專利名稱：一種生物素蛋白連接酶融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物素蛋白連接酶融合蛋白、基因、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化體及其制備方法。
背景技術(shù)：
生物素蛋白連接酶(EC 6. 3. 4. 15)能活化生物素形成生物酰5‘腺苷酸，再將生物素轉(zhuǎn)移到生物素受體蛋白上，同時(shí)也是生物素的操縱子的抑制物，由birA基因編碼。生物素蛋白連接酶廣泛存在于原核生物和真核生物的體內(nèi)，又可以稱為生物素連接酶、生物素操縱子阻遏蛋白、生物素全酶合成酶以及羧化全酶合成酶，而存在于原核細(xì)胞的生物素蛋白連接酶又名BirA酶。大腸桿菌中BirA酶蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)中其N端60個(gè)氨基酸殘基形成一個(gè)螺旋轉(zhuǎn)螺旋的結(jié)構(gòu)，此為DNA結(jié)構(gòu)域，而中間區(qū)域形成催化域，其C端結(jié)構(gòu)尚未確定。分子量約為 35KD。在大腸桿菌中，BirA酶僅識(shí)別并生物素化一種蛋白質(zhì)類型，即乙?；?CoA羧基酶的亞基生物素羧基載體蛋白(biotin carboxyl carrier protein，BCCP)，由于其生物素化的能力，BirA酶作為一種重要的試劑已廣泛用于蛋白質(zhì)分子之間相互作用的研究，特別是細(xì)胞表面受體-配體相互作用的研究。通過(guò)在目的蛋白上加入1個(gè)能被BirA酶識(shí)別的肽序列(可生物素化的序列 BSP =Leu-His-His-Ile-Leu-Asp-Ala-Gln-Lys-Met-Val-Trp-Asn-His-Arg), BirA酶可將生物素結(jié)合到目的蛋白上，這樣就可用標(biāo)記的親和素探測(cè)目的蛋白。 雖然BirA酶是大腸桿菌的固有成分，但現(xiàn)有商品化的BirA酶價(jià)格昂貴且活性不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種廉價(jià)的、酶活高的生物素蛋白連接酶融合蛋白及其制備方法。為此，本發(fā)明公開了一種如下(a)或(b)的生物素蛋白連接酶融合蛋白(a)其氨基酸序列包括SEQ ID NO. 1所述的氨基酸序列，其N端為多聚堿性氨基酸的蛋白；(b)至少與SEQ ID NO. 1所述氨基酸序列90%同源性、N端為多聚堿性氨基酸且具有生物素蛋白連接酶活性的蛋白。在一實(shí)施方式中，所述多聚堿性氨基酸為多聚組氨酸，其中優(yōu)選6聚組氨酸。在一實(shí)施方式中，所述生物素蛋白連接酶融合蛋白為SEQ ID N0. 2所述氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明公開了一種編碼本發(fā)明所述生物素蛋白連接酶融合蛋白多核苷酸分子。另一方面，本發(fā)明公開了一種包含本發(fā)明所述多核苷酸分子的重組表達(dá)載體。另一方面，本發(fā)明公開了一種包含本發(fā)明所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。在一實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌，優(yōu)選為大腸桿菌BL21。
另一方面，本發(fā)明公開了所述生物素蛋白連接酶融合蛋白的制備方法，包括如下步驟①生物素蛋白連接酶融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建；②生物素蛋白連接酶融合蛋白轉(zhuǎn)化體的制備；③生物素蛋白連接酶融合蛋白的表達(dá)；④生物素蛋白連接酶融合蛋白的純化。在一實(shí)施例中，步驟④采取金屬螯合柱純化，優(yōu)選為鎳離子金屬螯合柱純化。本發(fā)明所述生物素蛋白連接酶融合蛋白比現(xiàn)有商業(yè)化的BirA酶的活性高出約1 倍左右，所述的制備方法工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高。


圖1為PCR產(chǎn)物電泳圖；圖2為pET32-BirA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳；圖3為BirAl菌種大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)物SDS-PAGE電泳；圖4為純化產(chǎn)物SDS-PAGE電泳；圖5為BirA酶活曲線具體實(shí)施例方式在本文，術(shù)語(yǔ)所述“生物素蛋白連接酶”(Biotin Ligase,BirA,EC6. 3. 4. 15)，能活化生物素形成生物酰5'腺苷酸，再將生物素轉(zhuǎn)移到生物素受體蛋白上，同時(shí)也是生物素的操縱子的抑制物，由birA基因編碼。生物素-蛋白連接酶廣泛存在于原核生物和真核生物的體內(nèi)，又可以稱為生物素連接酶、生物素操縱子阻遏蛋白、生物素全酶合成酶以及羧化全酶合成酶，而存在于原核細(xì)胞的生物素蛋白連接酶又名BirA酶。大腸桿菌BirA酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述，同類生物素蛋白連接酶有90%的同源性，其生物學(xué)作用沒(méi)有種屬特異性。本發(fā)明的所述蛋白質(zhì)優(yōu)選該物質(zhì)是生物素蛋白連接酶及其突變體；其功能性活性片段或其類似物；具有高度同源性的同系物以及編碼包含SEQ ID NO. 2描述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的載體例如DNA載體(質(zhì)?；虿《?。功能性活性片段或類似物可通過(guò)添加、插入、修飾、取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多個(gè)氨基酸殘基而形成。術(shù)語(yǔ)“類似物”也包括嵌合蛋白質(zhì)、融合蛋白、抗獨(dú)特型抗體、上述化合物的前體和其它功能等效物或模擬物。術(shù)語(yǔ)“突變體”是指氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述生物素蛋白連接酶的突變體。 相比于天然蛋白，該突變體與它們野生型相比，具有增強(qiáng)的活性和/或改變了的立體專一性。天然蛋白的氨基酸序列突變體可通過(guò)向本發(fā)明的核苷酸中引入適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓⒒蛲ㄟ^(guò)體外合成所需多肽來(lái)制備。這些突變體包括，例如缺失、插入或替換該氨基酸序列中的殘基?？梢酝ㄟ^(guò)缺失、插入和替換的組合以得到最終的構(gòu)建體，提供最終的蛋白產(chǎn)品。蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和mmsh，1970)分析(GCG程序)確定，其 rPgap creation penalty = 5, gap extension penalty = 0. 30 ^^Ι/τWii^1JixiS 至少為15個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為15個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。更優(yōu)選地，被分析的序列長(zhǎng)度至少為50個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為50個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。更優(yōu)選地，被分析的序列長(zhǎng)度至少為100個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為100個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。更優(yōu)選地，被分析的序列長(zhǎng)度至少為250個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為250個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。甚至更優(yōu)選地，被分析的序列長(zhǎng)度至少為500個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為500個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。本發(fā)明涉及的方面還包括生物素蛋白連接酶類似物，在它們合成期間或合成后進(jìn)行了不同的修飾，例如，通過(guò)生物素化、芐基化、糖基化、乙?；?、磷酸化、由已知保護(hù)/封閉基團(tuán)的衍生作用、蛋白水解的切割作用、連接到抗體分子或其它細(xì)胞配體上等。這些修飾可以用來(lái)增加本發(fā)明生物素蛋白連接酶的穩(wěn)定性和/或生物活性。蛋白的表達(dá)本發(fā)明包括編碼本發(fā)明的生物素蛋白連接酶的DNA以及含有這些DNA的載體、轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明中，使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”(transformant)，即帶有異源DNA分子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括通過(guò)合成和重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明所述蛋白的方法。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法可以分離和純化多核苷酸(DNA或RNA)、載體、轉(zhuǎn)化體和生物體。用于本發(fā)明的載體可以是如噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?？捎糜诳寺『?或表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的載體是能在需復(fù)制和/或表達(dá)多核苷酸的宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)多核苷酸的載體。一般說(shuō)來(lái)，多核苷酸和/或載體可用于任何真核或原核細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞)、大鼠、倉(cāng)鼠(如CHO、NSO和幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)或小鼠細(xì)胞(如L細(xì)胞))、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)。有關(guān)適用于多種類型宿主細(xì)胞的適當(dāng)載體的例子可參見(jiàn)例如 F. Ausubel et al. , Current Protocolsin Molecular Biology. Greene Publishing Associates andWiley-Interscience(1992)禾口 Sambrook et al. (1989)?？梢允褂煤羞@些多核苷酸的宿主細(xì)胞來(lái)大量表達(dá)可用于例如藥物、診斷試劑、疫苗和治療劑的蛋白質(zhì)。已開發(fā)出多種方法用于經(jīng)由互補(bǔ)的粘性末端使多核苷酸與載體可操作相連。例如，可在欲插入載體DNA內(nèi)的DNA區(qū)段添加互補(bǔ)的同聚體序列片段。然后通過(guò)互補(bǔ)同聚體之間的氫鍵連接載體和DNA區(qū)段以形成重組DNA分子。含有一或多種限制性位點(diǎn)的合成接頭提供了另一種連接DNA區(qū)段與載體的方法。 用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理通過(guò)內(nèi)切核酸酶限制性消化產(chǎn)生的 DNA區(qū)段，所述的兩種聚合酶用其3'，5’-核酸外切活性除去突出的Y-單鏈末端，并用其聚合活性補(bǔ)平3’-凹端。因此，這些活性的聯(lián)合產(chǎn)生了平端DNA區(qū)段。然后在能催化平端 DNA分子連接的酶，如噬菌體T4DNA連接酶的存在下將平端區(qū)段與摩爾過(guò)量的接頭分子一起保溫。因此，反應(yīng)產(chǎn)物是末端攜有聚合接頭序列的DNA區(qū)段。然后用適當(dāng)?shù)南拗菩悦噶呀膺@些DNA區(qū)段，并連接至已用酶裂解的表達(dá)載體中，所述酶能產(chǎn)生與所述DNA區(qū)段相容的末端。從多個(gè)商家可以買到含有多個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的合成接頭。多核苷酸插入物應(yīng)該可操作地連接于同表達(dá)多核苷酸的宿主細(xì)胞相容的適當(dāng)啟動(dòng)子上。啟動(dòng)子可以是強(qiáng)啟動(dòng)子和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。列舉的一些啟動(dòng)子的例子包括噬菌體λ PL啟動(dòng)子、大腸桿菌lac、trP、phoA、tac啟動(dòng)子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子。其它適當(dāng)啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。表達(dá)重組載體進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄起始、終止位點(diǎn)，并在轉(zhuǎn)錄區(qū)含有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。重組載體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的編碼部分可包括位于起點(diǎn)處的翻譯起始密碼子和適當(dāng)?shù)匚挥诒环g多肽的末端的終止密碼子(UAA, UGA 或 UAG)。如上所述，表達(dá)載體可包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記。所述標(biāo)記包括對(duì)真核細(xì)胞培養(yǎng)物而言的二氫葉酸還原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大腸桿菌和其它細(xì)菌培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。適當(dāng)宿主的代表性例子包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞(如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母)；昆蟲細(xì)胞，如果蠅S2和夜蛾SF9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，如CH0，C0S，NS0，293 和Bowes黑素瘤細(xì)胞；和植物細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。為了有效地分離純化或分泌目標(biāo)蛋白，常常還可利用便于分離純化的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathiones-transferase, GST)、 六聚組氨酸肽(His. Tag)、蛋白質(zhì)A (protein Α)和纖維素結(jié)合位點(diǎn)(cellulose binding domain)等。通過(guò)特殊性蛋白或多肽與目標(biāo)蛋白構(gòu)成融合蛋白的形式，表達(dá)后利用所述的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽的特殊性質(zhì)可對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離和純化。如His. Tag與 Ni-ChelatingS印harose柱特異性結(jié)合。所述的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽可以在純化后用位點(diǎn)特異性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、腸激酶和)(a因子等，以獲得目標(biāo)蛋白。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的核苷酸序列的宿主細(xì)胞，所述核苷酸序列經(jīng)本領(lǐng)域已知的技術(shù)與一或多種異源控制區(qū)(如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)可操作相連?？梢赃x擇能調(diào)節(jié)插入的基因序列的表達(dá)，或能按照所需的特殊方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主菌株。在某些誘導(dǎo)物的存在下，某些啟動(dòng)子啟動(dòng)的表達(dá)會(huì)升高；因此，可以控制經(jīng)基因改造的多肽的表達(dá)。另外，不同宿主細(xì)胞具有特征性的和特殊的翻譯、翻譯后加工和修飾(如磷酸化、裂解) 蛋白質(zhì)的機(jī)制。可以選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系以確保對(duì)表達(dá)的外源蛋白質(zhì)進(jìn)行合乎需要的修飾和加工。通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法，即可將本發(fā)明的核酸和核酸重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。所述方法描述于多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中，如Davis et al. ,BasicMethods In Molecular Biology (1986)。編碼本發(fā)明所述蛋白的多核苷酸可以與含有選擇標(biāo)記的載體連接以在宿主中增殖。一般說(shuō)來(lái)，可在沉淀物，如磷酸鈣沉淀物或其與帶電脂質(zhì)的復(fù)合物中導(dǎo)入質(zhì)粒載體。如果載體是病毒，可使用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系在體外對(duì)其進(jìn)行包裝，再轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞。通過(guò)眾所周知的技術(shù)可以鑒定出被成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明的DNA重組載體的細(xì)胞。例如，可培養(yǎng)導(dǎo)入表達(dá)重組載體所得的細(xì)胞以產(chǎn)生所需多肽。收集并裂解細(xì)胞， 使用如 Southern(1975) J. Mol. Biol. 95，503 或 Berent et al (1985) Biotech. 3，208 所述的方法，檢測(cè)其DNA內(nèi)容物中DNA的存在?；蛘?，使用抗體檢測(cè)上清液中蛋白質(zhì)的存在。通過(guò)眾所周知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的所述蛋白較為有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、疏水電荷作用層析和凝集素層析。在一些實(shí)施方案中，可使用高效液相層析(HPLC)進(jìn)行純化。在一些實(shí)施方案中，可使用上述的一種或多種層析方法純化本發(fā)明的所述蛋白。 在其它實(shí)施方案中，可使用下述的一種或多種層析柱純化本發(fā)明的所述融合蛋白，所述層析柱有Q sepharose FF 柱、SP sepharose FF 柱、Qsepharose High Performance 柱、Blue sepharose FF 柱、Blue 柱、PhenylSepharose FF 柱、DEAE Sepharose FF> Ni-Chelating Sepharose FF 柱或 Methyl 柱等。另外，可使用國(guó)際公開號(hào)WO 00/44772(全文列入本文作為參考)中描述的方法純化本發(fā)明的蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地改動(dòng)其中所述的方法以用于純化本發(fā)明的蛋白?？梢詮陌ɡ缂?xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原核或真核宿主經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生的產(chǎn)物中回收本發(fā)明的蛋白。以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1、表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)BirA酶的PCR擴(kuò)增上下游引物，分別為BirA_Ul 5，TGCGGATCCATGAAGGATAACACCG 3’ ；BirA_Dl :5，TGCCCTCGAGTCATTTTTCTGCACTACG 3，，以大腸桿菌Dffia基因組DNA為模板，用pfu酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件95°C 4分鐘；95°C 40 秒，52. 50C 40秒，72°C 1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72°C 7分鐘；4°C放置。將擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如下圖1所示，其中1為BirA的PCR產(chǎn)物，2為250bp Marker 從上到下 8 條帶依次為4. 5kb, 3. Okb, 2. 25kb, 1. 5kb, 1. Okb, 750bp, 500bp, 250bp ；在 1. Okb 附近擴(kuò)增出特異性條帶。將瓊脂糖凝膠上1. OKB大小的特異性PCR條帶切下，并用膠回收試劑盒回收其中的DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切核酸酶BamHI和Β ο I雙酶切，與BamHlAho I雙酶切的載體pET3h 連接。連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株ToplO的感受態(tài)細(xì)胞，鋪板于含氨芐青霉素的LB瓊脂上。 分離已轉(zhuǎn)化的單菌落，擴(kuò)增，用BirA基因的正向、反向引物PCR鑒定出陽(yáng)性克隆，命名為 pET32-BirA/toplO。抽提質(zhì)粒pET32-BirA，通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切做初步鑒定，結(jié)果顯示構(gòu)建成功。菌落送樣至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序引物為 5’ T7promoter、3’ T7 terminator通用引物，測(cè)序結(jié)果證實(shí)pET32_BirA為表達(dá)載體的正確構(gòu)建體，其DNA序列與所設(shè)計(jì)的BirA基因完全相同。表達(dá)菌株的篩選抽提pET32-BirA質(zhì)粒，氯化鈣法轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)宿主菌，獲得多個(gè)克隆，挑選2個(gè)克隆進(jìn)行表達(dá)鑒定。在試管中進(jìn)行少量培養(yǎng)，0.5mM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后，收獲菌體。破菌后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果如圖2，圖中1為空pET3h的BL21 (DE3)宿主菌；2為1號(hào)克隆；3為2號(hào)克??；挑選1號(hào)克隆，保種，命名為BirAl菌種，并做進(jìn)一步的大規(guī)模發(fā)酵。大規(guī)模發(fā)酵BirAl菌種在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜后，OD值約為2.0，然后以的接種率接種30L發(fā)酵罐，37度，pH維持7. 0，溶氧控制在30%~60%,培養(yǎng)5小時(shí)，待溶氧上升后開始補(bǔ)料 (30%葡萄糖與20%酵母粉混合液)兩小時(shí)左右，然后加入終濃度0. 5mM IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)， 收獲菌體。破菌SDS-PAGE電泳，電泳圖如圖3，其中Marker從上到下4條帶依次為116KD， 66. 2KD，45KD，35KD，1，發(fā)酵罐誘導(dǎo)前；2，發(fā)酵罐誘導(dǎo)1小時(shí)；3，發(fā)酵罐誘導(dǎo)2小時(shí)；4，發(fā)酵罐誘導(dǎo)3小時(shí)；5，發(fā)酵罐誘導(dǎo)4小時(shí)?？梢杂^察到有目標(biāo)蛋白VRlll相應(yīng)條帶出現(xiàn)。純化使用Ni-chelating鎳柱進(jìn)行目標(biāo)蛋白的純化。取發(fā)酵好的BirAl菌體，洗滌干凈,重懸于平衡緩沖液(50mM Tris, 0. 5M NaCl, 20mM imidazol，PH8. 0)中，高壓勻漿破菌2 次，離心取上清。以平衡緩沖液平衡Ni-chelating鎳柱，破菌上清掛柱，然后用洗脫緩沖液 (50mM Tris, 0. 5M NaCl, 500mMimidazol, PH8. 0)，收集洗脫峰的各個(gè)組分，收集含蛋白的組分，加入甘油并稀釋至3mg/ml，凍存于-20度備用。SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化結(jié)果如圖4，其中M為Marker從上到下4條帶依次為116KD，66. 2KD，45KD，35KD ；1為洗脫峰組分1 ；2為洗脫峰組分；3為洗脫峰組分；4為洗脫峰組分；5為洗脫峰組分；6為流穿組分。實(shí)施例2酶活檢測(cè)1，按以下體系對(duì)VRlll蛋白進(jìn)行生物素化反應(yīng)
權(quán)利要求
1.一種如下(a)或(b)的生物素蛋白連接酶融合蛋白(a)其氨基酸序列包括SEQID NO. 1所述的氨基酸序列，其N端為多聚堿性氨基酸的蛋白；(b)至少與SEQID NO. 1所述氨基酸序列90%同源性、N端為多聚堿性氨基酸且具有生物素蛋白連接酶活性的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的生物素蛋白連接酶融合蛋白，其特征在于所述多聚堿性氨基酸為多聚組氨酸。
3.如權(quán)利要求2所述的生物素蛋白連接酶融合蛋白，其特征在于所述多聚組氨酸為6聚組氨酸。
4.如權(quán)利要求1所述的生物素蛋白連接酶融合蛋白，其特征在于所述生物素蛋白連接酶融合蛋白為SEQ ID NO. 2所述氨基酸序列。
5.一種編碼權(quán)利要求1所述生物素蛋白連接酶融合蛋白多核苷酸分子。
6.一種包含權(quán)利要求5所述多核苷酸分子的重組表達(dá)載體。
7.一種包含權(quán)利要求6所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體。
8.如權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述轉(zhuǎn)化體為大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21。
10.權(quán)利要求1所述生物素蛋白連接酶融合蛋白的制備方法，包括如下步驟①生物素蛋白連接酶融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建；②生物素蛋白連接酶融合蛋白轉(zhuǎn)化體的制備；③生物素蛋白連接酶融合蛋白的表達(dá)；④生物素蛋白連接酶融合蛋白的純化。
11.如權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于所述步驟④采取金屬螯合柱純化。
12.如權(quán)利要求11所述的制備方法，其特征在于所述金屬螯合柱為鎳離子金屬螯合柱。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物素蛋白連接酶融合蛋白、基因、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化體及其制備方法。本發(fā)明公開了一種如下(a)或(b)的生物素蛋白連接酶融合蛋白(a)其氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，其N端為多聚堿性氨基酸的蛋白；(b)至少與SEQ ID NO.1所述氨基酸序列90％同源性、N端為多聚堿性氨基酸且具有生物素蛋白連接酶活性的蛋白。本發(fā)明所述生物素蛋白連接酶融合蛋白比現(xiàn)有商業(yè)化的BirA酶的活性高出約1倍左右，所述的制備方法工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102190730SQ201010146660
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2010年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月15日
發(fā)明者叢薇, 袁靖宇, 雷建強(qiáng) 申請(qǐng)人:上海澤潤(rùn)生物科技有限公司