專利名稱：刺參希瓦氏菌hs7菌株及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從刺參腸道優(yōu)勢(shì)菌群中分離的益生菌，尤其是一種可作為刺參飼料添加劑的刺參希瓦氏菌HS7菌株。
背景技術(shù)：
近年來，食品和環(huán)境安全問題的各類事件已經(jīng)產(chǎn)生巨大的社會(huì)影響。我國(guó)水產(chǎn)品多起殘留事件不但給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且也為我們食品和環(huán)境安全敲響了警鐘。隨著集約化程度的的不斷提高，刺參養(yǎng)殖業(yè)面臨著種質(zhì)退化、病害頻發(fā)等問題，以抗生素和化學(xué)消毒劑為代表的傳統(tǒng)抗病手段已逐漸被禁止和取代，尋求替代抗生素等傳統(tǒng)手段的益生菌成為當(dāng)前的研究重點(diǎn)。因此，從健康刺參體內(nèi)篩選高效專用的益生菌對(duì)降低刺參養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)綠色無公害養(yǎng)殖具有重要意義。腸道正常微生物群對(duì)維持動(dòng)物(宿主)正常消化功能，抑制非正常菌在腸道內(nèi)的定植十分重要。有研究結(jié)果表明，動(dòng)物腸道正常微生物群對(duì)動(dòng)物機(jī)體的飼料消化吸收、抵抗病害以及健康生長(zhǎng)等方面發(fā)揮著顯著作用，健康動(dòng)物的腸道優(yōu)勢(shì)菌群和次優(yōu)勢(shì)菌群可以作為益生菌的來源。國(guó)內(nèi)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)行業(yè)的益生菌大多源自陸生動(dòng)物或借鑒陸生動(dòng)物思路研制，甚至有廠家直接將淡水種的益生菌不加選擇的應(yīng)用于海水養(yǎng)殖系統(tǒng)，其功能效應(yīng)較難充分發(fā)揮。有的益生菌雖然有一定的效果，但也存在難定植的不足，效果不能持續(xù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種可作為刺參飼料添加劑的刺參希瓦氏菌HS7菌株及用途。本發(fā)明的技術(shù)解 決方 案是:一種刺參希瓦氏菌HS7菌株(CCTCC M 2012513)，屬于希瓦氏菌，菌株代碼HS7,拉丁文學(xué)名Shewanellajaponica,已2012年12月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號(hào)為CCTCC M 2012513。所述刺參希瓦氏菌HS7菌株的16S rDNA的基因片段如下: CGGGGCGGCAGACTACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGCGGCGG
ACGGGTGAGTAATGCCTAGGGATCTGCCCAGTCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCC
CTACGGGGGAAAGGAGGGGACCTTCGGGCCTTTCGCGATTGGATGAACCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTAAGGTA
ATGGCTTACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGTTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC
TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAG
GCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAGGGAGGAAAGGTAGCAGCTTAATACGTTGTTACTGTGACGTTACCTACA
GAAGAAGGACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTCCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCG
TAAAGCGTACGCAGGCGGTTCATTAAGCCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTGGAACTGGT
GAACTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTG
GCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT
AAACGATGTCTACTCGGAGTTTGGTGCCTTGAGCACTGGGCTCCCAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTATTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGAGTACAGAGGGTTGCAAAGCCGCAAGGTCTAGCTAATCTCATAAAGCTCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTAGATAGTCTAACCTTCGGGAGGACGTTAACCAACGGTTGGTTCATGTGT一種上述刺參希瓦氏菌HS7菌株作為刺參飼料添加劑的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的刺參希瓦氏菌HS7菌株具有以下優(yōu)點(diǎn):
1)能分泌蛋白酶、淀粉酶等消化酶，具有促進(jìn)刺參消化吸收的能力，可提高刺參的生長(zhǎng) 生倉(cāng)泛;
2)在水體中能夠存活并且對(duì)藻類無殺滅作用；大量地增殖，可與水體中病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)以及分解了水體中的有機(jī)質(zhì)，起到凈化水質(zhì)的作用；
3)是真正意義上的可定植優(yōu)勢(shì)菌，能夠調(diào)節(jié)腸道正常微生態(tài)平衡，提高機(jī)體免疫力，在腸道內(nèi)能夠同病原菌競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)，可以替代化學(xué)藥物進(jìn)行疾病防治且不破環(huán)生態(tài)環(huán)境。


圖1是依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的刺參希瓦氏菌HS7菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖。菌種保藏日期:2012年12月6日
保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)
保藏號(hào):CCTCC M 2012513。
具體實(shí)施例方式1.刺參希瓦氏菌HS7菌株(CCTCC M 2012513)，屬于希瓦氏菌，菌株代碼HS7，拉丁文學(xué)名SlwwaiwllB japonica,已2012年12月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號(hào)為 CCTCC M 2012513。2.刺參希瓦氏菌HS7菌株(CCTCC M 2012513)的制備方法:
I)刺參來源
采自大連海域。2)菌株的分離與純化
用75 %酒精沖洗刺參體表。在無菌條件下，用剪刀剪開刺參體腔，取出刺參消化道，用0.9 %生理鹽水沖洗腸道外壁，擠出腸道內(nèi)容物，將腸壁置于無菌試管中，稱重后將腸壁置于研缽中，用5 mL無菌生理鹽水充分研磨均勻?yàn)闃悠?。用無菌生理鹽水對(duì)樣品進(jìn)行倍比稀釋至10_6，各稀釋度樣品均用旋窩振蕩器震蕩均勻。選取合適梯度，分別取100 μ L涂布2216Ε平板，每個(gè)平板3個(gè)重復(fù)，28°C培養(yǎng)5 d。挑取不同形態(tài)的菌株在2216E培養(yǎng)基上多次劃線分離純化，直到單一菌落為止。將得到的純種菌株保存于-80°C備用。所述的221 6E培養(yǎng)基的組分及配比為:蛋白胨5 g，酵母膏I g，磷酸高鐵0.01 g，海水 1000 mL, pH 7.2 7.4，121°C滅菌 20 min。
刺參希瓦氏菌HS7菌株的鑒定:I)形態(tài)學(xué)的特征刺參希瓦氏菌HS7菌株在2216E培養(yǎng)基上生長(zhǎng)呈粉紅色，表面光滑，生長(zhǎng)良好。培養(yǎng)特征見表I。
表I刺參希瓦氏菌HS7菌株的培養(yǎng)特征
形狀I(lǐng)顏色I(xiàn)光滑度 I凸起程度I邊緣I透明度I大小I菌體特征I革蘭氏染色 HS7 I圓狀I(lǐng)粉紅色I(xiàn)光滑濕潤(rùn)I高起 I全緣I不透明|2mn |桿狀單個(gè)|陰性
2)刺參希瓦氏菌HS7菌株的分子生物學(xué)鑒定。(I)刺參希瓦氏菌HS7菌株16S rDNA的基因片段序列測(cè)定
將刺參希瓦氏菌HS7純培養(yǎng)物接種于普通肉湯，28°C搖床培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，采用離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA。擴(kuò)增刺參希瓦氏菌HS7菌株16SrDNA的基因采用通用引物，正向引物為:5 ; - CAGGCCTAACACATGCAAGTC - 3 ;(對(duì)應(yīng)于萬.16S rDNA 5 ; 43_63f)，反向引物為:3' - GGGCGGffGTGTACAAGGC - 5 ;(對(duì)應(yīng)于萬.16S rDNA 3 ; 1405-1387r),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(50 yL):Mix 25 μ L, ddH20 19UL，正向引物I yL，反向引物I yL，DNA4 μ L0 PCR反應(yīng)條件:在94°C預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:94°C變性45 s— 53°C復(fù)性45 s — 72°C延伸90 S，循環(huán)32次，最后720C延伸7 min。結(jié)束反應(yīng)后，PCR產(chǎn)物用I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用凝膠回收試劑盒回收，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。刺參希瓦氏菌HS7菌株16S rDNA的基因片段序列長(zhǎng)度是1438 bp。
16S rDNA 序列如下:CGGGGCGGCAGACTACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGCGGCGG
ACGGGTGAGTAATGCCTAGGGATCTGCCCAGTCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCC
CTACGGGGGAAAGGAGGGGACCTTCGGGCCTTTCGCGATTGGATGAACCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTAAGGTA
ATGGCTTACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGTTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC
TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAG
GCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAGGGAGGAAAGGTAGCAGCTTAATACGTTGTTACTGTGACGTTACCTACA
GAAGAAGGACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTCCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCG
TAAAGCGTACGCAGGCGGTTCATTAAGCCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTGGAACTGGT
GAACTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTG
GCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGT
AAACGATGTCTACTCGGAGTTTGGTGCCTTGAGCACTGGGCTCCCAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAG
TACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGC
AACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGA
CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCT
TATTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAA
GTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGAGTACAGAGGGTTGCAAAGCCGCAAGGTCT
AGCTAATCTCATAAAGCTCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAAT
CGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCA
CCAGAAGTAGATAGTCTAACCTTCGGGAGGACGTTAACCAACGGTTGGTTCATGTGT(2)刺參希瓦氏菌HS7菌株序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
將測(cè)定的刺參希瓦氏菌HS7菌株16S rDNA序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有已測(cè)定的原核生物16S rDNA進(jìn)行比對(duì)，依據(jù)同源序列搜索結(jié)果，下載數(shù)株同代表菌株相似度最高的菌株的16S rDNA序列，與代表菌株一同根據(jù)Clustal W方法進(jìn)行匹配排列(Alignment),用MEGA5.0 軟件中的 Kimura2_Parameter Distance 模型以及 neighbour-joining 分析法構(gòu)建得到系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行1000次Bootstraps檢驗(yàn)。刺參希瓦氏菌HS7菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。試驗(yàn)例1:刺參希瓦氏菌HS7產(chǎn)酶能力分析
將刺參希瓦氏菌HS7菌株點(diǎn)種于蛋白酶選擇培養(yǎng)基、淀粉酶選擇培養(yǎng)基和脂肪酶選擇培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48 h。若菌落周圍產(chǎn)生透明環(huán)，說明菌株具有相應(yīng)產(chǎn)酶活力，測(cè)量并記錄菌落周圍透明環(huán)與菌落直徑比值。相關(guān)培養(yǎng)基配方如下:
蛋白酶選擇培養(yǎng)基:酪蛋白10 g，酵母膏I g，瓊脂16 g，人工海水1000 mL ;調(diào)pH至7.4。121.5°C，滅菌 20 min。淀粉酶選擇培養(yǎng)基:可溶性淀粉10 g，蛋白胨5 g，酵母膏I g，瓊脂16 g，人工海水 1000 mL ;調(diào) pH 至 7.4。121.5。。，滅菌 20 min。脂肪酶選擇培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，吐溫一80 10 mL, CaCl2.7Η20 0.1 g，瓊脂9 g，人工海水 1000 mL ;調(diào) pH 至 7.4。121.5°C，滅菌 20 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。表2刺參希瓦氏菌HS7菌株產(chǎn)酶能力分析
權(quán)利要求
1.一種刺參希瓦氏菌HS7菌株，分類命名為Japonica希瓦氏菌(.Shewanellajaponica ),已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為為CCTCC M2012513。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的刺參希瓦氏菌HS7菌株，其特征在于:所述刺參希瓦氏菌HS7菌株的16S rDNA的基因片段如下:CGGGGCGGCAGACTACACATGCAAGTCGAGCGGTAACAGAAAGTAGCTTGCTACTTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGGATCTGCCCAGTCGAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGAGGGGACCTTCGGGCCTTTCGCGATTGGATGAACCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGTTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGTAGGGAGGAAAGGTAGCAGCTTAATACGTTGTTACTGTGACGTTACCTACAGAAGAAGGACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGGGTCCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGTTCATTAAGCCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAATTGCATTTGGAACTGGTGAACTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTTCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGAAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCATGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAAACGATGTCTACTCGGAGTTTGGTGCCTTGAGCACTGGGCTCCCAAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTATTTGCCAGCGCGTAATGGCGGGAACTCTAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGAGTACAGAGGGTTGCAAAGCCGCAAGGTCTAGCTAATCTCATAAAGCTCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGCTGCACCAGAAGTAGATAGTCTAACCTTCGGGAGGACGTTAACCAACGGTTGGTTCATGTGT 。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的刺參希瓦氏菌HS7菌株作為刺參飼料添加劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開一種刺參希瓦氏菌HS7菌株(CCTCCM2012513)，分類命名為刺參Japonica希瓦氏菌HS7(Shewanellajaponica)，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為為CCTCCM2012513，可作為刺參飼料添加劑使用。能分泌蛋白酶、淀粉酶等消化酶，具有促進(jìn)刺參消化吸收的能力，可提高刺參的生長(zhǎng)性能；在水體中能夠存活并且對(duì)藻類無殺滅作用；大量地增殖，可與水體中病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)以及分解了水體中的有機(jī)質(zhì)，起到凈化水質(zhì)的作用；是真正意義上的可定植優(yōu)勢(shì)菌，可以替代化學(xué)藥物進(jìn)行疾病防治且不破環(huán)生態(tài)環(huán)境。
文檔編號(hào)C12N1/20GK103232950SQ20131002908
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月27日
發(fā)明者許淑芬, 劉小林, 常亞青, 費(fèi)世洲, 王高學(xué), 張喜昌, 冷曉飛, 李丹 申請(qǐng)人:大連海寶漁業(yè)有限公司