD80和CD86不僅能與CD28結(jié)合，其與被激活的T細(xì)胞上的CTLA4之間的親和力更高。后面的這種結(jié)合會(huì)誘發(fā)一種能中止免疫應(yīng)答的負(fù)性信號(hào)(Thompson，Lindsten et al.，ProcNati Acad Sci USA，86，1333-7，1989；Walunas et al.，Immunity，1，405-13，1994；Krummel and Allison，J Exp Med，183，2533-40，1996；Leach et al..Science，271，1734-6，1996；Walunas et al.，J Exp Med，183，2541-50，1996；Allison et al.，Novartis Found Symp，215，92-8，1998)，這說明其與CD28的結(jié)合是有治療意義的，與CTLA4的結(jié)合則沒有。
盡管免疫系統(tǒng)有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫性的潛能，但它對(duì)消除已經(jīng)形成的腫瘤還是相對(duì)無效的。通過常規(guī)腫瘤疫苗，或通過在體外轉(zhuǎn)化的、具有抗腫瘤活性的免疫T細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，很難破壞數(shù)百萬個(gè)腫瘤細(xì)胞。已證實(shí)這種現(xiàn)象與一些逃避機(jī)制有關(guān)，這些逃避機(jī)制可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的攻擊(Hellstrom and Hellstrom，Handbookof Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999；Kiessling et al..Cancer Immunol.Immunother.，48，353-362，1999)。這些機(jī)制包括腫瘤抗原決定簇(Maeurer et al.，J Clin Invest，98，1633-41，1996)和/或可將這些抗原遞呈給腫瘤殺傷性T淋巴細(xì)胞(CTL)的I類主要組織相容性抗原(MHC)分子(Restifo，1993；Maeurer，1996；Hellstrom，1997；Garrido，1997；Johnsen，1998)的丟失，和通過細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的消除(Hahne et al.，Science，274，1363-1366，1996；Shirald et al.，Proc Nati Acad Sci USA，94，6420-5，1997；Bennett et al.，J Immunol，160，5669-75，1998；Kume etal.，Int J Cancer，84.339-43，1999)(Chappell and Restifo，CancerImmunol Immunother，47，65-71，1998)。然而，能夠表達(dá)免疫原性腫瘤抗原，且未誘導(dǎo)反應(yīng)性淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡的腫瘤，通常會(huì)從免疫監(jiān)控下逃脫。這歸功于各種由腫瘤和/或宿主細(xì)胞產(chǎn)生的“阻斷因子”，直接地，或者通過有、或沒有抗原決定簇選擇的抗原遞呈細(xì)胞(APC)，間接地作用于T細(xì)胞發(fā)揮作用。這些阻斷因子包括可溶性的腫瘤抗原和免疫復(fù)合物，以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)，前列腺素，一氧化氮(NO)等等(Hellstrom and Hellstrom，Adv Immunol，18，209-77，1974；Kehrl et al..J Exp Med，163，1037-50，1986；Sulitzeanu，AdvCancer Res，60，247-267，1993；Kiessling et al..Springer Semin.Immunopathol.，18，227-242，1996；Kiessling，Wasserman et al..CancerImmunol.Immunother.，48，353-362，1999)。在從發(fā)生能破壞腫瘤的Th1反應(yīng)(Hu.Urba et al.，J Immunol，161，3033-41，1998)向發(fā)生Th2反應(yīng)(Fiorentino et al.，J Exp Med，170，2081-95，1989)轉(zhuǎn)變的過程中，由腫瘤細(xì)胞釋放的抗原單獨(dú)或與抗體形成免疫復(fù)合物所導(dǎo)致免疫應(yīng)答的下調(diào)，并可能會(huì)伴隨產(chǎn)生TGF-β，繼而產(chǎn)生例如IL-10這樣的Th2淋巴因子(Wilbanks et al.，Eur J Immunol，22，165-73，1992；D′Orazioand Niederkom，J Immunol，160，2089-98，1998)。被激活的T淋巴細(xì)胞上的CTLA4與APC上的CD80/CD86或被激活的T細(xì)胞之間的相互作用也會(huì)導(dǎo)致這種下調(diào)(Leach，Krummel et al.，Science.271，1734-6，1996；Allison，Chambers et al.，Novartis Found Symp，215，92-8，1998)，TGF-β也可以介導(dǎo)這種下調(diào)(Chen et al.，J Exp Med，188，1849-57，1998)。已證實(shí)巨噬細(xì)胞在下調(diào)過程中所扮演的角色是生成一氧化氮(NO)和前列腺素(Kiessling，Wasserman et al..CancerImmunol.Immunother.，48，353-362，1999)。
許多報(bào)告中指出，在腫瘤浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞中，T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制通常會(huì)發(fā)生缺陷，這反應(yīng)了T細(xì)胞反應(yīng)性被抑制(Mizoguchi etal.，Science，258，1795-8，1992；Nakagomi et al..Cancer Res，53，5610-5612，1993；Kiessling，Wasserman et al..Cancer Immunol.Immunothcr.，48，353-362，1999)，把淋巴細(xì)胞從體內(nèi)取出后這種抑制可以恢復(fù)。
這里列舉了一些很大的腫瘤被免疫系統(tǒng)排斥時(shí)情況的圖解，例如，關(guān)于使用T細(xì)胞活化分子4-1BB治療小鼠腫瘤的報(bào)告(Melero etal.，Nat Med，3，682-5，1997；Melero et al.，Eur J Immunol，28，1116-21，1998)。但是，更驚人的實(shí)例可能來自對(duì)腎移植早期的觀測(cè)，在一些接受腎移植患者體內(nèi)，由取自尸體腎臟的腫瘤細(xì)胞發(fā)展而來的大轉(zhuǎn)移灶在去除免疫抑制之后完全痊愈了(Wilson et al.，N Engi J Med，278，479-83，1968；Matter et al.Transplantation，9，71-4，1970)。
細(xì)胞表面分子4-1BB，在活化的、而不是在天然的T細(xì)胞上表達(dá)(DeBenedette et al.，J Exp Med，181，985-92，1995；Shuford et al.，J ExpMed，186，47-55，1997)。4-1BB的參予可以放大已經(jīng)被誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。有報(bào)道說4-1BB與抗4-1BB的單克隆抗體相接觸后可以刺激被抗原激活的、有腫瘤特異性殺傷活性的CD8+T淋巴細(xì)胞增殖，刺激干擾素-γ(IFN-γ)和其他Th1型的細(xì)胞因子(白介素-2(IL-2)，腫瘤壞死因子(TNF-α))的生成/釋放，并刺激對(duì)抗細(xì)胞凋亡的T細(xì)胞的保護(hù)(Hurtadoet al.，J Immunol，158，2600-9，1997；Kirn et al.，Eur JImmunol，28，881-90，1998；Natoli et al.，Biochem Pharmacol，56，915-20，1998；Takahashi et al.，J Immunol，162，5037-40，1999；Tsushima et al.，Exp Hematol，27，433-40，1999)。另外，4-1BB有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，包括對(duì)NK 1.1細(xì)胞的調(diào)節(jié)(Melero et al..Cell Immunol，190，67-72，1998)。
也有報(bào)道指出，4-1BB的單克隆抗體有對(duì)抗小鼠體內(nèi)，包括低免疫原性的腫瘤在內(nèi)的已經(jīng)長(zhǎng)成的腫瘤(直徑大約10毫米)的活性，用抗4-1BB單克隆抗體治療的小鼠的淋巴細(xì)胞已經(jīng)生成了溶細(xì)胞活性增高的CD8+腫瘤特異性殺傷T細(xì)胞(Melero，Shuford et al.，NatMed，3，682-5，1997)。淋巴細(xì)胞與被轉(zhuǎn)染整合4-1BB配體(4-1BBL)的腫瘤細(xì)胞相接觸，該配體與4-1BB相結(jié)合，也可以顯著放大CD8+T淋巴細(xì)胞的應(yīng)答，將4-1BBL轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞當(dāng)作疫苗用于小鼠模型時(shí)是有治療活性的。然而，用抗4-1BB的單克隆抗體進(jìn)行治療的療效明顯優(yōu)于用表達(dá)4-1BBL的腫瘤細(xì)胞做疫苗治療的效果?？贵w治療對(duì)于治療非免疫原性的肉瘤Ag104是非常有效的(Melero，Shuford etal.，Nat Med，3，682-5，1997)，將Ag104細(xì)胞轉(zhuǎn)染并表達(dá)4-1BBL，再與表達(dá)CD80的細(xì)胞結(jié)合，便可獲得對(duì)抗這種腫瘤的療效(Melero，1998)。
有一種可選擇的增加腫瘤免疫性的方法，就是給患者使用一次抗-CD3單克隆抗體，這樣可以使多克隆T細(xì)胞活化，包括激活任何腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，已報(bào)道在一些用小鼠模型進(jìn)行的研究中，有一些采用這種方法治療的成功經(jīng)驗(yàn)(Ellenhom et al.，Science，242，569-71，1988)。
腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可以在體外生成后用于體內(nèi)，通過淋巴細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的腫瘤免疫性的轉(zhuǎn)移，預(yù)防來自各個(gè)腫瘤新生物的移植細(xì)胞過度生長(zhǎng)(Klein et al.，Cancer Res，20，1561-1572，1960)。以前曾有有關(guān)在免疫淋巴細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移之后排斥小的、已形成腫瘤的報(bào)道(Hellstrom et al.，Transplant Proc，1，90-4，1969)。過繼轉(zhuǎn)移的淋巴細(xì)胞會(huì)優(yōu)先定位在腫瘤周圍(Mule*et al.，J.Immunol.，123，600-606，1979)，將已被賦予免疫性的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)用于治療這項(xiàng)發(fā)明已擴(kuò)大了其體外應(yīng)用范圍(Rosenberg，Biologic Therapy ofCancer(Chapter 19)，487，1995)。盡管已經(jīng)在少數(shù)患者身上看到了激動(dòng)人心的臨床反應(yīng)，但在治療小鼠體內(nèi)的直徑超過幾毫米的腫瘤，以及對(duì)人進(jìn)行治療時(shí)，成功的程度通常不夠理想(Greenberg，AdvImmunol，49，281-355，1991；Chen，Ashe et al..Cell.71，1093-102，1992；Meliefand Kast，Immunol Rev，145，167-77，1995；Hellstrom andHellstrom，Handbook of Experimental Pharmacology，Vaccines(Chapter 17)，463-478，1999)。這種失敗是由于先前討論的“逃逸”機(jī)制和/或浸入腫瘤實(shí)體的淋巴細(xì)胞錯(cuò)誤定位導(dǎo)致的。
因此需要對(duì)包括構(gòu)建能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)免疫應(yīng)答的腫瘤疫苗和生成用于治療腫瘤患者的T淋巴細(xì)胞在內(nèi)的方法進(jìn)行。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及體外生產(chǎn)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的方法，在體內(nèi)治療性應(yīng)用的腫瘤疫苗以及相關(guān)的組合物。
一種方法是將取自外周血或腫瘤的單核淋巴細(xì)胞，例如取自腫瘤患者的單核淋巴細(xì)胞，在特異性CD3和CD28固相化抗體存在下與自體腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)。經(jīng)過一個(gè)4-5天的周期便可完成這樣的培養(yǎng)?？蓪⒓?xì)胞擴(kuò)增至能夠用于治療的水平，例如在去除附著有固相化抗體的磁珠之后在10μl/ml的白介素-2中。這些方法對(duì)促進(jìn)用于治療腫瘤的腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的生產(chǎn)是很有用的。在沒有被任何特別的理論或機(jī)制束縛的情況下，可以將該發(fā)明的操作理解為下述過程表達(dá)低水平CD3的T淋巴細(xì)胞被多克隆激活，增生旺盛，產(chǎn)生Th1型淋巴因子，并迅速破壞腫瘤細(xì)胞，釋放腫瘤抗原。還可以認(rèn)為，多克隆T淋巴細(xì)胞的激活使培養(yǎng)基中的單核細(xì)胞成熟為樹突狀細(xì)胞，它會(huì)吞噬死亡的腫瘤細(xì)胞，加工并提呈腫瘤抗原，誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞，包括CTL的持續(xù)擴(kuò)增。
本發(fā)明還提供，例如，編碼在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的抗CD3或抗4-1BB單鏈Fv(scFv)分子的基因以及用這些基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用于體內(nèi)癌癥的治療。在沒有被任何特別的理論或機(jī)制束縛的情況下，可以認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的抗-CD3 scFv誘導(dǎo)多克隆T淋巴細(xì)胞激活，并破壞了腫瘤細(xì)胞，釋放腫瘤抗原，促進(jìn)抗原特異性的腫瘤免疫的轉(zhuǎn)換，即我們可檢測(cè)到相同腫瘤對(duì)“野生型”(非轉(zhuǎn)染)細(xì)胞的排斥。也可以認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)的抗4-1BB scFv分子通過不斷使腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增和/或通過保護(hù)它們不發(fā)生凋亡，從而生成腫瘤反應(yīng)性淋巴因子，例如干擾素-γ，誘導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的激活/擴(kuò)增。在用被轉(zhuǎn)染的、能夠在細(xì)胞表面表達(dá)抗4-1BB scFv分子的腫瘤細(xì)胞免疫之后，在沒有任何特別的理論或機(jī)制束縛下，可以認(rèn)為來自同一腫瘤的野生型細(xì)胞可以通過包括自然殺傷細(xì)胞和CD4+細(xì)胞激活在內(nèi)的機(jī)制被排斥。在細(xì)胞表面表達(dá)抗4-1BB scFv分子的腫瘤細(xì)胞在治療已經(jīng)長(zhǎng)成的野生型腫瘤時(shí)是有活性的。
本發(fā)明使兩種新的治療腫瘤的方法成為可能。首先，其可以通過例如附著有抗-CD3/抗-CD28/抗-CD40(或抗-CD3/CD28)固相化抗體的磁珠，使“被抑制的”淋巴細(xì)胞激活，并使它們?cè)錾?，生成Th1淋巴因子，同時(shí)變得對(duì)TGF-β抑制更不敏感。在沒有任何特別的理論或機(jī)制束縛下，可以認(rèn)為活化的淋巴細(xì)胞會(huì)破壞腫瘤細(xì)胞，從而提供腫瘤抗原，并誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞的成熟?？梢哉J(rèn)為這種方法會(huì)使腫瘤反應(yīng)性CD8+和CD4+T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增，這便更好地適應(yīng)了將它們過繼轉(zhuǎn)移給腫瘤患者的需要。其次，這種方法可以提供基因或多核苷酸，其編碼例如，腫瘤表面的抗-CD3或抗4-1BBscFv，這些分子能有效誘導(dǎo)對(duì)抗來自同一腫瘤的野生型細(xì)胞的腫瘤破壞性免疫應(yīng)答。
這項(xiàng)發(fā)明的其他方面在下列權(quán)利要求中進(jìn)行了闡述，此處完整引用作為參考。
附圖簡(jiǎn)述盡管這項(xiàng)發(fā)明的應(yīng)用范圍廣泛，并不局限于這里所描述或提到的實(shí)施例，參照附圖可以對(duì)發(fā)明的一些方面有更多的了解。


圖1.取自晚期卵巢癌(OV44)患者的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)的體外增殖。A顯示了用對(duì)照磁珠加自體腫瘤細(xì)胞刺激淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增。B顯示了用抗-CD3/CD28/CD40偶聯(lián)磁珠加自體腫瘤細(xì)胞共同刺激后淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增。C顯示了用不加腫瘤細(xì)胞的抗-CD3/CD28/CD40磁珠刺激后淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增。
圖2.自體的，而非同種異體的腫瘤細(xì)胞和由CD3與CD28組合刺激的磁珠結(jié)合誘導(dǎo)取自結(jié)腸癌患者的外周血單核細(xì)胞增殖。這張圖顯示了在存在有自體(1C)或同種異體(4007)的卵巢癌細(xì)胞的情況下，體外刺激五天后，取自腫瘤患者外周血淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增。所用的刺激物為A＝對(duì)照磁珠；B＝抗-CD28/CD40偶聯(lián)磁珠；C＝抗-CD3/CD28偶聯(lián)磁珠；D＝抗-CD3/CD28/CD40偶聯(lián)磁珠；E＝抗-CD3/CD40偶聯(lián)磁珠。
圖3.取自患有結(jié)腸癌患者的外周血單核細(xì)胞在磁珠存在的情況下，在4小時(shí)51Cr釋放分析中顯示其可裂解自體的腫瘤細(xì)胞，所述磁珠刺激CD3與CD28，或CD3與CD28和CD40的組合，。這張圖顯示了取自患者1C的外周血淋巴細(xì)胞表現(xiàn)出的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，在外周血淋巴細(xì)胞被自體的腫瘤細(xì)胞加抗-CD3/CD28磁珠(A)或被自體的腫瘤細(xì)胞加抗-CD3/CD28/CD40磁珠(B)激活之后，在被標(biāo)記的靶細(xì)胞上進(jìn)行檢測(cè)。
圖4.取自患有頭頸部腫瘤患者的外周血單核細(xì)胞，在與自體腫瘤細(xì)胞和能刺激CD3與CD28的磁珠共同培養(yǎng)后會(huì)產(chǎn)生干擾素-γ。這張圖顯示了取自晚期頭頸部腫瘤患者的外周血淋巴細(xì)胞生成干擾素-γ。培養(yǎng)上清液中干擾素-γ的水平是如所示通過單獨(dú)使用抗-CD3/CD28(A)，抗-CD3/CD28磁珠加自體腫瘤細(xì)胞(B)，或?qū)φ沾胖榧幼泽w腫瘤細(xì)胞(C)刺激后，在不同時(shí)間測(cè)定得出的。
圖5.CD83是在用磁珠刺激的CD3與CD28刺激之后，在取自結(jié)腸癌患者的外周血單核細(xì)胞上表達(dá)的。這張圖顯示了取自晚期腫瘤(38C)患者外周血單核細(xì)胞上CD83的表達(dá)。將細(xì)胞用抗-CD83抗體在刺激之前(0天)直接與藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)，或在刺激之后1天用抗-CD3/CD28磁珠偶聯(lián)。
圖6.通過CD3與CD28共同刺激取自結(jié)腸癌患者的外周血單核細(xì)胞兩天后所表達(dá)的CD83水平，比用CD3與CD28再加CD40共同刺激后CD83的表達(dá)水平高。這張圖顯示了取自晚期腫瘤(38C)患者的外周血單核細(xì)胞，這些細(xì)胞沒有被激活，或用抗-CD3/CD28/CD40磁珠刺激兩天，或如所示用抗-CD3/CD28磁珠刺激兩天。將細(xì)胞同時(shí)用與抗-CD3偶聯(lián)的熒光染料和與抗-CD83偶聯(lián)的藻紅蛋白染色。
圖7.經(jīng)轉(zhuǎn)染能夠在細(xì)胞表面表達(dá)抗-CD3scFv(500A2)的K1735黑色素瘤細(xì)胞與表達(dá)小鼠CD80的K1735細(xì)胞及野生型K1735細(xì)胞相比有所消退。
圖8.移植到同源小鼠的K-1735野生型細(xì)胞的消退，所述小鼠反復(fù)免疫以抵抗K1735-500A2細(xì)胞。用K1735M2/500A2(2×106/只小鼠)細(xì)胞對(duì)C3H/HeN小鼠進(jìn)行三次免疫，每次免疫間隔七天，再給小鼠以1×106/只小鼠(藍(lán)線)的濃度接種K1735M2/500A2野生型細(xì)胞。用PBS對(duì)C3H/HeN小鼠進(jìn)行免疫，然后用相同劑量的K1735M2給小鼠接種(紅線)。
圖9.抗-人CD3scFv基因序列，即抗-人CD3scFv-hIgGl-CD80TM合成多核苷酸的序列，能編碼一種在細(xì)胞表面表達(dá)的產(chǎn)物，能夠用于轉(zhuǎn)染。
圖10.在逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，抗-人CD3 scFv在兩種人體細(xì)胞系的細(xì)胞表面表達(dá)?？?人CD3 scFv(G19-4)在Reh和T51細(xì)胞系的細(xì)胞表面通過逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)得到表達(dá)。在細(xì)胞表面表達(dá)的G19-4 scFv基因產(chǎn)物可以用相應(yīng)的熒光抗-人IgG進(jìn)行檢測(cè)，后者可檢測(cè)基因產(chǎn)物IgG中的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在每一個(gè)圖面中，與野生型細(xì)胞發(fā)生的反應(yīng)用虛線表示，與轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生的反應(yīng)用實(shí)線表示。
圖11.與在細(xì)胞表面表達(dá)抗-CD3 scFv的人細(xì)胞系共同培養(yǎng)的人T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增。這張圖顯示了與在表面表達(dá)抗CD3 scFv的Reh或T51細(xì)胞(而非野生型Reh或T51細(xì)胞)培養(yǎng)后所誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。在一個(gè)持續(xù)三天的培養(yǎng)周期的最后八小時(shí)向培養(yǎng)的細(xì)胞中加入3H-胸腺嘧啶可以對(duì)擴(kuò)增進(jìn)行測(cè)定。
圖12.靜止的人外周血單核細(xì)胞裂解來自兩個(gè)在細(xì)胞表面表達(dá)抗CD3 scFv人細(xì)胞系的細(xì)胞。這張圖顯示了靜止的外周血單核細(xì)胞可快速殺死在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)抗-人CD3 scFv的Reh和T51細(xì)胞，但不會(huì)殺死野生型的Reh或T51細(xì)胞。51Cr-標(biāo)記的細(xì)胞系與外周血單核細(xì)胞按照所示比率孵育8小時(shí)(一式三份)，然后測(cè)定被釋放的51Cr?？捎媒?jīng)典的公式計(jì)算特異性殺傷的百分比(實(shí)驗(yàn)釋放量減去自發(fā)釋放量，再除以最大釋放量減去自發(fā)釋放量)。
圖13.當(dāng)K1735M2/500A2細(xì)胞與野生型K-1735細(xì)胞的比例為1∶10時(shí)，在細(xì)胞表面表達(dá)抗-人CD3 scFv的K1735-500A2細(xì)胞會(huì)抑制與之混合在一起的野生型K-1735細(xì)胞形成腫瘤，這證實(shí)了“旁觀者效應(yīng)”。這張圖顯示了在有免疫活性的自體(C3H)小鼠體內(nèi)，K1735M2/500A2細(xì)胞與野生型K-1735細(xì)胞的混合物(比例為1∶10)的生長(zhǎng)暈被抑制。單獨(dú)免疫野生型K1735細(xì)胞，或?qū)⒁吧蚄-1735細(xì)胞與轉(zhuǎn)染的K1735M2/500A2細(xì)胞以10∶1的比例相混合使未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。將2×106個(gè)野生型K1735細(xì)胞與2×106個(gè)K1735M2/500A2細(xì)胞相混合，再將混合后的細(xì)胞用于皮下免疫C3H小鼠。每隔5天對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè)。
圖14.取自用K1735-500A2細(xì)胞免疫的小鼠的脾細(xì)胞在與經(jīng)照射的野生型K1735細(xì)胞結(jié)合后會(huì)擴(kuò)增，但在與Ag104細(xì)胞結(jié)合時(shí)則不會(huì)。
圖15.被移植入自體小鼠體內(nèi)的K1735-1D8細(xì)胞會(huì)被排斥，這是因?yàn)镃D4+細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞共同產(chǎn)生的排斥機(jī)制所致。這張圖顯示了被移植入C3H小鼠的K1735-1D8細(xì)胞被CD4+細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞所產(chǎn)生的作用機(jī)制排斥。a)含有抗-小鼠4-1BB雜交瘤1D8 scFvDNA的病毒載體結(jié)構(gòu)；b)用與藻紅蛋白偶聯(lián)的F(ab′)2山羊抗人的免疫球蛋白可檢測(cè)出1D8 scFv的表達(dá)，這種免疫球蛋白可以識(shí)別在K1735-1D8細(xì)胞上(陰影區(qū)域)表達(dá)的免疫球蛋白尾部，但不能識(shí)別野生型K1735細(xì)胞上的免疫球蛋白(實(shí)線)；c)K1735-1D8(○)細(xì)胞和野生型K1735細(xì)胞(■)細(xì)胞在天然小鼠體內(nèi)的成長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)；d)小鼠體內(nèi)的K1735-1D8細(xì)胞被CD4+(■)，CD8+(□)，CD4+和CD8+(○)或自然殺傷細(xì)胞(△)耗盡的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，給對(duì)照組(●)的小鼠注射的是純化后的小鼠IgG。
圖16.用K1735-1D8細(xì)胞，而不用經(jīng)放射線照射的野生型K1735細(xì)胞進(jìn)行免疫，可以對(duì)抗被移植的野生型K1735細(xì)胞的生長(zhǎng)，相信這是由于免疫的記憶和特異性的機(jī)制造成的。a)通過用K1735-1D8(○)或經(jīng)放射線照射的野生型K1735細(xì)胞(□)進(jìn)行皮下移植的方法，或用磷酸鹽緩沖液(PBS)(■)每隔十天對(duì)小鼠(10只/組)皮下免疫兩次。在最后一次免疫十天之后給這些小鼠注射野生型K1735細(xì)胞，并在兩個(gè)月之后給具有抗K1735-1D8免疫性的小鼠再次用野生型細(xì)胞進(jìn)行第二次免疫(▲)；b)將Ag104細(xì)胞以3×105/只小鼠的濃度移植給已經(jīng)具有抗K1735-1D8免疫性的小鼠(■)，并注射兩次野生型K1735細(xì)胞，給對(duì)照組小鼠注射磷酸鹽緩沖液(PBS)(○)；c)給已經(jīng)具有抗K1735-1D8免疫性的小鼠注射野生型K1735細(xì)胞后，其背部皮膚會(huì)脫色。
圖17.可以將K1735-1D8細(xì)胞作為疫苗進(jìn)行皮下移植，對(duì)已經(jīng)在皮下或肺里生長(zhǎng)形成的野生型K1735腫瘤進(jìn)行治療。這張圖顯示了用K1735-1D8作為免疫源對(duì)已經(jīng)形成的野生型K1735腫瘤進(jìn)行治療。a)用皮下注射法，給野生型K1735腫瘤面積達(dá)到30平方毫米的小鼠，在移植的前六天，在腫瘤的對(duì)側(cè)面接種K1735-1D8(○)或經(jīng)放射線照射的野生型K1735細(xì)胞進(jìn)行免疫(□)；皮下注射磷酸鹽緩沖液(PBS)(■)的小鼠被視為對(duì)照組小鼠。在給定的(↓)時(shí)間點(diǎn)也要做相同的治療；b)在給未經(jīng)治療的小鼠移植野生型K1735細(xì)胞20天之后(左圖)，或在接受野生型K1735細(xì)胞之后第8天時(shí)首次接受K1735-1D8免疫時(shí)(中圖)，在接受野生型K1735細(xì)胞之后第8天時(shí)首次注射1D8單克隆抗體時(shí)(右圖)要對(duì)收集到的腫瘤進(jìn)行免疫組化分析。每張照片的上、下兩個(gè)區(qū)域分別代表了同一腫瘤結(jié)節(jié)中的CD4+和CD8+細(xì)胞；c)接受靜脈注射野生型K1735細(xì)胞小鼠的腫瘤肺轉(zhuǎn)移灶。上圖顯示了對(duì)照組小鼠的肺臟，下圖顯示了反復(fù)移植K1735-1D8細(xì)胞進(jìn)行免疫的小鼠的肺臟。
圖18.來自經(jīng)K1735-1D8免疫小鼠的脾細(xì)胞在與野生型K1735細(xì)胞結(jié)合時(shí)會(huì)擴(kuò)增，但與抗原性不同的Ag104細(xì)胞結(jié)合時(shí)則不會(huì)擴(kuò)增。這張圖顯示了經(jīng)K1735-1D8免疫小鼠脾細(xì)胞的擴(kuò)增。a)用取自兩次分別用K1735-1D8或經(jīng)放射線照射的野生型K1735細(xì)胞免疫小鼠的脾細(xì)胞，與經(jīng)放射線照射的野生型K1735(“K1735”)或Ag104(“Ag104”)共同培養(yǎng)三天；將取自天然小鼠的脾細(xì)胞作為對(duì)照。對(duì)氚標(biāo)記脾細(xì)胞的擴(kuò)增進(jìn)行測(cè)定；b)對(duì)已經(jīng)用CFDA SE標(biāo)記的CD4+和CD8+的脾細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。
圖19.取自用K1735-1D8免疫小鼠的脾細(xì)胞能分泌干擾素-γ，并具有細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的活性。這張圖顯示了干擾素-γ的分泌和細(xì)胞毒性活性。a)在用K1735-1D8細(xì)胞兩次免疫天然小鼠后第10天，直接對(duì)取自天然小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行干擾素-γ的ELISPOT分析。將最后一次免疫后10天時(shí)收集到的脾細(xì)胞加入到干擾素-γELISPOT培養(yǎng)皿中，孵育24小時(shí)；將來自天然小鼠的脾細(xì)胞和來自攜帶有野生型K1735腫瘤小鼠脾細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較；b)在用野生型K1735細(xì)胞進(jìn)行免疫之后的30天時(shí)，將在實(shí)驗(yàn)中在體外受到刺激的(■)和未受刺激的(□)脾細(xì)胞分泌干擾素-γ的情況歸納于表1中。下列每組(三只用同樣方法處理的)小鼠平均的斑點(diǎn)數(shù)目(從上至下)都顯示出來用K1735-1D8細(xì)胞處理1天前，或用野生型細(xì)胞處理4或8天后；用1D8的單克隆抗體處理1天前，或用野生型細(xì)胞處理4或8天后。下面兩行給出了取自天然小鼠的對(duì)照組脾細(xì)胞的ELISPOT數(shù)據(jù)；c)取自用K1735-1D8細(xì)胞免疫小鼠的脾細(xì)胞和經(jīng)放射線照射的野生型K1735細(xì)胞共同培養(yǎng)5天，并檢測(cè)裂解的野生型K1735細(xì)胞(■)，Ag104(□)和YAC-1(○)細(xì)胞的4小時(shí)51Cr釋放試驗(yàn)，d)要做一個(gè)與圖5c相似的實(shí)驗(yàn)，以除外已經(jīng)與抗asialo GM1抗體和兔補(bǔ)體共同孵育過的脾細(xì)胞，這樣可在與經(jīng)放射線照射的野生型K1735細(xì)胞共同培養(yǎng)和檢測(cè)之前去除自然殺傷細(xì)胞。它們的能抵抗野生型K1735細(xì)胞(■)的細(xì)胞裂解活性被I類抗主要組織相容性抗原的單克隆抗體(▲)所抑制。在YAC-1(○)細(xì)胞沒有被裂解的時(shí)候，可以檢測(cè)到抗Ag104(□)較低的溶細(xì)胞活性。
圖20.在細(xì)胞表面表達(dá)抗-4-1BB scFv的K1735-1D8細(xì)胞，可以在1D8和野生型細(xì)胞的比例為1∶10時(shí)抑制混合有野生型K1735細(xì)胞的混合物形成腫瘤，這被證實(shí)是一種“旁觀者效應(yīng)”。這張圖顯示了在具有免疫活性的自體(C3H)小鼠體內(nèi)，K1735-1D8細(xì)胞與野生型K1735細(xì)胞混合物(比例為1∶10)的生長(zhǎng)被抑制。用野生型K1735細(xì)胞單獨(dú)進(jìn)行免疫，或?qū)⒁吧蚄1735細(xì)胞與用K1735-1D8轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以未轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞與轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的比例，即10∶1的比例混合免疫。將2×106個(gè)野生型K1735細(xì)胞與2×105個(gè)K1735-1D8細(xì)胞相混合，用來皮下免疫C3H小鼠。每隔5天對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
圖21.5B9抗人4-1BB scFv序列。這張圖顯示了預(yù)測(cè)的細(xì)胞表面表達(dá)5B9Ig的核苷酸和氨基酸序列。
圖22.表1.
圖23.表2.
圖24.表3.
圖25.表4.
發(fā)明詳述除非特別說明，此項(xiàng)發(fā)明可能采用了分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))，微生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)，核酸化學(xué)和免疫學(xué)的多種技術(shù)，這些均是包含在所屬技術(shù)領(lǐng)域中的技術(shù)。各種有用的技術(shù)在文獻(xiàn)中均有解釋，例如，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版(Sambrook etal.，1989)和分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第三版(Sambrook and Russel，2001)，(在此共同和分別參考作為″Sambrook″)；寡核苷酸合成(M.J.Gait，ed.，1984)；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(R.I.Freshney，ed.，1987)；實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.)；哺乳類動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體(J.M.Miller & M.P.Calos，eds.，1987)；分子生物學(xué)最新操作手冊(cè)(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987，包括2001年全年增刊)；PCR聚合酶鏈反應(yīng)(Mullis et al.，eds.，1994)；免疫學(xué)最新操作手冊(cè)(J.E.Coligan et al.，eds.，1991)；免疫測(cè)定手冊(cè)(D.Wild，ed.，Stockton Press NY，1994)；生物結(jié)合技術(shù)(Greg T.Hermanson，ed..Academic Press，1996)；免疫分析方法(R.Masseyeff，W.H.Albert，和N.A.Staines，eds.，WeinheimVCH Verlags gesellschaftmbH，1993)；Harlow and Lane(1988)抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港出版社，紐約，and Harlow and Lane(1999)應(yīng)用抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，紐約冷泉港出版社，(在此共同和分別參考文獻(xiàn)作者為Harlow和Lane)，Beaucage et al.eds，核酸化學(xué)最新操作手冊(cè)，John Wiley &Sons，Inc.，New York，2000)；and Agrawal，ed.，寡核苷酸及其類似物合成操作手冊(cè)和特性Humana Press Inc.，美國新澤西州，1993)。
本發(fā)明涉及能夠從抗腫瘤或抗癌劑獲益的疾病、失常和病癥的治療、預(yù)防和/或緩解，還涉及其中所用的制劑。
本發(fā)明提供了，例如，用于產(chǎn)生抗腫瘤免疫的多種方法和組合物。
一方面，這項(xiàng)發(fā)明提供了一種新方法，可在體外獲得腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞群，這種細(xì)胞群通過用固相化CD3與單獨(dú)CD28或者與CD28加CD40共同組合來刺激共培養(yǎng)的PBMC和腫瘤細(xì)胞PBMC，后者來自癌癥患者，包括晚期癌癥患者(總體免疫抑制)。在另一方面，例如，這項(xiàng)發(fā)明提供組合物，其包括編碼在細(xì)胞表面表達(dá)的抗CD3 scFv或抗4-1BB scFv的基因或其他多核苷酸。另一方面，這項(xiàng)發(fā)明提供了能夠表達(dá)這些基因并用于誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
用固相化在磁珠上的抗CD3和CD28抗體刺激與活化T細(xì)胞，均可導(dǎo)致多克隆T細(xì)胞的生長(zhǎng)和多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生(Levine et al.，JImmunol，159，5921-30，1997；Garlie et al.，J Immunother，22，336-45，1999)。而從多克隆繁殖到經(jīng)過抗CD3和CD28抗體刺激后的抗原特異性T細(xì)胞的產(chǎn)生和/或增殖的轉(zhuǎn)換在先前沒有描述。
如此處所述，例如，通過在培養(yǎng)物，尤其是在最初的培養(yǎng)物中加入自體腫瘤細(xì)胞可以完成這種轉(zhuǎn)換。試驗(yàn)顯示腫瘤細(xì)胞在48-72小時(shí)之內(nèi)被活化的T細(xì)胞破壞，并且培養(yǎng)物中的單核細(xì)胞在同一時(shí)期發(fā)育成熟為CD83+的樹突狀細(xì)胞。這被認(rèn)為是其暴露在淋巴因子中的結(jié)果，這類因子包括由活化的T細(xì)胞分泌的干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α。樹突狀細(xì)胞吞噬被消滅的腫瘤細(xì)胞，并且遞呈腫瘤抗原給活化的T細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞不斷的增殖和生長(zhǎng)。
另一方面，本發(fā)明提供編碼抗CD3 scFv的基因或其他多核苷酸，這種抗體片段可能對(duì)CD3是特異性的。這種基因或者多核苷酸可以被轉(zhuǎn)染，用于在諸如人或小鼠腫瘤細(xì)胞系的表面進(jìn)行表達(dá)。在這兩種情況下，這種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以活化T淋巴細(xì)胞，使其增殖，產(chǎn)生淋巴細(xì)胞因子并殺傷腫瘤細(xì)胞。
另外進(jìn)行的體內(nèi)試驗(yàn)顯示，在細(xì)胞表面表達(dá)抗小鼠CD3的小鼠腫瘤細(xì)胞會(huì)被具有免疫活性的小鼠排斥，并且誘導(dǎo)出現(xiàn)對(duì)同一腫瘤野生型細(xì)胞的系統(tǒng)免疫力。因此，盡管由抗小鼠或抗人CD3基因編碼的scFv在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)時(shí)可以誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，本發(fā)明證實(shí)當(dāng)將上述基因產(chǎn)物作為一種腫瘤疫苗在體內(nèi)應(yīng)用，且體內(nèi)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞時(shí)，這種疫苗會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)免疫向抗原特異性免疫轉(zhuǎn)變。
另一方面，本發(fā)明中構(gòu)建的基因或者其他的多核苷酸可以編碼例如抗4-1BB scFv，對(duì)4-1BB具有特異性，例如可以將它們轉(zhuǎn)染至人和小鼠的腫瘤細(xì)胞中，并在這些細(xì)胞表面表達(dá)。這種被轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞可以活化來自各自種屬的T淋巴細(xì)胞。用抗小鼠4-1BB scFv基因轉(zhuǎn)染的小鼠腫瘤細(xì)胞會(huì)被具有免疫活性的小鼠排斥，這種基因可作為一種疫苗誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫，排斥來自相同腫瘤的野生型細(xì)胞。這種免疫反應(yīng)顯示出了記憶性和抗原特異性，對(duì)被研究的生長(zhǎng)在皮下或肺轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞(K1735黑色素瘤)具有治療效果。由于K1735表達(dá)的I類主要組織相容性抗原分子水平非常低，并缺乏II類主要組織相容性抗原分子，且大多數(shù)的人類腫瘤細(xì)胞情況也很類似，具有非常低的免疫原性，所以這些結(jié)果具有重要的生物學(xué)意義。
我們已經(jīng)制造出了與小鼠和人的CD3和4-1BB可以發(fā)生反應(yīng)的編碼scFv分子的基因。每個(gè)基因均包括跨膜結(jié)構(gòu)域和人CD80的細(xì)胞質(zhì)尾。另外，每個(gè)基因均編碼鉸鏈區(qū)和人IgG1的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，位于scFv結(jié)合位點(diǎn)和跨膜結(jié)構(gòu)域之間。這些基因和這些基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)于治療腫瘤都是有用的。
例如，正如下面的實(shí)驗(yàn)中指出的那樣，編碼在細(xì)胞表面表達(dá)的抗CD3或者抗4-1BB scFv分子的cDNA可以作為一種DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)給腫瘤患者，或者可以在諸如病毒或者細(xì)菌載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在體外，編碼在細(xì)胞表面表達(dá)的抗CD3或者抗4-1BB scFv分子的cDNA可以被導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞可以用于治療?？梢允褂米泽w的或同種異體的腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞表面表達(dá)的scFv基因編碼分子的結(jié)合源于其編碼基因的結(jié)合，所表達(dá)的scFv分子與T細(xì)胞表面的受體結(jié)合，提供活化或共刺激信號(hào)。本發(fā)明中還設(shè)想了另外一種在體內(nèi)傳導(dǎo)多克隆活化信號(hào)給T細(xì)胞的方法，包括給患者注射包含由T細(xì)胞表達(dá)的表面受體的抗體或配體的緩釋聚合體。
本發(fā)明還提供了一種新的方法，在體外生成/擴(kuò)增腫瘤選擇性T淋巴細(xì)胞，通過活化出現(xiàn)自體腫瘤細(xì)胞中的這些細(xì)胞和CD3和共刺激分子介導(dǎo)的信號(hào)，用于例如繼受性轉(zhuǎn)移給腫瘤患者。本發(fā)明有利于在體外產(chǎn)生能夠遞呈腫瘤細(xì)胞釋放抗原的樹突狀細(xì)胞，以擴(kuò)大已經(jīng)存在的腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞群，并有利于產(chǎn)生先前未被認(rèn)識(shí)的針對(duì)抗原的免疫反應(yīng)。在體外生成的T細(xì)胞，如發(fā)明中描述的那樣，對(duì)TGF-β的抑制作用更不敏感，并有較長(zhǎng)的生命周期。
本發(fā)明還描述了兩種通過轉(zhuǎn)染編碼抗體衍生分子的scFv基因產(chǎn)生的新型人類腫瘤疫苗，它們可以識(shí)別CD3或4-1BB，在檢驗(yàn)它們抵抗免疫原性較低、且僅少量表達(dá)I類主要組織相容性抗原分子而不表達(dá)II類主要組織相容性抗原分子的小鼠黑色素瘤時(shí)，顯示這些疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤破壞性免疫反應(yīng)。本發(fā)明中描述的這種方法可用于轉(zhuǎn)染人類腫瘤細(xì)胞，表達(dá)抗人CD3或抗人4-1BB scFv用于基于細(xì)胞的免疫。另外，其可以較容易地被用于構(gòu)建基于基因的腫瘤疫苗，其中基因編碼的腫瘤表位可以與基因編碼的抗CD3 scFv或/和抗4-1BBscFv相結(jié)合。通過結(jié)合可以識(shí)別其他的或不同的免疫刺激物受體的scFv和/或編碼上調(diào)抗腫瘤免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞因子的基因可以使本發(fā)明的應(yīng)用范圍擴(kuò)大。
本發(fā)明將參照特定的實(shí)驗(yàn)被進(jìn)一步討論，這些實(shí)驗(yàn)可能僅采用實(shí)施例的方式，不以任何方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)施例1來自晚期癌癥患者的CD3介導(dǎo)的腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的活化外周血單核細(xì)胞(PBMC)或腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)，在偶聯(lián)了與CD28單克隆抗體或者CD28和CD40單克隆抗體結(jié)合的CD3單克隆抗體的磁珠存在的情況下，與自體腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)中發(fā)生的一些情況進(jìn)行表征，包括培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞被破壞，淋巴細(xì)胞增殖和淋巴細(xì)胞因子的產(chǎn)生，CD83+抗原遞呈細(xì)胞的產(chǎn)生和腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的活化/擴(kuò)增，以及淋巴細(xì)胞對(duì)TGF-β抑制作用的敏感性下降。
取自患者的材料。腫瘤取自IV期癌癥患者的手術(shù)或者惡性滲出物(多數(shù)為腹水)。腫瘤和外周血樣品均在知情同意下獲得。大多數(shù)的研究采用8名患者，其中5名(1OV，3OV，8OV，44OV，48OV)患卵巢癌，2名(1C，22C)患結(jié)腸癌，一名(1HN)患有頭頸部腫瘤。實(shí)驗(yàn)還使用了來自卵巢癌細(xì)胞系4007的細(xì)胞。
腫瘤和血液樣品的準(zhǔn)備。將實(shí)體腫瘤懸于培養(yǎng)基中，去除滲出物中的液體部分，然后將細(xì)胞垂懸。用Ficoll-Hypaque(PharmaciaBiotech，Upsala，Sweden)去除紅細(xì)胞，利用Percoll梯度(Sigma，St Louis，MO)從腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中分離腫瘤細(xì)胞。淋巴細(xì)胞樣本可以直接使用或儲(chǔ)存在液氮中以備日后使用。使用標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟將腫瘤樣本移植到體外并建立細(xì)胞系。外周血單核細(xì)胞包括T淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和B細(xì)胞，用Ficoll-Hypaque對(duì)它們進(jìn)行純化。在很多最初的實(shí)驗(yàn)中，使用了CD8+T淋巴細(xì)胞(純度＞90％)，這些細(xì)胞是應(yīng)用VarioMac磁珠(Miltenyi Biotech公司，Auburn，CA)從腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中篩選出來的。
結(jié)合淋巴細(xì)胞、抗體偶聯(lián)的磁珠和腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物的制備。在最初的實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)腫瘤細(xì)胞中加入了5個(gè)淋巴細(xì)胞，然后混合物在裝有RPMI培養(yǎng)基和10％胎牛血清(Atlanta Biological，Norcross，GA)的Costar(3513)的12-孔培養(yǎng)板(Coming Inc.，Coming，NY)中，在37℃的環(huán)境中孵育。隨后，使用一種公開的技術(shù)(Levine，Bernstein et al.，J Immunol，159，5921-30，1997；Gariie，LeFever et al.，J Immunother，22，336-45，1999)，將外周血單核細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞與或不與被偶聯(lián)在磁珠(Dynal Inc.，Lake Success，NY)上的自體腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，磁珠上偶聯(lián)有CD3，CD28，和/或CD40的單克隆抗體；將沒有偶聯(lián)單克隆抗體(或偶聯(lián)有不相關(guān)的單克隆抗體)的磁珠作為對(duì)照。偶聯(lián)的單克隆抗體分別是64.1(Martin et al.，JImmunol，136，3282-7，1986)(Martin，Ledbetter et al.，J Immunol，136，3282-7，1986)、9.3(Martin，Ledbetter et al.，J Immimol，136，3282-7，1986)和G28-5(Ledbetter et al.，J Immunol，138，788-94，1987)，它們分別多克隆地刺激淋巴細(xì)胞(抗CD3)，共刺激(抗CD28)，或者活化抗原遞呈細(xì)胞(抗CD40)。當(dāng)使用自體腫瘤細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞(40,000-75,000/孔)首先需要通過過夜孵育吸附到Costar 24孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)板中加有含有10％胎牛血清的2ml IMDM培養(yǎng)基。然后加入單克隆抗體偶聯(lián)磁珠(3×106/ml)，再加入懸浮在含10％胎牛血清RPMI中的淋巴細(xì)胞(106/ml)。培養(yǎng)板在37℃含有6％CO2的空氣中孵育4-5天。使用磁鐵除去磁珠，將淋巴細(xì)胞置于一個(gè)新的含有10U/ml的白介素-2(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)的培養(yǎng)板中，然后當(dāng)濃度達(dá)到2×106個(gè)細(xì)胞/ml后將培養(yǎng)基移至細(xì)頸瓶中。觀察培養(yǎng)基尋找腫瘤細(xì)胞被破壞的證據(jù)。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)確定淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增情況。從培養(yǎng)基中取樣，分別用WEHI細(xì)胞(Espevik and Nissen-Meyer，J Immunol Methods，95，99-105，1986)應(yīng)用一種生物分析法測(cè)量產(chǎn)生的腫瘤壞死因子，用ELISA(EH-EFNG，Endogen，Wobum，MA)法測(cè)量干擾素-γ。TGF-β1購自Sigma公司(St Louis，MO)。所有試驗(yàn)中都會(huì)使用TGF-β1，即便是在去除了單克隆抗體偶聯(lián)的磁珠之后，這些分子仍然留在培養(yǎng)基中。
細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的檢測(cè)。使用經(jīng)典的4-小時(shí)51Cr釋放法進(jìn)行檢測(cè)。為了給效應(yīng)細(xì)胞定性，在實(shí)驗(yàn)時(shí)向細(xì)胞中加入可以識(shí)別I類主要組織相容性抗原分子的框架決定簇(Research Diagnostics Inc.，F(xiàn)landers，NJ)的單克隆抗體w6/32(10ug/ml)抑制細(xì)胞毒性。也可使用自然殺傷細(xì)胞標(biāo)志抗原CD16和CD56的單克隆抗體(BeckmanCoulter，Brea，CA)，抗CD8單克隆抗體HIT8a(BD Pharmingen，Lexington，KY)，和抗整合素-β2(CD18)的單克隆抗體60.3(Beattyet al.，J Immunol，131，2913-8，1983)。
淋巴細(xì)胞的FACS分析。通過FACS(Epics XL，Coulter，Miami，F(xiàn)L)方法評(píng)估CD的表達(dá)密度，使用PE標(biāo)記的單克隆抗體，并在細(xì)胞達(dá)到預(yù)設(shè)的最小亮度時(shí)將它們計(jì)為陽性。為了研究淋巴細(xì)胞在體外活化之后CD3表達(dá)密度增加是否是由于最初CD3高表達(dá)細(xì)胞選擇性增殖的造成的，用染料CFDA對(duì)從腫瘤患者收集的外周血淋巴細(xì)胞(den Haan et al.，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)(MolecularProbes，Eugene，OR)進(jìn)行標(biāo)記。隨后，在附著有抗CD3/CD28/CD40磁珠的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5天，然后去除磁珠，將擴(kuò)增后的淋巴細(xì)胞移至含有10U白介素-2/ml的培養(yǎng)基中。在去除磁珠后的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(4小時(shí)和3天)時(shí)進(jìn)行FACS分析，分析每個(gè)孔的CFDA亮度和CD3的表達(dá)。將培養(yǎng)后被標(biāo)記的淋巴細(xì)胞與對(duì)照磁珠共同培養(yǎng)用于比較研究。
抗體偶聯(lián)磁珠刺激T細(xì)胞低反應(yīng)水平。開始進(jìn)行了6項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，從腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中純化的CD8+的T淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，對(duì)懸浮液進(jìn)行腫瘤壞死因子或干擾素-γ的分析。在一個(gè)有代表性的實(shí)驗(yàn)中，將取自一名結(jié)腸癌患者，1C，的CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，與1C腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)15天，然后將淋巴細(xì)胞取出，并加入一組新鮮的1C細(xì)胞中或加入取自一名肺癌患者的腫瘤細(xì)胞--3L中。當(dāng)1C淋巴細(xì)胞與1C結(jié)合而沒有與3L結(jié)合時(shí)，僅測(cè)得少量的腫瘤壞死因子(1.2pg/ml)，但是當(dāng)來自3L的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞與3L腫瘤細(xì)胞結(jié)合，但沒有單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生了腫瘤壞死因子和干擾素-γ(1.5pg/ml)。沒有淋巴細(xì)胞增殖的證據(jù)。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，將除CD8+淋巴細(xì)胞之外，還包含有單核細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞和B細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞細(xì)胞群，與自體腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)10-15天。在13名患者中，有8名患者的培養(yǎng)懸液中檢測(cè)到了約10倍高水平的腫瘤壞死因子(4.5-48pg/ml)和干擾素-γ(高達(dá)150pg/ml)。仍然沒有淋巴細(xì)胞增殖。
在自體腫瘤細(xì)胞和抗CD3偶聯(lián)磁珠共同培養(yǎng)時(shí)，T細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞破壞的論證。最初的實(shí)驗(yàn)之后進(jìn)行一項(xiàng)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)，即使用單克隆抗體偶聯(lián)的磁性磁珠通過各種淋巴細(xì)胞受體(Levine，Bernstein etal.，J Immunol，159，5921-30，1997；Garlie，LeFever et al.，JImmunother，22，336-45，1999)誘導(dǎo)產(chǎn)生信號(hào)。在偶聯(lián)有CD3單克隆抗體，和CD28和/或CD40單克隆抗體磁珠存在的培養(yǎng)基中，將外周血單核細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞與自體腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)。還包括含有淋巴細(xì)胞但不含有腫瘤細(xì)胞的相同分組。作為對(duì)照，含有或不含有腫瘤細(xì)胞的淋巴細(xì)胞與未經(jīng)偶聯(lián)的對(duì)照磁珠共同培養(yǎng)。3-5天后，去除磁珠，將淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在10U/ml的白介素-2中分別孵育2-21天。
圖1顯示OV44患者腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在抗CD3/CD28/CD40偶聯(lián)磁珠中培養(yǎng)4天時(shí)旺盛增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。缺乏CD3信號(hào)刺激的淋巴細(xì)胞不會(huì)增殖，使用抗CD28和/或CD40磁珠培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞也不會(huì)增殖(未顯示數(shù)據(jù))。自體腫瘤細(xì)胞最初與通過CD3誘導(dǎo)信號(hào)的磁珠共同培養(yǎng)時(shí)增殖較多(圖面B)?？笴D3/CD28偶聯(lián)磁珠誘導(dǎo)的增殖與抗CD3/CD28/CD40偶聯(lián)磁珠相同(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖2顯示來自患者1C的外周血淋巴細(xì)胞和各種單克隆抗體偶聯(lián)磁珠與自體腫瘤細(xì)胞或同種異體(4007)細(xì)胞培養(yǎng)5天的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)CD3/CD28(圖面C)或抗CD3/CD28/CD40(圖2D)活化的淋巴細(xì)胞與1C腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)孔中淋巴細(xì)胞的數(shù)量比其與4007細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)要高，結(jié)果與圖1中所示相同。FACS分析顯示，＞90％的活化的淋巴細(xì)胞表達(dá)CD3，大約70％是CD8+，少于5％表達(dá)CD16或CD56。另一方面，在磁珠不提供任何CD3介導(dǎo)的信號(hào)的情況下(圖2A和B)，加入異源腫瘤細(xì)胞后增殖水平較高，可能是由于對(duì)在4007細(xì)胞上表達(dá)的異體抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在與存在抗CD3/CD28或抗CD3/CD28/CD40偶聯(lián)磁珠的情況下培養(yǎng)的自體淋巴細(xì)胞接觸24-48小時(shí)之內(nèi)被破壞，常常會(huì)留下含有完全由有著淋巴細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞構(gòu)成的培養(yǎng)基。為了研究這種腫瘤破壞是否具有免疫特異性，進(jìn)行了四項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，首先對(duì)來自腫瘤患者的外周血淋巴細(xì)胞(106-105/份樣本)進(jìn)行梯度稀釋，將它們與自體腫瘤細(xì)胞或來自同種異體供者的腫瘤細(xì)胞或纖維母細(xì)胞共同培養(yǎng)。在兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，與自體腫瘤共同培養(yǎng)的細(xì)胞懸液中存在大約10倍多的腫瘤壞死因子，但是自體或同種異體腫瘤細(xì)胞或同種異體纖維母細(xì)胞共同培養(yǎng)基之間在殺傷細(xì)胞的數(shù)據(jù)上沒有差異。由此推斷，在淋巴細(xì)胞活化24-72小時(shí)之后出現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞的破壞不具有抗原特異性，或許是由于大量活化的T淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞因子不能辨別特異性的組分。
腫瘤選擇性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生。I類主要組織相容性抗原限制性的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞是由腫瘤細(xì)胞加上抗CD3/CD28或抗CD3/CD28/CD40磁珠活化的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的。圖3顯示用取自患者1C的外周血淋巴細(xì)胞(在圖2顯示的實(shí)驗(yàn)中已被活化)所做的一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在經(jīng)腫瘤細(xì)胞和單克隆抗體偶聯(lián)磁珠活化之后，將磁珠去除，并將淋巴細(xì)胞在缺乏腫瘤細(xì)胞和磁珠的10U白介素-2/ml培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)超過3周。被1C和抗CD3/CD28磁珠活化的外周血淋巴細(xì)胞對(duì)1C細(xì)胞有著很強(qiáng)的細(xì)胞溶解性，CD8單克隆抗體和I類主要組織相容性抗原單克隆抗體w6/32可以抑制這種溶解作用(圖3A)。50∶1的E/T僅僅能殺死20％的同種異體4007細(xì)胞，相比之下98％的1C細(xì)胞會(huì)被50∶1的E/T溶解(圖3A)。圖3B提供了被抗CD3/CD28/CD40磁珠刺激的外周血淋巴細(xì)胞的類似數(shù)據(jù)。4007細(xì)胞的溶解與存在有單克隆抗體w6/32時(shí)培養(yǎng)的1C處于同樣低的水平。相比之下，抗CD3/CD28/CD40磁珠活化的外周血淋巴細(xì)胞可以殺傷1C和4007兩種細(xì)胞，這種情況也出現(xiàn)在CD8單克隆抗體或單克隆抗體w6/32存在的情況下(數(shù)據(jù)未顯示)。圖3B中顯示在實(shí)驗(yàn)中使用的從細(xì)胞群中濃縮得到的CD8+細(xì)胞以20/1的E/T比率溶解了25％的1C細(xì)胞，相比較來自4007細(xì)胞系溶解了0％的細(xì)胞，來自同種異體B細(xì)胞系也溶解了0％的細(xì)胞。在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，使用單克隆抗體w6/32培養(yǎng)1C細(xì)胞的溶解率為5％，使用抗CD18單克隆抗體60.3培養(yǎng)時(shí)的溶解率為5％，使用CD16和CD56單克隆抗體聯(lián)合培養(yǎng)時(shí)，溶解率僅僅從25％減少到18％。通過與4007細(xì)胞和任何一種磁珠聯(lián)合培養(yǎng)活化的淋巴細(xì)胞并不會(huì)選擇性的溶解1C或4007細(xì)胞。重復(fù)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞分析法兩次，均獲得同樣的結(jié)果。
Th1型淋巴因子的產(chǎn)生。CD3介導(dǎo)活化的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中可見檢測(cè)到大量的干擾素-γ。圖4中對(duì)此進(jìn)行了說明，這也說明在培養(yǎng)開始的4-5天期間還存在自體腫瘤細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的干擾素-γ較高。
表1顯示了六個(gè)額外的，有代表性的實(shí)驗(yàn)，表明外周血淋巴細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的增殖和淋巴細(xì)胞因子的產(chǎn)生在取自患者的細(xì)胞或在一輪的體外磁珠活化之后均可被檢測(cè)出來。抗CD3，抗CD3/CD28，抗CD3/CD40和抗CD3/CD28/CD40磁珠均能強(qiáng)烈地促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，它們之間的效果并沒有差別。相比較而言，單獨(dú)使用抗CD28，抗CD40和抗CD28/CD40磁珠，并不比對(duì)照磁珠更能增加淋巴細(xì)胞的增殖和淋巴因子的產(chǎn)生，這表明CD3介導(dǎo)的信號(hào)非常重要。腫瘤壞死因子和干擾素-γ的產(chǎn)生有相關(guān)性。當(dāng)淋巴細(xì)胞在沒有腫瘤細(xì)胞和磁珠的情況下生長(zhǎng)3-5天時(shí)，它們的含量降低到背景水平。如圖1和4所示，誘導(dǎo)有效的淋巴細(xì)胞增殖和淋巴因子產(chǎn)生需要CD3信號(hào)。
通過單克隆抗體-偶聯(lián)磁珠活化的淋巴細(xì)胞上CD3和其他標(biāo)志物的上調(diào)。在與腫瘤細(xì)胞和抗CD3/CD28/CD40磁珠一起培養(yǎng)3到5天之前和之后，用FACS測(cè)量在淋巴細(xì)胞群上CD抗原的表達(dá)密度，然后的3到7天則為不加磁珠培養(yǎng)的擴(kuò)增期。為了反應(yīng)CD受體表達(dá)密度的變化，報(bào)告每一群細(xì)胞的百分比，它們的密度等于選定的設(shè)定值亮度，或者高于設(shè)定值(表2)；分析來自6名健康供者(年齡在30到65歲)未被刺激的外周血淋巴細(xì)胞作為比較。來自腫瘤患者的未被刺激的外周血淋巴細(xì)胞的CD3，CD4和CD28的水平較低。5名患者中的4名CD3密度也較低，而CD86的密度高于健康供者未被刺激的外周血淋巴細(xì)胞水平。與對(duì)照磁珠共同培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞CD3表達(dá)部分增加，但CD28的表達(dá)增加不明顯。相比較之下，使用抗CD3/CD28/CD40磁珠培養(yǎng)的細(xì)胞CD3和CD28的表達(dá)量都能恢復(fù)到正常的水平，并且使高CD8表達(dá)密度的細(xì)胞數(shù)量加倍。對(duì)5名患者的TIL研究CD3的表達(dá)密度。分別為2.9％，40.2％，96％，42.8％和40.1％，顯示也更為多變，并且通常高于外周血單核細(xì)胞。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的CD3表達(dá)高于外周血單核細(xì)胞，并且從61.4％增加到87.3％。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中CD28表達(dá)的相應(yīng)值為39.3％和52.8％。
為了研究淋巴細(xì)胞在體外活化之后CD3表達(dá)密度的增加是否是由于最初高CD3表達(dá)的細(xì)胞選擇性增值的結(jié)果，可使用染料CFDA(Molecular Probes，Eugene，OR)對(duì)從腫瘤患者濃縮得到的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。使用腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，40.2％最初表達(dá)CD3，應(yīng)用染料CFDA(den Haan，Lehar et al，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)進(jìn)行標(biāo)記。通過抗CD3/CD28/CD40磁珠活化之后，CD3表達(dá)增加至95％。使用CFDA和PE-標(biāo)記的抗CD3作為探針進(jìn)行FACS分析，結(jié)果顯示沒有最初CD3高表達(dá)外周血淋巴細(xì)胞亞群的選擇性增殖。
在使用抗CD3/CD28磁珠活化之后培養(yǎng)細(xì)胞的CD83的表達(dá)。為了研究使用抗CD3/CD28/CD40磁珠刺激外周血單核細(xì)胞(發(fā)現(xiàn)其中10-20％表達(dá)單核細(xì)胞標(biāo)志物CD14)是否可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟，在刺激之后的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)CD83的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)量。CD83是由成熟之后的樹突狀細(xì)胞表達(dá)的，未成熟的樹突狀細(xì)胞和血單核細(xì)胞并不表達(dá)。圖5說明了一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)，顯示早在應(yīng)用抗CD3/CD28磁珠刺激PBMC之后的24小時(shí)，在35％的細(xì)胞中就可以檢測(cè)到CD83的表達(dá)。在刺激外周血單核細(xì)胞的第0天(刺激之前)未檢測(cè)到CD83的表達(dá)。
為了確定外周血單核細(xì)胞刺激之后什么細(xì)胞表達(dá)CD83，在使用抗CD3/CD28磁珠或抗CD3/CD28/CD40磁珠刺激之后的第2天，使用熒光素標(biāo)記的抗CD3對(duì)PE-標(biāo)記的抗CD83兩種顏色進(jìn)行染色。圖6顯示在缺乏磁珠刺激的細(xì)胞沒有CD83的表達(dá)，抗CD3/CD28偶聯(lián)磁珠誘導(dǎo)CD3陰性細(xì)胞群(13.9％)CD83的表達(dá)，且CD3陽性細(xì)胞中也有相當(dāng)?shù)谋壤磉_(dá)CD83。相比之下，抗CD3/CD28/CD40偶聯(lián)磁珠可以活化誘導(dǎo)CD83的表達(dá)，但是所誘導(dǎo)的CD3陰性細(xì)胞和CD3陽性細(xì)胞表達(dá)CD83的水平比抗CD3/CD28磁珠的誘導(dǎo)要低。這些結(jié)果顯示，表達(dá)樹突狀細(xì)胞標(biāo)志物CD83的細(xì)胞是在經(jīng)過抗CD3和抗CD28單克隆抗體偶聯(lián)磁珠刺激之后從外周血單核細(xì)胞快速誘導(dǎo)而來的?？笴D3，抗CD28，和抗CD40單克隆抗體偶聯(lián)磁珠的刺激作用，沒有抗CD3和抗CD28單克隆抗體偶聯(lián)磁珠單獨(dú)用于刺激CD83的表達(dá)那樣有效。
通過單克隆抗體偶聯(lián)磁珠產(chǎn)生的活化信號(hào)增加對(duì)TGF-β1抑制作用的抗性。表3顯示了5個(gè)有代表性的實(shí)驗(yàn)，研究TGF-β1對(duì)淋巴因子產(chǎn)生和淋巴細(xì)胞增殖的抑制效果是否可以通過與可以誘導(dǎo)CD3介導(dǎo)信號(hào)的磁珠共同培養(yǎng)而被改變。使用對(duì)照磁珠，腫瘤壞死因子和干擾素-γ水平很低，并且它們的水平被TGF-β1進(jìn)一步抑制。相比之下，使用抗CD3/CD28/CD40磁珠時(shí)，他們的水平增加到了沒有TGF-β1時(shí)出現(xiàn)的水平。同樣，當(dāng)使用抗CD3/CD28/CD40磁珠時(shí)，TGF-β1對(duì)于淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用更小，在患者1HN甚至根本未發(fā)現(xiàn)抑制作用。當(dāng)TGF-β1的劑量增加到20ng/ml，且當(dāng)淋巴細(xì)胞的濃度減少到105/樣本時(shí)(數(shù)據(jù)未顯示)，也可以見到T細(xì)胞的增殖和淋巴因子的產(chǎn)生出現(xiàn)相對(duì)排斥。當(dāng)磁珠通過CD28，CD40單獨(dú)或共同進(jìn)行刺激時(shí)，并不會(huì)抵抗TGF-β1的作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
因此，伴隨著腫瘤細(xì)胞的殺傷，與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞活化導(dǎo)致了抗原的釋放。培養(yǎng)基中的單核細(xì)胞吞噬腫瘤抗原，分化成CD83陽性的抗原遞呈細(xì)胞遞呈抗原決定簇，使腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞選擇性增殖。治療疫苗可以基于同樣的原理，活化和增殖腫瘤攜帶個(gè)體中的受抑制的淋巴細(xì)胞，也可以促進(jìn)針對(duì)亞顯性抗原決定簇的免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。總體而言，產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的培養(yǎng)體系將包括四部分。它們是1)來源于癌癥患者的T細(xì)胞，2)來自患者的抗原遞呈細(xì)胞，3)與抗CD3和抗CD28抗體，或抗CD3，抗CD28和抗CD40抗體偶聯(lián)的磁珠，和4)來自患者的腫瘤細(xì)胞這些組成部分可以有很多種變化，這下變化可被預(yù)測(cè)或進(jìn)行評(píng)價(jià)。包括任何四種組成部分加入時(shí)間的變化，還有四種組成部分來源的不同。例如，患者T細(xì)胞可以從外周血或腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中分離?？乖f呈細(xì)胞，在實(shí)施例中是存在于外周血單核細(xì)胞部分中的，但是可以有其他來源，例如骨髓。實(shí)施例中在培養(yǎng)基中使用的是自體腫瘤細(xì)胞，但是也可以加入同種異體腫瘤細(xì)胞或腫瘤抗原或用其替代自體腫瘤細(xì)胞，這是因?yàn)槟[瘤抗原是通過自體抗原遞呈細(xì)胞來遞呈的?？笴D3和抗CD28抗體偶聯(lián)磁珠可以被其他途徑固相化的抗體替代，也可以由針對(duì)其他細(xì)胞表面受體所產(chǎn)生的固相化抗體或者特異性的配體組成，促進(jìn)多克隆T細(xì)胞的活化和腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖。
這些操作方法也使CD3陽性淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生成為可能，持續(xù)在體外培養(yǎng)超過10周，即可用于過繼免疫治療。這可能是由于通過CD28的聯(lián)合刺激減少了淋巴細(xì)胞凋亡的可能性(Boise et al..Immunity，3，87-98，1995；Daniel et al.，J Immunol，159，3808-15，1997)，在體外的生命周期延長(zhǎng)(Levine，Bernstein et al.，J Immunol，159，5921-30，1997)。與在高劑量白介素2存在的情況下淋巴細(xì)胞存活期延長(zhǎng)有所不同，共刺激的淋巴細(xì)胞在轉(zhuǎn)導(dǎo)回患者自體之后存活周期也會(huì)延長(zhǎng)(Ranga et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，95，1201-1206，1998)。值得注意的是，CD3介導(dǎo)的T細(xì)胞的刺激作用是與CD28單獨(dú)結(jié)合或與CD24一起結(jié)合完成的，可以防止大約50％的TGF-β1介導(dǎo)的對(duì)淋巴細(xì)胞增殖和腫瘤壞死因子及干擾素-γ產(chǎn)生的抑制作用，即使當(dāng)使用的TGF-β1在培養(yǎng)液中的濃度處于20ng/ml的飽和水平時(shí)也是如此。
實(shí)施例2含有編碼抗人和抗小鼠CD3 scFv的載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)染，并且證實(shí)在細(xì)胞表面表達(dá)抗CD3 scFv可誘導(dǎo)T細(xì)胞的多克隆刺激，使其增殖，并產(chǎn)生Th1型淋巴因子，具有體內(nèi)溶細(xì)胞性及抗腫瘤活性的上面描述的實(shí)驗(yàn)顯示，在含有自體腫瘤細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基中，由抗CD3單克隆抗體偶聯(lián)磁珠提供的信號(hào)使腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞活化并擴(kuò)增。這里提到的基因是指構(gòu)建的用于腫瘤治療的基因，可以在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)具有活性的抗CD3單克隆抗體scFv(scFv)衍生物。用雜交瘤500A2構(gòu)建了與小鼠CD3具有反應(yīng)性的抗CD3 scFv，用雜交瘤G19-4構(gòu)建了與人CD3具有反應(yīng)性的抗CD3 scFv(Ledbetter et al.，J.Immunol.，136，3945-3952，1986)。
scFv的構(gòu)建。通過克隆來自雜交瘤RNA(Hayden et al.，TherImmunol，1，3-15.1994；Gilliland et al.，Tissue Antigens，47，1-20，1996)的抗體可變區(qū)輕鏈和重鏈構(gòu)建scFv(scFvs)的細(xì)胞表面構(gòu)型。雜交瘤生長(zhǎng)在RPMI溶液[10％胎牛血清，4mM谷氨酸鹽，1mM丙酮酸鈉，和50u/ml青鏈霉素，(均購自Life Technologies，Gaithersburg MD)]中，在收獲細(xì)胞前保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)方式數(shù)天。通過離心懸浮培養(yǎng)液收集細(xì)胞，應(yīng)用Trazol或使用QIAGEN RNA柱抽提的方法(LifeTechnologies，Gaithersburg MD，and QIAGEN，Valencia，CA)按照生產(chǎn)商提供的說明，或者使用一種改良的NP-40溶解技術(shù)(Gilliland，Norris et aL，Tissue Antigens，47，1-20，1996)，從2×107個(gè)細(xì)胞中提取RNA。使用Superscript II反轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies)和隨機(jī)六聚體(Takara Shuzo，Otsu Shiga，Japan)，及1微克的總RNA進(jìn)行隨機(jī)引物法合成cDNA第一鏈。在逆轉(zhuǎn)錄后，用dGTP和末端轉(zhuǎn)移酶使cDNA片段具有多聚G尾，這種酶可以催化三磷酸脫氧核苷酸在一條DNA鏈末端的3′-OH基團(tuán)加上一個(gè)脫氧核苷酸。cDNA具有錨定尾，可增加在一端具有未知前導(dǎo)肽的mRNA克隆的效率。如所述，5′端引物是一個(gè)修飾的ANCTAIL引物，包括一個(gè)多聚C尾，用于T細(xì)胞受體核酸鏈序列的聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)(Loh et aL，Science，243，217-20，1989)，其還具有SacI，XbaI，和EcoRI位點(diǎn)，方便進(jìn)行克隆。這一序列如下5’-cgtcgatgagctctagaattcgcatgtgcaagtccgatgagtccccccccccccc-3’cDNA的3’端引物來自重鏈或輕鏈的恒定區(qū)，并結(jié)合跨越J-C連接區(qū)的大約50個(gè)堿基。每個(gè)3’端引物包含有HindIII，BamHI，和SalI克隆位點(diǎn)。因此，用于起始片段亞克隆的限制性位點(diǎn)作為這些起始PCR擴(kuò)增引物的一部分，消化擴(kuò)增的PCR片段并亞克隆到pUC19，pSL1180，或TOPO載體(Invitrogen，San Diego，CA)用于測(cè)序。使用pUC，T7，或Ml3通用和反向引物，以及BigDye末端中止循環(huán)測(cè)序試劑盒(PE Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，用ABI Prism 310(PE Biosystems)測(cè)序儀對(duì)miniprep DNA(QIAGEN.Valencia，CA)進(jìn)行DNA測(cè)序。
一旦分離到可變區(qū)并且在至少三個(gè)相同的克隆得到了相同的序列，便可使用重疊寡聚核苷酸通過PCR擴(kuò)增構(gòu)建scFv，致使編碼輕鏈和重鏈可變區(qū)的cDNA融合。加入一種(gly4ser)3連接子作為重疊寡聚核苷酸的一部分的方法，使得輕鏈和重鏈可變區(qū)在這種縫合聚合酶鏈反應(yīng)期間連接到一起(Gilliland，Norris et al.，Tissue Antigens，47，1-20，1996)。將裝配完畢的scFv分子亞克隆到按照閱讀框融合人CD80跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)尾的人IgG1鉸鏈區(qū)，CH2，和CH3結(jié)構(gòu)域的上游(Winberg et al.，Immunol Rev，153，1996)。完整的表達(dá)盒編碼輕鏈V區(qū)域的天然的引導(dǎo)肽鏈，或來自能與scFv可變區(qū)的SalI位點(diǎn)融合的L6VK輕鏈的分泌性信號(hào)肽。scFv由HindIII-BclI，或SalI-BclI盒編碼，其第一個(gè)限制性位點(diǎn)與開放型閱讀框相符，與此同時(shí)，第二個(gè)限制性位點(diǎn)在與融合蛋白相關(guān)的編碼框之外。然后將該盒與編碼區(qū)位于BstBI-ClaI區(qū)段上的人IgG1野生型Fc結(jié)構(gòu)域相融合。CD80的跨膜區(qū)域和細(xì)胞質(zhì)中的尾部均可通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法從人扁桃體RNA擴(kuò)增而來，其編碼區(qū)位于BstBI-ClaI區(qū)段上，其中包括一個(gè)恰處于ClaI位點(diǎn)上游的終止密碼子。將每一個(gè)亞片段都用亞克隆的方法插入人工的多連接子/多克隆位點(diǎn)當(dāng)中，這些位點(diǎn)事先已被插入至經(jīng)修飾的pCDNA3載體當(dāng)中。一旦編碼細(xì)胞表面scFv的完整融合蛋白結(jié)構(gòu)組裝完畢，便可將整個(gè)表達(dá)盒作為一種HindIII-ClaI片段轉(zhuǎn)移至逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pLNCX當(dāng)中去(Miller and Rosman，Biotechniques，7，980-2，984-6，989-90，1989)(圖9)。
轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒DNA是由重組的反轉(zhuǎn)錄載體制備而來的，并用CaPO4沉淀技術(shù)(Winberg，et aL，(1996)Immunol Rev.153209-223.)轉(zhuǎn)染PT67雙嗜性包裝細(xì)胞(Clontech，Palo Alto，CA)。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞以約25％的融合度，加入含有10％胎牛血清、4mM谷氨酸鹽、2倍濃度的DMEM非必須氨基酸和青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(這種配方在下文中被稱為DMEM-C，所有的試劑均購自LifeTechnologies公司)中，在轉(zhuǎn)染之前培養(yǎng)過夜。將質(zhì)粒DNA加入0.5ml濃度為0.25M的CaCl2溶液中，再逐滴加入0.5ml 2倍濃度的HEBS緩沖液(pH 7.1)。在37℃的環(huán)境下，5分鐘后會(huì)析出沉淀，然后將溶液逐滴加入生長(zhǎng)在加有DMEM-C培養(yǎng)基(8ml)的、直徑為100mm的培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞中。將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孵育過夜，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩遍，再倒入新鮮的培養(yǎng)基。從被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中收集病毒上清，并在24小時(shí)之后將其用于轉(zhuǎn)導(dǎo)?；蛘撸瑢⒔?jīng)轉(zhuǎn)染的，能夠表達(dá)細(xì)胞表面scFv的貼壁PT67細(xì)胞與B細(xì)胞系的細(xì)胞在懸浮液中共同培養(yǎng)。幾次傳代之后，將培養(yǎng)基中的包裝細(xì)胞稀釋，用固相化在培養(yǎng)瓶上的山羊抗人IgG1對(duì)細(xì)胞表面表達(dá)scFv的B細(xì)胞系進(jìn)行陶選。表達(dá)高水平細(xì)胞表面scFv的細(xì)胞在培養(yǎng)瓶上的固定程度較為牢靠，不能表達(dá)該抗體的或抗體表達(dá)水平較低的細(xì)胞會(huì)被從培養(yǎng)瓶上洗脫。用在培養(yǎng)瓶表面刮拭的方法將高水平表達(dá)的細(xì)胞分離，在用于生物學(xué)分析之前重新培養(yǎng)數(shù)日。
小鼠和腫瘤細(xì)胞系。購買了6到8周的老年雌性C3H/HeN小鼠(Taconic，Germantown，New York)。K1735是一種C3H/HeN發(fā)生的惡性黑色素瘤，選擇了一種轉(zhuǎn)移克隆M2(Fidler and Hart，CancerRes，41，3266-3267，1981)。與先前的發(fā)現(xiàn)一致，發(fā)現(xiàn)其MHC I類表達(dá)非常低(數(shù)據(jù)未顯示)。動(dòng)物設(shè)施是經(jīng)過ALAC認(rèn)證的并且實(shí)驗(yàn)方法是經(jīng)過相應(yīng)的公共動(dòng)物協(xié)會(huì)認(rèn)可的。
抗體。R-藻紅蛋白(PE)-偶聯(lián)單克隆抗體GK1.5(抗小鼠CD4)，53-6.7(抗小鼠CD8a)和純化的AF3-12.1(抗H-2KK)購自Pharmingen公司(San Diego，California)，R-PE偶聯(lián)的山羊F(ab′)2抗人IgG購自Biosource International公司(Camarillo，California)。單克隆抗體169-4(抗CD8)來自R.Mittler博士(Emory University，Atlanta，Georgia)。GK1.5(抗CD4)是來自ATCC雜交細(xì)胞瘤產(chǎn)生的。
載體和K1735細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。描述了可變區(qū)克隆，scFv構(gòu)建，和scFv表達(dá)產(chǎn)生的方法(Gilliland，Norris et al.，Tissue Antigens，47，1-20，1996；Hayden et al.，Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaire et al.，Immunol Rev，153，1996)。本發(fā)明采用來自抗CD3雜交瘤500A2或者抗4-1BB雜交瘤1D8可變區(qū)的基因來使得細(xì)胞結(jié)合500A2 scFv或者1D8 scFv在細(xì)胞表面表達(dá)(Hayden，Grosmaire et al..Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaire et al.，ImmunolRev，153，1996)。為了表達(dá)scFv，使用了來自CD80的跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)尾，因?yàn)槠浣閷?dǎo)了細(xì)胞骨架的附著和細(xì)胞與細(xì)胞接觸時(shí)的交聯(lián)(Doty and dark，J Immunol，157，3270-9，1996；Doty and Clark，JImmunol，161，2700-7，1998)。將scFv基因融合到pLNCX中，通過CaPO4沉淀方法轉(zhuǎn)染RetroPackTMPT67包裝細(xì)胞(ClontechLaboratories.Inc，Palo Alto，California)。使用來自這些細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染K1735-WT細(xì)胞。使用PE標(biāo)記的羊抗人IgG對(duì)G418抗性克隆進(jìn)行標(biāo)記用于scFv細(xì)胞表面的表達(dá)。
動(dòng)物研究。小鼠，5或10只/組，后背一側(cè)皮下移植2×106個(gè)野生型K1735細(xì)胞或K1735-500A2細(xì)胞或γ-射線照射的(12,000拉德)野生型K1735細(xì)胞。使用野生型K1735細(xì)胞(2×106細(xì)胞/小鼠)或Ag104(3×105細(xì)胞/小鼠)刺激免疫小鼠。通過應(yīng)用測(cè)徑器測(cè)量?jī)蓚€(gè)最大的垂直直徑來評(píng)估腫瘤的大小，并報(bào)告平均腫瘤面積(mm2)±SD。將腫瘤皮下移植的部位的毛剃除有利于腫瘤的測(cè)量。
CD4+和/或CD8+T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞在體內(nèi)的消耗。T細(xì)胞消耗如文中所述(Chen，Ashe et al.，Cell，71，1093-102，1992)，給小鼠腹腔注射CD4單克隆抗體(GK1.5，小鼠IgG2b)或CD8(169-4，小鼠IgG 2a)或二者的混合成分，3次劑量為0.5mg/小鼠，連續(xù)注射3天。隨后每3天使用每種單克隆抗體0.5mg，以維持這種消耗。通過每4天腹腔以30ul/只小鼠的劑量注射抗asialo GM1抗體維持NK細(xì)胞的消耗。在第12天，用FACS分析每組的脾細(xì)胞來證實(shí)消耗的效率。隨后，給小鼠皮下移植腫瘤細(xì)胞。
增殖方法。將脾細(xì)胞在96孔平底培養(yǎng)板(1×105個(gè)細(xì)胞/孔)與5×105個(gè)自體的，經(jīng)射線照射后的(3,000拉德)脾細(xì)胞(作為抗原遞呈細(xì)胞)和腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)。在孵育了72小時(shí)之后，將一式三份的培養(yǎng)物用1μCi3[H]標(biāo)記的胸腺嘧啶脈沖16-18小時(shí)(AmershamPharmacia，Biotech Piscataway，New Jersey)，并測(cè)量攝入量。
為了研究哪些T細(xì)胞在體外增殖，按照生產(chǎn)商提供的方法(Molecular Probes，Eugene，Oregon)，將脾細(xì)胞在2μM的CFDASB(5-(和-6)-羧基熒光素雙乙酸琥珀酸脂)(den Haan，Lehar et al.，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)中進(jìn)行了孵育標(biāo)記，在野生型K1735細(xì)胞存在和不存在的情況下培養(yǎng)了三天，并用FACS進(jìn)行分析。
細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞活性檢測(cè)方法。K1735-1D8移植后2-4周處死小鼠，并制備脾細(xì)胞懸浮液。按照規(guī)定，使用抗asialo GM1抗體加上兔補(bǔ)體(Cedarane，Ontario，Canada)去除NK細(xì)胞，在一個(gè)24孔培養(yǎng)板中(Costar Corp.，Cambridge，Massachusetts)將5×106個(gè)脾細(xì)胞與用1×105□-照射的(12,000拉德)野生型K1735細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)5天。應(yīng)用一種4小時(shí)51Cr釋放方法，在不同的E/T比率檢測(cè)細(xì)胞的活性。
ELISPOT方法。按照生產(chǎn)商提供的方法使用小鼠IFN-γELISPOT試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota)，并通過平板掃描裝置對(duì)平板進(jìn)行計(jì)數(shù)(Cellular Technology Ltd.，Cleveland，Ohio)。
有多克隆活性的人T細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)生Th1型淋巴因子并使細(xì)胞裂解。圖10顯示了抗人CD3 scFv在Reh細(xì)胞和T51細(xì)胞表面的表達(dá)，其中，前者為一種網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系的細(xì)胞，后者為一種淋巴細(xì)胞系的細(xì)胞。圖中顯示，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞抗CD3 scFv基因產(chǎn)物的表達(dá)水平很高。
通過與取自正常捐獻(xiàn)者的PBMC共同培養(yǎng)并檢測(cè)得知，被轉(zhuǎn)染的Reh和T51細(xì)胞與野生的Reh和T51細(xì)胞的能力相比，前者可以誘導(dǎo)T細(xì)胞的擴(kuò)增。用絲裂酶素C對(duì)野生型的和被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系進(jìn)行處理，以預(yù)防它們?cè)谂囵B(yǎng)期間擴(kuò)增。被轉(zhuǎn)染的能夠表達(dá)抗CD3 scFv的Reh和T51細(xì)胞以劑量依賴的模式誘導(dǎo)T細(xì)胞的擴(kuò)增，野生型的Reh和T51細(xì)胞則不會(huì)(圖11)。
進(jìn)行試驗(yàn)以檢測(cè)在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的抗CD3 scFv是否能夠刺激來自外周血單核細(xì)胞的T細(xì)胞快速地殺死被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。將野生型的或被轉(zhuǎn)染的Reh和T51細(xì)胞分別用51Cr進(jìn)行標(biāo)記，用取自正常捐獻(xiàn)者的外周血單核細(xì)胞進(jìn)行8小時(shí)51Cr釋放試驗(yàn)。圖12顯示了靜止的T細(xì)胞快速殺死被轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而非野生型細(xì)胞，并導(dǎo)致劑量依賴性的51Cr的顯著釋放。
K1735-500A2細(xì)胞被有免疫活性的自體小鼠排斥。如在圖7中所見到的，已被轉(zhuǎn)染并表達(dá)抗小鼠CD3 scFv的K1735-500A2細(xì)胞一過性地在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)，隨后便遭到排斥。表達(dá)CD80的細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，盡管比未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞要慢一些，但這與先前被報(bào)道的發(fā)現(xiàn)是一致的(Chen et al，J Exp Med，179，523-532，1994)。
有10只小鼠被移植了3次，分別間隔7天，每次用2×106個(gè)抗CD3(500A2 scFv)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行移植(沒有接種任何腫瘤)。對(duì)9只對(duì)照組小鼠僅注射磷酸鹽緩沖液(PBS)。然后，對(duì)兩組小鼠都用106個(gè)野生型K1735細(xì)胞進(jìn)行刺激。野生型K1735細(xì)胞在所有對(duì)照組小鼠體內(nèi)形成腫瘤，在10只實(shí)驗(yàn)組小鼠中，有6只小鼠體內(nèi)沒有形成腫瘤。有4只經(jīng)免疫的小鼠體內(nèi)形成了腫瘤，但腫瘤形成的時(shí)間比未經(jīng)免疫(對(duì)照)組小鼠晚。在任何一只小鼠體內(nèi)均沒有出現(xiàn)毒性或免疫抑制的證據(jù)，包括已經(jīng)重復(fù)注射抗CD3 scFv轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞的小鼠。
在將K1735-500A2細(xì)胞與野生型K1735細(xì)胞混合式出現(xiàn)旁觀者效應(yīng)的證據(jù)。為了證實(shí)表達(dá)抗CD3 scFv的腫瘤細(xì)胞，例如，作為體內(nèi)轉(zhuǎn)染的結(jié)果，是否會(huì)誘導(dǎo)也能有效抗野生型腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，共進(jìn)行了兩項(xiàng)將野生型K1735細(xì)胞與K1735-500A2細(xì)胞相混合的試驗(yàn)。第一項(xiàng)試驗(yàn)顯示，當(dāng)兩種類型的細(xì)胞等量混合的時(shí)候，腫瘤會(huì)在體內(nèi)經(jīng)過短時(shí)間的生長(zhǎng)后發(fā)生退化。在第二項(xiàng)試驗(yàn)中是將2×106個(gè)野生型K1735細(xì)胞與2×105個(gè)K1735-500A2細(xì)胞相混合。如圖13顯示，與單獨(dú)移植時(shí)相比，野生型細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制了。
用K1735-500A2細(xì)胞免疫導(dǎo)致腫瘤選擇性T細(xì)胞增殖。收集拒絕移植的K1735-500A2細(xì)胞的小鼠的脾細(xì)胞。圖14顯示這種脾細(xì)胞的增殖，脾細(xì)胞當(dāng)在體外與經(jīng)放射照射的野生型K1735細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，比脾細(xì)胞與經(jīng)放射照射的抗原性迥異的自體肉瘤Ag104細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)增殖的程度更大。射線照射K1735-500A2細(xì)胞免疫小鼠脾細(xì)胞并不比天然小鼠脾細(xì)胞(對(duì)照)增殖旺盛。
因此，抗CD3 scFv在腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)誘導(dǎo)快速殺傷腫瘤細(xì)胞，并導(dǎo)致T細(xì)胞增殖。這些特性促進(jìn)了腫瘤特異性免疫，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的破壞以及T細(xì)胞的多克隆活化產(chǎn)生腫瘤抗原，后者由在T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的影響下成熟的樹突狀細(xì)胞吞噬。T細(xì)胞通過多克隆抗CD3激活作用首先被致敏，然后隨著他們識(shí)別由抗原遞呈細(xì)胞遞呈的腫瘤抗原，腫瘤特異性T細(xì)胞繼續(xù)增殖?；罨腡細(xì)胞形成的1型淋巴因子，以及T細(xì)胞本身，可以破壞旁觀腫瘤細(xì)胞，說明在體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，表達(dá)抗CD3 scFv可能具有治療效果。
實(shí)施例3抗4-1BB scFv用于癌癥基因治療為了制成能夠刺激免疫系統(tǒng)的疫苗，要用現(xiàn)有的技術(shù)(Hayden，Grosmaire et al.，Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaireet al.，Immunol Rev，153，1996)構(gòu)建一個(gè)能夠編碼來源于雜交瘤1D8(一種抗-4-1BB單克隆抗體)(Melero，Shuford et al.，Nat Med，3，682-5，1997)的細(xì)胞結(jié)合型scFv的載體。將這種載體轉(zhuǎn)染至來源于K1735黑色素瘤的細(xì)胞當(dāng)中(Ward et al.，J.Exp.Med.，170，1989)，這種細(xì)胞的免疫源性較低，且I型主要組織相容性抗原的表達(dá)水平較低。被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞會(huì)誘發(fā)一種強(qiáng)烈的Th1型免疫反應(yīng)，CD4+、而非CD8+的T淋巴細(xì)胞對(duì)這種反應(yīng)是必需的，自然殺傷細(xì)胞也參與了這種反應(yīng)。經(jīng)接種的小鼠能夠排斥野生型K1735腫瘤在皮下長(zhǎng)成結(jié)節(jié)或在肺中生長(zhǎng)。這項(xiàng)發(fā)明的方法將可以有效地對(duì)抗人類患者出現(xiàn)微型腫瘤轉(zhuǎn)移灶，包括，例如I型主要組織相容性抗原的表達(dá)水平較低的那些腫瘤。
小鼠和腫瘤細(xì)胞系。購買了6到8周齡的雌性C3H/HeN小鼠(Taconic，Germantown，New York)。K1735是一種C3H/HeN發(fā)生的惡性黑色素瘤，選擇了一種穩(wěn)定克隆M2(Fidler and Hart，CancerRes，41，3266-3267，1981)。與先前的發(fā)現(xiàn)一致，發(fā)現(xiàn)其MHC I類表達(dá)非常低(數(shù)據(jù)未顯示)。Ag104(Ward，Koeppen et al.，J.Exp.Med.，170，1989)是長(zhǎng)在C3H/HeN小鼠身上的一種自發(fā)性纖維肉瘤。YAC-1購自American Type Culture Collection(Rockville，Maryland)。動(dòng)物設(shè)施是經(jīng)過ALAC認(rèn)證的并且實(shí)驗(yàn)方法是經(jīng)過相應(yīng)的公共動(dòng)物協(xié)會(huì)認(rèn)可的。
抗體。R-藻紅蛋白(PE)-偶聯(lián)單克隆抗體GK1.5(抗小鼠CD4)，53-6.7(抗小鼠CD8a)和純化的AF3-12.1(抗H-2KK)購自Pharmingen公司(San Diego，California)，R-PE偶聯(lián)的山羊F(ab′)2抗人IgG購自Biosource International公司(Camarillo，California)。單克隆抗體169-4(抗CD8)來自R.Mittler博士(Emory University，Atlanta，Georgia)。GK1.5(抗CD4)是來自ATCC雜交細(xì)胞瘤產(chǎn)生的。兔抗asialo GM抗體購自Wako純化試劑工廠(Richmond，Virginia)，純化的兔IgG購自Sigma和Rockland公司(Gilbertsville，Pennsylvania)。
載體和K1735細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。描述了可變區(qū)克隆，scFv構(gòu)建，和scFv表達(dá)產(chǎn)生的方法(Gilliland，Norris et al.，Tissue Antigens，47，1-20，1996；Hayden et al.，Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaire et al.，Immunol Rev，153，1996)。本發(fā)明采用來自抗CD3雜交瘤500A2或者抗4-lBB雜交瘤1D8可變區(qū)的基因來獲得細(xì)胞結(jié)合500A2 scFv或者1D8 scFv的細(xì)胞表面的表達(dá)(Hayden，Grosmaire etal..Tissue Antigens，48，242-54，1996；Winberg，Grosmaire et al.，Immunol Rev，153，1996)。為了表達(dá)scFv，使用了來自CD80的跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)尾，因?yàn)槠浣閷?dǎo)了細(xì)胞骨架的附著和細(xì)胞與細(xì)胞接觸時(shí)的交聯(lián)(Doty and dark，J Immunol，157，3270-9，1996；Doty andClark，J Immunol，161，2700-7，1998)。將scFv基因整合到pLNCX中，通過CaPO4沉淀方法轉(zhuǎn)染RetroPackTMPT67包裝細(xì)胞(ClontechLaboratories.Inc，Palo Alto，California)。使用來自這些細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染野生型K1735細(xì)胞。使用PE標(biāo)記的羊抗人IgG對(duì)G418抗性克隆進(jìn)行標(biāo)記，用于scFv在細(xì)胞表面的表達(dá)。
動(dòng)物研究。小鼠，5或10只/組，后背一側(cè)皮下移植2×106個(gè)野生型K1735細(xì)胞或K1735-500A2細(xì)胞或經(jīng)γ-射線照射的(12,000拉德)野生型K1735細(xì)胞。使用野生型K1735細(xì)胞(2×106細(xì)胞/小鼠)或Ag104(3×105細(xì)胞/小鼠)刺激免疫小鼠。通過應(yīng)用測(cè)徑器測(cè)量?jī)蓚€(gè)最大的垂直直徑來評(píng)估腫瘤的大小，并報(bào)告平均腫瘤面積(mm2)±SD。將腫瘤皮下移植的部位的毛剃除，利于腫瘤的測(cè)量。
在第一項(xiàng)試驗(yàn)中，給小鼠在尾側(cè)靜脈靜脈注射3×105野生型K1735細(xì)胞，以造成肺部轉(zhuǎn)移灶(Kahn et al.，J Immunol，146，3235-3241，1991)。三天之后，在小鼠背部的一側(cè)皮下移植K1735-1D8細(xì)胞，每周移植一次，共移植四次。移植野生型細(xì)胞37天之后，將小鼠處死。給小鼠氣管內(nèi)注射印第安墨水(以15％的濃度溶于磷酸鹽緩沖液中)，將肺臟取出，未著色的轉(zhuǎn)移灶在黑色的正常組織襯托下肉眼可見(Estin et al.，Proc Nati Acad Sci USA，85，1052-6，1988)。
CD4+和/或CD8+T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞在體內(nèi)的消耗。T細(xì)胞消耗如文中所述(Chen，Ashe et al.，Cell，71，1093-102，1992)，給小鼠腹腔注射CD4單克隆抗體(GK1.5，小鼠IgG2b)或CD8(169-4，小鼠IgG 2a)或二者的混合成分3次，以0.5mg/小鼠連續(xù)注射3天。隨后每3天使用每種單克隆抗體0.5mg，以維持這種消耗。通過每4天腹腔以30ul/只小鼠的劑量注射抗asialo GM1抗體維持NK細(xì)胞的消耗。在第12天，用FACS分析每組的脾細(xì)胞來證實(shí)消耗的效率。隨后，給小鼠皮下移植腫瘤細(xì)胞。
增殖方法。將脾細(xì)胞在96孔平底培養(yǎng)板(1×105個(gè)細(xì)胞/孔)與5×105個(gè)自體的，經(jīng)射線照射后的(3,000拉德)脾細(xì)胞(作為抗原遞呈細(xì)胞)和腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)。在孵育了72小時(shí)之后，將一式三份的培養(yǎng)物用1μCi3[H]標(biāo)記的胸腺嘧啶脈沖16-18小時(shí)(AmershamPharmacia，Biotech Piscataway，New Jersey)，并測(cè)量攝入量。
為了研究哪些T細(xì)胞在體外增殖，按照生產(chǎn)商提供的方法(Molecular Probes，Eugene，Oregon)，將脾細(xì)胞在2μM的CFDASB(5-(和-6)-羧基熒光素雙乙酸琥珀酸脂)(den Haan，Lehar et al.，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)中進(jìn)行了孵育標(biāo)記，在野生型K1735細(xì)胞存在和不存在的情況下培養(yǎng)了三天，并用FACS進(jìn)行分析。
細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞活性檢測(cè)方法。K1735-1D8移植后2-4周處死小鼠，并制備脾細(xì)胞懸浮液。按照規(guī)定，使用抗asialo GM1抗體加上兔補(bǔ)體(Cedarane，Ontario，Canada)去除NK細(xì)胞，在一個(gè)24孔培養(yǎng)板中(Costar Corp.，Cambridge，Massachusetts)將5×106個(gè)脾細(xì)胞與用1×105□-照射的(12,000拉德)野生型K1735細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)5天。應(yīng)用一種4小時(shí)51Cr釋放方法，在不同的E/T比率檢測(cè)細(xì)胞的活性。
ELISPOT方法。按照生產(chǎn)商提供的方法使用小鼠IFN-γELISPOT試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota)，并通過平板掃描裝置對(duì)平板進(jìn)行計(jì)數(shù)(Cellular Technology Ltd.，Cleveland，Ohio)。
免疫組化。在注射腫瘤后10-30天將組織取出，用10％福爾馬林固定，封閉，制作4-6μm的切片，并用Vector ABC試劑盒(加利福尼亞，柏林蓋姆，Vector實(shí)驗(yàn)室)染色，再按照操作手冊(cè)檢測(cè)CD4+和CD8+的T細(xì)胞。這部分操作也可采用H-E染色。
通過需要CD4+T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞參與的機(jī)制排斥K1735-1D8細(xì)胞。將細(xì)胞結(jié)合的抗4-1BB scFv克隆至逆轉(zhuǎn)錄載體pLNCX中(圖15a)。將這個(gè)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至取自K1735的轉(zhuǎn)移M2克隆的細(xì)胞(Fidlerand Hart，Cancer Res，41，3266-3267，1981)(被稱為野生型K1735細(xì)胞)。被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，即K1735-1D8細(xì)胞，會(huì)在其表面表達(dá)高水平的抗4-1BB scFv(圖15b)。
野生型K1735細(xì)胞在皮下(s.c.)移植給天然自體(C3H)小鼠后生長(zhǎng)迅速。盡管用與上述皮下移植相同劑量的K1735-1D8細(xì)胞已經(jīng)在開始時(shí)形成面積約為30mm2的腫瘤，但在皮下移植后第20天時(shí)，這些腫瘤消退并消失了(圖15c)。用以同樣方法構(gòu)建的，編碼抗人CD28scFv的對(duì)照載體轉(zhuǎn)染野生型K1735細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在C3H小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)速率與野生型K1735細(xì)胞相同。
為了研究CD4+和CD8+的T淋巴細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞在K1735-1D8細(xì)胞消退過程中的作用，給天然小鼠腹腔內(nèi)注射單克隆抗體以去除CD8+，CD4+，或CD4+和CD8+的T細(xì)胞，或腹腔內(nèi)注射抗-asialo GM1兔抗體，以去除自然殺傷細(xì)胞。給對(duì)照組的小鼠注射大鼠IgG。12天之后，在對(duì)取自相同小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行FACS分析顯示大量靶細(xì)胞已經(jīng)耗盡的時(shí)候，給每個(gè)組的小鼠均皮下移植K1735-1D8細(xì)胞。在被注射抗CD8單克隆抗體或?qū)φ沾笫驣gG，去除了CD4+T細(xì)胞或/和CD8+T細(xì)胞的小鼠體內(nèi)，K1735-1D8細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)是相同的，這使得K1735-1D8細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況與野生型K1735細(xì)胞相同。細(xì)胞可以在所有自然殺傷細(xì)胞被耗盡的小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)，盡管這種生長(zhǎng)的速度比在CD4被耗盡的小鼠體內(nèi)的速度要慢很多(圖15d)。
用K1735-1D8細(xì)胞進(jìn)行免疫，利用免疫的記憶性和特異性誘導(dǎo)針對(duì)野生型K1735細(xì)胞的免疫。將C3H小鼠分為每組10只，每隔10天皮下移植兩次K1735-1D8細(xì)胞或經(jīng)放射線照射的野生型K1735細(xì)胞；給對(duì)照組的小鼠皮下注射磷酸鹽緩沖液(PBS)。10天之后，給小鼠注射野生型細(xì)胞。經(jīng)K1735-1D8細(xì)胞免疫、但沒有接受經(jīng)放射線照射的野生型K1735細(xì)胞免疫的小鼠抑制了野生型細(xì)胞(圖16a)。單獨(dú)用K1735-1D8細(xì)胞免疫足以保護(hù)機(jī)體對(duì)抗移植的野生型K1735細(xì)胞。
抑制野生型細(xì)胞兩個(gè)月后，經(jīng)免疫能夠排斥K1735-1D8細(xì)胞的小鼠可以再次排斥被注射移植的野生型細(xì)胞(圖16a)。與此形成對(duì)比的是，來自無抗原相關(guān)性的肉瘤Ag104細(xì)胞在“排斥型”小鼠體內(nèi)與在天然對(duì)照體內(nèi)生長(zhǎng)的一樣好(圖16b)。
在經(jīng)過兩次對(duì)抗K1735-1D8的免疫，并在此后能夠排斥被移植的野生型細(xì)胞的小鼠中，約有20％會(huì)在長(zhǎng)于4個(gè)月的隨診期間出現(xiàn)皮膚退色(圖16c)。沒有其他自身免疫的體征。
K1735-1D8細(xì)胞作為一種治療用疫苗是有效的。進(jìn)行了三項(xiàng)給已經(jīng)形成野生型K1735腫瘤的小鼠體內(nèi)移植K1735-1D8細(xì)胞的試驗(yàn)。第一項(xiàng)是在已有表面積約為30mm2皮下腫瘤的小鼠體內(nèi)做的試驗(yàn)。給其中一組在每四周的第一周時(shí)在背部、野生型腫瘤的對(duì)側(cè)注射K1735-1D8細(xì)胞。給另一組移植經(jīng)照射的野生型K1735細(xì)胞，給第三組皮下注射磷酸鹽緩沖液(PBS)。在所有對(duì)照組的小鼠和所有用經(jīng)照射的野生型K1735細(xì)胞免疫的小鼠體內(nèi)均形成了野生型腫瘤，與此形成對(duì)比的是，在被免疫抗K1735-1D8細(xì)胞的小鼠中，五只小鼠中的四只小鼠體內(nèi)的腫瘤消退了(圖17a)，在三個(gè)月之后試驗(yàn)終止時(shí)，這四只小鼠仍沒有腫瘤，也沒有中毒的體征。第五只小鼠腫瘤結(jié)節(jié)的大小也減小了，只要該小鼠接受K1735-1D8細(xì)胞移植。
在第二項(xiàng)試驗(yàn)中，是在用野生型K1735細(xì)胞移植前1天或移植后的4或8天開始，給小鼠每周皮下注射K1735-1D8細(xì)胞。在相同的用藥時(shí)機(jī)給其他組別的小鼠腹腔內(nèi)注射1D8單克隆抗體用作比較。給對(duì)照組腹腔內(nèi)注射磷酸鹽緩沖液(PBS)。如表4中所顯示的，必須在接受野生型細(xì)胞移植之后49天內(nèi)處死所有對(duì)照組的小鼠，因?yàn)樗鼈凅w內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)了≥100mm2的腫瘤。與此形成對(duì)比的是，在移植野生型細(xì)胞的前一天開始用K1735-1D8細(xì)胞接種或給予1D8單克隆抗體的小鼠，在移植野生型細(xì)胞之后70天試驗(yàn)結(jié)束時(shí)小鼠體內(nèi)沒有腫瘤。在用野生型細(xì)胞移植之后的第4或第8天開始，被免疫的抗K1735-1D8的小鼠，在進(jìn)行觀察的前28天期間沒有可檢測(cè)出來的腫瘤，但在不再注射疫苗之后，這10只小鼠中的4只出現(xiàn)了腫瘤。WT細(xì)胞形成腫瘤后8天注射單克隆抗體的小鼠發(fā)生腫瘤的時(shí)間比相應(yīng)的K1735-1D8組小鼠要早，但兩組小鼠的存活率沒有區(qū)別。將移植野生型細(xì)胞后20天收獲的腫瘤分成幾個(gè)部分，并進(jìn)行H&E染色和免疫組化評(píng)估。一個(gè)取自磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)照組小鼠的腫瘤結(jié)節(jié)包括有許多腫瘤細(xì)胞和少量的CD4+和CD8+的T淋巴細(xì)胞，并對(duì)接受單克隆抗體注射第8天的一只小鼠進(jìn)行同樣的分析。與此對(duì)應(yīng)的是，在取自首次進(jìn)行抗K1735-1D8免疫第8天小鼠的腫瘤結(jié)節(jié)中，含有大量的CD4+和CD8+的T淋巴細(xì)胞，而僅含有極少量的腫瘤細(xì)胞(圖17b)。
第三項(xiàng)試驗(yàn)也是五只小鼠/組，在這項(xiàng)試驗(yàn)中我們給小鼠靜脈注射3×105個(gè)野生型K1735細(xì)胞以形成肺部轉(zhuǎn)移。三天之后，每周皮下移植K1735-1D8細(xì)胞，共持續(xù)一個(gè)月；給對(duì)照組的小鼠靜脈注射磷酸鹽緩沖液(PBS)。在有一只對(duì)照組小鼠死亡，或在接受野生型K1735細(xì)胞三十七天之后試驗(yàn)中止。在那時(shí)，每個(gè)對(duì)照組小鼠的肺臟均有超過500個(gè)轉(zhuǎn)移灶，相比較之下，經(jīng)免疫的小鼠肺臟中這樣的轉(zhuǎn)移灶少于10個(gè)(圖17c)。
用K1735-1D8細(xì)胞免疫可誘發(fā)Th1型免疫應(yīng)答。通過氚標(biāo)記的胸腺嘧啶的攝取進(jìn)行測(cè)定，取自經(jīng)免疫抗K1735-1D8小鼠的脾細(xì)胞的增殖程度大約為取自天然小鼠的或經(jīng)放射線照射的野生型K1735細(xì)胞免疫的小鼠的脾細(xì)胞的兩倍(圖18a)。取自用K1735-1D8免疫的小鼠的脾細(xì)胞在與經(jīng)放射線照射的野生型K1735細(xì)胞共同培養(yǎng)之后會(huì)增加大約4倍，與Ag104細(xì)胞共同培養(yǎng)則不能。也可以對(duì)取自天然小鼠和經(jīng)免疫抗K1735-1D8的小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，脾細(xì)胞在與或不與經(jīng)放射線照射的野生型K1735細(xì)胞共同孵育之前用CFDA SE(den Haan，Lehar et al.，J.Exp.Med.，192，1685-1695，2000)進(jìn)行標(biāo)記。取自K1735-1D8免疫小鼠的CD4+和CD8+脾細(xì)胞擴(kuò)增迅猛(圖18b)，最強(qiáng)烈的擴(kuò)增出現(xiàn)在野生型K1735細(xì)胞中。取自天然小鼠的脾細(xì)胞不出現(xiàn)擴(kuò)增。
來自經(jīng)免疫抗K1735-1D8小鼠的脾細(xì)胞比來自天然小鼠成攜帶K1735-WT腫瘤(圖19a)的小鼠的脾細(xì)胞，在ELISPOT分析中產(chǎn)生IFN r的要多。在表4的試驗(yàn)中，用脾細(xì)胞進(jìn)行的ELISPOT分析證實(shí)了在移植野生型K1735之前一天或之后四天，用K1735-1D8免疫的小鼠是有反應(yīng)活性的，當(dāng)先與野生型K1735細(xì)胞共同培養(yǎng)3天時(shí)反應(yīng)活性較高(圖19b)。最強(qiáng)烈的反應(yīng)活性出現(xiàn)在野生型細(xì)胞前一天免疫的組，這可能是由于腫瘤負(fù)荷較小的。來自用抗4-1BB單克隆抗體注射的小鼠或天然小鼠的脾細(xì)胞沒有表現(xiàn)出反應(yīng)活性。
將取自被免疫抗K1735-1D8的小鼠的脾細(xì)胞與經(jīng)照射的野生型K1735細(xì)胞共同孵育5天，然后用4小時(shí)51Cr釋放實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。沒有先行去除自然殺傷細(xì)胞，K1735、Ag104和YAC細(xì)胞會(huì)以幾乎相同的量被裂解(圖19c)。然而，如果先將脾細(xì)胞與兔抗asialo GM1抗體加補(bǔ)體共同孵育去除自然殺傷細(xì)胞，那么與Ag104或YAC細(xì)胞相比，其會(huì)明顯地表現(xiàn)出對(duì)抗野生型K1735細(xì)胞的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞活性，盡管這種活性是較低的，這種活性還能被抗I類主要組織相容性抗原的單克隆抗體所抑制(圖19d)。
在K1735-1D8細(xì)胞與野生型K1735細(xì)胞混合式時(shí)出現(xiàn)旁觀者效應(yīng)的證據(jù)。為了研究在體內(nèi)表達(dá)抗4-1BB scFv的腫瘤細(xì)胞，例如作為一種體內(nèi)轉(zhuǎn)染的結(jié)果，是否會(huì)誘發(fā)一種免疫應(yīng)答，這種應(yīng)答也具有對(duì)抗野生型腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)，現(xiàn)已進(jìn)行了兩項(xiàng)將野生型K1735細(xì)胞與K1735-1D8細(xì)胞混合后進(jìn)行研究的試驗(yàn)。第一項(xiàng)試驗(yàn)顯示了在兩種細(xì)胞等量混合之后，腫瘤在體內(nèi)短暫生長(zhǎng)之后便發(fā)生了消退。在第二項(xiàng)試驗(yàn)中，將2×106個(gè)野生型K1735細(xì)胞與2×105個(gè)K1735-1D8細(xì)胞相混合。如圖20顯示，與它們單獨(dú)被移植時(shí)的情況相比，野生型細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制了。
因此，源自抗-4-1BB雜交瘤1D8的，能夠表達(dá)細(xì)胞結(jié)合scFv的K1735-1D8細(xì)胞會(huì)被自體小鼠排斥，CD4+T淋巴細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，而非CD8+的T淋巴細(xì)胞都是排異所必需的。另外，抗K1735-1D8的免疫會(huì)誘發(fā)針對(duì)野生型K1735的具有免疫記憶和特異性的系統(tǒng)免疫反應(yīng)。與此相反，反復(fù)用經(jīng)放射線照射的野生型K1735細(xì)胞免疫的小鼠不會(huì)對(duì)野生型細(xì)胞的侵襲表現(xiàn)出保護(hù)作用。這與顯示K1735在轉(zhuǎn)染并表達(dá)CD80之后仍有著低免疫源性的數(shù)據(jù)是一致的。體外分析顯示，被免疫小鼠的脾細(xì)胞能夠?qū)筀1735-1D8細(xì)胞。給腫瘤攜帶小鼠接種疫苗不管是在腫瘤生長(zhǎng)于皮下或肺中時(shí)都是具有療效的。
所觀察到的對(duì)抗野生型K1735這種低免疫源性的，I型主要組織相容性抗原表達(dá)量極低的腫瘤的治療效果提示，將腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染，使其表達(dá)抗4-1BB scFv，然后作為自體或同種異體疫苗使用可以破壞癌癥病人在接受傳統(tǒng)治療后所剩余的微小轉(zhuǎn)移灶。
人4-1BB特異性scFv來自雜交瘤5B9，加工過程與上面描述的G19-4，500A2和1D8 scFv的加工過程是一致的。圖21顯示了5B9 scFv序列與人IgG1鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域以及人CD80的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿尾相融合。
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此處引用和提及的所有專利，出版物，科技文章，網(wǎng)站和其他參考文獻(xiàn)和資料，都是本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員水平的體現(xiàn)，均各自完整引用作為參考。申請(qǐng)者保留將任意或所有來自任何這項(xiàng)專利，出版物，科技文章，網(wǎng)頁，可用的電子信息，和其他參考材料或文獻(xiàn)的全部添加到這份專利說明書的權(quán)利。
此處所描述的特異方法和組合物代表優(yōu)選的實(shí)施方案，是示例性的，其目的不在于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。在本發(fā)明的基礎(chǔ)上聯(lián)想到的其他方面和實(shí)施方案也包含在本發(fā)明的權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，在不背離本發(fā)明的范圍和主旨的前提下，對(duì)其做各種替代和修正，是非常顯而易見的。在此作為例證說明的這項(xiàng)發(fā)明，如果缺乏任何組成部分或者多個(gè)組成部分，限度或多個(gè)限度，在此未作特意說明時(shí)，仍然可以實(shí)施。因此，在本說明的任何情況中，例如本發(fā)明的實(shí)施例或?qū)嵤┓桨钢校魏涡g(shù)語“包含”，“基本由…組成”，“包括”和“由…組成”都可以被說明書中任何另外兩個(gè)術(shù)語替代。同時(shí)，“包含”，“包括”，“含有”等等術(shù)語可以延展含義并不受限制。在此描述說明的方法和步驟以不同的步驟順序呈現(xiàn)時(shí)仍然成立，并不限于此處或權(quán)利要求中指定的步驟順序。在任何情況下，都不可將本專利限定在實(shí)施例和實(shí)施方案公開的范圍內(nèi)。本專利絕不可以解釋為受任何檢查者或任何其他的官方以及專利和商標(biāo)辦公室職員制訂的報(bào)告書的限制，除非這種報(bào)告書是特殊的，并未加限制或申請(qǐng)者書面反應(yīng)明確采用保留。
采用的術(shù)語和表達(dá)是用來解釋說明的術(shù)語，并不是對(duì)本發(fā)明的限制，并沒有通過使用這樣的術(shù)語和表達(dá)法來排除任何同義表達(dá)此處顯示特征和描述或某一部分的意圖，但是應(yīng)該意識(shí)到各種變化可能在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。因此，可以理解，盡管現(xiàn)在的發(fā)明通過優(yōu)選的實(shí)施方案和可選擇的特征公開，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)此作出變化和調(diào)整，這種修飾和變化在本發(fā)明從屬權(quán)利要求定義的范圍中。
本發(fā)明在此進(jìn)行了廣泛地、一般性的描述。落入一般公開范圍的更窄的種類和亞屬也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。一般性公布中的每個(gè)限定種類和亞一般性分組也構(gòu)成了本發(fā)明的部分。這包括對(duì)發(fā)明的一般性描述，附帶限制性條款或否定限制是去除任何物質(zhì)，而不考慮去除的材料是否在此進(jìn)行了特別描述。
其他的實(shí)施方案都包括在下列權(quán)利要求當(dāng)中。另外，本發(fā)明的特點(diǎn)或方面以馬庫什(Markush)基團(tuán)的方式描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到本發(fā)明也可通過馬庫什基團(tuán)的成員或成員亞組的方式進(jìn)行描述。
序列表<110>LEDBETTER，JEFFREYHAYDEN-LEDBETTER，MARTHAHELLSTROM，INGEGERDHELLSTROM，KARL ERIK<120>識(shí)別CD3或4-1BB的抗體或基因介導(dǎo)的腫瘤反應(yīng)性淋巴細(xì)胞活化<130>034474.0004<140>10/107,991<141>2002-04-26<150>60/286,585<151>2001-04-26<160>5<170>專利版本2.1<210>1<211>1687<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述小鼠-人雜交基因<220>
<221>CDS<222>(7)(1671)<220>
<221>信號(hào)肽<222>(7)(75)<223>編碼兩側(cè)連接有Hind III和SalI酶切位點(diǎn)的L6 Vκ前導(dǎo)肽<220>
<221>V_區(qū)<222>(76)(406)<223>編碼Gl9-4小鼠抗人CD3 VL結(jié)構(gòu)域<220>
<221>misc_特征<222>(406).(451)<223>編碼(Gly4Ser)3接頭<220>
<221>V_區(qū)<222>(451).(816)<223>G19-4小鼠抗人CD3 VH結(jié)構(gòu)域<220>
<221>misc_特征<222>(816)(1521)<223>編碼人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域(鉸鏈區(qū)，CH2，CH3)
<220>
<221>misc_特征<222>(1521)..(1687)<223>編碼人CD80跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和連接的限制性酶切位點(diǎn)<400>1aagctt atg gat ttt caa gtg cag att ttc agc ttc ctg cta atc agt 48Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser1 5 10gct tca gtc ata atg tcc aga gga gtc gac atc cag atg aca cag act96Ala Ser Val Ile Met Ser Arg Gly Val Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr15 20 25 30aca tcc tcc ctg tct gcc tct ctg gga gac aga gtc acc atc agt tgc144Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys35 40 45agg gca agt cag gac att cgc aat tat tta aac tgg tat cag cag aaa192Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys50 55 60cca gat gga act gtt aaa ctc ctg atc tac tac aca tca aga tta cac240Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His65 70 75tca gga gtc cca tca agg ttc agt ggc agt ggg tct gga aca gat tat288Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr80 85 90tct ctc acc att gcc aac ctg caa cca gaa gat att gcc act tac ttt336Ser Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe95 100 105 110tgc caa cag ggt aat acg ctt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aaa384Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys115 120 125ctg gta acc aaa cgg gag ctc ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt ggg432Leu Val Thr Lys Arg Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly130 135 140tcg ggt ggc ggc gga tct atc gat gag gtc cag ctg caa cag tct gga480Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly145 150 155cct gaa ctg gtg aag cct gga gct tca atg tcc tgc aag gcc tct ggt528Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly160 165 170tac tca ttc act ggc tac atc gtg aac tgg ctg aag cag agc cat gga576Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Ile Val Asn Trp Leu Lys Gln Ser His Gly175 180 185 190
aag aac ctt gag tgg att gga ctt att aat cca tac aaa ggt ctt act624Lys Asn Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Leu Thr195 200 205acc tac aac cag aaa ttc aag ggc aag gcc aca tta act gta gac aag672Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys210 215 220tca tcc agc aca gcc tac atg gag ctc ctc agt ctg aca tct gaa gac720Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr ser Glu Asp225 230 235tct gca gtc tat tac tgt gca aga tct ggg tac tat ggt gac tcg gac768Ser Ala Val Tyr TyL Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp240 245 250tgg tac ttc gat gtc tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tct816Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser255 260 265 270gat ctg gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca agc cca ccg agc864Asp Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser275 280 285cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga tcg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca912Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro290 295 300aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc960Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys305 310 315gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg1008Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp320 325 330tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag1056Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu335 340 345 350gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg1104Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu355 360 365cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac1152His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn370 375 380aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg1200Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly385 390 395cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag1248Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu400 405 410
ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat1296Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr415 420 425 430ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac1344Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn435 440 445aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc1392Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe450 455 460ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac1440Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn465 470 475gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg1488Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr480 485 490cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa gcg gat cct tcg aac ctg1536Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asp Pro Ser Asn Leu495 500 505 510ctc cca tcc tgg gcc att acc tta atc tca gta aat gga att ttt gtg1584Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val515 520 525ata tgc tgc ctg acc tac tgc ttt gcc cca aga tgc aga gag aga agg1632Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg530 535 540agg aat gag aga ttg aga agg gaa agt gta cgc cct gta taaatcgata 1681Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val545 550 555ctcgag 1687<210>2<211>1696<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述小鼠-人雜交基因<220>
<221>CDS<222>(13)..(1680)<220>
<221>信號(hào)肽<222>(13)..(71)<223>編碼5B9小鼠抗人4-1BB VL前導(dǎo)肽序列
<220>
<221>V_區(qū)<222>(72)..(412)<223>編碼5B9小鼠抗人4-1BB VL結(jié)構(gòu)域<220>
<221>misc_特征<222>(413)..(459)<223>編碼(Gly4Ser)3接頭多肽<220>
<221>V_區(qū)<222>(460)..(826)<223>編碼5B9小鼠抗人4-1BB VII結(jié)構(gòu)域<220>
<221>misc_特征<222>(827)..(1527)<223>編碼人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域(鉸鏈區(qū)，CH2，CH3)<220>
<221>misc_特征<222>(1528)..(1696)<223>編碼帶有限制性位點(diǎn)的人CD80跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>2aagcttgccg cc atg agg ttc tct gct cag ctt ctg ggg ctg ctt gtg ctc 51Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu1 5 10tgg atc cct gga tcc act gca gat att gtg atg acg cag gct gca ttc99Trp Ile Pro Gly Ser Thr Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe15 20 25tcc aat cca gtc act ctt gga aca tca gct tcc atc tcc tgc agg tct147Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser30 35 40 45agt aag agt ctc cta cat agt aat ggc atc act tat ttg tat tgg tat195Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr50 55 60ctg cag aag cca ggc cag tct cct cag ctc ctg att tat cag atg tcc243Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser65 70 75aac ctt gcc tca gga gtc cca gac agg ttc agt agc agt ggg tca gga291Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly80 85 90act gat ttc aca ctg aga atc agc aga gtg gag gct gag gat gtg ggt339Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly95 100 105gtt tat tac tgt gct caa aat cta gaa ctt ccg ctc acg ttc ggt gct387Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala110 115 120 125
ggg acc aag ctg gag ctg aaa cgg ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt435Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly130 135 140ggg tcg ggt ggc ggc gga tcg tca cag gtg cag ctg aag cag tca gga483Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly145 150 155cct ggc cta gtg cag tcc tca cag agc ctg tcc atc acc tgc aca gtc531Pro Gly Leu Val Gln Ser Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val160 165 170tct ggt ttc tca tta act acc tat gct gta cac tgg gtt cgc cag tct579Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr Ala Val His Trp Val Arg Gln Ser175 180 185cca gga aag ggt ctg gag tgg ctg gga gtg ata tgg agt ggt gga atc627Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ile190 195 200 205aca gac tat aat gca gct ttc ata tcc aga ctg agc atc acc aag gac675Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp210 215 220gat tcc aag agc caa gtt ttc ttt aaa atg aac agt ctg caa cct aat723Asp Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Asn225 230 235gac aca gcc att tat tac tgt gcc aga aat ggg ggt gat aac tac cct771Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Gly Asp Asn Tyr Pro240 245 250tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc819Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val255 260 265tcc tct gat ctg gag ccc aaa tct tct gac aaa act cac aca agc cca867Ser Ser Asp Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro270 275 280 285ccg agc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga tcg tca gtc ttc ctc ttc915Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe290 295 300ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc963Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val305 310 315aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc1011Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe320 325 330aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg1059Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro335 340 345
cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc1107Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr350 355 360 365gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 1155Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val370 375 380tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc1203Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala385 390 395aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg1251Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg400 405 410gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc1299Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly415 420 425ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg1347Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro430 435 440 445gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc1395Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser450 455 460ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag1443Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln465 470 475ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac1491Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His480 485 490tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa gcg gat cct tcg1539Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asp Pro Ser495 500 505aac ctg ctc cca tcc tgg gcc att acc tta atc tca gta aat gga att1587Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile510 515 520 525ttt gtg ata tgc tgc ctg acc tac tgc ttt gcc cca aga tgc aga gag1635Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu530 535 540aga agg agg aat gag aga ttg aga agg gaa agt gta cgc cct gta1680Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val545 550 555taaatcgata ctcgag 1696<210>3<211>555
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述小鼠-人融合蛋白<220>
<221>信號(hào)<222>(1)..(23)<223>L6 Vκ信號(hào)肽<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(24)..(133)<223>G19-4小鼠抗人CD3輕鏈可變區(qū)<220>
<221>多肽<222>(134)..(148)<223>(Gly4Scr)3接頭多肽<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(149)..(270)<223>G19-4小鼠抗人VH結(jié)構(gòu)域<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(271)..(504)<223>人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域(鉸鏈區(qū)，CH2，CH3)<220>
<221>跨膜<222>(505)..(555)<223>人CD80跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)尾<400>3Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Met Ser Arg Gly Val Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser20 25 30Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala35 40 45Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp50 55 60Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly65 70 75 80Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu85 90 95Thr Ile Ala Asn Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln100 105 110
Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Val115 120 125Thr Lys Arg Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Gly Gly Gly Ser Ile Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu145 150 155 160Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser165 170 175Phe Thr Gly Tyr Ile Val Asn Trp Leu Lys Gln Ser His Gly Lys Asn180 185 190Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Leu Thr Thr Tyr195 200 205Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser210 215 220Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala225 230 235 240Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr245 250 255Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Asp Leu260 265 270Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala275 280 285Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro290 295 300Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val305 310 315 320Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val325 330 335Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln340 345 350Tyr Asn Ser Tnr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln355 360 365Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala370 375 380Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro385 390 395 400Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr405 410 415
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser420 425 430Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr435 440 445Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr450 455 460Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe465 470 475 480Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys485 490 495Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asp Pro Ser Asn Leu Leu Pro500 505 510Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys515 520 525Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn530 535 540Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val545 550 555<210>4<211>556<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述小鼠-人融合蛋白<220>
<221>信號(hào)<222>(1)..(20)<223>5B9小鼠抗人4-1BB Vκ信號(hào)肽<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(21)..(133)<223>5B9小鼠抗人4-1BB VL結(jié)構(gòu)域<220>
<221>多肽<222>(134)..(149)<223>(Gly4Ser)3接頭多肽<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(150)..(271)<223>5B9小鼠抗人4-1BB VH結(jié)構(gòu)域<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(272)..(505)<223>人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域(鉸鏈區(qū).CH2，CH3)<220>
<221>跨膜<222>(506)..(555)<223>人CD80跨膜和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>4Met Arg Phe Ser Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro20 25 30Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser35 40 45Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys50 55 60Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala65 70 75 80Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Sei Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe85 90 95Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr100 105 110Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys115 120 125Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu145 150 155 160Val Gln Ser Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe165 170 175Ser Leu Thr Thr Tyr Ala Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys180 185 190Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ile Thr Asp Tyr195 200 205Asn Ala Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asp Ser Lys210 215 220Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Pro Asn Asp Thr Ala225 230 235 240Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Gly Asp Asn Tyr Pro Tyr Tyr Tyr245 250 255
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Asp260 265 270Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro275 280 285Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys290 295 300Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val305 310 315 320Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr325 330 335Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu340 345 350Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His355 360 365Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys370 375 380Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln385 390 395 400Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu405 410 415Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro420 425 430Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn435 440 445Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu450 455 460Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val465 470 475 480Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln485 490 495Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ala Asp Pro Ser Asn Leu Leu500 505 510Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile515 520 525Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg530 535 540Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val545 550 555
<210>5<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述；引物<400>5cgtcgatgag ctctagaatt cgcatgtgca agtccgatga gtcccccccc ccccc5權(quán)利要求
1.產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)體系，其包括來自癌癥患者的T細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞、自體或同種異體的腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)多克隆活化的T細(xì)胞受體的固相化抗體。
2.權(quán)利要求1的培養(yǎng)體系，其中所述抗原遞呈細(xì)胞是自體的單核細(xì)胞，其對(duì)所述T細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答而分化。
3.權(quán)利要求1的培養(yǎng)體系，其中所述自體的或同種異體的腫瘤細(xì)胞被轉(zhuǎn)染來表達(dá)至少一種基因，所述基因編碼刺激直接或間接T細(xì)胞應(yīng)答的分子。
4.權(quán)利要求1的培養(yǎng)體系，其中所述固相化抗體與CD3和CD28受體相結(jié)合。
5.一種組合物，其包括編碼能在細(xì)胞表面表達(dá)的抗-CD3scFv的多核苷酸。
6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述多核苷酸編碼G19-4scFv。
7.一種組合物，其包括編碼能在細(xì)胞表面表達(dá)的抗人4-1BB scFv的多核苷酸。
8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述多核苷酸編碼5B9 scFv。
9.一種組合物，其包括由編碼能在細(xì)胞表面表達(dá)的抗CD3 scFv的基因所轉(zhuǎn)染的自體或同種異體腫瘤細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述的自體或同種異體腫瘤細(xì)胞被G19-4 scFv轉(zhuǎn)染，所述G19-4 scFv能在細(xì)胞表面表達(dá)。
11.一種組合物，其包括由編碼能在細(xì)胞表面表達(dá)的抗4-1BBscFv的基因所轉(zhuǎn)染的自體或同種異體腫瘤細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述自體或同種異體腫瘤細(xì)胞被5B9 scFv轉(zhuǎn)染，所述5B9 scFv能在細(xì)胞表面表達(dá)。
13.治療癌癥患者的方法，其包括給患者施用腫瘤細(xì)胞，所述腫瘤細(xì)胞被轉(zhuǎn)染能在細(xì)胞表面表達(dá)抗-CD3 scFv。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞表達(dá)G19-4。
15.治療癌癥患者的方法，其包括給患者施用腫瘤細(xì)胞，所述腫瘤細(xì)胞被轉(zhuǎn)染能在細(xì)胞表面表達(dá)抗-4-1BB scFv。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞表達(dá)5B9。
17.治療癌癥患者的方法，其包括給患者施用質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含能在細(xì)胞表面表達(dá)抗-CD3 scFv的序列。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述質(zhì)粒編碼G19-4 scFv。
19.治療癌癥患者的方法，其包括給患者施用質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含能在細(xì)胞表面表達(dá)抗4-1BB的序列。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述質(zhì)粒編碼5B7 scFv。
21.一種分離的多核苷酸，其包括編碼能在細(xì)胞表面表達(dá)抗-CD3 scFv的序列。
22.一種分離的多核苷酸，其包括編碼能在細(xì)胞表面表達(dá)G19-4scFv的序列。
23.一種分離的多核苷酸，其包括編碼能在細(xì)胞表面表達(dá)抗-4-1BB的序列。
24.一種分離的多核苷酸，其包括編碼能在細(xì)胞表面表達(dá)5B9scFv的序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種體外產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的改良方法，其包括，例如，將來自癌癥患者的PBMC與自體腫瘤細(xì)胞和磁珠共同培養(yǎng)，所述磁珠能通過CD3與CD28、CD40或CD28加CD40的組合來活化T細(xì)胞。本發(fā)明還提供了編碼抗－CD3或抗－41BB scFv的基因以及轉(zhuǎn)染正?；蜻^度增殖細(xì)胞以在其表面表達(dá)所述基因的方法?；蚝娃D(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞是有用的誘導(dǎo)腫瘤破壞性免疫應(yīng)答的組合物。
文檔編號(hào)C12N15/86GK1894413SQ03812095
公開日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2003年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月26日
發(fā)明者J·A·萊德貝特, I·赫爾斯特倫, M·海登-萊德貝特, K·E·赫爾斯特倫 申請(qǐng)人:特魯比昂藥品公司