專利名稱：2型糖尿病的標記蛋白的制作方法
2型糖尿病的標記蛋白本發(fā)明提供用于早期檢測II型糖尿病的診斷標記蛋白，針對所述標記蛋白的抗體和它們在II型糖尿病的診斷方法和藥物開發(fā)中的應(yīng)用。2型糖尿病(Type 2 diabetes)(非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM))是這樣的病癥，其特征在于在胰島素抵抗和相對胰島素缺乏的背景下的高血糖。估計在美國有2360萬人(人口的7. 8% )患有糖尿病，被診斷的有1790萬人，其中90%的是2型。隨著1990至2005年間流行率加倍，CDC(疾病控制和預(yù)防中心(Centers for Disease Control andPrevention))已經(jīng)將該增長表征為流行性的。因此，存在對允許早期檢測II型糖尿病的診斷標記和方法的需求。在第一個目的中，本發(fā)明涉及用于診斷II型糖尿病或用于確定個體發(fā)展 II型糖尿病的素因的方法，其包括下述步驟測量所述個體的組織樣品中嗅介蛋白4(0LFM4)的多肽水平，其中，與代表健康群體的0LFM4多肽水平相比，所述個體的所述樣品中0LFM4多肽的降低的水平指示II型糖尿病或發(fā)展II型糖尿病的素因(predisposition)。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組織是血液，優(yōu)選血漿。在第二個目的中，本發(fā)明提供鑒別用于治療II型糖尿病的化合物的方法，其包括下述步驟a)將所述化合物施用給患有II型糖尿病的非人動物，b)測量步驟a)的非人動物的組織樣品中0LFM4多肽水平，其中與沒有被施用化合物的患有II型糖尿病的非人動物的組織樣品中0LFM4多肽水平相比，步驟a)的非人動物的組織樣品中改變的0LFM4多肽水平指示用于治療II型糖尿病的化合物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組織是血液，優(yōu)選血漿.在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述非人動物是嚙齒動物,優(yōu)選小鼠或大鼠,更優(yōu)選DIO小鼠，ob/ob小鼠或ZDF大鼠。在第三個目的中，本發(fā)明涉及0LFM4多肽用于診斷II型糖尿病或用于確定個體發(fā)展II型糖尿病的素因的應(yīng)用。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述0LFM4多肽是人0LFM4多肽。人0LFM4的氨基酸序列公開于Seq. Id. No. I。在第四個目的中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合0LFM4多肽的抗體用于診斷II型糖尿病或用于確定個體發(fā)展II型糖尿病的素因的應(yīng)用。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體結(jié)合人0LFM4多肽.在第五個目的中，本發(fā)明涉及用于診斷II型糖尿病或確定個體中發(fā)展II型糖尿病的素因的試劑盒，其包含a)對0LFM4多肽特異性的抗體，優(yōu)選本發(fā)明的抗體，b)結(jié)合被a)的抗體捕獲的0LFM4的標記抗體(labeled antibody),或結(jié)合a)的抗體的標記抗體，和c)用于進行診斷測定的試劑。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述對0LFM4多肽特異性的抗體結(jié)合人0LFM4多肽。本發(fā)明的方法可用于監(jiān)測進行糖尿病療法的患者中II型糖尿病療法的應(yīng)答，其通過測量這些患者的組織樣品(優(yōu)選血液樣品)中的0LFM4多肽水平來進行。與所述療法開始時0LFM4多肽水平相比，在治療過程中的組織樣品中顯示改變的0LFM4多肽水平的患者對所述糖尿病療法有應(yīng)答。在另一個目的中，本發(fā)明涉及針對人0LFM4多肽的單克隆抗體。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是這樣的抗體，其包含能夠從選自由以下組成的組的雜交瘤細胞系獲得的抗體的￥11結(jié)構(gòu)域的CDR1-CDR3 0LFM4 2/3 (DSM ACC3012)，0LFM4 1/46(DSM ACC301I)， 0LFM4 2/1(DSM ACC3013), 0LFM4 2/14(DSM ACC3014),0LFM4 2/28 (DSM ACC3015)和 0LFM4 1/23 (DSMACC3010)，和能夠從選自由以下組成的組的雜交瘤細胞系獲得的抗體的\結(jié)構(gòu)域的CDR1-CDR3 0LFM42/3 (DSM ACC3012)，0LFM41/46(DSM ACC3011),0LFM4 2/1(DSMACC3013),0LFM4 2/14(DSM ACC3014)，0LFM4 2/28(DSMACC3015)和 0LFM4 1/23(DSM ACC3010)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是嵌合抗體，其包含能夠從選自由以下組成的組的雜交瘤細胞系獲得的抗體的Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域0LFM4 2/3 (DSM ACC3012)，0LFM4 1/46(DSM ACC3011), 0LFM4 2/1(DSM ACC3013)， 0LFM4 2/14(DSM ACC3014)， 0LFM42/28(DSMACC3015)和 0LFM4 1/23(DSM ACC3010)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體由選自由以下組成的組的雜交瘤細胞系產(chǎn)生0LFM4 2/3 (DSM ACC3012)，0LFM4 1/46 (DSM ACC3011), 0LFM4 2/1 (DSM ACC3013)，0LFM4 2/14(DSM ACC3014)，0LFM4 2/28(DSM ACC3015)和 0LFM4 1/23(DSM ACC3010)。用于檢測和/或測量生物學(xué)樣品中的多肽的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于蛋白質(zhì)印跡，ELISAs或RIAs，或各種蛋白組學(xué)技術(shù)?？梢援a(chǎn)生用于檢測多肽或肽片段目的的識別0LFM4多肽/其片段的單克隆或多克隆抗體或其肽片段(例如通過用純化的蛋白免疫兔來產(chǎn)生)，或者可以使用識別所述多肽或肽片段的已知抗體。例如，能夠結(jié)合變性蛋白的抗體(如多克隆抗體)可用于在蛋白質(zhì)印跡中檢測0LFM4多肽/其片段。用于測量標記的方法的一個實例是ELISA。這種類型的蛋白定量是基于能夠捕獲特異性抗原的抗體，和能夠檢測被捕獲的抗原的第二抗體。用于制備和使用抗體的方法和上文提及的測定法描述于 Harlow, E.和 Lane, D. Antibodies ALaboratory Manual,(抗體實驗室手冊)(1988)，Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港實驗室出版社)中。在另一個目的中，本發(fā)明提供檢測組織樣品中胰腺￠-細胞的方法，其包括a)提供個體或非人動物的胰腺組織樣品，b)檢測a)所述的組織樣品中的0LFM4陽性細胞，其中所述0LFM4陽性細胞是￠-細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述0LFM4陽性細胞通過0LFM4特異性的抗體檢測，所述抗體優(yōu)選本發(fā)明的抗體。
用于檢測人個體或非人動物的組織樣品中的P -細胞的方法可用于評估II型糖尿病療法對胰腺生理學(xué)/組織學(xué)的作用。例如，在開發(fā)用于治療II型糖尿病的化合物的過程中，本發(fā)明的檢測0-細胞的方法可用于評估所述化合物是否對胰腺的生理學(xué)/組織學(xué)有作用，即，該化合物是否能夠逆轉(zhuǎn)II型糖尿病動物模型中II型糖尿病對胰腺的一些作用。在另一個目的中，本發(fā)明提供用于檢測胰腺組織樣品中的細胞的試劑盒，其包含a)對0LFM4多肽特異性的抗體，優(yōu)選本發(fā)明的抗體，b)結(jié)合a)所述抗體的標記抗體或?qū)?LFM4多肽特異性的標記抗體，和c)用于進行免疫組織化學(xué)測定的試劑。多肽嗅介蛋白4(Olfactomedin 4，0LFM4)的同義詞是 hGC_l 和 GW112。術(shù)語“多肽”用于本文中時是指氨基酸的聚合物，而不是指具體長度。因此，肽、寡肽和肽片段包含于多肽的定義中。 術(shù)語“化合物”用于本文中，在關(guān)于本發(fā)明的測定中描述的“測試化合物”或“藥物候選化合物”的背景下使用。因此，這些化合物包括有機或無機化合物，由合成獲得或從天然來源獲得。這些化合物包括無機或有機化合物如多核苷酸、脂質(zhì)或激素類似物，其特征在于相對低的分子量。其它生物聚合有機測試化合物包括包含約2至約40個氨基酸的肽和包含約40至約500個氨基酸的更大的多肽，如抗體或抗體綴合物。術(shù)語“抗體”涵蓋各種形式的抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于完整抗體和抗體片段。本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選是人源化抗體、嵌合抗體或進一步遺傳改造的抗體，只要其保留了本發(fā)明所述的特有性質(zhì)?！翱贵w片段”包括全長抗體的一部分，優(yōu)選其可變結(jié)構(gòu)域，或至少其抗原結(jié)合位點?？贵w片段的實例包括雙抗體(diabodies)、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。scFv抗體是例如在Houston, J. S. ,Methods in EnzymoI.(酶學(xué)方法)203 (1991) 46-96)中描述的抗體。另外，抗體片段包括具有VH結(jié)構(gòu)域特性(即能夠與VL結(jié)構(gòu)域組裝在一起)的單鏈多肽，或具有結(jié)合ANG-2的VL結(jié)構(gòu)域特性(即能夠與VH結(jié)構(gòu)域組裝在一起)的單鏈多肽，所述組裝形成功能性抗原結(jié)合位點并由此提供所述性質(zhì)。 術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”用于本文中時是指單一氨基酸組成的抗體分子的制備物。術(shù)語“嵌合抗體”是指這樣的抗體，其包含來自一個來源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)，和獲自不同來源或物種的恒定區(qū)的至少一部分，所述抗體通常通過重組DNA技術(shù)制備。包含鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體是優(yōu)選的。本發(fā)明涵蓋的其它優(yōu)選形式的“嵌合抗體”是其中來自最初抗體的恒定區(qū)已經(jīng)被修飾或改變從而產(chǎn)生本發(fā)明的性質(zhì)的那些抗體，所述性質(zhì)尤其是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fe受體(FcR)結(jié)合的性質(zhì)。此類嵌合抗體也稱為“類型轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體是表達的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，所述基因包含編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA片段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA片段。產(chǎn)生嵌合抗體的方法涉及常規(guī)重組DNA，并且基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。參見例如Morrison, S. L.,等人,Proc. Natl. Acad. Sci.USA(美國國家科學(xué)院學(xué)報)81(1984)6851-6855 ;美國專利號5，202，238和5，204，244。術(shù)語“人抗體”用于本文中時意欲包括具有獲自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)水平中熟知的(van Dijk, M. A.,和van de ffinkel,J. G. , Curr. Opin. Chem. Biol.(當前化學(xué)生物學(xué)觀點)5 (2001) 368-374)。人抗體也可在這樣的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)中產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動物能夠在免疫后產(chǎn)生人抗體的完整庫或選擇物，同時沒有內(nèi)源免疫球蛋白產(chǎn)生。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移人種系免疫球蛋白基因陣列經(jīng)抗原激發(fā)后將導(dǎo)致人抗體的產(chǎn)生(參見例如，Jakobovits, A.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報)90 (1993) 2551-2555 Jakobovits, A.，等人，Nature (自然)362 (1993) 255-258 ；Bruggemann, M.，等人，Year TmmunoI.(年度免疫學(xué))7 (1993) 33-40)。人抗體也可在卩遼菌體展示文庫中產(chǎn)生(Hoogenboom, H. R ,和Winter,G.，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等人，J. Mol. Biol.
(分子生物學(xué)雜志)222(1991)581-597)。也可獲得Cole等人和Boerner等人的技術(shù)用于制備人單克隆抗體(Cole 等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體和癌癥療法)，Alan R. Liss, p. 77 (1985);和 Boerner, P.,等人，J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)147(1991)86-95)。如在本發(fā)明所述的嵌合和人源化抗體中已經(jīng)提及的，術(shù)語“人抗體”用于本文中時還包括這樣的抗體 ，其在恒定區(qū)被修飾以產(chǎn)生本發(fā)明所述的性質(zhì)，尤其是關(guān)于Clq結(jié)合和/或FcR結(jié)合的性質(zhì)，例如通過“類型轉(zhuǎn)換”，即改變或突變Fe部分(例如從IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4突變)來產(chǎn)生。術(shù)語“表位”包括能夠特異性結(jié)合抗體的任何多肽決定簇。在某些實施方案中，表位決定簇包括化學(xué)活性表面成組分子如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，以及在某些實施方案中，可具有特定三維結(jié)構(gòu)特性，和/或特定電荷特性。表位是這樣的抗原區(qū)域，該區(qū)域被抗體結(jié)合?！翱勺兘Y(jié)構(gòu)域”(輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(')、重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh))用于本文中時表示直接涉及抗體與抗原結(jié)合的輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域?qū)χ械拿恳粋€?？勺冚p鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)，且每個結(jié)構(gòu)域包括四個構(gòu)架(FR)區(qū)，其序列是普遍保守的，并通過三個“高變區(qū)”(或互補決定區(qū)，⑶R)相連。所述構(gòu)架區(qū)采用￠-折疊構(gòu)象，且⑶R可以形成連接所述￠-折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每個鏈中的CDR通過構(gòu)架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)，且與來自另一條鏈的CDR—起形成抗原結(jié)合位點?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在按照本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力中起特別重要的作用，且因此提供本發(fā)明的另一個目的。術(shù)語“抗體的抗原結(jié)合部分”在用于本文中時，指負責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基?？贵w的抗原結(jié)合部分包括來自“互補決定區(qū)”或“⑶R”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或“FR”區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基以外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)。因此，抗體的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域從N-末端到C-末端包括結(jié)構(gòu)域FRl，CDRl，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，和FR4。特別地，重鏈的CDR3是主要對抗原結(jié)合作出貢獻的區(qū)域并且定義抗體的性質(zhì)。CDR和FR區(qū)根據(jù)Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫學(xué)目的蛋白序列),第 5 版.Public Health Service (公共衛(wèi)生局)，National Institutes of Health (國立衛(wèi)生研究所)，貝塞斯達，MD (1991)的標準定義和/或來自“高變環(huán)”的那些殘基來確定。單克隆抗體可使用雜交瘤方法(如由Kohler和Milstein, Nature (自然)256 :495(1975)描述的那些)制備。在雜交瘤方法中，小鼠、倉鼠或其它適當?shù)乃拗鲃游锏湫偷赜妹庖邉┟庖咭哉T導(dǎo)淋巴細胞，所述淋巴細胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合所述免疫劑的抗體。許多熟知的用于融合淋巴細胞和永生細胞系的方案中的任何方案都可用于產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的目的(參見例如，G. Galfre等人(1977)Nature (自然)266 :55052 ;Gefter 等人 Somatic Cell Genet.(體細胞遺傳學(xué))，上文引用；Lerner, Yale J. Biol. Med.
(耶魯生物學(xué)醫(yī)學(xué)雜志)，上文引用；Kenneth, Monoclonal Antibodies (單克隆抗體)，上文引用)。此外，普通技術(shù)工作人員將理解此類方法有許多變化，它們也將是有用的。典型地，永生細胞系(例如骨髓瘤細胞系)獲自與淋巴細胞相同的哺乳動物物種。例如，可通過融合來自用本發(fā)明的免疫原性制劑免疫的小鼠的淋巴細胞和永生小鼠細胞系來制備鼠雜交瘤。優(yōu)選的永生細胞系是小鼠骨髓瘤細胞系，其對含有次黃嘌呤、氨喋呤和胸苷的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基”)敏感。許多骨髓瘤細胞系中的任何細胞系都可用作根據(jù)標準技術(shù)的融合配偶體，所述細胞系例如P3-NSl/l-Ag4-l，P3-x63-Ag8. 653或Sp2/0-Agl4骨髓瘤系。這些骨髓瘤系可從ATCC獲得。典型地，HAT-敏感的小鼠骨髓瘤細胞使用聚乙二醇(“PEG”)融合小鼠脾細胞。然后使用HAT培養(yǎng)基選擇融合產(chǎn)生的雜交瘤細胞，該培養(yǎng)基殺死未融合的和非生產(chǎn)性融合的骨髓瘤細胞(未融合的脾細胞幾天后死去，因為它們未被轉(zhuǎn)化)。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細胞通過篩選雜交瘤培養(yǎng)物上清中獲得結(jié)合的抗體來檢測，例如使用標準ELISA測定?？贵w可使用重組方法和組成(例如如美國專利號4，816，567中所描述)產(chǎn)生。在一個實施方案中，提供編碼本文描述的抗-0LFM4抗體的分離的核酸。此類核酸可編碼包含抗體的\的氨基酸序列和/或包含抗體的Vh的氨基酸序列(例如，抗體的輕鏈和/或重鏈)。在另一個實施方案中，提供包含此類核酸的一個或多個載體(例如表達載體)。在另一個實施方案中，提供包含此類核酸的宿主細胞。在一個此類實施方案中，宿主細胞包含(例如已經(jīng)被轉(zhuǎn)化了)(I)包含核酸的載體，所述核酸編碼包含抗體的\的氨基酸序列和包含抗體的Vh的氨基酸序列，或(2)包含編碼包含抗體的'的氨基酸序列的核酸的第一載體，和包含編碼包含抗體的Vh的氨基酸序列的核酸的第二載體。在一個實施方案中，宿主細胞是真核的，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0，NS0，Sp20細胞)。在一個實施方案中，提供制造抗-TMEM27抗體的方法，其中所述方法包括在適合所述抗體表達的條件下培養(yǎng)包含編碼所述抗體的核酸的宿主細胞，如上文所提供的，并且任選地從所述宿主細胞(或宿主細胞培養(yǎng)基)中回收所述抗體。對于本發(fā)明的抗體的重組產(chǎn)生，將例如如上文所描述的編碼抗體的核酸分離并且插入到一個或多個載體中，用于進一步在宿主細胞中克隆和/或表達。此類核酸可使用常規(guī)程序(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地分離并且測序。用于克隆或表達編碼抗體的載體的適當?shù)乃拗骷毎ū疚拿枋龅脑嘶蛘婧思毎?。例如，抗體可在細菌中產(chǎn)生，尤其是當糖基化和Fe效應(yīng)子功能不需要的時候。對于在細菌中表達抗體片段和多肽，參見例如美國專利號5，648，237，5，789，199，和5，840，523。(也參見 Charlton, Methods in Molecular Biology (分子生物學(xué)中的方法)，卷 248 (B.K. C. Lo,編輯,Humana Press, Totowa, NJ, 2003)，pp. 245-254,描述了在大腸桿菌(E. coli.)中表達抗體片段)。表達后，抗體可從細菌細胞糊中以可溶性級分分離并且可進一步純化。從產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞中克隆抗體基因的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域(Vi^PV1)的遺傳信息可使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)通過免疫球蛋白特異性引物從雜交瘤細胞中擴增(Methods Mol Med. 2004 ;94 :447-58)。編碼可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域(％和')的核酸可然后在適當載體中克隆用于在宿主細胞中表達。附圖
簡述圖IA :使用抗體對0LFM4-1/23和0LFM4-2/3通過ELISA檢測在10個人血漿樣品、中的0LFM4多肽，圖IB :使用抗體對0LFM4-2/1和0LFM4-2/28通過ELISA檢測在10個人血漿樣品中的0LFM4多肽，圖IC :使用抗體對0LFM4-2/28和0LFM4-2/14通過ELISA檢測在10個人血漿樣品中的0LFM4多肽，圖2A :使用單克隆抗體0LFM4-2/1與10個人血漿樣品的免疫沉淀(IP)，圖2B :使用單克隆抗體0LFM4-2/3與10個人血漿樣品的免疫沉淀(IP)，圖2C :使用單克隆抗體0LFM4-2/28與10個人血漿樣品的免疫沉淀(IP)， 圖2D :使用單克隆抗體0LFM4-2/14與10個人血漿樣品的免疫沉淀(IP)，圖3A :使用抗體對0LFM4 2/1和0LFM4 2/28通過ELISA檢測在選自下述組的人受試者的血漿樣品中的0LFM4多肽健康對照，空腹血糖受損(IFG)，糖耐量減低(IGT)，空腹血糖受損+糖耐量減低(IFG+IGT)，I型糖尿病患者(TlD)和2型糖尿病患者(T2D)，圖3B :使用抗體對0LFM4 2/28和0LFM4 2/14通過ELISA檢測在選自下述組的人受試者的血漿樣品中的0LFM4多肽健康對照，空腹血糖受損(IFG)，糖耐量減低(IGT)，和空腹血糖受損+糖耐量減低(IFG+IGT)，I型糖尿病患者(TlD)和2型糖尿病患者(T2D)，圖4A :使用單克隆抗體hOLFM4 1/46的人組織陣列的免疫組織化學(xué)(IHC)染色，圖4B和C :使用單克隆抗體hOLFM4 1/46對人胰島染色(0LFM4 :綠色，胰高血糖素紅色，DAPI :藍色)。
實施例本發(fā)明的單克隆抗人0LFM4抗體下述五種產(chǎn)生針對人0LFM4的單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞系已經(jīng)于2009年10月7日以霍夫曼-拉羅奇有限公司(F. Hoffmann-La Roche Ltd.)的名義保藏于DSMZ_(德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH))并且收到下列保藏號0LMF4-1/23 = DSM ACC30100LMF4-1/46 =DSM ACC30110LMF4-2/3 = DSMACC30120LMF4-2/1 = DSM ACC30130LMF4-2/14 = DSM ACC30140LMF4-2/28 = DSM ACC3015產(chǎn)生針對人0LFM4的小鼠單克隆抗體(小鼠0LFM4 mAbs)用于產(chǎn)生單克隆抗體的重組人0LFM4融合多肽的氨基酸序列如下給出GSGGSVSQLFSNFTGSVDDRGTCQCSVSLPDTTFPVDRVERLEFTAHVLSQKFEKELSKVREYVQLISVYEKKLLNLTVRIDIMEKDTISYTELDFELIKVEVKEMEKLVIQLKESFGGSSEIVDQLEVEIRNMTLLVEKLETLDKNNVLAIRREIVALKTKLKECEASKDQNTPVVHPPPTPGSCGHGGVVNISKPSVVQLNWRGFSYLYGAWGRDYSPQHPNKGLYVAPLNTDGRLLEYYRLYNTLDDLLLYINARELRTYGQGSGTAVYNNNMYVNMYNTGNIARVNLTTNTIAVTQTLPNAAYNNRFSYAVAWQDIDFAVDENGLWVI
YSTEASTGNMVISKLNDTTLQVLNTWYTKQYKPSASNAFMVCGVLYATRTMNTRTEEIFYYDTNTGKEGKLDIVMHKMQEKVQSINYNPFDQLYVYNDGYLL-NYDLSVLQKPQHHHHHH(Seq. Id. No. 2)將小鼠用在昆蟲細胞中產(chǎn)生的偶聯(lián)His標簽的重組0LFM4 5iig/注射免疫。在第0，13 和 28 天在 ImmunEasy 佐劑(ALHY-DR0GEL 2% +CPG-0DN)中以 20 y I 的體積 ip 進行免疫。通過從第41天采血，通過ELISA評價動物對重組的0LFM4的免疫應(yīng)答。在第56天超加強(Superboost) (PBS中的5 y g重組0LFM4 iv) 2只選擇的動物，2天后融合脾細胞與PAI-細胞。通過ELISA針對重組的0LFM4進行雜交瘤篩選以及克隆評價。ELISA特異性驗證在ELISA中使用三對本發(fā)明的mAbs

包被-mAb檢測-mAb
~r 0LFM4-1/230LFM4-2/3-生物素
~ 0LFM4-2/10LFM4-2/28-生物素
~ 0LFM4-2/280LFM4-2/14-生物素10個對照人血漿的ELISA-結(jié)果測定的結(jié)果在圖IA-圖IC中給出Hu I-Hu 10 :對照人血清(血液供體人血漿)陽性對照(0LFM4):INS-I hOLFM4 WT Fll陰性對照(med):培養(yǎng)基使用三種不同ELISA測定測試10個人血漿樣品給出非常相似的結(jié)果。這驗證了測定的特異性。這些樣品進一步用于通過免疫沉淀(IP)定性驗證這些ELISA結(jié)果。通過IP (免疫沉淀(IP)-最終選擇的mAb對血液供體人血漿和INS-I hOLFM4 WTFll/培養(yǎng)基)定性證實ELISAs使用在之前ELISA中使用的人血漿樣品來進行免疫沉淀(IP)，用于評價通過不同技術(shù)是否獲得相似結(jié)果(參見圖2A-D)。ELISA和IP結(jié)果之間完全匹配。這非常重要，因為它是使用兩種不同技術(shù)的結(jié)果的定性證實。在IP實驗中使用下述樣品和抗體樣品
泳道 I 2丨3丨4丨5丨6丨7|8丨9丨1()| 11 12 13 14 15
陽性和
人血漿號明性對
厘
樣品 MWM 123456798^ ^10 MWM ■11 ] 12 MWM
MWM :分子量標記；對照與ELISA測定中相同。杭體:圖2A :0LFM4-2/l圖2B 0LFM4-2/3圖2C 0LFM4-2/28圖2D 0LFM4-2/14
IP測定的結(jié)果在圖2A-D中給出。在ELISA中的陽性樣品(#1-5和#7-10)在IP中也是陽性的。在ELISA中陰性的樣品(#6)在IP中也是陰性。將INS-I 0LFM4上清和培養(yǎng)基分別用作陽性和陰性對照。這是通過IP定性確認ELISA結(jié)果。人橫斷面隊列(cross sectional cohort)的ELISA結(jié)果在前驅(qū)糖尿病(pre-diabetic)和糖尿病患者(Bratislava隊列)中0LFM4顯著降低。圖3A+3B人血漿隊列等試者篩詵滿足下述入選標準的來自門診病人門診部登記簿的具有T2D代謝風(fēng)險的大約200
受試者性別男性年齡40-55歲BMI 25-32kg/m2HbAlC ^ 7. 0%進行口服葡萄糖耐受測試(75g)。排除標準包括以前已知葡萄糖代謝改變，使用已知改變胰島素分泌或作用的藥物，和存在肝或內(nèi)分泌疾病。在收集血液樣品前，使用標準方案評估身高和重量。體重指數(shù)(BMI)計算為重量(千克)除以高度(米)的平方。在10-12小時過夜禁食后并且在2小時葡萄糖負荷后，將來自肘前靜脈的全血樣品(20ml)收集到EDTA試管中。為了獲得適當?shù)慕碃顟B(tài)，向參加者提供關(guān)于食物種類和它們最后攝入時間的精確說明。通過離心分離的血漿在分析前以Iml的等分試樣(IOx)存儲于_80°C。在該研究中招募簽署知情同意書并且滿足合格標準的患者。斯洛伐克科學(xué)院(Slovak Academy of Sciences)實驗內(nèi)分泌學(xué)研究所(Institute of ExperimentalEndocrinology)的倫理委員會(The Ethical committee)批準了所述研究的方案。邏將受試者根據(jù)ADA指南2005 (Diabetes Care.(糖尿病護理)2005年I月；28增刊I :S37-42)分為4個不同的組健康對照禁食血漿葡萄糖(FPG) < 5. 6mmol/l并且正常葡萄糖耐受(NGT)< 7. 8mmol/l o空腹血糖受損(IFG) :IFG定義為FPG值在彡5. 6和<6. 9mmol/l之間并且在激發(fā)后2小時正常糖耐量(NGT) < I. 8mmol/l。糖耐量減低(IGT) =IGT定義為負荷后2小時葡萄糖濃度在彡7. 8和< 11. Immol/I之間。
空腹血糖受損和葡萄糖耐受(IFG+IGT) :16了+正6定義為？ 6值在彡5.6和<6. 9mmol/l之間并且激發(fā)后2小時的NGT值在彡7. 8和< 11. lmmol/1)之間。另外，還選擇了來自門診病人門診部登記簿的一組8名I型糖尿病患者和一組11名2型患者?；加醒惓５幕颊哂媒笛瑒?hypolipidemic agents)(例如他汀類(statins)或貝特類(fibrates))治療。糖尿病受試者的總結(jié)表

權(quán)利要求
1.用于診斷II型糖尿病或確定個體發(fā)展II型糖尿病的素因的方法，其包括下述步驟 測量所述個體的組織樣品中嗅介蛋白4(0LFM4)多肽水平，其中與代表健康群體的0LFM4多肽水平相比，所述個體的所述樣品中降低的0LFM4多肽水平指示II型糖尿病或發(fā)展II型糖尿病的素因。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述組織是血液，優(yōu)選血漿。
3.鑒別用于治療II型糖尿病的化合物的方法，其包括下述步驟 c)將所述化合物施用給患有II型糖尿病的非人動物， d)測量步驟a)的非人動物的組織樣品中0LFM4多肽水平，其中與沒有被施用化合物的患有II型糖尿病的非人動物的組織樣品中0LFM4多肽水平相比，步驟a)的非人動物的組織樣品中改變的0LFM4多肽水平指示用于治療II型糖尿病的化合物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述組織是血液，優(yōu)選血漿。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述非人動物是嚙齒動物，優(yōu)選小鼠或大鼠。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述嚙齒動物是ZDF大鼠或ob/ob小鼠。
7.0LFM4多肽用于診斷II型糖尿病或用于確定個體發(fā)展II型糖尿病的素因的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述0LFM4多肽是人0LFM4多肽。
9.特異性結(jié)合0LFM4多肽的抗體用于診斷II型糖尿病或用于確定個體發(fā)展II型糖尿病的素因的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中所述抗體結(jié)合人0LFM4多肽。
11.用于診斷II型糖尿病或確定個體中發(fā)展II型糖尿病的素因的試劑盒，其包含 d)對0LFM4多肽特異性的抗體，優(yōu)選權(quán)利要求13-16的抗體， e)結(jié)合a)所述抗體的標記抗體，或結(jié)合a)的被捕獲的0LFM4多肽的標記抗體，和 f)用于進行診斷測定的試劑。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述對0LFM4多肽特異性的抗體結(jié)合人0LFM4多肽。
13.針對人0LFM4多肽的單克隆抗體。
14.權(quán)利要求13的抗體，其中所述抗體包含能夠從選自由以下組成的組的雜交瘤細胞系獲得的抗體的 Vh 結(jié)構(gòu)域的 CDR1-CDR3 :0LFM4 2/3 (DSM ACC3012)，0LFM4 1/46 (DSMACC3011), 0LFM4 2/1(DSMACC3013), 0LFM4 2/14(DSM ACC3014), 0LFM4 2/28(DSMACC3015)和0LFM4 1/23 (DSM ACC3010)，和能夠從選自由以下組成的組的雜交瘤細胞系獲得的抗體的 \ 結(jié)構(gòu)域的 CDR1-CDR3 0LFM4 2/3 (DSMACC3012)，0LFM4 1/46 (DSM ACC3011)，0LFM4 2/1(DSM ACC3013)， 0LFM4 2/14(DSM ACC3014)， 0LFM4 2/28(DSM ACC3015)和0LFM41/23(DSM ACC3010)。
15.權(quán)利要求13或14的抗體，其中所述抗體包含能夠從選自由以下組成的組的雜交瘤細胞系獲得的抗體的Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域0LFM42/3 (DSM ACC3012)，0LFM41/46(DSM ACC3011),0LFM4 2/1(DSMACC3013),0LFM4 2/14(DSM ACC3014)，0LFM4 2/28(DSMACC3015)和 0LFM4 1/23(DSM ACC3010)。
16.權(quán)利要求13-15的抗體，其中所述抗體由選自由以下組成的組的雜交瘤細胞系產(chǎn)生0LFM4 2/3(DSM ACC3012)，0LFM4 1/46(DSMACC3011),0LFM4 2/1(DSM ACC3013)，0LFM42/14(DSM ACC3014)，0LFM4 2/28(DSM ACC3015)和 0LFM4 1/23(DSM ACC3010)。
17.選自由以下組成的組的雜交瘤細胞系0LFM42/3(DSMACC3012), 0LFM4 1/46 (DSMACC3011), 0LFM4 2/1(DSM ACC3013), 0LFM4 2/14(DSM ACC3014), 0LFM4 2/28(DSMACC3015)和 0LFM41/23(DSM ACC3010)。
18.核酸序列，其包含編碼能夠從選自由以下組成的組的雜交瘤細胞系獲得的抗體的Vh 結(jié)構(gòu)域的序列0LFM4 2/3 (DSM ACC3012)，0LFM41/46 (DSM ACC3011)，0LFM4 2/1 (DSMACC3013)， 0LFM4 2/14(DSMACC3014)， 0LFM4 2/28(DSM ACC3015)和 0LFM4 1/23(DSMACC3010)。
19.核酸序列，其包含編碼能夠從選自由以下組成的組的雜交瘤細胞系獲得的抗體的\ 結(jié)構(gòu)域的序列0LFM4 2/3 (DS M ACC3012)，0LFM41/46 (DSM ACC3011)，0LFM4 2/1 (DSMACC3013)， 0LFM4 2/14(DSMACC3014)， 0LFM4 2/28(DSM ACC3015)和 0LFM4 1/23(DSMACC3010)。
20.0LFM4多肽作為胰腺P -細胞標記的應(yīng)用。
21.檢測組織樣品中胰腺￠-細胞的方法，其包括 c)提供個體或非人動物的胰腺組織樣品， d)檢測a)所述的組織樣品中的0LFM4陽性細胞，其中所述0LFM4陽性細胞是P-細胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述0LFM4陽性細胞通過0LFM4特異性的抗體檢測，所述抗體優(yōu)選權(quán)利要求13-16的抗體。
23.用于檢測胰腺組織樣品中的￠-細胞的試劑盒，其包含 a)對0LFM4多肽特異性的抗體，優(yōu)選權(quán)利要求13-16的抗體， b)結(jié)合a)所述抗體的標記抗體，和 c)用于進行免疫組織化學(xué)測定的試劑。
24.基本上如上文所描述的，特別是參照前述實施例的方法和抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供用于早期檢測II型糖尿病的標記蛋白，針對所述標記蛋白的抗體，和它們在用于II型糖尿病的診斷方法和藥物開發(fā)中的應(yīng)用。
文檔編號C07K16/18GK102639563SQ201080053131
公開日2012年8月15日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日
發(fā)明者克里斯蒂亞諾·米廖里尼, 勞拉·拜迪, 埃萊娜·謝伯科娃, 托馬斯·施奈德, 王海燕, 胡格斯·馬蒂勒, 雅各布·薩瓦斯特貝利韋爾, 馬丁·埃貝林 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司