專利名稱：冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群及其擴(kuò)增引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群及其擴(kuò)增引物。
背景技術(shù)：
腌冬瓜(即臭冬瓜)是浙東地區(qū)傳統(tǒng)的特色腌制蔬菜食品之一，其歷史淵源深遠(yuǎn)；臭冬瓜具有臭味，但入口易化、口味獨(dú)特，是浙江寧紹等地區(qū)人們十分喜愛的佐餐佳品。冬瓜的熟腌按傳統(tǒng)熟腌工藝進(jìn)行，將新鮮的冬瓜清洗干凈后，稱重、去皮、去子瓤。然后切成邊長(zhǎng)8cm左右的方塊，放入沸水中煮至6 8分熟，撈出。將撈出的冬瓜在清水中浸泡一天，然后按照一定比例加入食鹽，加鹽的時(shí)候要將冬瓜塊的六個(gè)面都抹上食鹽，以面對(duì)面、背對(duì)背的方式放入壇中，最后用塑料紙封口，放于陰涼處發(fā)酵20天即可。目前冬瓜的熟腌加工方式還是以傳統(tǒng)的自然發(fā)酵工藝為主，大多數(shù)加工企業(yè)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的控制是通過技術(shù)人員長(zhǎng)期生產(chǎn)所積累的經(jīng)驗(yàn)來判斷和控制，而且產(chǎn)品的質(zhì)量受外界因素(溫度、濕度、PH等)的影響非常明顯，這難于維持產(chǎn)品質(zhì)量(如風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)等)的穩(wěn)定性，更談不上實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。很多研究表明，在蔬菜腌制過程中，微生物的菌群結(jié)構(gòu)以及各種微生物的數(shù)量在腌制過程中的變化在腌制過程中起到非常重要的作用。首先，這些微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸及其他代謝產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)品特殊風(fēng)味的形成起到了重要的作用；其次，有機(jī)酸等微生物的代謝產(chǎn)物能夠抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)，對(duì)產(chǎn)品的保藏起到了決定性作用。由于傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)研究微生物多樣性的局限性和片面性，很難準(zhǔn)確了解冬瓜腌制過程中微生物種群結(jié)構(gòu)以及不同微生物的作用，給腌制工藝的改進(jìn)也帶來盲目性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群及其擴(kuò)增引物，該擴(kuò)增引物可用于定量檢測(cè)優(yōu)勢(shì)菌群的數(shù)量，從而為產(chǎn)品的工藝優(yōu)化和品質(zhì)控制提供依據(jù)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群，在冬瓜熟腌的初期，腌制體系中的優(yōu)勢(shì)菌為不動(dòng)桿菌屬、魏斯氏菌屬和芽孢桿菌屬；在冬瓜熟腌的早期，優(yōu)勢(shì)菌則轉(zhuǎn)變?yōu)槲核故暇鷮?、芽孢桿菌屬和腸桿菌屬；在冬瓜熟腌的中期，優(yōu)勢(shì)菌屬變?yōu)槿闂U菌屬、芽孢桿菌屬和魏斯氏菌屬；在冬瓜熟腌的后期，優(yōu)勢(shì)菌為魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬。所述的初期為冬瓜熟腌的第0-5天，所述的早期為冬瓜熟腌的第6-10天，所述的中期為冬瓜熟腌的第11-15天，所述的后期為冬瓜熟腌的第16-20天?！N冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群的擴(kuò)增引物，所述的優(yōu)勢(shì)菌為所述的腸桿菌屬的類腸膜明串珠菌 ，所述的類腸膜明串珠菌的上游引物為5' -GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA-3'，下游引物為 5' -AACCATGCGGTTGTTGGTA-3'。所述的類腸膜明串珠菌的熒光定量PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C保持2分鐘，然后40 個(gè)循環(huán):95°C 15s，57°C 20s, 72°C 20s。一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群的擴(kuò)增引物，所述的優(yōu)勢(shì)菌為所述的不動(dòng)桿菌屬的醋酸鈣不動(dòng)桿菌，所述的醋酸鈣不動(dòng)桿菌的上游引物為5'-GGAGAGAGGTAGCTTGCTACTGATC -3'，下游引物為 5' - AACTAAAGTAGCCTCCTCCTCGC -3'。所述的醋酸鈣不動(dòng)桿菌的熒光定量PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C保持2分鐘，然后40 個(gè)循環(huán):95°C 15s，60°C 20s, 72°C 20s。一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群的擴(kuò)增引物，所述的優(yōu)勢(shì)菌為所述的魏斯氏菌屬的食竇魏斯氏菌，所述的食竇魏斯氏菌的上游引物為5' - GAGTAACTGTTCAGTGTGTGACGG-3'，下游引物為 5' - TCATCCAGTTTCCAAAGCCAT -3'。所述的食竇魏斯氏菌的熒光定量PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C保持2分鐘，然后40個(gè)循環(huán):95°C 15s，60°C 20s, 72°C 20s。一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群的擴(kuò)增引物，所述的優(yōu)勢(shì)菌為所述的乳桿菌屬的彎曲乳桿菌，所述的彎曲乳桿菌的上游引物為Y - GAACGCACTCTCGTTAGATTG ，下游引物為 5' - CAAATGTTATCCCCCACTTTAG -3'。所述的彎曲乳桿菌的熒光定量PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C保持2分鐘，然后40個(gè)循環(huán):95°C 15s，57°C 20s, 72°C 15s。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明首次公開了冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群及其擴(kuò)增引物，依據(jù)冬瓜腌制過程中的優(yōu)勢(shì)微生物的序列，設(shè)計(jì)特異性的引物，利用SYBR Green I作為熒光染液，對(duì)冬瓜腌制過程中的優(yōu)勢(shì)菌在各個(gè)腌制階段的數(shù)量進(jìn)行了檢測(cè)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為產(chǎn)品的工藝優(yōu)化和品質(zhì)控制提供依據(jù)。冬瓜腌制加工中產(chǎn)品質(zhì)地、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)等品質(zhì)與存在的微生物種群、數(shù)量等密切相關(guān)，因此了解蔬菜腌制過程中的微生態(tài)結(jié)構(gòu)以及數(shù)量變化，揭示冬瓜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)微生物的動(dòng)態(tài)變化情況，從而為工藝改進(jìn)及品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。


圖1為類腸膜明串珠菌的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖2為醋酸鈣不動(dòng)桿菌的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖3為食竇魏斯氏菌的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖4為彎曲乳桿菌的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖5為類腸膜明串珠菌特異性引物電泳圖；M:maker，l:類腸膜明串珠菌(魏斯氏菌屬)，2:醋酸鈣不動(dòng)桿菌(不動(dòng)桿菌屬)，3:食竇魏斯氏菌(魏斯氏菌屬)，4:彎曲乳桿菌(乳桿菌屬)，5:鹽脫氮芽孢桿菌(芽孢桿菌屬)，6:產(chǎn)氣腸桿菌(腸桿菌屬)，7:金黃色葡萄球菌(葡萄球菌屬)；
圖6為醋酸鈣不動(dòng)桿菌特異性引物電泳圖；M:maker，l:醋酸鈣不動(dòng)桿菌(不動(dòng)桿菌屬)，2:類腸膜明串珠菌(魏斯氏菌屬)，3:食竇魏斯氏菌(魏斯氏菌屬)，4:彎曲乳桿菌(乳桿菌屬)，5:鹽脫氮芽孢桿菌(芽孢桿菌屬)，6:產(chǎn)氣腸桿菌(腸桿菌屬)
7:金黃色葡萄球菌(葡萄球菌屬)；
圖7為食竇魏斯氏菌特異性引物電泳圖； M:maker, 1:食竇魏斯氏菌(魏斯氏菌屬)，2:醋酸鈣不動(dòng)桿菌(不動(dòng)桿菌屬)，3:類腸膜明串珠菌(魏斯氏菌屬)，4:彎曲乳桿菌(乳桿菌屬)，5:鹽脫氮芽孢桿菌(芽孢桿菌屬)，6:產(chǎn)氣腸桿菌(腸桿菌屬)7:金黃色葡萄球菌(葡萄球菌屬)；
圖8為彎曲乳桿圃特異性引物電泳圖；M:maker, 1:彎曲乳桿圃(乳桿圃屬)，2:食棄魏斯氏菌(魏斯氏菌屬)，3:醋酸鈣不動(dòng)桿菌(不動(dòng)桿菌屬)，4:類腸膜明串珠菌(魏斯氏菌屬)，
5:鹽脫氮芽孢桿菌(芽孢桿菌屬),6:產(chǎn)氣腸桿菌(腸桿菌屬),7:金黃色葡萄球菌(葡萄球菌屬)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。一、具體實(shí)施例1
本發(fā)明一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群，在冬瓜熟腌的初期，腌制體系中的優(yōu)勢(shì)菌為不動(dòng)桿菌屬、魏斯氏菌屬和芽孢桿菌屬；在冬瓜熟腌的早期，優(yōu)勢(shì)菌則轉(zhuǎn)變?yōu)槲核故暇鷮?、芽孢桿菌屬和腸桿菌屬；在冬瓜熟腌的中期，優(yōu)勢(shì)菌屬變?yōu)槿闂U菌屬、芽孢桿菌屬和魏斯氏菌屬；在冬瓜熟腌的后期，優(yōu)勢(shì)菌為魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬。確定優(yōu)勢(shì)菌群的具體過程如下:
1、冬瓜熟腌
冬瓜的熟腌按傳統(tǒng)熟腌工藝進(jìn)行。將新鮮的冬瓜清洗干凈后，稱重、去皮、去子瓤。然后切成邊長(zhǎng)8 cm左右的方塊，放入沸水中煮至6 8分熟，撈出。將撈出的冬瓜在清水中浸泡一天，然后按照12.5千克冬瓜加0.8千克食鹽的比例加入食鹽，加鹽的時(shí)候要將冬瓜塊的六個(gè)面都抹上食鹽，以面對(duì)面、背對(duì)背的方式放入壇中。最后用塑料紙封口，放于陰涼處發(fā)酵20天即可。
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2、樣品總DNA提取純化
采用Fast DNA SPIN Kit試劑盒(MP Biomedicals，美國(guó))，按說明書上步驟，分別取熟腌冬瓜O天、5天、10天、15天、20天的腌制冬瓜鹵水樣品50ml進(jìn)行總DNA的提取,提取過程如下:
(1)取冬瓜腌制鹵水樣品約200mL，記為樣品1-5，無菌紗布過濾后，lOOOOrpm，4°C離心5min,棄上清,浙干；
(2)在管中加入978ul磷酸鹽緩沖液和122ul MT緩沖液；
(3)用混凝器震蕩混勻10min, 12000rpm離心Imin ；
(4)取上清液到干凈的1.5ml的離心管中，加入250ul pps緩沖液至上清液中反復(fù)用手顛倒10次左右進(jìn)行混勻后，1200rpm離心5min ；
(5)將上清液轉(zhuǎn)移到兩個(gè)干凈的離心管中，在每管中加入45ml混勻的bindingMattix,反復(fù)顛倒,持續(xù)混勻2 min ；
(6)取步驟(5)得到的混合物600ul，轉(zhuǎn)移至IjSpin Filter中，10000 rpm離心Imin,倒掉下層液體，把剩余混合物依舊加入Spin Filter中，再次10000 rpm,離心Imin,直到混合物離心完為止；
(7)加入500ulSEWS-M溶液到Spin Filter，用槍頭輕輕吹打使其懸浮，12000rpm離心Imin,去除濾液，12000rpm離心2min,棄去Catch Tube (用于旋轉(zhuǎn)過濾用的試管),換一個(gè)干凈的Catch Tube室溫干燥5min ；(8)在CatchTube中加入120ul DES并混勻，55°C水浴5min，水浴2_3min時(shí)輕輕吹打一次，以此來提高DNA的洗脫率；
(9)水浴后,將CatchTubel2000rpm離心Imin,收集到的濾液即為樣品DNA ;
(10)在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20°C冷藏備用。3、PCR 擴(kuò)增
PCR 擴(kuò)增所用的反應(yīng)體系為:10XBuffer 5μ L.25 mmol/L 的 MgCl25 μ L、2.5mmol/L的dNTP8yL、10ymol/L的生腌冬瓜總DNA PCR擴(kuò)增上下游引物各1.0 μ L，具體為27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ')和 1492R (5 ' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 ')、模板DNA1.0 μ L、5U/ μ L的Εχ-T^DNA聚合酶0.4 μ L，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足50 μ L體系。PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為95°C預(yù)變性3min，30個(gè)循環(huán)(94°C變性50s，52°C退火50s，72°C延伸lmin30s)，72°C最后延伸lOmin。PCR產(chǎn)物采用純化試劑盒切膠純化。4、PCR產(chǎn)物的純化
UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)回收DNA目的片段步驟:
(1)通過瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，然后用干凈的手術(shù)刀割下含需回收DNA的瓊脂塊， 放入1.5mL離心管中。判定DNA片段位置時(shí)，要盡可能使用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外光，在紫外光下照射的時(shí)間應(yīng)盡可能短。切膠時(shí)應(yīng)盡可能減少膠的體積；
(2)稱量凝膠的重量，以Img=Iμ L換算凝膠的體積。每IOOmg凝膠中加入300 μ LBinding Buffer II ；
(3)置于50-60°C水浴中l(wèi)Omin，使膠徹底融化。加熱融膠時(shí)，每2min混勻一次。(當(dāng)所要回收的DNA片段小于500bp時(shí)，需要在溶膠后，另外再加入2倍膠體積的100%的異丙醇混勻)；
(4)將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放在2mL收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，室溫放置2min，12000rpm室溫離心lmin。(如果溶膠后的總體積大于700 μ L，可以加樣2次以上進(jìn)行分別離心。)
(5)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，加入500 μ L Wash Solution, 12000rpm 室溫離心 lmin ；
(6)重復(fù)步驟5—次；
(7)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，12000rpm室溫離心lmin。(將離心后的UNIQ-10柱放入恒溫箱中50°C干燥5min，或自然晾干lOmin，有助于酒精的揮發(fā)，提高DNA的洗脫效率)
(8)將UNIQ-10柱放入一根新的1.5mL離心管中，在柱子膜中央加40 μ L ElutionBuffer(洗脫液)放置 5min。(將 Elution Buffer 加熱到 60°C或者直接將 Elution Buffer加入到UNIQ-10柱中后60°C溫育5min，有助于提高DNA的洗脫效率；也可以用雙蒸水，用IM的NaOH將pH調(diào)節(jié)到8.5后，再60°C洗脫)
(9)12000rpm室溫離心lmin,離心管中的液體即為回收的DNA片段,可立即使用或保存于-20°C備用。5、連接轉(zhuǎn)化
將純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體試劑盒(大連寶生物公司，產(chǎn)品貨號(hào):D101A)在4°C過夜連接，連接體系如下所示，pMD18-T vector:0.5PL ;Solution 1:2.5PL;PCR 回收產(chǎn)物:2PL。然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞疋coli DH5a中，涂板。轉(zhuǎn)化過程如下:
(I)將連接產(chǎn)物吸到IOOPL感受態(tài)細(xì)胞中，溫和混勻，置于冰上30min。(2)42°C熱休克90s，迅速放回冰中，將細(xì)胞冷卻l_2min后，加入800μ LB培養(yǎng)基，370C、125rpm 振蕩培養(yǎng)細(xì)菌 45_90min。(3) 4000rpm離心lmin，沉淀菌體，吸去上清液，留250μ 左右轉(zhuǎn)化混合物鋪于LB (Amp+)瓊脂平板上，室溫下放置20-30min，待溶液完全被瓊脂吸收后，倒置平皿37°C培養(yǎng)
12-16h。(4)隨機(jī)挑取單菌落作PCR進(jìn)行初步檢測(cè)，并振蕩培養(yǎng)。6、轉(zhuǎn)化子的篩選
對(duì)轉(zhuǎn)化子的篩選采用了藍(lán)白斑及PCR的方法，PCR直接以白斑菌落為模板，采用能與T-載體插入點(diǎn)兩側(cè)特異結(jié)合的M13通用引物進(jìn)行檢測(cè)。PCR 擴(kuò)增采用引物為:M13+(5’ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 ’)及 M13_(5’ -AGCGGATAACAATTTCACACGA-3’ ) (M13 通用引物為現(xiàn)有技術(shù))。PCR 反應(yīng)體系為:10 X PCR Buffer 2.5 μ L, dNTP (2.5mmol/L) 1.5 μ L，正向引物(10ymol/L)0.5μ L,反向引物(10 μ mol/L) 0.5 μ L, DNA 聚合酶(5U/μ L) 0.2 μ L,MgCl2 (25mmol/L) 2.5 μ L，模板DNA 1.0 μ L，用超純水補(bǔ)足反應(yīng)總體積至25 μ L。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94 °C預(yù)變性5min，32個(gè)循環(huán)(94 V變性50s，56 °C退火50s, 72°C延伸lmin20s)，72°C最終延伸10 min。擴(kuò)增完畢后，于1%的瓊脂糖凝膠上電泳。7、基因序列的鑒別
測(cè)序結(jié)果采用DAMBE、DNAstar, MEGA4.1等軟件進(jìn)行編輯分析，并把編輯好的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，分析出克隆所屬物種的系統(tǒng)位置和與之最近似的種類，即得到冬瓜熟腌過程中各個(gè)階段的優(yōu)勢(shì)菌群。8、冬瓜熟腌體系腌制過程中優(yōu)勢(shì)菌群的分析
將來自冬瓜熟腌體系不同腌制過程中 陽(yáng)性克隆子的測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，檢測(cè)出腌制過程中共涉及到9個(gè)不同的菌屬，其中以不動(dòng)桿菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬的變化最為明顯。5個(gè)時(shí)期的克隆子與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的16SrDNA序列相似性范圍在90%以上；冬瓜熟腌體系中不同腌制時(shí)期樣品的細(xì)菌群落測(cè)定結(jié)果如表I所示。表I 16S rDNA克隆文庫(kù)法對(duì)腌制冬瓜樣品的細(xì)菌群落組成分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群，其特征在于:在冬瓜熟腌的初期，腌制體系中的優(yōu)勢(shì)菌為不動(dòng)桿菌屬、魏斯氏菌屬和芽孢桿菌屬；在冬瓜熟腌的早期，優(yōu)勢(shì)菌則轉(zhuǎn)變?yōu)槲核故暇鷮佟⒀挎邨U菌屬和腸桿菌屬；在冬瓜熟腌的中期，優(yōu)勢(shì)菌屬變?yōu)槿闂U菌屬、芽孢桿菌屬和魏斯氏菌屬；在冬瓜熟腌的后期，優(yōu)勢(shì)菌為魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群，其特征在于:所述的初期為冬瓜熟腌的第0-5天，所述的早期為冬瓜熟腌的第6-10天，所述的中期為冬瓜熟腌的第11-15天，所述的后期為冬瓜熟腌的第16-20天。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群的擴(kuò)增引物，其特征在于:所述的優(yōu)勢(shì)菌為所述的腸桿菌屬的類腸膜明串珠菌，所述的類腸膜明串珠菌的上游引物為5' -GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA-3'，下游引物為 5' -AACCATGCGGTTGTTGGTA-3'。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群的擴(kuò)增引物，其特征在于:所述的類腸膜明串珠菌的熒光定量PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C保持2分鐘，然后40個(gè)循環(huán):95°C 15s，57°C 20s, 7 2°C 20s。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群的擴(kuò)增引物，其特征在于:所述的優(yōu)勢(shì)菌為所述的不動(dòng)桿菌屬的醋酸鈣不動(dòng)桿菌，所述的醋酸鈣不動(dòng)桿菌的上游引物為 5' - GGAGAGAGGTAGCTTGCTACTGATC -3'，下游引物為 5' - AACTAAAGTAGCCTCCTCCTCGC_3' ο
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群的擴(kuò)增引物，其特征在于:所述的醋酸鈣不動(dòng)桿菌的熒光定量PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C保持2分鐘，然后40個(gè)循環(huán):95°C 15s，60°C 20s, 72°C 20s。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群的擴(kuò)增引物，其特征在于:所述的優(yōu)勢(shì)菌為所述的魏斯氏菌屬的食竇魏斯氏菌，所述的食竇魏斯氏菌的上游引物為5' - GAGTAACTGTTCAGTGTGTGACGG -3'，下游引物為 5' - TCATCCAGTTTCCAMGCCAT -3'。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群的擴(kuò)增引物，其特征在于:所述的食竇魏斯氏菌的熒光定量PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C保持2分鐘，然后40個(gè)循環(huán):950C 15s,60°C 20s, 72°C 20s。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群的擴(kuò)增引物，其特征在于:所述的優(yōu)勢(shì)菌為所述的乳桿菌屬的彎曲乳桿菌，所述的彎曲乳桿菌的上游引物為5,-GAACGCACTCTCGTTAGATTG -3'，下游引物為 5' - CAAATGTTATCCCCCACTTTAG -3'。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群的擴(kuò)增引物，其特征在于:所述的彎曲乳桿菌的熒光定量PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C保持2分鐘，然后40個(gè)循環(huán):950C 15s,57°C 20s, 72°C 15s。
全文摘要
本發(fā)明公開了冬瓜熟腌過程中的優(yōu)勢(shì)菌群及其擴(kuò)增引物，在冬瓜熟腌的初期，腌制體系中的優(yōu)勢(shì)菌為不動(dòng)桿菌屬、魏斯氏菌屬和芽孢桿菌屬；早期為魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬和腸桿菌屬；中期為乳桿菌屬、芽孢桿菌屬和魏斯氏菌屬；后期為魏斯氏菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬，其中類腸膜明串珠菌的上下游引物如SEQIDNO.1和NO.2所示，醋酸鈣不動(dòng)桿菌的上下游引物如SEQIDNO.3和NO.4所示，食竇魏斯氏菌的上下游引物如SEQIDNO.5和NO.6所示，彎曲乳桿菌的上下游引物如SEQIDNO.7和NO.8所示，優(yōu)點(diǎn)是揭示冬瓜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)微生物動(dòng)態(tài)變化情況，從而為工藝改進(jìn)及品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103114058SQ20131002962
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月24日
發(fā)明者沈錫權(quán), 趙永威, 吳祖芳, 翁佩芳 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)