專(zhuān)利名稱(chēng)：一種無(wú)物種限制無(wú)生物安全性問(wèn)題的真核生物基因打靶方法及螺旋結(jié)構(gòu)dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種無(wú)物種限制無(wú)生物安全性問(wèn)題的真核生物基因打靶方法及螺旋結(jié)構(gòu)DNA序列。
背景技術(shù)：
基因打祀(gene targeting)技術(shù)是一種定向改變生物體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)方法。近年來(lái)隨著生物技術(shù)的發(fā)展，鋅指核酸酶(ZFN)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)技術(shù)被應(yīng)用于基因打靶中，這兩項(xiàng)技術(shù)大大提高了定向修飾的特異性。ZFN是由一個(gè)DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。DNA識(shí)別域是由一系列Cys2-His2鋅指蛋白(zinc-fingers)串聯(lián)組成(一般3 4個(gè)),每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基。多個(gè)鋅指蛋白可以串聯(lián)起來(lái)形成一個(gè)鋅指蛋白組識(shí)別一段特異的堿基序列，與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內(nèi)切酶是來(lái)自FokI的C端的96個(gè)氨基酸殘基組成的DNA剪切域。FokI是來(lái)自海床黃桿菌的一種限制性?xún)?nèi)切酶，只在二聚體狀態(tài)時(shí)才有酶切活性，每個(gè)FokI單體與一個(gè)鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個(gè)ZFN,識(shí)別特定的位點(diǎn)，當(dāng)兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)相距恰當(dāng)?shù)木嚯x時(shí)(6 8bp)，兩個(gè)單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功能。從而達(dá)到DNA定點(diǎn)剪切的目的。剪切后產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自身天然的DNA修復(fù)過(guò)程“同源定向修復(fù)”或“非同源末端連接”來(lái)引入外源DNA，從而修改細(xì)胞內(nèi)源基因。鋅指核酸酶技術(shù)突破了基因打靶限制性的因素-打靶效率，將基因打靶的效率由原來(lái)的10-6 10-7提高至10-1 10-2。但是鋅指核酸酶在進(jìn)行基因修飾過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生脫革El現(xiàn)象(off-target),引起細(xì)胞劑量依賴(lài)性毒性。Gupta等通過(guò)不同的鋅指核酸酶對(duì)斑馬魚(yú)kdrl基因座進(jìn)行祀向修飾研究,利用Illumina測(cè)序評(píng)估了斑馬魚(yú)中141處潛在的脫靶位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)的脫靶位點(diǎn)導(dǎo)致細(xì)胞累積損傷。為此尚需對(duì)鋅指核酸酶-基因打靶技術(shù)進(jìn)行深入研究。
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TALEN技術(shù)是利用植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白一_即激活因子樣效應(yīng)物(TAL effectors, TALEs)能夠識(shí)別特異性DNA堿基對(duì)的功能，設(shè)計(jì)一串合適的TALEs來(lái)識(shí)別和結(jié)合到任何特定序列，再在TALEs后附加一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，構(gòu)建出TALEN，從而實(shí)現(xiàn)了在特定位點(diǎn)切斷DNA雙鏈，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自身天然的DNA修復(fù)過(guò)程，在細(xì)胞基因組中引入新的遺傳物質(zhì)。相對(duì)鋅指核酸酶技術(shù)而言，TALEN能夠靶向更長(zhǎng)的基因序列，而且也更容易構(gòu)建。但是到目前為止，無(wú)論是ZFN還是TALEN，對(duì)其識(shí)別序列都有很多要求，無(wú)法實(shí)現(xiàn)靶向每一種可能的DNA序列，而且不容易進(jìn)行兩個(gè)或更多位點(diǎn)的同期打祀，并且組裝ZFN或TALEN蛋白也是一個(gè)耗時(shí)、耗力且花費(fèi)很高的過(guò)程，人們一直都沒(méi)有一種低成本的而且公開(kāi)能夠獲得的方法來(lái)快速地產(chǎn)生大量的ZFNs或TALENs
發(fā)明內(nèi)容
1.發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中通過(guò)ZFNs或TALENs實(shí)現(xiàn)特異性基因組改造存在的局限性大、耗時(shí)耗力且成本高的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種無(wú)物種限制無(wú)生物安全性問(wèn)題的真核生物基因打靶方法及螺旋結(jié)構(gòu)DNA序列，該方法步驟簡(jiǎn)單、識(shí)別位點(diǎn)靈活且消耗低。2.技術(shù)方案發(fā)明原理:利用原核生物的規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(CRISPR/Cas)系統(tǒng)的定向識(shí)別和剪切功能，本發(fā)明的方法通過(guò)增加這一系統(tǒng)在真核生物中的核定位，實(shí)現(xiàn)對(duì)真核生物中靶向DNA的特定位點(diǎn)的剪切，在剪切后的修復(fù)過(guò)程中會(huì)引入靶向DNA序列的突變，從而實(shí)現(xiàn)基因打靶的目的。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的:一種無(wú)物種限制無(wú)生物安全性問(wèn)題的真核生物基因打靶方法，其步驟為:
(I) CRISPR/Cas9和嵌合RNA的設(shè)計(jì)與構(gòu)建I)優(yōu)化編碼Cas9的密碼子2) Cas9核酸酶載體構(gòu)建和Cas9核酸酶mRNA合成根據(jù)步驟I)優(yōu)化后的序列，定制合成編碼Cas9核酸酶的DNA序列，并將其分別插入到如下表達(dá)載體中形成:pST1374-Cas9、pST1374-NLS-Flag-Cas9 ；利用Cas9C_NLS Cla For和Cas9C_NLS Apa Rev兩個(gè)引物，通過(guò)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增一個(gè)DNA片段，使用ClaI和ApaI兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段和 pST1374-NLS-Flag-Cas9，將擴(kuò)增的 DNA 片段插入到 pST1374-NLS_Flag-Cas9，構(gòu)建pST1374-NLS-Flag-Cas9-NLS 載體；編碼三個(gè)細(xì)胞核定位信號(hào)NLS的序列是利用Cas9-N-3NLS For和Cas9_N_3NLSRev引物以寡核苷酸為模板PCR擴(kuò)增出來(lái)的，PCR產(chǎn)物經(jīng)NheI和NotI兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶消化后，再由同樣的酶切位點(diǎn)插入到pST1374-NLS-Flag-Cas9載體中，構(gòu)建pST1374-3XNLS-Flag-Cas9 ；螺旋結(jié)構(gòu)(Helix)DNA序列經(jīng)定制合成后插入到編碼標(biāo)簽蛋白Flag的序列和編碼Cas9核酸酶序列中間，形成pST1374-NLS-Flag-Helix_Cas9載體；Cas9系統(tǒng)來(lái)源于原核細(xì)胞，在真核細(xì)胞中難于向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，因而無(wú)法保證這一系統(tǒng)在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)其剪切功能。本發(fā)明通過(guò)在細(xì)胞核核定位信號(hào)序列和Cas9編碼序列間添加螺旋結(jié)構(gòu)DNA序列增加Cas9在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，解決了這一問(wèn)題，見(jiàn)圖
2。在這個(gè)過(guò)程中使用了人類(lèi)293T。Cas9核酸酶系列載體經(jīng)AgeI線性化后，利用T7Ultra Kit體外轉(zhuǎn)錄后得到Cas9核酸酶mRNA，直接用于基因打靶；由于mRNA的不穩(wěn)定性，不會(huì)長(zhǎng)期存在生物體內(nèi)，不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生進(jìn)一步影響，因而沒(méi)有生物安全性問(wèn)題。3)嵌合RNA的合成嵌合RNA模板上的T7啟動(dòng)子序列,是以合成的寡核苷酸為模板通過(guò)PCR產(chǎn)生,利用T7Shortscript Kit體外轉(zhuǎn)錄出嵌合RNA,它包含crRNA以及tracrRNA結(jié)構(gòu)，可以定向結(jié)合靶向DNA上的位點(diǎn)；(2) Cas9mRNA體內(nèi)翻譯后形成Cas9核酸酶與嵌合RNA結(jié)合，實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)剪切，剪切后產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自身天然的DNA修復(fù)過(guò)程“非同源末端連接”來(lái)引入外源DNA，從而修改細(xì)胞內(nèi)源基因。一種螺旋結(jié)構(gòu)DNA序列，該螺旋結(jié)構(gòu)DNA序列在核定位信號(hào)指導(dǎo)下增強(qiáng)蛋白的核轉(zhuǎn)移能力以及與核酸結(jié)合的能力，其基因序列為:ctggaacccggcgagaagccatacaaatgcccagagtgtggtaaatctttctctcagtctggtgctctgaccagacaccagcggacccacactaga。3.有益效果相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:(I)準(zhǔn)確性更高。采用本發(fā)明的方法，只要RNA靶向序列和基因組序列之間存在任何堿基對(duì)的差異，Cas9都不會(huì)結(jié)合，因而無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的剪切；(2)基因組多位點(diǎn)打靶。采用本發(fā)明的方法，可以同時(shí)對(duì)靶基因上的多個(gè)位點(diǎn)實(shí)行剪切，實(shí)現(xiàn)基因組改造的目的；(3)使用更方便，費(fèi)用更低。無(wú)論是ZFN還是TALEN都需要針對(duì)不同靶點(diǎn)改變核酸酶前面的識(shí)別序列，這些識(shí)別序列的合成或組裝耗時(shí)耗力且費(fèi)用很高。本發(fā)明的方法中，CRISPR/Cas系統(tǒng)只需改變很短的RNA序列就可以實(shí)現(xiàn)不同位點(diǎn)的特異性識(shí)別。在動(dòng)物基因工程模型的建立中，如果使用ZFN或TALEN技術(shù)，還要將ZFN或TALEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄為mRNA，這又增加了費(fèi)用和實(shí)驗(yàn)的難度，采用CRISPR/Cas系統(tǒng)只需轉(zhuǎn)錄一次Cas核酸酶就可完成多次實(shí)驗(yàn)，極大地降低了成本；(4)無(wú)生物安全性問(wèn)題。本發(fā)明采取mRNA和RNA做為基因打靶原材料，沒(méi)有任何篩選用抗性基因，因而不存在生物安全性問(wèn)題；( 5)采用本發(fā)明的方法，無(wú)物種限制。


圖1為Cas9與嵌合RNA結(jié)合實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)剪切導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂過(guò)程示意圖；圖2為Cas9核酸酶各載體的共聚焦顯微鏡拍攝熒光照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步介紹。實(shí)施例1本實(shí)施例的一種無(wú)物種限制無(wú)生物安全性問(wèn)題的真核生物基因打靶方法，其步驟為:(I) CRISPR/Cas9和嵌合RNA的設(shè)計(jì)與構(gòu)建I)優(yōu)化編碼Cas9的密碼子Cas9屬于第二類(lèi)CRISPR/Cas系統(tǒng)，來(lái)源于原核細(xì)胞，為了使其能更好地在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，首先對(duì)Cas9編碼序列經(jīng)過(guò)優(yōu)化，在不改變氨基酸的前提下，使用真核細(xì)胞內(nèi)編碼氨基酸的密碼子；2) Cas9核酸酶載體構(gòu)建和Cas9核酸酶mRNA合成根據(jù)步驟I)優(yōu)化后的序列，定制合成編碼Cas9核酸酶的DNA序列，并將其分別插入到如下表達(dá)載體中形成:pST1374-Cas9、pST1374-NLS_Flag-Cas9 (這個(gè)載體上除含有載體pST1374-Cas9所有序列外，還有一個(gè)編碼細(xì)胞核定位信號(hào)的序列NLS和一個(gè)編碼標(biāo)簽蛋白Flag的序列)；利用Cas9C_NLS Cla For和Cas9C_NLS Apa Rev兩個(gè)引物(引物序列見(jiàn)表I )，通過(guò)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增一個(gè)DNA片段，使用ClaI和ApaI兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA 片段和 pST1374-NLS-Flag-Cas9，將擴(kuò)增的 DNA 片段插入到 pST1374-NLS-Flag-Cas9，構(gòu)建pST1374-NLS-Flag-Cas9-NLS載體，該載體上除含有載體pST1374_Cas9所有序列外，還有前后兩個(gè)編碼細(xì)胞核定位信號(hào)的序列NLS和一個(gè)編碼標(biāo)簽蛋白Flag的序列；編碼三個(gè)細(xì)胞核定位信號(hào)NLS的序列是利用Cas9-N_3NLS For和Cas9_N_3NLSRev引物(引物序列見(jiàn)表I)以寡核苷酸為模板(模板序列見(jiàn)表1)PCR擴(kuò)增出來(lái)的，PCR產(chǎn)物經(jīng)NheI和NotI兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶消化后，再由同樣的酶切位點(diǎn)插入到pST1374-NLS-Flag-Cas9 載體中，構(gòu)建 pST1374-3XNLS_Flag-Cas9，該載體上除含有載體pST1374-Cas9所有序列外，還有三個(gè)編碼細(xì)胞核定位信號(hào)的序列NLS和一個(gè)編碼標(biāo)簽蛋白Flag的序列；螺旋結(jié)構(gòu)(Helix)DNA序列(見(jiàn)表2)經(jīng)定制合成后插入到編碼標(biāo)簽蛋白Flag的序列和編碼Cas9核酸酶序列中間，形成pST1374-NLS-Flag-Helix-Cas9載體，該載體上除含有載體pST1374-Cas9所有序列外,還有一個(gè)編碼細(xì)胞核定位信號(hào)的序列NLS, —個(gè)編碼標(biāo)簽蛋白Flag的序列和一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)DNA序列；Cas9系統(tǒng)來(lái)源于原核細(xì)胞，在真核細(xì)胞中難于向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，因而無(wú)法保證這一系統(tǒng)在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)其剪切功能。本發(fā)明通過(guò)在細(xì)胞核核定位信號(hào)序列和Cas9編碼序列間添加螺旋結(jié)構(gòu)DNA序列增加Cas9在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)，解決了這一問(wèn)題，見(jiàn)圖
2。在這個(gè)過(guò)程中使用了人類(lèi)293T。本實(shí)施例還 構(gòu)建了一系列含有Cas9的表達(dá)載體，將這些載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)后通過(guò)免疫染色反應(yīng)就可以展示Cas9在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，要將細(xì)胞培育在多聚賴(lài)氨酸包被的蓋片上，利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將Cas9系列質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中。在免疫染色實(shí)驗(yàn)中，用4%的多聚甲醛在室溫下將細(xì)胞固定15分鐘，用緩沖液PBS洗兩次，再用PBS加0.2%的Triton X-100浸泡5分鐘，再用PBS洗兩次。之后用正常的山羊血清室溫下封閉I小時(shí)，再將抗標(biāo)簽蛋白FLAG的抗體加入封閉液中，室溫孵育2小時(shí)。用PBS清洗后，再用溶解于PBS中的cy3結(jié)合的山羊抗小鼠的二抗和Hoechst室溫孵育細(xì)胞I小時(shí)，用PBS清洗后，將細(xì)胞用Vectashield培育液封閉，然后用Olympus FlueviewlOOO共聚焦顯微鏡拍攝熒光照片(見(jiàn)圖2)。只有在細(xì)胞核核定位信號(hào)序列和Cas9編碼序列間添加螺旋結(jié)構(gòu)DNA序列才能使Cas9在真核生物細(xì)胞核內(nèi)得以表達(dá)，進(jìn)一步保障了其在基因打靶中行使剪切功能。Cas9核酸酶系列載體經(jīng)AgeI線性化后，利用T7Ultra Kit體外轉(zhuǎn)錄后得到Cas9核酸酶mRNA，可直接用于基因打靶；由于mRNA的不穩(wěn)定性，不會(huì)長(zhǎng)期存在生物體內(nèi)，不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生進(jìn)一步影響，因而沒(méi)有生物安全性問(wèn)題。3)嵌合RNA的合成嵌合RNA模板上有段T7啟動(dòng)子序列，這是以合成的寡核苷酸為模板通過(guò)PCR產(chǎn)生的(模板序列見(jiàn)表1)，利用T7Shortscript Kit體外轉(zhuǎn)錄出嵌合RNA，它包含crRNA以及tracrRNA結(jié)構(gòu),可以定向結(jié)合祀向DNA上的位點(diǎn)；(2) Cas9mRNA體內(nèi)翻譯后形成Cas9核酸酶與嵌合RNA結(jié)合，實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)剪切，剪切后產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自身天然的DNA修復(fù)過(guò)程“非同源末端連接”來(lái)引入外源DNA，從而修改細(xì)胞內(nèi)源基因；見(jiàn)圖1。表I

權(quán)利要求
1.一種無(wú)物種限制無(wú)生物安全性問(wèn)題的真核生物基因打靶方法，其步驟為: (1)CRISPR/Cas9和嵌合RNA的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 1)優(yōu)化編碼Cas9的密碼子 2)Cas9核酸酶載體構(gòu)建和Cas9核酸酶mRNA合成 根據(jù)步驟I)優(yōu)化后的序列，定制合成編碼Cas9核酸酶的DNA序列，并將其分別插入到如下表達(dá)載體中形成:pST1374-Cas9、pST1374-NLS-Flag-Cas9 ； 利用Cas9 C-NLS Cla For和Cas9 C-NLS Apa Rev兩個(gè)引物，通過(guò)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增一個(gè)DNA片段，使用CI a I和Apa I兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段和 pST1374-NLS-Flag-Cas9，將擴(kuò)增的 DNA 片段插入到 pST1374-NLS_Flag-Cas9，構(gòu)建pST1374-NLS-Flag-Cas9-NLS 載體； 編碼三個(gè)細(xì)胞核定位信號(hào)NLS的序列是利用Cas9-N-3NLS For和Cas9_N_3NLSRev引物以寡核苷酸為模板PCR擴(kuò)增出來(lái)的，PCR產(chǎn)物經(jīng)NheI和NotI兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶消化后，再由 同樣的酶切位點(diǎn)插入到pST1374-NLS-Flag-Cas9載體中，構(gòu)建pST1374-3XNLS-Flag-Cas9 ； 螺旋結(jié)構(gòu)DNA序列經(jīng)定制合成后插入到編碼標(biāo)簽蛋白Flag的序列和編碼Cas9核酸酶序列中間，形成 pST1374-NLS-Flag-Helix_Cas9 載體； Cas9核酸酶系列載體經(jīng)AgeI線性化后，利用T7 Ultra Kit體外轉(zhuǎn)錄后得到Cas9核酸酶mRNA，直接用于基因打靶； 3)嵌合RNA的合成 嵌合RNA模板上的T7啟動(dòng)子序列，是以合成的寡核苷酸為模板通過(guò)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)產(chǎn)生，利用T7 Shortscript Kit體外轉(zhuǎn)錄出嵌合RNA; (2)Cas9mRNA體內(nèi)翻譯后形成Cas9核酸酶與嵌合RNA結(jié)合，實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)剪切，剪切后產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自身天然的DNA修復(fù)過(guò)程“非同源末端連接”來(lái)引入外源DNA，從而修改細(xì)胞內(nèi)源基因。
2.一種螺旋結(jié)構(gòu)DNA序列，其特征在于，該螺旋結(jié)構(gòu)DNA序列在核定位信號(hào)指導(dǎo)下增強(qiáng)蛋白的核轉(zhuǎn)移能力以及與核酸結(jié)合的能力，其基因序列為:ctggaacccggcgagaagccatacaaatgcccagagtgtggtaaatctttctctcagtctggtgctctgaccagacaccagcggacccacactaga。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)物種限制無(wú)生物安全性問(wèn)題的真核生物基因打靶方法及螺旋結(jié)構(gòu)DNA序列，屬于基因工程領(lǐng)域。該方法的步驟為(1)CRISPR/Cas9和嵌合RNA的設(shè)計(jì)與構(gòu)建；(2)Cas9mRNA體內(nèi)翻譯后形成Cas9核酸酶與嵌合RNA結(jié)合，實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)剪切，剪切后產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自身天然的DNA修復(fù)過(guò)程“非同源末端連接”來(lái)引入外源DNA，從而修改細(xì)胞內(nèi)源基因。該方法步驟簡(jiǎn)單，識(shí)別位點(diǎn)靈活且消耗低。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103233028SQ201310028668
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者沈彬, 黃行許 申請(qǐng)人:南京徇齊生物技術(shù)有限公司