專利名稱：生物素修飾稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物素修飾無機(jī)納米材料的制備方法，尤其是涉及一種生物素修飾稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒的制備方法。
背景技術(shù)：
近年來稀土摻雜的無機(jī)熒光納米顆粒以其較高的物理化學(xué)穩(wěn)定性、優(yōu)異的發(fā)光性能等特點(diǎn)而受到人們的重視，被廣泛應(yīng)用于信息顯示、綠色照明、生物標(biāo)記、太陽能電池等領(lǐng)域。尤其是在應(yīng)用于生物標(biāo)記時，相比于目前常用的熒光染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)，由于無機(jī)稀土納米發(fā)光材料具有發(fā)光效率高、毒性低、線寬窄、熒光壽命長和發(fā)射波長可調(diào)諧等綜合優(yōu)勢，是目前普遍被看好的新一代熒光生物標(biāo)記材料。而在生物標(biāo)記和免疫分析領(lǐng)域， 生物素(biotin)和親和素(avidin)或鏈霉親和素(streptavidin)的高親和力(結(jié)合常數(shù)& = IO15M-1)使兩者可在較低的濃度下快速結(jié)合并保持復(fù)合體的穩(wěn)定，此結(jié)合過程幾乎是不可逆的。以生物素和親和素具有的獨(dú)特結(jié)合特性為基礎(chǔ)，結(jié)合二者即可偶聯(lián)抗原抗體等生物活性物質(zhì)進(jìn)行檢測，此種特性使生物素-親和素系統(tǒng)成為近年來發(fā)展迅速的一門生物分析系統(tǒng)。因此，將稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒與生物素-親和素系統(tǒng)結(jié)合起來有利于進(jìn)行靈敏、高效的生物標(biāo)記檢測甚至生物成像，這一領(lǐng)域也越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。 而進(jìn)行該領(lǐng)域研究的基礎(chǔ)就是如何將生物素或者親和素連接到納米顆粒表面，目前已有的研究成果通常是采用I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)為交聯(lián)劑，在緩沖溶液的“水相”環(huán)境中進(jìn)行生物素和表面含有氨基或羧基等官能團(tuán)的無機(jī)納米顆粒的連接，在這一連接過程中，生物素、親和素和納米顆粒在緩沖溶液中的溶解度是影響反應(yīng)產(chǎn)率的重要因素；同時EDC還存在中間產(chǎn)物水解的問題，這些都限制了這一連接反應(yīng)的產(chǎn)率。(參考文獻(xiàn)Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2nd edition, Academic Press,Inc. , (2008) ；Chun-Hua Yan et al,J.Phys. Chem. C, Vol. 112, No. 17,6589-6593, (2008))。本發(fā)明采取有機(jī)反應(yīng)中酰胺合成常用的“固相合成法”，使用苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)為縮合劑以及N，N- 二異丙基乙胺(DIEA)為活化劑，在無水N，N-二甲基甲酰胺的“油相”溶劑中，將生物素的羧基進(jìn)行活化，然后與納米顆粒的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，可以成功實(shí)現(xiàn)對多種無機(jī)納米顆粒的生物素修飾，體現(xiàn)出了本方法的廣泛適用性。通過該方法制備的生物素修飾稀土摻雜無機(jī)熒光納米晶，可以與親和素進(jìn)行迅速而穩(wěn)定的連接，同時利用納米顆粒內(nèi)摻雜的稀土離子的特定發(fā)光對這一連接進(jìn)行響應(yīng)，即可應(yīng)用于異相或均相熒光免疫分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種使稀土摻雜無機(jī)納米晶表面修飾生物素的制備方法。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案I. 一種稀土摻雜無機(jī)納米晶表面修飾生物素的制備方法。其特征在于稱量苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)和N，N_ 二異丙基乙胺(DIEA)以及生物素，在無水N，N-二甲基甲酰胺的“油相”溶劑中，將生物素的羧基進(jìn)行活化，然后與納米顆粒的氨基反應(yīng)數(shù)小時后形成酰胺鍵，然后用N，N-二甲基甲酰胺和去離子水洗滌反應(yīng)產(chǎn)生的納米顆粒多次，在真空干燥箱中干燥，即得到表面修飾生物素的稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒。2. 一種如項(xiàng)I所述的生物素修飾稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒的制備方法，其特征在于反應(yīng)物的加入摩爾量比例納米顆粒I份；苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯1 5份；N, N- 二異丙基乙胺1 10份；生物素O. 5 5份。3. 一種采取如項(xiàng)I和2所述的制備方法，所采用的稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒，所摻雜的稀土兀素為Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb,納米顆粒表面為氨基。4.為了證實(shí)如項(xiàng)I和2所述的稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒表面進(jìn)行生物素修飾的制備方法的可行性，本發(fā)明選取稀土摻雜氟化釔鈉(NaYF4)納米顆粒和氟化釓(GdF3)納米顆粒為實(shí)施例子，本發(fā)明具有廣泛適用性，并非僅限于以上兩個實(shí)施例子。5.稀土摻雜無機(jī)納米顆粒修飾生物素的檢測與驗(yàn)證。通過傅立葉變換紅外光譜檢測表明，在經(jīng)過HBTU/DIEA的作用，納米顆粒表面修飾生物素后，產(chǎn)生了兩個新的紅外振動吸收峰dZncnT1和1153CHT1，這是對應(yīng)于生物素的C-N振動吸收峰；同時納米顆粒對應(yīng)于氨基的N-H的振動吸收峰1635CHT1消失，產(chǎn)生了一個新的吸收峰1685CHT1，這是酰胺鍵中 C = O的振動吸收峰，說明顆粒表面的氨基已經(jīng)與生物素的羧基發(fā)生反應(yīng)生成了酰胺鍵，即生物素已經(jīng)被成功連接到納米顆粒表面。另外，將修飾前的GdF3納米顆粒與按照如項(xiàng)I和2所述的方法制備好的表面修飾生物素的GdF3納米顆粒分別溶解于磷酸鹽緩沖液中，向其中加入相同量的連接了羅丹明異硫氰酸酯的親和素(Avidin-RhBITC)，培養(yǎng)一段時間后離心分離，用磷酸鹽緩沖液清洗數(shù)次，再將清洗后的納米顆粒分別溶解于磷酸鹽緩沖液中，在熒光讀板機(jī)上進(jìn)行測試。未修飾生物素的GdF3納米顆粒由于其只能在表面吸附少量的熒光染料RhBITC，溶液對應(yīng)的發(fā)射峰強(qiáng)度也較弱；而修飾有生物素的GdF3納米顆粒可以通過Biotin-Avidin反應(yīng)連接上 RhBITC，其溶液可以檢測到對應(yīng)于RhBITC的較強(qiáng)的發(fā)射峰。6. 一種采用如項(xiàng)I和2所述的制備方法所得到的生物素修飾的稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒的用途，其特征在于用于生物標(biāo)記和免疫分析。將親和素溶解于碳酸鹽緩沖液中，并稀釋成不同濃度加入到高親和性的96微孔板中，培養(yǎng)一段時間使親和素通過物理吸附標(biāo)記到微孔板上，然后用碳酸鹽緩沖液清洗數(shù)次以除去游離的親和素，接著將已制備的生物素標(biāo)記的納米顆粒溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，取相同體積相同濃度的納米顆粒溶液加入到標(biāo)記不同濃度親和素的微孔內(nèi)，培養(yǎng)一段時間后用磷酸緩沖液清洗數(shù)次，在熒光讀板機(jī)上進(jìn)行光譜檢測。由于納米顆粒表面已經(jīng)修飾上了生物素，在熒光讀板機(jī)上進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示隨著微孔板標(biāo)記的親和素濃度的增大，所連接到的表面修飾有生物素的納米顆粒越多，檢測到對應(yīng)的稀土離子熒光強(qiáng)度也越大，親和素濃度與熒光強(qiáng)度之間存在著較好的線性關(guān)系， 說明利用納米顆粒的熒光可以檢測親和素或親或素偶聯(lián)的蛋白質(zhì)濃度，這一檢測可以達(dá)到較高的靈敏度，其極限可達(dá)到nM，表明了這種生物素標(biāo)記的熒光納米顆粒應(yīng)用于生物標(biāo)記領(lǐng)域的前景。通過本發(fā)明制備的生物素標(biāo)記稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒，制備過程簡單、重復(fù)性好。本發(fā)明與目前國內(nèi)外通常采用的在水溶液中進(jìn)行生物素修飾納米晶的方法相比，由于反應(yīng)在“油相”溶劑中進(jìn)行，對顆粒及生物素的水溶性要求較低，同時避免了中間產(chǎn)物的水解，因而反應(yīng)產(chǎn)率較高。我們得到的這種生物素修飾的稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒，可以與親和素進(jìn)行迅速而穩(wěn)定的連接，同時納米顆粒內(nèi)摻雜的稀土離子特征發(fā)光也可對這一連接進(jìn)行靈敏的響應(yīng)，表明了通過這一方法制備得到的材料應(yīng)用于生物標(biāo)記領(lǐng)域的潛力。


附圖I : (a)生物素與氨基化的納米顆粒在HBTU/DIEA作用下結(jié)合的反應(yīng)機(jī)理。附圖2 (a)未經(jīng)修飾的與(b)生物素修飾后的NaYF4:5% Ce,5% Tb納米顆粒在水溶液中的熒光光譜及發(fā)光照片。附圖3 : (a)未經(jīng)修飾的與(b)生物素修飾后的NaYF4:20% Yb, 2% Er納米顆粒的傅里葉變換紅外光譜。附圖4 (a)未經(jīng)修飾的與(b)生物素修飾后的GdF3納米顆粒與Avidin-RhBITC反應(yīng)后的熒光光譜。附圖5 :生物素修飾后的納米顆粒對親和素進(jìn)行熒光檢測的步驟。附圖6 :生物素修飾后的NaYF4:20% Yb，2% Er納米顆粒與標(biāo)記在微孔板上的不同濃度親和素連接后的熒光測試分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所提供的生物素標(biāo)記稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒的制備方法，其實(shí)質(zhì)特點(diǎn)和顯著優(yōu)點(diǎn)可以通過以下實(shí)施例子進(jìn)一步予以證實(shí)，但本發(fā)明并非僅限于實(shí)施例子。實(shí)例I :NaYF4:5% Ce, 5 % Tb納米顆粒表面連接生物素的制備。稱取30mg苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)以及30mg生物素溶解于O. 9mL的N， N- 二甲基甲酰胺(DMF)，加入O. ImL的N，N- 二異丙基乙胺(DIEA)將生物素的羧基進(jìn)行活化12小時，然后加入30mg表面帶有氨基的NaYF4:5% Ce, 5% Tb納米顆粒，震蕩反應(yīng)12小時后，用DMF和去離子水洗滌反應(yīng)產(chǎn)生的納米顆粒多次，在真空干燥箱中干燥，即可得到表面修飾生物素的NaYF4:5% Ce, 5% Tb無機(jī)納米顆粒。實(shí)例2 =NaYF4:20% Yb, 2% Er納米顆粒表面連接生物素的制備。稱取75mg的HBTU 以及50mg生物素溶解于I. 8mL的DMF，加入O. 2mL的DIEA將生物素的羧基進(jìn)行活化8小時，然后加入50mg表面帶有氨基的NaYF4:20% Yb，2% Er納米顆粒，震蕩反應(yīng)8小時后，用 DMF和去離子水洗滌反應(yīng)產(chǎn)生的納米顆粒多次，在真空干燥箱中干燥，即可得到表面修飾生物素的NaYF4:20% Yb, 2% Er無機(jī)納米顆粒。實(shí)例3 =NaYF4Il % Dy納米顆粒表面連接生物素的制備。稱取IOmg的HBTU以及 20mg生物素溶解于O. 9mL的DMF，加入O. ImL的DIEA將生物素的羧基進(jìn)行活化24小時， 然后加入15mg表面帶有氨基的NaYF4:1 % Dy納米顆粒，震蕩反應(yīng)24小時后，用DMF和去離子水洗滌反應(yīng)產(chǎn)生的納米顆粒多次，在真空干燥箱中干燥，即可得到表面修飾生物素的NaYF4:1 % Dy無機(jī)納米顆粒。實(shí)例4 =GdF3:5% Tb納米顆粒表面連接生物素的制備。稱取50mg的HBTU以及50mg 生物素溶解于O. 8mL的DMFJpA O. 2mL的DIEA將生物素的羧基進(jìn)行活化10小時，然后加 A50mg表面帶有氨基的GdF3:5% Tb納米顆粒，震蕩反應(yīng)10小時后，用DMF和去離子水洗滌反應(yīng)產(chǎn)生的納米顆粒多次，在真空干燥箱中干燥，即可得到表面修飾生物素的GdF3:5% Tb無機(jī)納米顆粒。實(shí)例5 =GdF3:50 % Eu納米顆粒表面連接生物素的制備。稱取IOOmg的HBTU以及IOOmg生物素溶解于3mL的DMF，加入O. 3mL的DIEA將生物素的羧基進(jìn)行活化8小時， 然后加入20mg表面帶有氨基的GdF3:50 % Eu納米顆粒，震蕩反應(yīng)12小時后，用DMF和去離子水洗滌反應(yīng)產(chǎn)生的納米顆粒多次，在真空干燥箱中干燥，即可得到表面修飾生物素的 GdF3:50% Eu無機(jī)納米顆粒。實(shí)例6 :將Img親和素溶解于碳酸鹽緩沖液中，并稀釋成不同濃度加入到高清合性的96微孔板中，培養(yǎng)一段時間使親和素通過物理吸附標(biāo)記到微孔板上，接著用碳酸鹽緩沖液清洗數(shù)次以除去游離的親和素，然后將實(shí)例2中制備的生物素標(biāo)記的NaYF4:20% Yb,2% Er納米顆粒溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，取相同體積相同濃度的納米顆粒溶液加入到不同濃度親和素標(biāo)記的微孔內(nèi)，培養(yǎng)一段時間后用磷酸鹽緩沖液清洗數(shù)次，在980nm激發(fā)下，在熒光讀板機(jī)上進(jìn)行熒光光譜檢測。
權(quán)利要求
1.生物素修飾稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒的制備方法，其特征在于利用苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸酯以及N，N-二異丙基乙胺為活化劑，在無水N，N-二甲基甲酰胺的溶劑中，將生物素的羧基進(jìn)行活化，然后與納米顆粒的氨基反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒表面連接生物素。
2.如權(quán)利要求I的生物素修飾稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒的制備方法，其特征在于反應(yīng)物的加入摩爾量比例納米顆粒1份；苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯1 5份；N, N- 二異丙基乙胺1 10份；生物素0. 5 5份。
3.如權(quán)利要求I或2的生物素修飾稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒的制備方法，采用的稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒，所摻雜的稀土元素為Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、 Tm、Yb，納米顆粒表面為氨基。
4.如權(quán)利要求I或2的生物素修飾稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒的制備方法，其特征在于利用苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯以及N，N-二異丙基乙胺在無水 N, N-二甲基甲酰胺中使稀土摻雜氟化釔鈉納米顆粒表面進(jìn)行生物素修飾，納米顆粒組分為xLn3+-(I-x) NaYF4,其中 Ln3+ = Yb3+、Er3+、Tm3+、Ho3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+、Nd3+、pr3+, O < X ^ 50atom%。
5.如權(quán)利要求I或2的生物素修飾稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒的制備方法，其特征在于利用苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯以及N，N- 二異丙基乙胺在無水N，N-二甲基甲酰胺中使稀土摻雜氟化釓納米顆粒表面進(jìn)行生物素修飾，納米顆粒組分為yLn3+-(l-y)GdF3，其中 Ln3+ = Yb3+、Er3+、Tm3+、Ho3+、Eu3+、Tb3+、Dy3+、Sm3+、Nd3+、pr3+, O < X ^ 50atom%。
6.權(quán)利要求I或2的制備方法所得到的生物素修飾的稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒用于生物標(biāo)記和免疫分析。
全文摘要
本發(fā)明公開一種生物素修飾稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒的制備方法。利用苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)以及N，N-二異丙基乙胺(DIEA)為活化劑，在無水N，N-二甲基甲酰胺的溶劑中，將生物素的羧基進(jìn)行活化，然后與納米顆粒的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，從而實(shí)現(xiàn)稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆粒表面的生物素修飾。采用本方法制備的生物素修飾稀土摻雜無機(jī)熒光納米顆?？膳c親和素進(jìn)行迅速而穩(wěn)定的連接，同時由于納米顆粒內(nèi)摻雜的稀土離子特定發(fā)光可以對這一連接進(jìn)行靈敏的響應(yīng)，表明了通過這一制備方法得到的納米材料應(yīng)用于生物標(biāo)記和免疫分析領(lǐng)域的潛力。
文檔編號G01N33/53GK102604637SQ20121003046
公開日2012年7月25日 申請日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者劉永升, 周山勇, 朱浩淼, 李仁富, 涂大濤, 陳學(xué)元 申請人:中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所