修飾型生物素結(jié)合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及修飾型生物素結(jié)合蛋白。本發(fā)明的修飾型生物素結(jié)合蛋白是在包含SEQ?ID?NO:2所述的氨基酸序列、或在該序列中具有一個(gè)～數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或與該序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)中，選自下組中的一個(gè)或多個(gè)殘基被取代成酸性氨基酸殘基或中性氨基酸殘基而成的：1)SEQ?ID?NO:2的104位的精氨酸殘基；2)SEQ?ID?NO:2的141位的賴氨酸殘基；3)SEQ?ID?NO:2的26位的賴氨酸殘基；以及4)SEQ?ID?NO:2的73位的賴氨酸殘基。
【專利說明】修飾型生物素結(jié)合蛋白
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年8月13日、申請(qǐng)?zhí)枮?00980140630.6 (國際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/JP2009/064302)，名稱為“修飾型生物素結(jié)合蛋白”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本申請(qǐng)要求2008年8月13日提出的日本國專利申請(qǐng)2008-208766的優(yōu)先權(quán)。
[0003]本發(fā)明涉及修飾型生物素結(jié)合蛋白。
【背景技術(shù)】
[0004]抗生物素蛋白是卵清來源的蛋白質(zhì)，鏈霉菌抗生物素蛋白是放線菌(Streptomyces avidinii)來源的蛋白質(zhì)?？股锼氐鞍谆蜴溍咕股锼氐鞍着c生物素(D-[ (+) -Cis-六氫-2-氧代-1H-噻吩并-(3，4)-咪唑-4-戊酸]之間的親和性(affinity)非常高(KD = 10_16~_14)，是兩生物分子間相互作用之中最強(qiáng)的相互作用之一。分子量是60kDa左右。現(xiàn)在，抗生物素蛋白/鏈霉菌抗生物素蛋白-生物素相互作用在生物化學(xué)、分子生物學(xué)或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用(Green, (1975), Adv.Protein Chem.，29:85-133 ;Green, (1990), Methods Enzymol.，184:51-67)?？股锼氐鞍?鏈霉菌抗生物素蛋白這兩種蛋白質(zhì)均形成四聚體，每一個(gè)亞基結(jié)合I分子的生物素。
[0005]在抗生物素蛋白的利用方面，其非特異性結(jié)合是一個(gè)問題?？股锼氐鞍子行┣闆r下與細(xì)胞、DNA、蛋 白質(zhì)或膜這些生物體成分非特異性結(jié)合，例如，在使用抗生物素蛋白-生物素結(jié)合對(duì)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，有些情況下抗生物素蛋白與檢測(cè)對(duì)象物質(zhì)以外的物質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致背景增高。作為抗生物素蛋白的非特異性結(jié)合高的理由，可以列舉出等電點(diǎn)高、具有分子量的約10%的糖鏈、等等?？股锼氐鞍资菑?qiáng)堿性蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)為10以上非常之高，整體上帶有正電荷，因而可以認(rèn)為其容易與帶負(fù)電荷的物質(zhì)居多的生物體成分發(fā)生結(jié)合。
[0006]此外，可以認(rèn)為，抗生物素蛋白表面的糖鏈容易與生物體成分結(jié)合(Marttila等，(2000)FEBS Lett，467，31-36)。為了降低抗生物素蛋白的非特異性結(jié)合，進(jìn)行了下述的研究:利用糖苷酶除去抗生物素蛋白的糖鏈而得到的化學(xué)修飾中性抗生物素蛋白的研究(Bayer 等，(1995) Appl Biochem Biotechnol, 53 (I)，1-9),通過將抗生物素蛋白中的糖基化靶點(diǎn)即17位的天冬酰胺殘基取代成異亮氨酸殘基來生物合成不受糖鏈修飾的抗生物素蛋白的研究(Marttila等，(2000)FEBS Lett, 467，31-36),等等。而且,還進(jìn)行了通過采用基因工程方法將抗生物素蛋白所具有的賴氨酸殘基、精氨酸殘基變換為中性氨基酸、酸性氨基酸，來降低抗生物素蛋白的等電點(diǎn)的研究(Marttila等，(1998)FEBSLett, 441，313-317)。
[0007]然而，通過這樣的修飾，雖然例如DNA、細(xì)胞針對(duì)抗生物素蛋白的非特異性結(jié)合得以降低，但關(guān)于在應(yīng)用于臨床檢查系統(tǒng)等時(shí)所必須的針對(duì)人血清的非特異性結(jié)合的抑制，尚未進(jìn)行充分研究。此外，在生物合成抗生物素蛋白變體時(shí)，有必要使用基于昆蟲細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)。因此，現(xiàn)狀是因培養(yǎng)需要時(shí)間及成本高，序列修飾抗生物素蛋白尚未達(dá)到實(shí)用化。[0008]作為關(guān)于抗生物素蛋白、鏈霉菌抗生物素蛋白這樣的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)與生物素之間的親和性的研究，有報(bào)告稱，對(duì)鏈霉菌抗生物素蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行大的修飾，增強(qiáng)了其與熒光生物素的結(jié)合(Aslan 等，(2005) Proc Natl Acad Sci U.S.A.，102，8507-8512)。但是，該蛋白質(zhì)同時(shí)大幅損失了與生物素的結(jié)合能力。
[0009]本發(fā)明人等從食用菌白黃側(cè)耳(Plueurotus conucopiae)中純化了對(duì)稻痕病菌(Magnaporthe grisea)顯示抗菌性的蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)顯示生物素結(jié)合性，將其命名為tamavidin(tamavidinl)。tamavidinl蛋白質(zhì)的氨基酸序列、以及編碼該蛋白質(zhì)的基因的堿基序列均在W002/072817中公開(W002/072817中的SEQ ID NO:1和2)。而且，還從同一食用菌中鑒定出tamavidinl的同源物(tamavidin2),其顯示具有強(qiáng)的生物素結(jié)合能力。tamavidin2蛋白質(zhì)的氣基酸序列、以及編碼該蛋白質(zhì)的基因的喊基序列均在W002/072817中公開(W002/072817中的SEQ ID NO: 3和4)，且重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)也取得了成功。tamavidinl和2可在大腸桿菌中表達(dá),特別是tamavidin2可以通過使用亞胺基生物素柱的純化容易地制備，且其與鏈霉菌抗生物素蛋白相比具有更高的耐熱性，就這點(diǎn)而言，其是一種優(yōu)異的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)。然而，在針對(duì)核酸和/或蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合方面，其雖然比傳統(tǒng)的抗生物素蛋白少，但卻與鏈霉菌抗生物素蛋白程度等同。[0010]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0011]專利文獻(xiàn)
[0012]專利文獻(xiàn)1:TO02/072817A1
[0013]非專利文獻(xiàn)
[0014]非專利文獻(xiàn)2:TO2008/081938A1
[0015]非專利文獻(xiàn)l:Marttila 等，(2000)FEBS Lett, 467，31-36
[0016]非專利文獻(xiàn)2: Bayer 等,(1995) Appl Biochem Biotechnol, 53 (I)，1-9)
[0017]非專利文獻(xiàn)3:Marttila 等，(1998)FEBS Lett, 441，313-317
[0018]非專利文獻(xiàn)4:Α1οη 等，(1990)Biochem Biophys Res Commun, 170, 1236-1241
[0019]非專利文獻(xiàn)5:Aslan 等，(2005)Proc Natl Acad Sci U.S.A.，102，8507-8512
[0020]非專利文獻(xiàn)6:Weber 等，(I989)ScienceM3:85-88
[0021]非專利文獻(xiàn)7: Livnah 等，(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.90:5076-5080
[0022]非專利文獻(xiàn)8: Qureshi et al.(2001) J.Biol.Chem.276 (49)，ρ.46422-46428

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]發(fā)明所要解決的問題
[0024]本發(fā)明的課題是提供:在保持生物素結(jié)合能力高的tamavidin的特性的同時(shí)，性能提升的修飾型生物素結(jié)合蛋白，所述性能提升是指非特異性結(jié)合性降低和/或進(jìn)一步的生物素結(jié)合提高。
[0025]解決問題的方法
[0026]本發(fā)明通過對(duì)天然的tamavidin2(以下，在本說明書中也記作“TM2”)的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)進(jìn)行修飾，成功地提高了其性能。
[0027]本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式
[0028]本發(fā)明優(yōu)選包含以下實(shí)施方式。[0029][實(shí)施方式I]
[0030] 在包含SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列、或在該序列中具有一個(gè)~數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或與該序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)中，選自下組中的一個(gè)或多個(gè)殘基被取代成酸性氨基酸殘基或中性氨基酸殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白:
[0031]DSEQ ID NO: 2的104位的精氨酸殘基；
[0032]2) SEQ ID NO: 2的141位的賴氨酸殘基；
[0033]3) SEQ ID NO: 2的26位的賴氨酸殘基；以及
[0034]4) SEQ ID NO: 2的73位的賴氨酸殘基。
[0035][實(shí)施方式2]
[0036]實(shí)施方式I所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其中，選自I)~4)中的氨基酸殘基被取代成疏水性指數(shù)為2以下的氨基酸殘基。
[0037][實(shí)施方式3]
[0038]實(shí)施方式I所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其中，1)SEQ ID N0:2的104位的精氨酸殘基、和/或、2) SEQ ID NO: 2的141位的賴氨酸殘基被取代成酸性氨基酸殘基或中性氨
基酸殘基。
[0039][實(shí)施方式4]
[0040]實(shí)施方式3所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其中，1)SEQ ID N0:2的104位的精氨酸殘基、和/或、2)SEQ ID NO:2的141位的賴氨酸殘基被取代成酸性氨基酸殘基。
[0041][實(shí)施方式5]
[0042]實(shí)施方式3或4所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其中，1)SEQ ID N0:2的104位的精氨酸殘基、和/或、2) SEQ ID NO: 2的141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基。
[0043][實(shí)施方式6]
[0044]實(shí)施方式I~5中任一項(xiàng)所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其中，進(jìn)一步，SEQ IDNO:2的40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基。
[0045][實(shí)施方式7]
[0046]實(shí)施方式I~6中任一項(xiàng)所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其選自下組:
[0047]在SEQ ID NO: 2中，104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白(R104E-K141E)；
[0048]在SEQ ID N0:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、且104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白(D40N-R104E)；
[0049]在SEQ ID NO:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白(D40N-K141E);以及
[0050]在SEQ ID NO:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白(D40N-R104E-K141E)。
[0051][實(shí)施方式8]
[0052]實(shí)施方式I~7中任一項(xiàng)所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其滿足以下a)-1)的條件中的一個(gè)至全部:[0053]a) SEQ ID NO: 2的14位的天冬酰胺殘基未被修飾、或者被取代成谷氨酰胺或天冬
氨酸；
[0054]b)SEQ ID NO:2的18位的絲氨酸殘基未被修飾、或者被取代成蘇氨酸或酪氨酸；
[0055]c)SEQ ID NO: 2的34位的酪氨酸殘基未被修飾、或者被取代成絲氨酸、蘇氨酸或苯
丙氨酸；
[0056]d) SEQ ID NO: 2的36位的絲氨酸殘基未被修飾、或者被取代成蘇氨酸或酪氨酸； [0057]e) SEQ ID NO: 2的40位的天冬氨酸殘基未被修飾、或者被取代成天冬酰胺；
[0058]f) SEQ ID NO: 2的69位的色氨酸殘基未被修飾；
[0059]g) SEQ ID NO: 2的76位的絲氨酸殘基未被修飾、或者被取代成蘇氨酸或酪氨酸；
[0060]h) SEQ ID NO: 2的78位的蘇氨酸殘基未被修飾、或者被取代成絲氨酸或酪氨酸；
[0061]i) SEQ ID NO: 2的80位的色氨酸殘基未被修飾；
[0062]j) SEQ ID NO: 2的96位的色氨酸殘基未被修飾；
[0063]k) SEQ ID NO: 2的108位的色氨酸殘基未被修飾；以及
[0064]DSEQ ID NO: 2的116位的天冬氨酸殘基未被修飾、或者被取代成谷氨酸或天冬酰胺。
[0065][實(shí)施方式9]
[0066]實(shí)施方式I所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其包含與SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
[0067][實(shí)施方式10]
[0068]實(shí)施方式I~9中任一項(xiàng)所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其滿足以下性質(zhì)中的一個(gè)至全部:
[0069]i)與由SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)相比，具有低的等電點(diǎn)；
[0070]ii)與由SEQ ID N0:2所述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)相比，顯示對(duì)核酸和/或蛋白質(zhì)的低的非特異性結(jié)合；
[0071]iii)與由SEQ ID N0:2所述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)相比，顯示低的纖連蛋白結(jié)合性；
[0072]iv)與由SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)相比，顯示高的生物素結(jié)合性。
[0073][實(shí)施方式11]
[0074]在包含SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列、或在該序列中具有一個(gè)~數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或與該序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)中，SEQ ID NO: 2的40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白。
[0075][實(shí)施方式12]
[0076]實(shí)施方式11所述的修飾型生物素結(jié)合蛋白，其與由SEQ ID N0:2所述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)相比，顯示高的生物素結(jié)合性。
[0077][實(shí)施方式13]
[0078]編碼實(shí)施方式I~12中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的核酸。
[0079][實(shí)施方式14][0080]包含實(shí)施方式13所述的核酸的載體。
[0081][實(shí)施方式15]
[0082]固定化有實(shí)施方式I~14中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的載體。
[0083]以下，對(duì)用于實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行說明。
[0084]tamavidin
[0085]tamavidin是從作為食用菌的擔(dān)子菌白黃側(cè)耳(Pleurotus conucopiae)中發(fā)現(xiàn)的新的生物素結(jié)合蛋白(W002/072817)。該文獻(xiàn)中記載:
[0086]-tamavidinl與tamavidin2相互之間的氨基酸同源性為65.5%,與生物素強(qiáng)結(jié)合；
[0087]_tamavidin2在大腸桿菌中高表達(dá)在可溶性級(jí)分中；以及
[0088]-用大腸桿菌表達(dá)tamavidin2時(shí),經(jīng)過4.5小時(shí)的培養(yǎng),每50ml培養(yǎng)可以獲得約Img的高純度純化重組蛋白質(zhì)。與已知的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)抗生物素蛋白、鏈霉菌抗生物素蛋白相比，這是非常高的值。
[0089]本說明書中的 “tamavidin2”是指:tamavidin2 (TM2)或其變體。本發(fā)明通過對(duì)TM2或其變體的特定氨基酸殘基進(jìn)行修飾，提供顯示對(duì)核酸和/或蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合比野生型TM2更低的修飾型TM2。在本說明書中，當(dāng)記作“tamavidin2”、“TM2”時(shí)，如無特別說明，是指野生型的TM2及其變體。但是，根據(jù)文意，有些情況下也作為包括本發(fā)明的修飾型TM2在內(nèi)的TM2的野生型、突變型和本發(fā)明的修飾型的統(tǒng)稱使用。此外，TM2顯示生物素結(jié)合性，因而在本說明書中，有時(shí)也將TM2稱作“生物素結(jié)合蛋白”。
[0090]具體地，TM2(野生型)典型地，可以是包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或由包含SEQ ID NO:1的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)?；蛘撸琓M2可以是包含SEQ IDN0:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或由包含SEQ ID NO:1的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)的變體，該蛋白質(zhì)具有與tamavidin2等同的生物素結(jié)合活性。TM2的變體可以是包含在SEQ IDN0:2的氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有與TM2等同的生物素結(jié)合活性。取代可以是保守取代，即將特定的氨基酸殘基替換為具有相似物理化學(xué)特征的殘基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基團(tuán)的氨基酸殘基之間的取代(例如He、Val、Leu或Ala間的相互取代)、極性殘基之間的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之間的相互取代)等。
[0091]氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的變體可以通過對(duì)編碼野生型蛋白質(zhì)的DNA實(shí)施例如作為公知技術(shù)的定點(diǎn)誘變(例如參見Nucleic Acid Research, Vol.10,N0.20,p.6487-6500，1982，通過引用將其全文引入到本說明書中)而產(chǎn)生。在本說明書中，“一個(gè)或多個(gè)氨基酸”是指通過定點(diǎn)誘變方法能夠缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。此外，在本說明書中，“一個(gè)或多個(gè)氨基酸”根據(jù)情況可以指一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。
[0092]就定點(diǎn)誘變方法而言，例如，除希望的變異即特定的不一致之外，還可以使用與要突變的單鏈?zhǔn)删wDNA互補(bǔ)的合成寡核苷酸引物按如下方式進(jìn)行。即，使用上述合成寡核苷酸作為引物合成與噬菌體互補(bǔ)的鏈，用得到的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌的培養(yǎng)物鋪在瓊脂上，由含噬菌體的單個(gè)細(xì)胞形成噬菌斑。這樣，理論上有50%的新菌落含有單鏈形式的具有突變的噬菌體，其余的50%攜帶原序列。在合適的溫度下，使獲得的噬菌斑與通過激酶處理而標(biāo)記的合成探針雜交，所述合適的溫度指該溫度下所述探針與和帶有目的突變的DNA完全一致的噬菌斑雜交，而不與攜帶原有鏈的噬菌斑雜交。然后，收集與該探針雜交的噬菌斑，進(jìn)行培養(yǎng)，回收DNA。
[0093]而且，在保持其活性的同時(shí)對(duì)生物活性肽的氨基酸序列施加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定點(diǎn)突變外，還有用誘變物處理基因的方法，以及選擇性地?cái)嚅_基因，然后刪除、取代、插入或添加選定的核苷酸，再進(jìn)行連接的方法。更優(yōu)選地，本發(fā)明中的TM2是由在SEQ ID NO:2中缺失、取代或添加I~10個(gè)氨基酸的氨基酸序列組成、且具有生物素活性的蛋白質(zhì)。
[0094]TM2的變體還可以是:包含與SEQ ID NO: 2的氨基酸序列具有至少80 %以上、優(yōu)選85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上、更優(yōu)選99.3%以上的氨基酸同一性的氨基酸序列、且具有與TM2等同的生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。
[0095]兩個(gè)氨基酸序列的同一性％可通過目測(cè)和數(shù)學(xué)計(jì)算來確定?；蛘邇蓚€(gè)蛋白質(zhì)序列的同一性百分比可以通過使用以Needleman, S.B.及ffunsch, C.D.(J.Mol.Bol.,48:443-453,1970)的算法為基礎(chǔ)的、可從威斯康星州大學(xué)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(UWGCG)獲得的GAP計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行序列信息比較來確定。GAP程序優(yōu)選的默認(rèn)參數(shù)包括=(I)Henikoff，S.以R Henikoff, J.G.(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，89:10915-10919，1992)所記載的得分 / 矩陣(7 7 u >夕''.?卜U '7夕7 )、blosum62 ； (2) 一個(gè)空位扣12分；(3)連續(xù)空位加扣4分；以及(4)末端空位不扣分。
[0096]也可使用該領(lǐng)域技術(shù)人員使用的進(jìn)行序列比較的其它程序。關(guān)于同一性百分比，例如:Altschul 等(Nucl.Acids.Res.,25, p.3389-3402,1997)中記載的可用 BLAST 程序?qū)π蛄行畔⑦M(jìn)行比較和確定。該程序可于網(wǎng)絡(luò)上在Nantional Center for BiotechnologyInformation(NCBI)或 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)網(wǎng)站使用。在相同站點(diǎn)，對(duì)利用BLAST程序進(jìn)行同一性檢索的各種條件(參數(shù))進(jìn)行了詳細(xì)記載，可對(duì)部分設(shè)定進(jìn)行適當(dāng)變更，但檢索通常使用默認(rèn)值來進(jìn)行。此外，兩個(gè)氨基酸序列的同一性％也可用遺傳信息處理軟件GENETYX Ver.7 (GENETYX制)等程序或FASTA算法等來確定。此時(shí)，也可用默認(rèn)值進(jìn)行檢索。
[0097]兩個(gè)核酸序列的同一性％可通過目測(cè)和數(shù)學(xué)計(jì)算來確定，此外，該比較更優(yōu)選使用計(jì)算機(jī)程序?qū)π蛄行畔⑦M(jìn)行比較。具有代表性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序?yàn)檫z傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(GCG ;威斯康星州Madison)的威斯康星.軟件包、10.0版“GAP”程序(Devereux等，1984,Nucl.Acids Res.,12:387)。使用該“GAP”程序,不僅可對(duì)兩個(gè)核酸序列進(jìn)行比較,還可比較兩個(gè)氨基酸序列，并可對(duì)核酸序列和氨基酸序列進(jìn)行比較。此處，“GAP”程序的優(yōu)選默認(rèn)參數(shù)包括:(1)實(shí)行關(guān)于核苷酸的(包括相同物質(zhì)為I，不同物質(zhì)為O的值)一元(unary)比較矩陣的GCG時(shí)，如Schwartz和Dayhoff主編的”多肽序列及結(jié)構(gòu)圖譜(Atlas ofPolypeptide Sequence and Structure) ” (國立生物醫(yī)學(xué)研究財(cái)團(tuán)，353-358 頁，1979 年)所記載的Gribskov及Burgess (Nucl.Acids Res.,14:6745,1986)的加權(quán)氨基酸比對(duì)矩陣；或其它可比對(duì)的比對(duì)矩陣；(2)氨基酸的各空位罰分30，各空位中的各記號(hào)追加I罰分；此外，核苷酸序列的各空位罰分50，各空位中的各記號(hào)追加3罰分；(3)末端空位不罰分；以及(4)長空位沒有最大罰分。技術(shù)人員使用的其它序列比較程序中，可使用例如美國國立醫(yī)學(xué)圖書館的網(wǎng)站:http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html 提供的版本2.2.7的BLASTN程序、或UW-BLAST2.0算法。關(guān)于UW-BLAST2.0標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)的設(shè)定，以下網(wǎng)站:http://blast.wustl.edu中有記載。而且,BLAST算法使用BL0SUM62氨基酸得分矩陣，可使用的選擇參數(shù)如下:(A)包含具有低組成復(fù)雜性的提問序列片斷(由Wootton及Federhen 的 SEG 程序(Computers and Chemistry, 1993)確定；參考 Wootton 及 Federhen,1996“序列數(shù)據(jù)庫中組成偏移區(qū)域的分析(Analysis of compositionally biased regionsin sequence databases) ” Methods Enzymol., 266:544-71),或用于掩蔽短周期性內(nèi)部重復(fù)形成的片段(由 Claverie 及 States (Computers and Chemistry, 1993)的 XNU 程序確定)的濾器，以及(B)用于報(bào)告數(shù)據(jù)庫序列匹配的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的閾值，或根據(jù)E-得分(Karlin和Altschul，1990)統(tǒng)計(jì)學(xué)模型得到的單純偶然發(fā)現(xiàn)匹配的期待幾率；某種匹配引起的有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差值大于E-得分閾值時(shí)，不能報(bào)告該匹配；優(yōu)選的E-得分閾值的數(shù)值為0.5，此外按照優(yōu)選度增大的順序依次為0.25,0.1,0.05,0.01,0.001,0.0001、le_5、Ie-10、Ie-15、le_20、le_25、le_30、le_40、le_50、le_75、Ie-1OO。
[0098]此外，TM2的變體還可以是由包含在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的堿基序列的核酸編碼的、具有與TM2等同的生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。
[0099]此處，“嚴(yán)格條件下”是指:在中度或高度的嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交。具體來說，關(guān)于中度嚴(yán)格條件，根據(jù)例如DNA長度，掌握常規(guī)技術(shù)的該領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定?；緱l件如 Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版,第 6 章，ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001 所不，例如包括下述條件的使用:5 X SSC、0.5 %SDS, 1.0mM EDTA (pH8.0)的預(yù)洗滌溶液、約42°C的約50 %的甲酰胺、2 X SSC-6 X SSC優(yōu)選5-6XSSC、0.5% SDS(或約42°C、約50%甲酰胺中的Stark’ s溶液等其它類似的雜交液)的雜交條件，以及例如在約50°C -68°C >0.1-6XSSC、0.1% SDS的洗滌條件。優(yōu)選的中度嚴(yán)格條件包括約50°C、6XSSC、0.5% SDS的雜交條件(及洗滌條件)。關(guān)于高度嚴(yán)格條件，根據(jù)例如DNA長度，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地確定。 [0100]通常，這樣的條件包括較中度嚴(yán)格條件更高溫度和/或更低鹽濃度的雜交(例如:含0.5 %左右的SDS、約65 °C，6 X SSC~0.2 X SSC,優(yōu)選6 X SSC、更優(yōu)選2 X SSC、更優(yōu)選0.2 X SSC或者0.1XSSC的雜交)和/或洗滌，例如可定義為上述雜交條件以及伴隨大約65°C -68°C >0.2~0.1 X SSC,0.1% SDS的洗滌。關(guān)于雜交及洗滌的緩沖液，可以使用SSPE (I X SSPE 為 0.15M NaCl、IOmM NaH2PO4 以及 1.25mM EDTA，pH7.4)代替 SSC (I X SSC 為
0.15M NaCl以及15mM檸檬酸鈉)，在雜交結(jié)束后15分鐘~I小時(shí)左右進(jìn)行洗滌。
[0101]此外，也可使用探針中不使用放射性物質(zhì)的市售雜交試劑盒。具體可以列舉出使用 ECL direct labeling&detection system(Amersham 公司制)進(jìn)行的雜交等。嚴(yán)格雜交條件的例子為，向試劑盒的雜交緩沖液中加入5% (w/v)的封閉試劑，使NaCl達(dá)到0.5M，在42°C進(jìn)行4小時(shí)雜交，關(guān)于洗滌，在0.4% SDS,0.5xSSC中，55°C條件下洗滌兩次，每次20分鐘，在2xSSC中，室溫條件下，洗滌一次5分鐘。
[0102]TM2的變體的生物素結(jié)合活性可以采用任何公知方法來測(cè)定。例如，可以像Kada等(Biochim.Biophys.Acta., 1427:44-48(1999))所描述的那樣,采用使用了突光生物素的方法來測(cè)定。該方法是利用以下性質(zhì)的測(cè)定系統(tǒng):在生物素結(jié)合蛋白的生物素結(jié)合位點(diǎn)上結(jié)合熒光生物素時(shí)，熒光生物素的熒光強(qiáng)度消失?；蛘撸梢允褂没诒砻娴入x子體共振原理的生物傳感器等能夠測(cè)定蛋白與生物素間的結(jié)合的傳感器，來評(píng)價(jià)變體蛋白的生物素結(jié)合活性。
[0103]在本發(fā)明的修飾tamavidin中，希望不進(jìn)行修飾的氨基酸殘基如后述。
[0104]本發(fā)明的非特異性結(jié)合降低的修飾tamavidin
[0105]本發(fā)明的修飾型TM2的特征是:在包含SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列、或在該序列中具有一個(gè)~數(shù)個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或與該序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，并顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)(野生型TM2以及突變型TM2)中，選自下組中的一個(gè)或多個(gè)殘基被取代成酸性氨基酸殘基或中性氨基酸殘基:
[0106]DSEQ ID NO: 2的104位的精氨酸殘基；[0107]2) SEQ ID NO: 2的141位的賴氨酸殘基；
[0108]3) SEQ ID NO: 2的26位的賴氨酸殘基；以及
[0109]4) SEQ ID NO: 2的73位的賴氨酸殘基。
[0110]野生型TM2的等電點(diǎn)(Pl)，由其一級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算得到的值是約7.4，實(shí)測(cè)值為
8.2-8.6左右，是中性~弱堿性的蛋白質(zhì)。TM2的非特異性結(jié)合程度遠(yuǎn)比抗生物素蛋白少，與作為中性蛋白質(zhì)的鏈霉菌抗生物素蛋白基本上等同。
[0111]本發(fā)明人等對(duì)進(jìn)一步減少TM2的非特異性結(jié)合進(jìn)行了研究。即，本發(fā)明人認(rèn)為，即使是TM2這樣的中性~弱堿性蛋白質(zhì)，通過降低pl，也可能進(jìn)一步降低非特異性結(jié)合，從而將TM2所具有的堿性氨基酸殘基修飾成酸性氨基酸或中性氨基酸，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
[0112]這里，對(duì)于鏈霉菌抗生物素蛋白或抗生物素蛋白而言，已知有些情況下一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代會(huì)導(dǎo)致其對(duì)生物素的結(jié)合親和力降低，因此，在實(shí)驗(yàn)中，不僅是降低等電點(diǎn)，還對(duì)如何不損害作為TM2的優(yōu)良特征的高生物素結(jié)合能力進(jìn)行了如后述的研究，來進(jìn)行氨基酸殘基的修飾。
[0113]深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn):滿足這樣的條件的本發(fā)明的低Pl修飾型TM2是包含選自下組中的一個(gè)或多個(gè)殘基的突變的修飾TM2蛋白質(zhì)，從而想到了本發(fā)明:
[0114]DSEQ ID NO: 2 的 104 位的精氨酸殘基(R104)；
[0115]2) SEQ ID NO: 2 的 141 位的賴氨酸殘基(K141)；
[0116]3) SEQ ID NO: 2的26位的賴氨酸殘基(K26);以及
[0117]4) SEQ ID NO: 2 的 73 位的賴氨酸殘基(K73)。
[0118]突變后的氨基酸是酸性氨基酸殘基(天冬氨酸、谷氨酸)或中性氨基酸殘基(天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)。
[0119]此外，非極性的氨基酸存在具有基于疏水性相互作用的非特異性結(jié)合的可能性，因而優(yōu)選疏水性指數(shù)為2以下的酸性氨基酸殘基或中性氨基酸殘基。疏水性指數(shù)(hydropathy inde 是指:例如Kyte and Doolittle, J.Mol.Biol., 157, 105-132 (1982)中記載的將各氨基酸殘基的疏水性程度數(shù)值化而得到的指數(shù)，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。“疏水性指數(shù)為2以下的酸性氨基酸殘基或中性氨基酸殘基”是作為酸性氨基酸殘基的天冬氨酸和谷氨酸，以及作為中性氨基酸殘基的天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、蘇氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和丙氨酸。
[0120]更優(yōu)選，I) SEQ ID NO: 2的104位的精氨酸殘基、和/或、2) SEQ ID NO: 2的141位的賴氨酸殘基被取代成酸性氨基酸殘基或中性氨基酸殘基。更優(yōu)選，1)SEQ ID N0:2的104位的精氨酸殘基、和/或、2) SEQ ID NO: 2的141位的賴氨酸殘基被取代成酸性氨基酸殘基。[0121 ] K26的位置上更優(yōu)選A (丙氨酸)、K73的位置上更優(yōu)選Q (谷氨酰胺)、R104的位置上更優(yōu)選E (谷氨酸)或D (天冬氨酸)、K141的位置上更優(yōu)選E (谷氨酸)或D (天冬氨酸)；而R104的位置上更優(yōu)選E，K141的位置上更優(yōu)選E。
[0122]本發(fā)明的低pi型修飾TM2與野生型TM2相比，顯示顯著低的等電點(diǎn)。具體地，可以明確:在實(shí)施例1的1-8)中導(dǎo)入了突變的修飾型TM2的等電點(diǎn)，均較野生型的TM2降低了 I以上。
[0123]由此性質(zhì)，與野生型或突變型TM2蛋白質(zhì)相比，本發(fā)明的修飾型TM2蛋白質(zhì)顯示對(duì)核酸和/或蛋白質(zhì)的低的非特異性結(jié)合。具體地，在實(shí)施例1的1-11)中顯示了針對(duì)DNA的非特異性結(jié)合降低。而且，實(shí)施例1的1-9)中顯示血清蛋白質(zhì)的非特異吸附性降低。在K26、K73、K141的位置上發(fā)生突變，均減少至野生型TM2的6成左右；而R104-K141 (R104和K141這兩個(gè)位置發(fā)生突變)甚至減少至TM2的2成多。與此相對(duì)，對(duì)于抗生物素蛋白的堿性氨基酸變體，雖然有報(bào)告稱對(duì)DNA或細(xì)胞的非特異性結(jié)合降低(Marttila等，(2000)FEBS, 467，p.31-36)，但對(duì)血清蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合的這樣的大幅降低還未見報(bào)告。
[0124]此外，對(duì)于本發(fā)明的低pi型修飾TM2，考察了與纖連蛋白之間的結(jié)合性，發(fā)現(xiàn)其大幅降低。纖連蛋白是存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的細(xì)胞粘附分子，特別是在對(duì)血漿、血清中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其會(huì)成為噪聲的原因之一。因此，希望與纖連蛋白之間的結(jié)合少。如實(shí)施例1的1-10)所示，與TM2相比，任何一種變體的纖連蛋白結(jié)合量均減少。特別是，就K141、R104-K141而言，結(jié)合量顯著減少至野生型TM2結(jié)合量的I成~2成。而且，pi值與纖連蛋白結(jié)合能力之間的關(guān)系是此前未知的，實(shí)際上未發(fā)現(xiàn)Pl值與纖連蛋白減少程度明確相關(guān)。考慮到這一點(diǎn)，K141 、R104-K141的變體的纖連蛋白結(jié)合量的減少非常之大，達(dá)到了意料不到的顯著。
[0125]纖連蛋白結(jié)合減少的本發(fā)明的優(yōu)選修飾TM2的一例是，將TM2氨基酸序列的141位的賴氨酸殘基修飾成酸性氨基酸或中性氨基酸而得到的修飾TM2。更優(yōu)選修飾成疏水性指數(shù)為2以下的酸性氨基酸或中性氨基酸而得到的修飾TM2。更優(yōu)選E (谷氨酸)或D (天冬氨酸)，其中最優(yōu)選E。
[0126]或者，纖連蛋白結(jié)合減少的其它修飾TM2是，將R104和K141這兩個(gè)氨基酸殘基同時(shí)修飾成酸性氨基酸或中性氨基酸而得到的修飾TM2。更優(yōu)選修飾成疏水性指數(shù)為2以下的酸性氨基酸或中性氨基酸而得到的修飾TM2，更優(yōu)選E (谷氨酸)或D (天冬氨酸)，其中最優(yōu)選E。
[0127]牛.物素結(jié)合倉R力提高的{I條飾tamavidin
[0128]TM2與生物素之間的結(jié)合速度常數(shù)(ka)是9.19 X IO5 (MH，解離速度常數(shù)(kd)是e.SSXlO—U)，解離常數(shù)(KD)是7.43X10_12(M)，TM2非常強(qiáng)烈地結(jié)合生物素。針對(duì)作為其它生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的鏈霉菌抗生物素蛋白進(jìn)行了同樣的測(cè)定，結(jié)果ka是
2.28 X IO6 (MU，kd 是 2.52 X I(T6 (s_1)，KD 是 L 11 X 1(T12 (M)。即，與鏈霉菌抗生物素蛋白相比，ΤΜ2與生物素之間的結(jié)合力處于同一數(shù)量級(jí)，但稍弱(W02008/081938A1)。在希望生物素結(jié)合蛋白與生物素更快結(jié)合或更多結(jié)合的情況下，需要具有更高的生物素結(jié)合能力。
[0129]發(fā)明人等對(duì)ΤΜ2的氨基酸殘基進(jìn)行修飾，成功制作了針對(duì)原本就具有高生物素結(jié)合能力的野生型ΤΜ2進(jìn)一步提高了生物素結(jié)合能力的高親和性型修飾ΤΜ2。本發(fā)明的高親和性型TM2是在TM2的SEQ ID NO: 2的氨基酸序列中、至少40位的天冬氨酸殘基(D40)發(fā)生突變而得到的。突變后的氨基酸優(yōu)選為N(天冬酰胺)。
[0130]D40的修飾可以與前述的用于降低非特異性結(jié)合的R104、K141、K26和/或K73的修飾組合進(jìn)行(實(shí)施方式6)，或者也可以單獨(dú)進(jìn)行(實(shí)施方式11)。如實(shí)施例2和3所示，與野生型TM2相比，D40經(jīng)修飾的修飾TM2顯示顯著地高的生物素結(jié)合能力。
[0131]非特異性結(jié)合降低、且生物素結(jié)合能力提高的修飾tamavidin
[0132]制作將上述的“非特異性結(jié)合降低的修飾tamavidin”和“生物素結(jié)合能力提高的修飾tamavidin”中的氨基酸突變組合而成的修飾tamavidin時(shí),得到了非特異性結(jié)合降低、生物素結(jié)合能力提高的修飾tamavidin。這樣的修飾tamavidin是包含TM2氨基酸序列的K26、K73、R104、K141中的至少一個(gè)氨基酸殘基的突變、且D40的氨基酸殘基突變成N而得到的修飾TM2蛋白質(zhì)(實(shí)施方式6)。
[0133]K26、K73、R104、K141突變后的氨基酸是酸性氨基酸或中性氨基酸，優(yōu)選疏水性指數(shù)(hydropathy index:Kyte and Doolittle, J.Mol.Biol., 157, 105-132 (1982))為 2 以下的酸性氨基酸或中性氨基酸。K26的位置上更優(yōu)選A (丙氨酸)、K73的位置上更優(yōu)選Q (谷氨酰胺)、R104的位置上更優(yōu)選E (谷氨酸)或D (天冬氨酸)、Κ141的位置上更優(yōu)選E (谷氨酸)或D (天冬氨酸)；而R104的位置上更優(yōu)選Ε，Κ141的位置上更優(yōu)選Ε。
[0134]對(duì)于同時(shí)進(jìn)行了 R104與D40的修飾而得到的修飾tamavidin,可見親和性提高和蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合的降低(實(shí)施例3的3-7)和3-9))。
[0135]此外，對(duì)于同時(shí)修飾了 R104、K141、D40而得到的修飾tamavidin，觀察到了等電點(diǎn)的降低、親和性提 高、蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合的降低、纖連蛋白結(jié)合性的降低以及核酸非特異性結(jié)合的降低(實(shí)施例3的3-6)、3-7)、3-9)、3-10)和3_11)。而且，令人驚訝的是，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性大幅提高(實(shí)施例3的3-8))。
[0136]因此，優(yōu)選同時(shí)對(duì)D40和R104氨基酸殘基進(jìn)行修飾，更優(yōu)選同時(shí)對(duì)D40、R104和K141進(jìn)行修飾。
[0137]如以上，優(yōu)選本發(fā)明的修飾型TM2可以選自下組，但不限于此:
[0138]在SEQ ID N0:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、且104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白(D40N-R104E)；
[0139]在SEQ ID NO:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白(D40N-K141E);以及
[0140]在SEQ ID NO:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白(D40N-R104E-K141E)。
[0141]本發(fā)明的修飾TM2蛋白質(zhì)的優(yōu)選實(shí)施方式具有例如SEQ ID NO:8、10、16、20、22、24以及25中的任何一個(gè)氨基酸序列。
[0142]更優(yōu)選D40N-R104E、D40N-K141E 或 D40N-R104E-K141E，最優(yōu)選D40N-R104E-K141E。
[0143]本申請(qǐng)發(fā)明的修飾型TM2蛋白質(zhì)優(yōu)選滿足以下性質(zhì)中的一個(gè)直至全部:
[0144]i)與由SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)相比，具有低的等電點(diǎn)；
[0145]ii)與由SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)相比，顯示對(duì)核酸和/或蛋白質(zhì)的低的非特異性結(jié)合；
[0146]iii)與由SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)相比，顯示低的纖連蛋白結(jié)合性；
[0147]iv)與由SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)相比，顯示高的生物素結(jié)合性。
[0148] 關(guān)于i)，野生型TM2的等電點(diǎn)是約8.5-8.8。本發(fā)明的修飾TM2的等電點(diǎn)優(yōu)選是8.0以下，更優(yōu)選是7.7以下。
[0149]關(guān)于iii)，設(shè)野生型TM2對(duì)纖連蛋白的結(jié)合性為1.3~1.4的情況下，本發(fā)明的修飾TM2的纖連蛋白結(jié)合性優(yōu)選是1.0以下、更優(yōu)選0.7以下、0.25以下、0.15以下。
[0150]希望在本發(fā)明的修飾TM2中未進(jìn)行修飾的氨基酸殘基
[0151]關(guān)于本發(fā)明的修飾TM2中的氨基酸殘基的修飾，需要不影響生物素結(jié)合能力。另一方面，作為生物素結(jié)合蛋白之一的鏈霉菌抗生物素蛋白的生物素口袋(pocket)已經(jīng)闡明。該鏈霉菌抗生物素蛋白與TM2之間的氨基酸序列同源性僅為50%左右，但發(fā)明人等為了獲得關(guān)于TM2的生物素口袋的認(rèn)識(shí)，將TM2與鏈霉菌抗生物素蛋白的氨基酸序列進(jìn)行了并列比較。于是發(fā)現(xiàn):形成鏈霉菌抗生物素蛋白的生物素口袋的氨基酸中的、與生物素直接相互作用的殘基 N23、S27、Y43、S45、N49、W79、S88、T90、W92、W108、W120、D128 (Weber 等，(1989) Science243:85-88,Livnah 等，(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.90:5076-5080)，在 TM2 中分別相當(dāng)于 N14、S18、Y34、S36、D40、W69、S76、T78、W80、W96、W108、D116,是非常保守的。
[0152]唯一的例外是，鏈霉菌抗生物素蛋白的49位的N(天冬酰胺)在TM2中是40位的D (天冬氨酸)，正如所述，將其修飾成與鏈霉菌抗生物素蛋白相同的天冬酰胺而得到的D40N TM2的生物素結(jié)合能力提高。由這些結(jié)果可以認(rèn)為，TM2與鏈霉菌抗生物素蛋白的生物素結(jié)合口袋具有非常相似的結(jié)構(gòu)，這些氨基酸殘基在很大程度上參與了生物素結(jié)合。
[0153]特別是，4個(gè)色氨酸殘基(W69、W80、W96、W108)被認(rèn)為對(duì)生物素口袋的結(jié)構(gòu)起著重要的作用，因而希望不進(jìn)行修飾。另一方面，被認(rèn)為參與與生物素的結(jié)合的其它氨基酸，即被認(rèn)為在TM2中與生物素直接相互作用的氨基酸殘基(N14、S18、Y34、S36、S76、T78、D116)，也希望不進(jìn)行修飾?；蛘?，在對(duì)這些氨基酸進(jìn)行修飾時(shí)，希望修飾成性質(zhì)或者結(jié)構(gòu)類似的氨基酸，以能夠維持與生物素的結(jié)合。例如，對(duì)于天冬酰胺(N14)，希望修飾成谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)，優(yōu)選天冬氨酸；對(duì)于天冬氨酸(D40)，希望修飾成天冬酰胺(N);對(duì)于絲氨酸(S18、S36、S76)，希望修飾成蘇氨酸(T)或者酪氨酸(Y)，優(yōu)選蘇氨酸；對(duì)于酪氨酸(Y34)，希望修飾成絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)或者苯丙氨酸(F)，優(yōu)選苯丙氨酸；對(duì)于蘇氨酸(T78)，希望修飾成絲氨酸(S)、酪氨酸(Y)，優(yōu)選絲氨酸；對(duì)于天冬氨酸(Dl 16)，希望修飾成谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)，優(yōu)選天冬酰胺。
[0154]氨基酸的修飾方法
[0155]用于對(duì)TM2的氨基酸進(jìn)行修飾來獲得本發(fā)明的修飾TM2的方法，可以采用公知的對(duì)氨基酸序列實(shí)施突變的方法，對(duì)其沒有特殊限制。優(yōu)選對(duì)編碼TM2的核酸的堿基序列實(shí)施修飾，來進(jìn)行修飾。
[0156]例如，為了對(duì)氨基酸序列的特定位置的氨基酸進(jìn)行修飾，可以列舉出例如利用PCR的方法(Higuchi等(1988), Ho ^ (1989))。即，通過利用包含目標(biāo)突變的錯(cuò)配密碼子的引物進(jìn)行PCR，制作編碼目的變體的DNA并使之表達(dá)，能夠得到目的變體。
[0157]另外，氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的變體可以通過對(duì)編碼野生型蛋白質(zhì)的DNA實(shí)施例如作為公知技術(shù)的定點(diǎn)誘變(例如參見Nucleic Acid Research, Vol.10,N0.20，p.6487-6500，1982，通過引用將其全文引入到本說明書中)而產(chǎn)生。就定點(diǎn)誘變方法而言，例如，除希望的變異即特定的不一致之外，還可以使用與要突變的單鏈?zhǔn)删wDNA互補(bǔ)的合成寡核苷酸引物按如下方式進(jìn)行。即，使用上述合成寡核苷酸作為引物合成與噬菌體互補(bǔ)的鏈，用得到的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌的培養(yǎng)物鋪在瓊脂上，由含噬菌體的單個(gè)細(xì)胞形成噬菌斑。這樣，理論上有50%的新菌落含有單鏈形式的具有突變的噬菌體，其余的50%攜帶原序列。在下述溫度下，使獲得的噬菌斑與通過激酶處理而標(biāo)記的合成探針雜交，所述溫度下所述探針與和帶有目的突變的DNA完全一致的噬菌斑雜交，而不與攜帶原有鏈的噬菌斑雜交。然后，收集與該探針雜交的噬菌斑，進(jìn)行培養(yǎng)，回收DNA。
[0158]編碼修飾tamavidin2 (TM2)蛋白質(zhì)的核酸
[0159]本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的修飾型TM2的核酸。這樣的核酸的堿基序列是將TM2的堿基序列(SEQ ID NO:1)修飾成編碼修飾型TM2蛋白質(zhì)的修飾氨基酸的堿基序列而得到的。被修飾的堿基序列只要是編碼修飾后氨基酸的堿基序列即可，對(duì)其沒有限制。例如包括:為了對(duì)由SEQ ID NO:1的堿基序列組成的核酸，或與其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的核酸(以下稱作“TM2基因”)實(shí)施本發(fā)明的修飾，而對(duì)堿基序列進(jìn)行修飾而得到的。
[0160]本發(fā)明的核酸優(yōu)選編碼SEQ ID N0:8、10、16、20、22、24以及25中的任何一個(gè)氨基酸序列。更優(yōu)選編碼氨基酸序列22或24。本發(fā)明的核酸優(yōu)選由SEQ ID NO:7、9、15、19、21以及23的核酸序列組成。更優(yōu)選由SEQID NO:21或23的核酸序列組成。
[0161]包含發(fā)明的核酸的載體
[0162]此外，本發(fā)明提供包含編碼修飾TM2蛋白質(zhì)的核酸的載體。優(yōu)選用于表達(dá)修飾TM2蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。
[0163]編碼本發(fā)明的修飾TM2蛋白質(zhì)的核酸如上述“編碼修飾tamavidin蛋白質(zhì)的核酸”中所述，沒有特殊限制。
[0164]而且，編碼修飾TM2蛋白質(zhì)的核酸的一端或兩端可以具有限制酶識(shí)別位點(diǎn)或aatBl、aatB2、aatB3等Gateway系統(tǒng)(Invitrogen公司)中使用的序列等，此外修飾TM2蛋白質(zhì)編碼核酸的上游可以配置在希望的宿主中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子，或者其下游可以配置終止子。
[0165]而且，對(duì)于限制酶識(shí)別位點(diǎn)的種類沒有特殊限制，但優(yōu)選在表達(dá)載體中其是唯一的識(shí)別位點(diǎn)。對(duì)識(shí)別位點(diǎn)的數(shù)量沒有特殊限制，可以是I個(gè)或2個(gè)以上，優(yōu)選10個(gè)以下。
[0166]而且，限制酶位點(diǎn)、aatB序列與修飾TM2核酸的堿基序列之間可以配置編碼I個(gè)氨基酸以上、優(yōu)選5個(gè)氨基酸以上、更優(yōu)選10個(gè)氨基酸以上、更優(yōu)選25個(gè)氨基酸以上且50個(gè)氨基酸以下的接頭氨基酸序列(對(duì)其沒有特殊限制，可以是富含甘氨酸、絲氨酸的序列等本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的序列)的核酸序列，此外，并非特殊限制，還可以配置例如編碼諸如腸激酶、Factor Xa等蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)的序列。
[0167]此外,在將例如scFv、Fab等抗體基因插入該表達(dá)載體的情況下,在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部這樣的還原條件不適合融合蛋白質(zhì)的表達(dá)時(shí)，在啟動(dòng)子與由用于插入編碼修飾tamavidin的核酸序列構(gòu)成的單元之間，可以包含編碼諸如信號(hào)肽、分泌信號(hào)等前導(dǎo)肽的核酸序列。
[0168]本發(fā)明的載體優(yōu)選是表達(dá)載體。表達(dá)載體除了具有這樣的表達(dá)單元之外，還可以具有用于能夠在希望的宿主中進(jìn)行復(fù)制的單元例如具有復(fù)制起點(diǎn)，或者還可以具有用于選擇希望的宿主細(xì)胞的藥物抗性標(biāo)記基因。對(duì)于宿主沒有特殊限制，優(yōu)選是大腸桿菌。此外，該表達(dá)載體中還可以組合入例如大腸桿菌中的乳糖阻遏物系統(tǒng)這樣的合適的表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。
[0169]固定化有修飾tamavidin的載體
[0170]本發(fā)明提供固定化有本發(fā)明的修飾TM2蛋白質(zhì)的載體。
[0171]構(gòu)成的載體的材料可以使用公知材料。包括例如纖維素、特氟隆、硝酸纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白質(zhì)(白蛋白等)、碳或它們的組合，但不限于此。此外，優(yōu)選具有一定強(qiáng)度、組成穩(wěn)定、且非特異性結(jié)合少的載體。
[0172]固體載體的形狀包括但不限于:珠子、磁珠、薄膜、微細(xì)管、濾膜、平板、微量板、碳納米管、傳感器芯片等。正如本【技術(shù)領(lǐng)域】公知的那樣，薄膜或平板等平坦的固體載體上可以設(shè)置凹坑、溝槽、濾膜底部等。 [0173]在本發(fā)明的一類實(shí)施方式中，珠子可以具有約25nm~約Imm范圍的球體直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，珠子具有約50nm~約ΙΟμπι范圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據(jù)特定的用途來進(jìn)行選擇。數(shù)種細(xì)菌孢子具有約I μ m數(shù)量級(jí)的尺寸，因此用于捕捉這些孢子的優(yōu)選珠子具有大于Iym的直徑。
[0174]對(duì)于蛋白質(zhì)針對(duì)載體的結(jié)合沒有特殊限制，可以使用使蛋白質(zhì)結(jié)合于載體的公知方法。具體的結(jié)合方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)載體的種類等適宜選擇。
[0175]發(fā)明的效果
[0176]根據(jù)本發(fā)明，能夠提供:在保持tamavidin的生物素結(jié)合能力高的特性的同時(shí),性能提升的修飾型生物素結(jié)合蛋白，所述性能提升是指非特異性結(jié)合性降低和/或進(jìn)一步的生物素結(jié)合提高。通過利用這些修飾tamavidin，能夠在利用了抗生物素蛋白_生物素結(jié)合的用于測(cè)定檢測(cè)對(duì)象的檢測(cè)方法例如免疫測(cè)定、核酸雜交測(cè)定中，謀求降低背景、提高靈敏度、保持惡劣環(huán)境(高溫、變性劑、酶存在下等)中的生物素結(jié)合性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0177]圖1顯示了本發(fā)明的低pi型修飾TM2蛋白質(zhì)對(duì)于血清蛋白質(zhì)固定化磁珠的非特異性結(jié)合性。**P〈0.01對(duì)ΤΜ2
[0178]圖2顯示了本發(fā)明的低pi型修飾ΤΜ2蛋白質(zhì)對(duì)于纖連蛋白的非特異性結(jié)合性。*p〈0.01 對(duì) ΤΜ2
[0179]圖3顯示了本發(fā)明的低pi型修飾ΤΜ2蛋白質(zhì)對(duì)DNA的非特異性結(jié)合性。
[0180]圖4中考察了血清蛋白質(zhì)針對(duì)固定化有本發(fā)明的低非特異性結(jié)合-高親和性型ΤΜ2蛋白質(zhì)的磁珠的非特異吸附性。*ρ〈0.1對(duì)ΤΜ2
[0181]圖5顯示了本發(fā)明的低非特異性結(jié)合-高親和性型ΤΜ2蛋白質(zhì)對(duì)纖連蛋白的非特異性結(jié)合性。*ρ〈0.01對(duì)ΤΜ2[0182]圖6顯示了本發(fā)明的低非特異性結(jié)合-高親和性型TM2蛋白質(zhì)對(duì)DNA的非特異性結(jié)合性。圖6的上、中、下分別顯示了野生型TM2、TM2R104EK141E、TM2D40NR104EK141E的結(jié)
果O
實(shí)施例
[0183]以下，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明，但這些并不是對(duì)本發(fā)明的技術(shù)范圍的限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于本說明書的記載容易地對(duì)本發(fā)明加以修飾、變更，這些也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
[0184]實(shí)施例1低Dl型TM2的構(gòu)律與分析
[0185]1-1)低Dl型TM2的構(gòu)律
[0186]以降低TM2的等電點(diǎn)為目的，將TM2中的堿性氨基酸殘基取代成中性氨基酸或酸性氨基酸，構(gòu)建了以下的7個(gè)修飾體。
[0187](1)將26位的賴氨酸取代成丙氨酸的TM2 (以下稱作“TM2K26A”，堿基序列SEQ IDNO:3，氨基酸序列 SEQ ID NO:4)；
[0188](2)將73位的賴氨酸取代成谷氨酰胺的TM2(以下稱作“TM2K73Q”，堿基序列為SEQ ID NO:5，氨基酸序列為 SEQ ID NO:6)；
[0189](3)將104位的精氨酸取代成谷氨酸的TM2(以下稱作“TM2R104E”，堿基序列為SEQ ID NO:7，氨基酸序列為 SEQ ID NO:8)；
[0190](4) 141位的賴氨酸突變成谷氨酸的TM2(以下稱作“TM2K141E”，堿基序列為SEQID NO:9，氨基酸序列為 SEQ ID NO: 10)；
[0191](5)具有33位的賴氨酸一蘇氨酸的取代和37位的賴氨酸一丙氨酸的取代的TM2(以下稱作“TM2K33TK37A”，堿基序列為SEQ ID NO: 11，氨基酸序列為SEQ ID NO: 12)；
[0192](6)具有33位的賴氨酸一蘇氨酸的取代、37位的賴氨酸一丙氨酸的取代以及104位的精氨酸一谷氨酸的取代的TM2(以下稱作“TM2K33TK37AR104E”，堿基序列為SEQ IDNO: 13，氨基酸序列為SEQ ID NO: 14);以及
[0193](7)具有104位的精氨酸一谷氨酸的取代和141位的賴氨酸一谷氨酸的取代的TM2(以下稱作“TM2R104EK141E”，堿基序列為SEQ ID NO: 15，氨基酸序列為SEQ ID NO: 16)。
[0194](8)將19位的賴氨酸取代成蘇氨酸的TM2 (以下稱作“TM2K19T”，堿基序列為SEQID NO: 17，氨基酸序列為 SEQ ID NO: 18)；
[0195]R104E的Ε、K33TK37A的T和A是通過TM2與鏈霉菌抗生物素蛋白的氨基酸序列比較，參考鏈霉菌抗生物素蛋白序列上的該部分的氨基酸確定的。此外，K141E的E是參考tamavidinl序列上的該部分的氨基酸確定的。
[0196]首先，為了構(gòu)建低pi型TM2，設(shè)計(jì)了用于導(dǎo)入各突變的引物。設(shè)計(jì)了由TM2基因的5’部分及在其上游編碼Pci I限制酶切割位點(diǎn)(ACATGT)的序列構(gòu)成的引物Tm2NtermPC1、以及由TM2基因的3’部分及在其下游編碼BamH I限制酶切割位點(diǎn)(GGATCC)的序列構(gòu)成的引物Tm2CtermBam。針對(duì)各變體的包含錯(cuò)配密碼子的一系列有義引物和反義引物分別如下(SEQ ID NO:26-37)。
[0197]表1低pi型TM2構(gòu)建用引物
[0198][表 I][0199]
【權(quán)利要求】
1.一種修飾型生物素結(jié)合蛋白，其選自: (1)SEQID NO:2的40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2D40N)； (2)在SEQID NO:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、且104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2D40N-R104E);以及 (3)在SEQID NO:2中，40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基的修飾型生物素結(jié)合蛋白(TM2D40N-R104E-K141E)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸。
3.包含權(quán)利要求2所述核酸的載體。
4.固定化有權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的載體。
【文檔編號(hào)】C12N15/31GK103923195SQ201410186634
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2009年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2008年8月13日
【發(fā)明者】高倉由光, 市川雅子 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社