專利名稱：一種用rna病毒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用RNA病毒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的方法。
背景技術(shù)：
甜菜叢根病是危害甜菜的重要病害，目前已成為世界各甜菜產(chǎn)區(qū)的一種毀滅性病害，尤其對(duì)甜菜產(chǎn)量和含糖量影響極大。近年來該病害在內(nèi)蒙古、甘肅、新疆和黑龍江等主要甜菜產(chǎn)區(qū)都有不同程度的發(fā)生，嚴(yán)重影響我國甜菜制糖業(yè)的發(fā)展。該病害的病原物是甜菜壞死黃脈病毒(Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV),該病毒是Benyvirus 屬的代表病毒，由甜菜多粘菌(Polymyxa beta)傳播(Tamada, T and Baba, T.Beet necrotic yellow vein virus from rhizomania-affected sugar beet in Japan.Ann PhytopatholSoc Japan. 1973，39:325-332)。BNYVV 是正義 RNA 多分體病毒，其基因組由4飛條RNA組成，分別包裝在不同長度的桿狀病毒粒子中。其中RNAl和RNA2編碼“持家基因”，是病毒侵染各種寄主所必需的，而RNA3和RNA4不是病毒所必需的(Bouzoubaa，S.,Niesbach-Klosgen, U. , Jupin,1. , Guilley, H. , Richards, K. , and Jonard, G. Shotrenedforms of Beet necrotic yellow vein virus RNA-3and_4:1nternal deletions and asubgenomic RNA. Journal of General Virology,1991，72:259-226)。BNYVV 僅 RNAl 和RNA2就可以系統(tǒng)侵染本生煙，其中RNA2編碼的P14是其系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)所必需的，其他小組分RNAs的系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)能力和致病性各有不同。分子實(shí)驗(yàn)證實(shí)含有RNA4的BNYVV田間分離物接種本生煙時(shí)可產(chǎn)生嚴(yán)重癥狀，即新生葉下卷，植株矮化(Rahim M.D.，Andika1. B. , Han C. GH. , and Tamada T. RNA4-encoded p31ofBeet necrotic yellow vein virus is involvedin efficient vector transmission, symptom severity and silencing suppressionin root. Journal of General Virology, 2007，88:1611-1619)。野生型 RNA3 在本生煙的選擇壓下更快地產(chǎn)生內(nèi)部缺失型RNA3，并且缺失型的RNA3與本生煙的嚴(yán)重癥狀相關(guān)，而RNA5 則極易在系統(tǒng)葉上發(fā)生自 我丟失(Wang Ying, Fan Huiyan, Wang Xian-Bing, Li Min,Han Chenggui, Li Dawei, Yu Jialin. Detection and characterization of spontaneousinternal deletion mutants of Beet Necrotic yellow vein virus RNA3from systemichost Nicotianabenthamiana. Virology Journal, 2011，8:355)。之前由于接種體系的限制，BNYVV的相關(guān)研究都主要集中在田間寄主甜菜或其他一些枯斑寄主(昆諾藜或者番杏)上進(jìn)行，而其與病毒系統(tǒng)侵染模式植物本生煙的研究還有待進(jìn)一步深入。原生質(zhì)體是去除細(xì)胞壁，由質(zhì)膜包裹的裸露細(xì)胞。由于原生質(zhì)體失去了細(xì)胞壁這一屏障，不僅使其成為植物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物工程和作物改良的理想材料，也成為植物病毒研究的有效手段。煙草原生質(zhì)體是植物病毒研究中應(yīng)用最早、最廣泛的植物材料，它在植物病毒的侵染、復(fù)制、病毒與寄主互作、轉(zhuǎn)基因抗病毒、病毒抑制物等個(gè)方面中有著廣泛的應(yīng)用，為推動(dòng)植物病毒學(xué)的研究起到了重要的作用。接種原生質(zhì)體有用病毒粒體和病毒核酸兩種方式。接種的基本要求是高濃度，侵染性強(qiáng)的病毒(或病毒核酸)懸液和新制備的高活性原生質(zhì)體。目前轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體主要有聚乙二醇(PEG)法、電激法和顯微注射法等。其中PGE法可促進(jìn)膜的融合，通過破環(huán)原生質(zhì)體膜而協(xié)助病毒或核酸侵染，由于可以用少量的病毒核酸得到高感染率的原生質(zhì)體，是目前常用的病毒RNA接種煙草原生質(zhì)體的方法之一(陳占洲，李壞房.煙草原生質(zhì)體在植物病毒研究中的應(yīng)用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34，1119-1122)。目前利用電擊法將BNYVV體外轉(zhuǎn)錄物侵染甜菜(Joersbo M, and BrunstedtJ.1noculation of sugar beet protoplasts with beet necrotic yellow vein virusparticles by mild sonication. Journal of virological methods. 1990，29:63-69)和昆諾藜原生質(zhì)體(Gilmer D.，Bouzoubaa S. , Hehn A. , Guilley H. , Richards K. , JonardG. Efficient cel1-to-celI movement of beet necrotic yellow vein virusrequires3/ proximal genes located on RNA2. Virology，992，189:40-47)以及BY-2懸浮細(xì)胞器有成功報(bào)道，但侵染系統(tǒng)寄主本生煙原生質(zhì)體的體系尚未建立。隨著BNYVV與本生煙寄主相互作用機(jī)制研究的不斷深入，轉(zhuǎn)化本生煙原生質(zhì)體體系的建立也日漸重要。此外，由于電擊轉(zhuǎn)化法對(duì)實(shí)驗(yàn)中所用的儀器有較高的要求，從而限制BNYVV轉(zhuǎn)染原生質(zhì)方法的推廣
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用RNA病毒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的方法。本發(fā)明所提供的用RNA病毒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的方法，是將從感染RNA病毒的植物中提取的總RNA轉(zhuǎn)入到植物原生質(zhì)體中。所述方法特別適合于所述RNA病毒為多分體RNA病毒的情況。所述多分體RNA病毒是指病毒的基因組分布在不同的核酸鏈上，分別包裝在不同的病毒粒體里，由于遺傳信息分開了，單獨(dú)一個(gè)粒體不能侵染，必需是一組幾個(gè)同時(shí)侵染才能全部表達(dá)遺傳特性。當(dāng)帶轉(zhuǎn)化的所述RNA病毒為多分體RNA病毒時(shí),米用上述方法，從感染了相應(yīng)多分體RNA病毒的植物中提取植物總RNA，將其轉(zhuǎn)化目的植物原生質(zhì)體，這樣的轉(zhuǎn)化方法與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法(直接用病毒粒體或從病毒粒體中提取的病毒RNA，或利用病毒不同組分侵染性克隆的體外轉(zhuǎn)錄物混合后轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體)相比，更加簡化和節(jié)約成本，且對(duì)無該病毒侵染性克隆的實(shí)驗(yàn)室提供了開展實(shí)驗(yàn)的可能，其原因如下傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化時(shí)需要首先提純病毒，而利用侵染性克隆體外轉(zhuǎn)錄物則需要摸索不同病毒核酸鏈的之間的配比；對(duì)于本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)化方法來說，相應(yīng)的多分體RNA病毒感染植株體后，該病毒在植物體內(nèi)以其生理狀態(tài)存在，所以用從感病毒的植物體中直接提取的總RNA轉(zhuǎn)化目的植物原生質(zhì)體不僅可以省略掉大量提純病毒顆粒的繁瑣步驟，而且避免了不同RNA組分間配比摸索這一問題。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述多分體RNA病毒具體為甜菜壞死黃脈病毒(Beetnecrotic yellow vein virus，BNYVV)。在上述方法中，所述植物原生質(zhì)體可為煙草原生質(zhì)體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述煙草原生質(zhì)體具體為本生煙(Nicotianabenthamiana)原生質(zhì)體。更加具體的，所述本生煙原生質(zhì)體來自于6-8葉期本生煙的完全展開的新葉，如第一位和第二位展開葉。所述6-8葉期本生煙的完全展開的新葉在原生質(zhì)體提取體系中，是以葉面積小于等于0. 5mm2的組織塊的形式存在的。
所述本生煙原生質(zhì)體具體是按照包括如下步驟的方法制備得到的將所述6-8葉期本生煙的完全展開的新葉(如第一位和第二位展開葉)切碎至葉面積小于等于0. 5mm2，將切碎的葉片置于酶解液中酶解，從而獲得所述本生煙原生質(zhì)體。所述第一位和第二位是指從植株頂端往下數(shù)的第一片新葉和第二片新葉。所述切碎的葉片與所述酶解液的配比具體可為3g葉片5ml酶解液。所述酶解液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下纖維素酶15g/L，離析酶1.5g/L，2-N-嗎啡啉乙磺酸(MES)20mM，甘露醇82g/L，氯化鉀20mM，氯化鈣10mM，牛血清白蛋白Ig/L0所述酶解液的pH可為5. 4-5. 5。所述纖維素酶可為市售的各種纖維素酶，尤其以cellulase “Onozuka” R-1O(Yakult Honsha Co. Ltd)效果最佳，所述離析酶可為市售的各種離析酶，尤其是Macerozyme R-1O (Yakult Honsha Co. Ltd)效果最佳。在所述本生煙原生質(zhì)體的制備方法中，所述酶解的時(shí)間可為3_4h。所述酶解的溫度可為24°C，黑暗條件。在用RNA病毒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的方法中，所述轉(zhuǎn)化可為聚乙二醇轉(zhuǎn)化。所述聚乙二醇轉(zhuǎn)化的體系中，所述總RNA的濃度大于等于0. g/iil，如0. 5-3. Ou g/u 1，再如1. 0-3. 0 u g/ u I ;所述總RNA、所述植物原生質(zhì)體和所述聚乙二醇的配比可為 2-20 u g :2X105f:135mgJn 20 u g :2 X IO5 個(gè)135mg。本發(fā)明以本生煙(Nicotiana benthamiana)煙草葉片為制備原生質(zhì)體的材料,經(jīng)聚二乙醇(PEG)介導(dǎo)將感染了 BNYVV病葉的植物總RNA接種到本生煙原生質(zhì)體內(nèi)，成功建立BNYVV對(duì)原生質(zhì)體的侵染。本發(fā)明為研究甜菜壞死黃脈病毒與本生煙寄主間的致病機(jī)制提供了一個(gè)理想模型，對(duì)揭示`該病毒與寄主植物間互作及病毒演化具有重要的理論價(jià)值。


圖1為從感染了 BNYVV的番杏葉片組織中提取的總RNA的電泳圖。圖2為本生煙原生質(zhì)體的顯微鏡圖片。圖3為本生煙原生質(zhì)體臺(tái)盼蘭染色的顯微鏡圖片。圖4為總量20 U g不同濃度的發(fā)病葉片植物總RNA侵染本生煙原生質(zhì)體24小時(shí)取樣BNYVV CP表達(dá)量情況的Western-blot檢測結(jié)果。圖5為濃度1. 0 ii g/ ill總量不同的發(fā)病葉片植物總RNA侵染本生煙原生質(zhì)體24小時(shí)取樣BNYVV CP表達(dá)情況的Western-blot檢測結(jié)果。圖6為濃度1. 0 ii g/ ill總量20 ii g發(fā)病葉片植物總RNA侵染本生煙原生質(zhì)體不同時(shí)間取樣BNYVV CP表達(dá)情況的Western-blot檢測結(jié)果。圖7為傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)化本生煙原生質(zhì)體后CP表達(dá)量的檢測結(jié)果。其中，CK+表示從感染了 BNYVV的番杏葉片組織中提取的總蛋白的檢測結(jié)果(陽性對(duì)照)；1表示本傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)化本生煙原生質(zhì)體后CP表達(dá)量的檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
本生煙(Nicotianabenthamiana)、甜菜壞死黃脈病毒(Beet necroticyellowvein virus, BNYVV)和番杏(Tetragonia expansa):記載于 “Wang Ying, Fan Huiyan, Wangxian-B ing,Li Min, Han chenggui,Li Dawei,Yu Jial in(2011)Detect ion andcharacterization of spontaneous internal deletion mutants of Beet Necroticyellow vein virus RNA3 from systemic host Nicotiana benthamiana. VirologyJournal2011，8:3351-9” 一文中，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。用于提取本生煙原生質(zhì)體的酶解液(使用時(shí)需用0. 2 的濾膜過濾除菌)纖維素酶15g/L，離析酶1. 5g/L, 2-N-嗎啡啉乙磺酸(MES) 20mM，甘露醇82g/L，氯化鉀20mM，氯化鈣10mM，牛血清白蛋白(BSA) lg/L，pH5. 4-5. 5。以上各濃度為相應(yīng)組分在酶解液中的終濃度。在酶解液的配制過程中，先將除氯化鈣和BSA外的其他組分配置好后，于55°C水浴IOmin,冷卻至室溫,再加入所述氯化鈣和BSA。其中，纖維素酶為cellulase “Onozuka” R-10 (Yakult Honsha Co. Ltd),離析酶為 Macerozyme R-1O (Yakult Honsha Co. Ltd)。用于培養(yǎng)本生煙原生質(zhì)體的培養(yǎng)基(IL):稱取MS Salt (Sigma M5524) 4. 3g,KH2PO410mg,肌醇100mg，蔗糖10g，甘露醇75g，溶于適量蒸餾水并定容至1L，高溫滅菌，PH5. 5。使用之前每升培養(yǎng)基加入過濾滅菌的下列溶液VB5 水溶液(1000 X ) ImL2-4-D 溶液(濃度為 2g/L) 500 U LVB5 水溶液(1000 X ) :1 IOOmg 的 VB5 加到 100ml ddH20 中。2-4-D 溶液100mg 的 2-4-D 力口 Iml 10M NaOH,再加至 50ml ddH20 中。W5 溶液154mmol/L NaCl, 125mmol/L CaCl2, 5mmol/L KCl,2mmol/L MES，溶劑為水，pH5. 7。以上各濃度為相應(yīng)組分在W5溶液中的終濃度。MMG 溶液0. 4mol/L Mannitol, 1 Smmol /T, MgCl2,4mmol/L MES,溶劑為水，pH5. 7。以上各濃度為相應(yīng)組分在W5溶液中的終濃度。0. 05M PB 緩沖液:9. 363g H3BO4, 33. 230g NaB4O7 IOH2O, 2ml0. 5M EDTA,加蒸餾水定溶至1L, pH8. O。RNA 抽提溶液IOOmM Tris-HCl, 0.1mM LiCl，IOmM EDTA,1. 0% (lg/100mL)SDS，溶劑為水，pH8. O。以上各濃度為相應(yīng)組分在RNA抽提溶液中的終濃度。PEG4000 溶液4g PEG4000 (Fluka, cat. No. 81240),2. 5mL Mannitol (濃度為
0.8mol/L), ImL CaCl2 (濃度為 lmol/L)，3mL H2O0實(shí)施例1、病毒侵染的寄主葉片植物組織總RNA的提取本實(shí)施例采用番杏(Tetragonia expansa)作為待感染植物,用多分體RNA病毒甜菜壞死黃脈病毒(Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV)對(duì)其進(jìn)行感染,提取感染后的番杏葉片組織的總RNA，以備用于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。具體如下(1)汁液機(jī)械摩擦接種寄主番杏擴(kuò)繁BNYVV :在感染了 BNYVV的番杏葉片上均勻撒上少量金剛砂，取發(fā)病葉片或者分離出病斑，用0. 05M PB緩沖液研磨充分，雙手帶潔凈乳膠手套蘸取少量病汁液摩擦涂抹整片葉片，5-7天后在葉片上可見黃色的圓形病斑。(2)采集發(fā)病的番杏葉片(每病葉平均病斑數(shù)為60-90個(gè))，約8-10g植物材料加入液氮充分研磨成粉末，轉(zhuǎn)入50ml離心管中，迅速加入80°C預(yù)熱的IOml水飽和苯酹(pH5. 2-6. 0)和等體積的RNA抽提溶液，振蕩20s ;靜置5min后加入IOml的氯仿，振蕩20s，放置 5min, 7000rpm 離心 lOmin。(3)取上清液至新的50ml管中，加入等體積4M LiCl水溶液，混勻后_20°C放置至少4h。8000rpm離心20min，沉淀用720 U I的DEPC水重懸，充分溶解后分別吸取360 yl上清放置在兩個(gè)1. 5ml離心管中，分別加入40 ill的3M醋酸鈉水溶液(pH5. 2)和800 U I的無水乙醇，混勻后_20°C放置至少2h。(4) 4°C條件下，將上述混合物12000rpm離心15min后，再用70%乙醇洗一遍，晾干，加入400 u I的DEPC水懸浮干粉，濃度測定后保存于_20°C。所提取的總RNA的鑒定結(jié)果如圖1所示，所提取的RNA有如下明顯的電泳條帶，從上到下依次為28S RNAU8S RNA和5S RNA，表明獲得了純度較高、較完整的總RNA。實(shí)施例2、本生煙原生質(zhì)體的制備本實(shí)施例從本生煙(Nicotiana benthamiana)中制備用于轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體。具體如下(I)選取在溫室(24°C，12h光照，12h黑暗)培養(yǎng)的6_8葉期本生煙的第一位和第二位全展葉片用于原生質(zhì)體制備，將其盡量切碎(葉片面積小于等于0. 5mm2)，迅速將切碎的葉片放到酶解液(配方見上文)中。葉片與酶解液的配比為3g葉(相當(dāng)于約20片完整葉)5ml酶解液。(2)于24°C黑暗處靜置酶解3_4h，顯微鏡下觀察細(xì)胞大部呈圓球狀終止酶解，80rpm離心Imin,將酶解的細(xì)胞釋放出來。(3)用200目的尼龍濾膜將含有原生質(zhì)體的酶解液過濾到在冰上放置的50ml離心管中，除去未酶解細(xì)胞團(tuán)。350 rpm離心4min(離心機(jī)的accel調(diào)到I,brake要調(diào)到0,使離心機(jī)保持較小的加速度，從而將原生質(zhì)體受到的物理損傷最小化)，收集原生質(zhì)體(沉淀)。(4)將上清輕輕吸出，沿管壁輕輕加入10_15ml的W5溶液(配方見上文)，輕輕將原生質(zhì)體懸浮(盡量避免用槍吹打原生質(zhì)體)，4°C,350rpm離心4min (離心機(jī)的accel調(diào)到I,brake要調(diào)到0，使離心機(jī)保持較小的加速度，從而將原生質(zhì)體受到的物理損傷最小化)，洗滌酶解液。(5)將上清吸出，重復(fù)步驟(4)的操作一次，即用W5溶液共洗滌2次。(6)再次用W5溶液懸浮原生質(zhì)體，冰上至少靜置半小時(shí)(一般靜置1-1. 5小時(shí))，使原生質(zhì)體再次自然沉降。(7)靜置過程中，原生質(zhì)體會(huì)逐漸沉到離心管底部，將上清輕輕吸出，根據(jù)原生質(zhì)體的濃度加入適量的MMG溶液(配方見上文)重懸原生質(zhì)體，一般要求原生質(zhì)體的濃度為IXlO6個(gè)/ml (用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算原生質(zhì)體濃度)，顯微鏡圖片見圖2。由圖1可知，酶解得到的原生質(zhì)體數(shù)目較多，細(xì)胞狀態(tài)良好。高質(zhì)量的原生質(zhì)體一般都是質(zhì)膜光亮、不透明，液泡系不發(fā)達(dá)、大小均勻、呈圓球狀的裸露細(xì)胞。(8)使用臺(tái)盼蘭染色(工作濃度為0. 5g/100ml)，吸取IOOyl步驟(7)的原生質(zhì)體懸浮液，加入20 u I染色液混均勻，室溫靜置2min，用0. 7M甘露醇水溶液清洗2次后在顯微鏡下觀察，活的原生質(zhì)體不被染色，死亡的原生質(zhì)體則被染成藍(lán)色(臺(tái)盼蘭不能透過正常完整的細(xì)胞膜)。結(jié)果如圖3所示。檢測結(jié)果顯示，其中的活原生質(zhì)體占原生質(zhì)體總數(shù)的90%以上，可見，通過本發(fā)明方法制備得到的原生質(zhì)體具有極佳的活性。
實(shí)施例3、PEG介導(dǎo)的本生煙原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化本實(shí)施例將利用實(shí)施例1得到從感染了 BNYVV的番杏病葉提取的植物總RNA，通過PEG介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化到實(shí)施例2制備得到的本生煙原生質(zhì)體內(nèi)，旨在構(gòu)建轉(zhuǎn)入BNYVV的重組本生煙原生質(zhì)體，以備用于研究BNYVV與本生煙寄主間的致病機(jī)制。具體如下(I)將實(shí)施例1獲得的適量的從被BNYVV侵染的番杏病葉中提取的植物總RNA加到2ml離心管(DEPC處理)中，加入200 u I實(shí)施例2制備的本生煙原生質(zhì)體溶液(濃度為
1X IO6個(gè)/ml)，使原生質(zhì)體與植物總RNA充分混合，再加入220 U I的PEG4000溶液(配方見上文)，充分混勻(動(dòng)作一定要輕柔)，室溫(一般為23°C )放置8-10分鐘后，立即輕輕加入Iml的W5溶液(配方見上文)，輕輕混勻。(2) 4°C, 400rpm, 4min (離心機(jī)的accel調(diào)到I, brake要調(diào)到0,使離心機(jī)保持較小的加速度，從而將原生質(zhì)體受到的物理損傷最小化)；輕輕吸出上清，先在六孔培養(yǎng)板上加入1. 5ml原生質(zhì)體培養(yǎng)基(配方見上文)，將步驟(I)得到的含有本生煙原生質(zhì)體和植物總RNA的混合液輕輕加入培養(yǎng)基中。常溫(一般為23°C )散光培養(yǎng)6-48個(gè)小時(shí)。(3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡男枰?，取不同培養(yǎng)時(shí)間的重組原生質(zhì)體，提取總蛋白，定量后利用免疫印記的方法(western-blot)檢測重組原生質(zhì)體中BNYVV病毒的CP蛋白表達(dá)量，從而鑒定轉(zhuǎn)化效率的高低。所用一抗為Beet necrotic yellow vein virus coatingantibody (Agdia, Catalog No:CAB16301),所用二抗為 Protein A-Alaline Phosphatase(SIGMA, Catalog No:P7488_500UG)。本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了如下優(yōu)化在實(shí)施例2制備的本生煙原生質(zhì)體用量為2X105個(gè)(200iil，濃度為IXlO6個(gè)/ml)，PEG4000用量約為135mg (220iU，濃度為4g/6. 5ml), W5溶液用量為lmL，原生質(zhì)體培養(yǎng)基用量為1. 5mL的前提下，對(duì)轉(zhuǎn)化體系中實(shí)施例1制備的植物總RNA的濃度及總量進(jìn)行了一系列優(yōu)化(檢測時(shí)間為病毒侵染原生質(zhì)體后24小時(shí))。詳見如下(a )和(b):(a)轉(zhuǎn)化體系中實(shí)施例1制備的植物總RNA的總量為20 ii g，設(shè)置濃度梯度為
0.2 u g/ u 1、0. 5 u g/u 1、1. 0 u g/u 1、1. 5 u g/u 1、2. 0 u g/ u I 和 3. 0 u g/ u I。同時(shí)設(shè)置零濃度陰性對(duì)照(記作mock)，以及以從感染了 BNYVV的番杏葉片中提取的總蛋白作為待測樣本的陽性對(duì)照(記作CK+)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果如圖4所示，當(dāng)植物總RNA的濃度為0. 5 ii g/iU及以上時(shí)，均有CP蛋白的表達(dá)，特別是濃度為1. Oil g/iil以上時(shí)，CP蛋白的表達(dá)量較高。這表明轉(zhuǎn)化體系中當(dāng)植物總RNA的濃度達(dá)到0. 5 ii g/ ill時(shí)，BNYVV即可侵染本生煙原生質(zhì)體，且濃度為1. 0 y g/ yl以上時(shí)，侵染效果相對(duì)較好。本著節(jié)約成本的原則，選定1. Oii g/yl為最優(yōu)植物總RNA濃度。(b)轉(zhuǎn)化體系中實(shí)施例1制備的植物總RNA的濃度為1. 0 ii g/ ii 1，設(shè)置總量梯度為
2V- g、5 u g> 10 u g、15 v- g、20 u g、30 u g和40 u g。同時(shí)設(shè)置零濃度陰性對(duì)照(記作mock),以及以從感染了 BNYVV的番杏葉片中提取的總蛋白作為待測樣本的陽性對(duì)照(記作CK+)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)植物總RNA的總量為2 U g及以上時(shí)，均有CP蛋白的表達(dá)，并且隨著總量的增加其同一時(shí)間的CP表達(dá)量也隨著增加，當(dāng)RNA總量> 20 ii g時(shí)CP表達(dá)量達(dá)到最大值，并逐漸趨向于平穩(wěn)。這表明轉(zhuǎn)化體系中當(dāng)植物總RNA的總量達(dá)到2 ii g時(shí)，BNYVV即可侵染本生煙原生質(zhì)體，且總量為20 y g以上時(shí)，侵染效果相對(duì)較好。本著節(jié)約成本的原貝U，選定20 i! g為最優(yōu)植物總RNA總量。另外，本發(fā)明的發(fā)明人還對(duì)在優(yōu)化條件下用植物總RNA轉(zhuǎn)化本生煙原生質(zhì)體(SP轉(zhuǎn)化體系中，植物總RNA的濃度為1. 0 ii g/ul，總量為20 u g)后，Western-blot檢測CP表達(dá)情況的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了測定。設(shè)定檢測時(shí)間點(diǎn)依次為病毒侵染原生質(zhì)體后6小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)和48小時(shí)。同時(shí)設(shè)置零濃度陰性對(duì)照(記作mock)，以及以從感染了 BNYVV的番杏葉片中提取的總蛋白作為待測樣本的陽性對(duì)照(記作CK+)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。 結(jié)果如圖6所示，BNYVV侵染原生質(zhì)體12h左右就可以檢測到病毒CP蛋白的表達(dá)，在24h左右達(dá)到最大值，而之后隨著時(shí)間的增加，CP蛋白的表達(dá)量有一定的降低，這可能與原生質(zhì)體活力下降有關(guān)。建議最佳的檢測時(shí)間為病毒侵染原生質(zhì)體后24-36h。對(duì)比例采用傳統(tǒng)的從BNYVV病毒粒體中提取總RNA轉(zhuǎn)化本生煙原生質(zhì)體，在培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)檢測轉(zhuǎn)化后原生質(zhì)體中BNYVV病毒的CP蛋白的表達(dá)量。具體的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的方法及CP蛋白表達(dá)量檢測方法參照實(shí)施例3相關(guān)步驟進(jìn)行。結(jié)果如圖7所示，該傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法與實(shí)施例3中提取植物總RNA的方法(原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)24小時(shí))相比，效果差不多。其中該傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法原生質(zhì)體中表達(dá)的CP蛋白相對(duì)少一點(diǎn)，這可能與提取的病毒粒體的活性或提取的RNA總濃度相關(guān)。這說明在病毒粒體提取過程中實(shí)驗(yàn)操作更繁瑣，`而且存在病毒侵染力降低的風(fēng)險(xiǎn)。
權(quán)利要求
1.一種用RNA病毒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的方法，是將從感染RNA病毒的植物中提取的總RNA轉(zhuǎn)入到植物原生質(zhì)體中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述RNA病毒為多分體RNA病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述多分體RNA病毒為甜菜壞死黃脈病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述植物原生質(zhì)體為煙草原生質(zhì)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述煙草原生質(zhì)體為本生煙原生質(zhì)體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述本生煙原生質(zhì)體來自于6-8葉期本生煙的完全展開的新葉。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述6-8葉期本生煙的完全展開的新葉在原生質(zhì)體提取體系中，是以葉面積小于等于0. 5mm2的組織塊的形式存在的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化為聚乙二醇轉(zhuǎn)化。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述聚乙二醇轉(zhuǎn)化的體系中，所述總RNA的濃度大于等于0. g/yl ;所述總RNA、所述植物原生質(zhì)體和所述聚乙二醇的配比為 2-20 u g :2X105 個(gè)135mg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用RNA病毒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的方法。本發(fā)明所提供的用RNA病毒轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體的方法是將從感染RNA病毒的植物中提取的總RNA轉(zhuǎn)入到植物原生質(zhì)體中；所述RNA病毒為多分體RNA病毒，如甜菜壞死黃脈病毒；所述植物原生質(zhì)體為煙草原生質(zhì)體，如本生煙原生質(zhì)體。本發(fā)明以本生煙煙草葉片為制備原生質(zhì)體的材料，經(jīng)聚二乙醇介導(dǎo)將感染了甜菜壞死黃脈病毒病葉的植物總RNA接種到本生煙原生質(zhì)體內(nèi)，成功建立甜菜壞死黃脈病毒對(duì)原生質(zhì)體的侵染。本發(fā)明為研究甜菜壞死黃脈病毒與本生煙寄主間的致病機(jī)制提供了一個(gè)理想模型，對(duì)揭示該病毒與寄主植物間互作及病毒演化具有重要的理論價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/87GK103060380SQ20131002954
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者韓成貴, 范慧艷, 李大偉, 于嘉林, 王穎, 張永亮, 武文琦, 王曉輝 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)