專利名稱：經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)、其制備方法、及中間體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過與聚亞烷基二醇衍生物結(jié)合而被修飾的生物相關(guān)物質(zhì)、其制備方法、以及作為中間體的活性聚亞烷基二醇衍生物。
背景技術(shù)：
近來，已廣泛研究了大量的具有生理活性的蛋白質(zhì)、多肽、合成化合物、以及從自然資源提取的化合物，以及其在藥品中的應(yīng)用。然而，當(dāng)向體內(nèi)給藥時(shí)，這些生理活性物質(zhì)在血液內(nèi)具有較短的半衰期，因此很難獲得足夠的藥理效應(yīng)。這是因?yàn)檫@些進(jìn)入到體內(nèi)的生理活性物質(zhì)通常被腎中的腎小球過濾以及被肝和脾中的巨噬細(xì)胞攝取，而從體內(nèi)被清除。因此，試圖通過把這些生理活性物質(zhì)封入在脂質(zhì)體或聚合物微團(tuán)中或通過用聚乙二醇(其是兩親聚合物)進(jìn)行的化學(xué)修飾來增加其分子量從而改善在體內(nèi)的狀態(tài)。聚乙二醇由于空間排斥效應(yīng)，表現(xiàn)出較低的與其他生物成分的相互作用，因此，用聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)或酶等多肽，表現(xiàn)出以下效應(yīng)避免通過腎中的腎小球的過濾以及生物反應(yīng)如免疫反應(yīng)，以致它們比那些未修飾物質(zhì)在血液中獲得更長(zhǎng)的半衰期。此外，它們還具有降低的毒性和抗原性，并進(jìn)一步增強(qiáng)具有高疏水性的難溶化合物的溶解性。
至今，在用聚乙二醇修飾生理活性物質(zhì)的情況下，尤其是在修飾低分子量藥物或肽的情況下，出現(xiàn)這樣的問題很少的活性官能團(tuán)可以用于用聚乙二醇進(jìn)行的修飾。此外，當(dāng)為了獲得用聚乙二醇修飾的足夠效應(yīng)而用許多聚乙二醇分子來修飾肽或藥物時(shí)，肽或藥物的活性部位則被阻斷，因而可產(chǎn)生以下問題不能充分地表現(xiàn)出其自身的功能和功效并且在水中不可能獲得足夠的溶解度。
為了解決這類問題，已試圖利用支鏈聚乙二醇衍生物來減少用聚乙二醇修飾的數(shù)目。在特公昭61-42558號(hào)公報(bào)中披露了聚乙二醇修飾L-天冬酰胺酶。然而，作為活性聚乙二醇衍生物的原料的氰尿酰氯具有三個(gè)活性部位，因而很難在其中選擇性地引入兩個(gè)聚乙二醇鏈。因此，很難合成高純度聚乙二醇修飾L-天冬酰胺酶。
并且，在特開平10-67800號(hào)公報(bào)中披露了聚乙二醇修飾干擾素α。然而，此物質(zhì)具有三個(gè)尿烷和酰胺鍵，包括干擾素α和聚乙二醇氧基之間的鍵合。這些鍵在貯藏期間或在堿性條件下的反應(yīng)期間易于水解，因而產(chǎn)生以下問題支鏈聚乙二醇部分被分解成單鏈。這是因?yàn)?，通過某種方法已產(chǎn)生作為中間體材料的聚乙二醇衍生物，其中兩個(gè)單甲氧基聚乙二醇和賴氨酸的在α-位和ε-位氨基通過尿烷鍵結(jié)合，然后賴氨酸的羧基殘基被轉(zhuǎn)化成琥珀酰亞胺酯。此外，為了制備聚乙二醇修飾干擾素α，會(huì)產(chǎn)生以下問題由于經(jīng)過兩個(gè)單甲氧基聚乙二醇的末端羥基的活化作用、與賴氨酸的結(jié)合、賴氨酸的羧基殘基的活化作用、以及與干擾素α的結(jié)合等多個(gè)步驟而產(chǎn)生的雜質(zhì)多。
因此，希望開發(fā)由高度穩(wěn)定鍵形成的生物相關(guān)物質(zhì)、其制備方法、以及可以以簡(jiǎn)便方式和高純度制備并具有較高的穩(wěn)定性的支鏈活性聚亞烷基二醇衍生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供具有支鏈聚亞烷基二醇氧基的生物相關(guān)物質(zhì)，其由穩(wěn)定鍵形成并很難分解為單鏈；以及其制備方法。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供具有反應(yīng)基的聚亞烷基二醇衍生物，該反應(yīng)基可以在甘油骨架1位的伯碳與生物相關(guān)物質(zhì)結(jié)合，并在2位和3位具有聚亞烷基二醇鏈。
由于為解決上述問題而進(jìn)行廣泛研究的結(jié)果，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)一種新穎的具有支鏈聚亞烷基二醇氧基的生物相關(guān)物質(zhì)、其制備方法、以及作為其中間體的聚亞烷基二醇衍生物，因而完成本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)，其中在分子中結(jié)合有至少一個(gè)聚亞烷基二醇氧基，其由以下化學(xué)式(1)表示 (式中，R是具有1至24個(gè)碳原子的烴基，OA1和OA2各自為具有2至4個(gè)碳原子的氧化烯基，在一個(gè)分子中R和OA2是彼此相同或不同，n和m各自為加入的氧化烯基的摩爾的平均數(shù)，n表示0至1000，以及m表示10至1000。)此外，本發(fā)明涉及用于經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)的中間體，其由以下的化學(xué)式(2)表示
(式中，R、OA1、OA2、n、以及m和上述相同，而X表示能夠與生物相關(guān)物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)。)此外，本發(fā)明涉及制備經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)的方法，其中在分子中結(jié)合有至少一個(gè)由化學(xué)式(1)表示的聚亞烷基二醇氧基，包括上述中間體與生物相關(guān)物質(zhì)結(jié)合的步驟。
此外，本發(fā)明涉及作為化學(xué)式(2)的化合物的原料的化學(xué)式(p)的化合物以及其制備方法。
本發(fā)明的經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)是通過穩(wěn)定鍵形成并很難分解為單鏈。此外，本發(fā)明可以提供具有反應(yīng)基的聚亞烷基二醇衍生物，該反應(yīng)基可以在甘油骨架1位的伯碳與生物相關(guān)物質(zhì)結(jié)合，并在2位和3位具有聚亞烷基二醇鏈。


圖1說明OVA和被修飾OVA的聚丙烯酰胺凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖2是說明在化合物p-8的加速老化試驗(yàn)之前GPC測(cè)量的結(jié)果的圖。
圖3是說明在化合物p-8的加速老化試驗(yàn)之后GPC測(cè)量的結(jié)果的圖。
圖4是說明在化合物p-10的加速老化試驗(yàn)之前GPC測(cè)量的結(jié)果的圖。
圖5是說明在化合物p-10的加速老化試驗(yàn)之后GPC測(cè)量的結(jié)果的圖。
圖6是通過用化合物(p31)修飾Humanin獲得的化合物的電泳結(jié)果。
圖7是通過用化合物(p32)或(p35)修飾胰島素獲得的化合物的電泳結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)是將生物相關(guān)物質(zhì)與至少一個(gè)由上述化學(xué)式(1)表示的聚亞烷基二醇氧基結(jié)合的物質(zhì)。
在化學(xué)式(1)的聚亞烷基二醇氧基中R是具有1至24個(gè)碳原子的烴基，而具體的烴基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、庚基、2-乙基己基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、油基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基、二十四烷基、芐基、羥甲苯基、丁基苯基、以及十二烷基苯基，該烴基優(yōu)選為具有1至10個(gè)碳原子的烴基，更為甲基或乙基，最優(yōu)選為甲基。
OA1和OA2各自表示具有2至4個(gè)碳原子的氧化烯基。具體地說，包括氧化乙烯基、氧化丙烯基、氧化亞丙基、氧-1-乙基乙烯基、氧-1，2-二甲基乙烯基、以及氧化四亞甲基等。這些氧化烯基彼此可以相同或不同，并以任意形狀或塊狀加入。一般來說，碳原子越少，則親水性越高，該基團(tuán)優(yōu)選為氧化乙烯基或氧化丙烯基，更優(yōu)選為氧化乙烯基。m和n各自為加入的氧化烯基的摩爾平均數(shù)。m表示10至1000，優(yōu)選20至800，更優(yōu)選50至800，最優(yōu)選100至800。n表示0至1000，優(yōu)選0至500，更優(yōu)選0至200，最優(yōu)選0至50。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，n是0。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，n是1至50。在后一種情況下，n特別優(yōu)選為1至3。
用聚亞烷基二醇氧基對(duì)生物相關(guān)物質(zhì)的修飾數(shù)目并沒有特定限制，但優(yōu)選為1至100，更優(yōu)選為1至20。
本發(fā)明所說的“生物相關(guān)物質(zhì)”是指與生物有關(guān)的物質(zhì)。這些與生物有關(guān)的物質(zhì)包括以下物質(zhì)。
(1)磷脂、糖脂、以及糖蛋白等動(dòng)物細(xì)胞構(gòu)成材料動(dòng)物細(xì)胞構(gòu)成材料是構(gòu)成細(xì)胞膜等的成分，并不特別限制其種類，例如包括磷脂、糖脂、以及糖蛋白等。更具體的磷脂例如包括磷脂酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、心磷脂、磷脂酰絲氨酸、以及磷脂酰肌醇。此外，還包括其溶血甘油磷脂異構(gòu)體。這些磷脂可以是那些衍生自天然物質(zhì)的磷脂如蛋黃或大豆等，或可以是合成物。脂肪酸的成分并不特別限制但優(yōu)選包括具有12至22個(gè)碳原子的脂肪酸。這些脂肪酸可以是飽和脂肪酸或可以是那些含有不飽和鍵的脂肪酸。更具體的糖脂例如包括神經(jīng)酰胺、腦苷脂、鞘氨醇、神經(jīng)節(jié)苷脂、以及甘油基糖脂等。此外，還包括脂肪酸、單甘油酯、甘油二酯、膽固醇、以及膽汁酸。
(2)血液、淋巴液、以及骨髓液等體液構(gòu)成物質(zhì)體液構(gòu)成物質(zhì)是指存在于細(xì)胞內(nèi)外的液體成分，并不特別限制其種類，例如包括血液、淋巴液、以及骨髓液。更具體的體液構(gòu)成成分包括血紅蛋白、白蛋白、以及血液凝固因子等。
(3)維生素、神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白質(zhì)、多肽、以及藥物等生理活性物質(zhì)生理活性物質(zhì)是指調(diào)節(jié)生物體功能的成分，并不特別限制其種類，例如包括維生素、神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白質(zhì)、多肽、以及藥物。
更具體的維生素例如包括維生素A、維生素B、維生素C、維生素D、維生素E、以及維生素K等。
更具體的神經(jīng)遞質(zhì)例如包括腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、乙酰膽堿、GABA、谷氨酸、以及天冬氨酸等。
更具體的蛋白質(zhì)和多肽例如包括激素，如垂體激素、甲狀腺激素、雄性激素、雌性激素、以及腎上腺皮質(zhì)激素等；血清蛋白，如血紅蛋白以及血液因子等；免疫球蛋白，如IgG、IgE、IgM、IgA、以及IgD等；細(xì)胞因子和其片段，如白介素(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、以及L-12亞型)、干擾素(-α、-β、-γ)、粒細(xì)胞集落刺激因子(α和β型)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、血小板源生長(zhǎng)因子、磷脂酶激活蛋白、胰島素、高血糖素、凝集素、蓖麻毒蛋白、腫瘤壞死因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(-α、-β)、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、骨生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子、腫瘤生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞系源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、巨噬細(xì)胞分化因子、分化誘導(dǎo)因子、白血病抑制因子、雙調(diào)節(jié)素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、促紅細(xì)胞生成素、血細(xì)胞生成素、凝血細(xì)胞生成素、以及降鈣素；酶，如蛋白水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脫氨酶、腺苷脫氨酶、超氧化物歧化酶、內(nèi)毒素酶、過氧化氫酶、糜蛋白酶、脂肪酶、尿酸酶、彈性酶、鏈激酶、尿激酶、尿激酶原、腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶、膽紅素氧化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖酶、半乳糖甙酶、葡糖腦苷脂酶、以及葡糖苷酸酶；單克隆和多克隆抗體以及其片段；多聚氨基酸，如聚L-賴氨酸、聚D-賴氨酸等；疫苗以及抗原，如乙型肝炎疫苗、瘧疾疫苗、黑素瘤疫苗、HIV-1疫苗等。此外，還包括糖蛋白。另外，還包括具有與這些生理活性物質(zhì)相同的生理活性的結(jié)構(gòu)類似物質(zhì)。
此外，這些蛋白質(zhì)和多肽可以分離自其天然來源或進(jìn)行遺傳工程處理的細(xì)胞，或可以經(jīng)過各種合成方法制備。
作為藥物并不受特別限制，但優(yōu)選包括抗癌藥物和抗真菌藥物。
作為更具體的抗癌藥物并不受特別限制，例如包括紫杉醇、阿霉素、多柔比星、順鉑、道諾霉素、絲裂霉素、長(zhǎng)春新堿、表柔比星、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿克拉霉素、伊達(dá)霉素、博來霉素、吡柔比星、培洛霉素、萬古霉素、以及喜樹堿等。
具體的抗真菌藥物并不受特別限制，例如包括兩性霉素B、制霉菌素、氟胞嘧啶、咪康唑、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、以及肽抗真菌藥物。
此外，這些生理活性物質(zhì)例如還包括具有抗氧化作用、PAF抑制作用、抗炎作用、抗菌作用等的黃酮類、類萜、類胡蘿卜素、皂草苷、類固醇、醌、蒽醌、噸酮、香豆素、生物堿、卟啉、以及多元酚等。
本發(fā)明的生物相關(guān)物質(zhì)的中間體由以下化學(xué)式(2)表示。
在該化學(xué)式中，X只要是能夠與生物相關(guān)物質(zhì)形成化學(xué)鍵的官能團(tuán)或不飽和鍵并沒有特別限制。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，X是由組(I)或組(II)表示的基團(tuán)。
組(I) -Z-SH (c) 組(II)-Z-NH2(g)-NH2(j)-Z-COOH (k)在與生物相關(guān)物質(zhì)的氨基起反應(yīng)的情況下，由(a)、(b)、(d)、(f)、(h)、(i)、以及(k)表示的基團(tuán)是優(yōu)選的。在與生物相關(guān)物質(zhì)的巰基起反應(yīng)的情況下，由(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(h)、(i)、以及(k)表示的基團(tuán)是優(yōu)選的。在與生物相關(guān)物質(zhì)的不飽和鍵起反應(yīng)的情況下，由(c)表示的基團(tuán)是優(yōu)選的。在與生物相關(guān)物質(zhì)的羧基起反應(yīng)的情況下，由(c)、(g)、以及(j)表示的基團(tuán)是優(yōu)選的。
在組(I)或組(II)中Z是聚亞烷基二醇氧基和活性官能團(tuán)之間的連接并且只要它是共價(jià)鍵就沒有特別限制，優(yōu)選包括亞烷基和含有下述基團(tuán)的亞烷基酯鍵、尿烷鍵、酰胺鍵、醚鍵、碳酸酯鍵、或仲氨基。優(yōu)選的亞烷基包括亞甲基、1，2-亞乙基、1，3-亞丙基、1，2-亞丙基、異亞丙基、四亞甲基、亞丁基、異亞丁基、亞戊基、以及亞己基。更優(yōu)選的是以下(z1)的結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選的含有酯鍵的亞烷基是以下(z2)的結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選的含有酰胺鍵的亞烷基是以下(z3)的結(jié)構(gòu)。以下(z4)基團(tuán)作為含有醚鍵的亞烷基是更優(yōu)選的。更優(yōu)選的含有尿烷鍵的亞烷基是以下(z5)的結(jié)構(gòu)。以下(z6)作為含有仲氨基的亞烷基是更優(yōu)選的結(jié)構(gòu)。在每個(gè)化學(xué)式中，s是1至6的整數(shù)，優(yōu)選為1至3的整數(shù)，更優(yōu)選為2至3的整數(shù)。
-(CH2)s- (z1) -O(CH2)s- (z4) Y是具有1至10個(gè)碳原子的烴基，其可以包括氟原子。具體地說，Y包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、己基、壬基、乙烯基、苯基、芐基、4-甲基苯基、三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-(三氟甲氧基)苯基，并且優(yōu)選為甲基、乙烯基、4-甲基苯基、以及2，2，2-三氟乙基。
在由化學(xué)式(2)表示的化合物中，R、A1O、A2O、n、以及m和上述相同。
在組(II)中的Z、R、A1O、A2O、n、以及m也和上述相同。
表1和表2表示上述生物相關(guān)物質(zhì)的殘基T和聚亞烷基二醇氧基側(cè)的官能團(tuán)X(其與殘基T形成化學(xué)鍵)之間的關(guān)系。此外，表1和表2還表示由生物相關(guān)物質(zhì)與X的反應(yīng)所形成的在聚亞烷基二醇氧基和生物相關(guān)物質(zhì)之間的化學(xué)鍵的類型。
表1 注在(b)和(d)中，X基團(tuán)是除去(OA1)的部分表2 注在(h)和(i)中，X基團(tuán)是除去(OA1)的部分如從表中可以明顯看到的，在本發(fā)明的經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)中，聚亞烷基二醇氧基和生物相關(guān)物質(zhì)是通過例如酰胺鍵、仲氨基、尿烷鍵、硫酯鍵、硫鍵、二硫鍵、或硫代碳酸酯鍵結(jié)合。
本發(fā)明的經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)可以按如下所述進(jìn)行制備。
(生物相關(guān)物質(zhì)的氨基與本發(fā)明的中間體起反應(yīng)的情況)在用生物相關(guān)物質(zhì)的氨基進(jìn)行修飾的情況下，使用本發(fā)明的中間體(a)、(b)、(d)、(f)、(h)、(i)、以及(k)。更優(yōu)選地，使用(a)、(b)、(d)、以及(f)。在反應(yīng)中，本發(fā)明的中間體(a)、(b)、(d)、(f)、(h)、(i)、以及(k)可以以等摩爾或更大的比率和生物相關(guān)物質(zhì)起反應(yīng)。只要不參與反應(yīng)并不特別限制反應(yīng)溶劑，但在使蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行反應(yīng)的情況下，優(yōu)選的溶劑包括磷酸緩沖溶液、硼酸緩沖溶液、Tris酸緩沖溶液、乙酸緩沖溶液、以及碳酸緩沖溶液等緩沖溶液。此外，可以加入不影響蛋白質(zhì)或多肽的活性并且不參與反應(yīng)的有機(jī)溶劑，如乙腈、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、或二甲基乙酰胺等。在使抗癌藥物、抗真菌藥物、或磷脂反應(yīng)的情況下，優(yōu)選的溶劑除上述緩沖溶液以外，還包括甲苯、苯、二甲苯、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、叔丁基甲醚、四氫呋喃、氯仿、二氯甲烷、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、水、甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、以及正丁醇等。此外還可以不使用溶劑。加入本發(fā)明的中間體和生物相關(guān)物質(zhì)的次序可以是任意的。只要不使生物相關(guān)物質(zhì)失去活性并不特別限制反應(yīng)溫度，但在使蛋白質(zhì)或多肽反應(yīng)的情況下溫度優(yōu)選為0至40℃，以及在使抗癌藥物、抗真菌藥物、或磷脂反應(yīng)的情況下溫度優(yōu)選為-20至150℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為0.5至72小時(shí)，更優(yōu)選為1至24小時(shí)。在反應(yīng)中，可以使用縮合劑如N，N’-碳化雙環(huán)己基亞胺(DCC)或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺氫氯化物(EDC)。通過進(jìn)行該反應(yīng)，在生物相關(guān)物質(zhì)和本發(fā)明的中間體之間形成共價(jià)鍵，在使用(a)或(k)的情況下形成酰胺鍵，在使用(b)的情況下形成仲氨基，在使用(d)、(h)、或(i)的情況下形成尿烷鍵，以及在使用(f)的情況下形成席夫堿。當(dāng)形成席夫堿時(shí)，可以利用氰基硼氫鈉等還原劑進(jìn)行還原處理，以形成仲氨基。在反應(yīng)后，可以通過滲析、鹽折、超濾、離子交換色譜法、電泳、提取、再結(jié)晶、吸附處理、再沉淀、柱色譜法、或超臨界提取等純化方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。
(生物相關(guān)物質(zhì)的巰基與本發(fā)明的中間體起反應(yīng)的情況)在用生物相關(guān)物質(zhì)的巰基進(jìn)行修飾的情況下，使用本發(fā)明的中間體(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(h)、(i)、以及(k)。更優(yōu)選地，使用(e)。反應(yīng)溶劑、反應(yīng)條件等和使用氨基的情況相同。在反應(yīng)中，可以使用自由基引發(fā)劑如碘或AIBN。通過進(jìn)行該反應(yīng)，在生物相關(guān)物質(zhì)和本發(fā)明的中間體之間形成共價(jià)鍵，在使用(a)或(k)的情況下形成硫醚鍵，在使用(d)、(h)、或(i)的情況下形成硫代碳酸酯鍵，在使用(c)的情況下形成二硫鍵，以及在使用(b)、(e)、或(f)的情況下形成硫鍵。
(生物相關(guān)物質(zhì)的不飽和鍵與本發(fā)明的中間體起反應(yīng)的情況)在用生物相關(guān)物質(zhì)的不飽和鍵進(jìn)行修飾的情況下，使用本發(fā)明的中間體(c)。反應(yīng)溶劑、反應(yīng)條件等和使用氨基的情況相同。在反應(yīng)中，可以使用自由基引發(fā)劑如碘或AIBN。通過進(jìn)行該反應(yīng)，在生物相關(guān)物質(zhì)和本發(fā)明的中間體之間形成硫鍵。
(生物相關(guān)物質(zhì)的羧基與本發(fā)明的中間體起反應(yīng)的情況)在用生物相關(guān)物質(zhì)的羧基進(jìn)行修飾的情況下，使用本發(fā)明的中間體(c)、(g)、或(j)。反應(yīng)溶劑、反應(yīng)條件等和使用氨基的情況相同。在反應(yīng)中，可以適當(dāng)?shù)厥褂每s合劑如DCC或EDC。通過進(jìn)行該反應(yīng)，在生物相關(guān)物質(zhì)和本發(fā)明的中間體之間形成共價(jià)鍵，在使用(c)的情況下形成硫酯鍵以及在使用(g)或(j)的情況下形成酰胺鍵。
此外，在生物相關(guān)物質(zhì)中沒有氨基、巰基、不飽和鍵、以及羧基的情況下，通過把反應(yīng)基適當(dāng)引入至生物相關(guān)物質(zhì)以及使用本發(fā)明的中間體，可以對(duì)生物相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行修飾。
(中間體的制備)本發(fā)明的中間體例如可以按如下所述進(jìn)行制備。將烯化氧以0至1000mol的量聚合到2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇的伯羥基殘基，而末端羥基用芐基或叔丁基加以保護(hù)。其后，環(huán)狀縮醛結(jié)構(gòu)在酸性條件下去保護(hù)，而使烯化氧以10至1000mol的量聚合到新形成的兩個(gè)羥基，并對(duì)末端進(jìn)行烷基醚化。然后，保護(hù)基如芐基或叔丁基被去保護(hù)，從而可以獲得通式(p)的化合物。當(dāng)n為0時(shí)，將2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇的伯羥基殘基用芐基或叔丁基加以保護(hù)，環(huán)狀縮醛結(jié)構(gòu)在酸性條件下去保護(hù)，然后使烯化氧以10至1000mol的量聚合到新形成的兩個(gè)羥基，并對(duì)末端進(jìn)行烷基醚化。然后，保護(hù)基如芐基或叔丁基被去保護(hù)，從而可以獲得通式(p)的化合物。
可替換地，化合物(p)也可以通過以下方法制備。用芐基或叔丁基保護(hù)2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇的伯羥基，其后，環(huán)狀縮醛結(jié)構(gòu)在酸性條件下去保護(hù)，而使烯化氧以10至1000mol的量聚合到新形成的兩個(gè)羥基，并對(duì)末端進(jìn)行烷基醚化。然后，保護(hù)基如芐基或叔丁基被去保護(hù)，從而可以獲得通式(p)的化合物，其中n為0。該化合物也可以通過以0至1000mol的量把烯化氧聚合到新形成的羥基來制備。
當(dāng)n是1至3時(shí)，在2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇與2-芐氧基乙醇(n＝1)、二甘醇芐基醚(n＝2)、或三甘醇芐基醚(n＝3)偶合以后，環(huán)狀縮醛結(jié)構(gòu)在酸性條件下去保護(hù)，而烯化氧以10至1000mol的量聚合到新形成的兩個(gè)羥基，并對(duì)末端進(jìn)行的烷基醚化。然后，保護(hù)基如芐基或叔丁基被去保護(hù)，從而可以獲得通式(p)的化合物。
如上所述，通過利用烯化氧加聚反應(yīng)，無需柱純化就可以以高產(chǎn)率和工業(yè)適用方式制備高純度支鏈聚亞烷基二醇衍生物。
通過將如此獲得的化合物(p)的羥基修飾到在組(I)和組(II)中示出的各種反應(yīng)基，就可以制備本發(fā)明的中間體。此外，利用形成的反應(yīng)基，可以反應(yīng)和修飾各種生物相關(guān)物質(zhì)以制備本發(fā)明的經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)。
此外，具有組(I)和組(II)的各官能團(tuán)的中間體可以與生物相關(guān)物質(zhì)起反應(yīng)，但在某些情況下，中間體可以進(jìn)一步與其他化合物起反應(yīng)以制備其他中間體，然后其他中間體可以與生物相關(guān)物質(zhì)起反應(yīng)。例如，使用具有屬于組(II)的官能團(tuán)(g)、(j)、或(k)的中間體作為原材料，就可以合成具有組(II)的(a)、(e)、或(f)的中間體。
烯化氧與2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇的伯羥基殘基的加成聚合可以用以下方式進(jìn)行。氧化烯的加成聚合可以在甲苯中或沒有溶劑的條件下，或在鈉、鉀、氫化鈉、氫化鉀、甲醇鈉、或叔丁醇鉀等堿性條件下完成。在n是1至3的情況下，則無需進(jìn)行烯化氧的加聚步驟。其后的芐基醚化可以以下述方式進(jìn)行。
1)可以在疏質(zhì)子溶劑中或沒有溶劑的條件下，并存在氫氧化鈉或氫氧化鉀等堿催化劑的情況下，通過芐基氯或芐基溴與2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇或其烯化氧加成物起反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。
2)可以在疏質(zhì)子溶劑中或沒有溶劑的條件下，通過利用鈉、鉀、氫化鈉、氫化鉀、甲醇鈉、甲醇鉀、叔丁醇鉀等，把2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇或其烯化氧加成物的羥基轉(zhuǎn)化成醇化物以及在堿性條件下醇化物與芐基氯或芐基溴起反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。
3)可以在疏質(zhì)子溶劑中或沒有溶劑的條件下，通過用甲磺酰氯、對(duì)甲苯磺酰氯、2，2，2-三氟乙磺酰氯等活化2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇或其烯化氧加成物的羥基，接著與芐醇的醇化物起反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。
4)可以在疏質(zhì)子溶劑中或沒有溶劑的條件下，通過用甲磺酰氯、對(duì)甲苯磺酰氯、2，2，2-三氟乙磺酰氯等活化2-芐氧基乙醇(n＝1)、二甘醇芐基醚(n＝2)、或三甘醇芐基醚(n＝3)的羥基，接著與2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇的醇化物起反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。
在芐基醚化以后的環(huán)狀縮醛結(jié)構(gòu)的去保護(hù)是通過在調(diào)節(jié)到pH1至4的水溶液中與酸如乙酸、磷酸、硫酸、或鹽酸的反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，從而可以制備化學(xué)式(9)的化合物。
并不特別限制具有通過環(huán)狀縮醛的去保護(hù)而新形成的兩個(gè)羥基的烯化氧與以下化學(xué)式(9)的化合物的加成聚合，但可以經(jīng)過以下步驟(C1)和(C2)來實(shí)現(xiàn)。

步驟(C1)化學(xué)式(9)的化合物的醇化是通過利用鈉或鉀，優(yōu)選鈉作為催化劑(催化劑的量為5至50mol％)，在10至50℃溶解來實(shí)現(xiàn)。
步驟(C2)烯化氧加聚是在50至130℃的反應(yīng)溫度下進(jìn)行。
關(guān)于在步驟(C1)中的催化劑的量，如果小于5mol％，因?yàn)橄┗醯木酆纤俾式档投塾?jì)熱增加從而導(dǎo)致形成雜質(zhì)如末端乙烯醚化合物，所以使用5mol％或更大的催化劑量有利于制備高質(zhì)量的高分子量化合物。當(dāng)催化劑量超過50mol％時(shí)，在醇化反應(yīng)中反應(yīng)液體的粘度會(huì)增加或液體會(huì)固化，因而攪拌效率降低并且不會(huì)加速醇化。此外，當(dāng)液體固化時(shí)，其處理勢(shì)必困難，其引起吸水性。當(dāng)醇化物已吸收水時(shí)，則形成衍生自水的亞烷基二醇化合物，并作為在醫(yī)用中不希望的雜質(zhì)混入。
當(dāng)溶解溫度高于50℃時(shí)，可發(fā)生分解反應(yīng)從而形成芐醇或甘油。當(dāng)形成芐醇時(shí)，它與靶子化合物同樣引發(fā)與烯化氧的加聚，從而形成分子量為靶子化合物分子量的0.5倍的低分子量雜質(zhì)。當(dāng)形成衍生自芐醇的低分子量雜質(zhì)時(shí)，則與靶子化合物同樣經(jīng)過下一步驟的羥基的烷基醚化步驟和去保護(hù)步驟而引入官能團(tuán)，從而成為可與生物相關(guān)物質(zhì)起反應(yīng)的低分子量雜質(zhì)。這類雜質(zhì)可與生物相關(guān)物質(zhì)起反應(yīng)并改變制劑的物理性能。此外，當(dāng)形成甘油時(shí)也同樣，它也引發(fā)與烯化氧的加聚從而形成高分子量雜質(zhì)，其分子量為靶子化合物分子量的1.5倍。因?yàn)楦叻肿恿侩s質(zhì)并不具有芐基并且其末端羥基僅被烷基醚化，所以沒有官能團(tuán)，然而，當(dāng)在含有這類雜質(zhì)的狀態(tài)下進(jìn)行與藥物等的結(jié)合時(shí)，生成的制劑則變得不均勻，因而導(dǎo)致質(zhì)量不穩(wěn)定。并且，該制劑不適用于需要高純度產(chǎn)物的醫(yī)用。
當(dāng)在低于10℃的溫度下進(jìn)行溶解時(shí)，和催化劑量大于50mol％的情況一樣，在醇化反應(yīng)中反應(yīng)液體的粘度會(huì)增加或液體會(huì)固化，以及其處理勢(shì)必困難，并引起吸水性。
并不特別限制反應(yīng)溶劑，只要它是疏質(zhì)子溶劑如甲苯、苯、二甲苯、乙腈、乙酸乙酯、四氫呋喃、氯仿、二氯甲烷、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、或二甲基乙酰胺，但優(yōu)選的是甲苯或沒有溶劑。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為1至24小時(shí)。當(dāng)時(shí)間少于1小時(shí)時(shí)，則催化劑可能不會(huì)完全溶解。當(dāng)時(shí)間大于24小時(shí)時(shí)，則可能發(fā)生上述的分解反應(yīng)。
關(guān)于在步驟(C2)的反應(yīng)溫度，當(dāng)溫度低于50℃時(shí)，聚合速率較低且累計(jì)熱增加從而降低化學(xué)式(5)的化合物的質(zhì)量。此外，當(dāng)溫度高于130℃時(shí)，在聚合期間則發(fā)生副反應(yīng)如末端的乙烯基醚化，因而靶子化合物的質(zhì)量降低。在聚合期間，當(dāng)分子量增加時(shí)，反應(yīng)液體的粘度也增加，因此可以適當(dāng)?shù)丶尤胧栀|(zhì)子溶劑、優(yōu)選加入甲苯。
作為在醇化步驟中的另一種制備方法，可以提到以下步驟(C3)。
步驟(C3)作為催化劑加入甲醇鈉、叔丁醇鉀鉀、或甲醇鉀，優(yōu)選加入甲醇鈉，其量為5至50mol％，在60至80℃下進(jìn)行反應(yīng)。此時(shí)，可以進(jìn)行減壓操作以促進(jìn)交換反應(yīng)。
由于上述原因，催化劑量?jī)?yōu)選為5至50mol％。關(guān)于反應(yīng)溫度，當(dāng)溫度低于60℃時(shí)，交換反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率降低，殘留醇如甲醇，其經(jīng)過烯化氧的加聚反應(yīng)形成分子量為靶子化合物分子量0.5倍的雜質(zhì)。當(dāng)溫度高于80℃時(shí)，可發(fā)生分解反應(yīng)。由于醇化反應(yīng)需要提高溫度并易于發(fā)生分解反應(yīng)，因而反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為1至3小時(shí)。當(dāng)時(shí)間少于1小時(shí)時(shí)，可能會(huì)降低醇化轉(zhuǎn)化率。當(dāng)時(shí)間大于3小時(shí)時(shí)，可發(fā)生分解。只要是疏質(zhì)子溶劑并不特別限制反應(yīng)溶劑，但優(yōu)選為甲苯或沒有溶劑。
其后末端的烷基醚化可以通過以下(1)或(2)任何一種方法來實(shí)現(xiàn)(1)將聚亞烷基二醇鏈的末端轉(zhuǎn)化成醇化物并將它與烷基鹵起反應(yīng)的方法；(2)用甲磺酰氯、對(duì)甲苯磺酰氯、2，2，2-三氟乙磺酰氯等活化聚亞烷基二醇鏈的末端羥基，接著與烷基醇的醇化物起反應(yīng)的方法。
優(yōu)選的是方法(2)，并在下面對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)描述。
制備方法(2)包括以下步驟(B1)、(B2)、以及(B3)。
步驟(B1)把脫鹵劑和由化學(xué)式(6)表示的化合物加入到由化學(xué)式(5)表示的化合物中，并在20至60℃下使它們起反應(yīng)以獲得化學(xué)式(7)的化合物。此時(shí)，每個(gè)加入物的摩爾比率滿足以下關(guān)系式Vc≥3VaVb＞VcVa由化學(xué)式(5)表示的化合物的摩爾數(shù)Vb脫鹵劑的摩爾數(shù)Vc由化學(xué)式(6)表示的化合物的摩爾數(shù)更優(yōu)選的，每個(gè)加入物的摩爾比率滿足以下關(guān)系式20Va≥Vc≥3Va4Vc＞Vb＞Vc。
當(dāng)Vc小于3Va時(shí)，轉(zhuǎn)化率下降，因而在氧化烯鏈末端仍然殘留羥基。官能團(tuán)被引入到剩余的羥基從而形成多官能雜質(zhì)，其具有和靶子化合物相同的分子量。當(dāng)這類多官能雜質(zhì)存在時(shí)，它在與生物相關(guān)物質(zhì)結(jié)合時(shí)起交聯(lián)劑的作用，從而降低生成的經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)的純度。當(dāng)Vb不大于Vc時(shí)，由于不能有效捕集隨反應(yīng)進(jìn)行產(chǎn)生的作為副產(chǎn)物的酸，所以轉(zhuǎn)化率下降，因而在氧化烯鏈末端殘留羥基。此外，當(dāng)Vc大于20Va或Vb不小于4Vc時(shí)，過量的試劑或化合物混入后步驟，從而在其后的過程中引起副反應(yīng)。

使用的脫鹵劑包括有機(jī)堿如三乙胺、吡啶、以及4-二甲基氨基吡啶，以及無機(jī)堿如碳酸鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、乙酸鈉、碳酸鉀、以及氫氧化鉀。優(yōu)選的脫氯化氫劑是有機(jī)堿如三乙胺、吡啶、或4-二甲基氨基吡啶。
在使用的化學(xué)式(6)的化合物中，W優(yōu)選為Cl或Br，而R1優(yōu)選為甲基、苯基、或?qū)谆交顑?yōu)選為甲磺酰氯，其中W是Cl而R1是甲基。
此時(shí)，只要是疏質(zhì)子溶劑并不特別限制要使用的溶劑，優(yōu)選包括甲苯、苯、二甲苯、乙腈、乙酸乙酯、四氫呋喃、氯仿、二氯甲烷、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、或二甲基乙酰胺，但更優(yōu)選的是甲苯，其使得能夠共沸除去反應(yīng)系統(tǒng)中的水。在反應(yīng)中使用的溶劑量?jī)?yōu)選為化學(xué)式(5)的化合物的0.5至10倍重量。在化學(xué)式(5)的化合物具有較大分子量的情況下，反應(yīng)液體的粘度會(huì)增加而轉(zhuǎn)化率會(huì)下降，因而優(yōu)選用溶劑稀釋反應(yīng)液體。
并不特別限制反應(yīng)溫度，但優(yōu)選為60℃或更低以便抑制副反應(yīng)，并且優(yōu)選為20℃或更高以便抑制反應(yīng)液體粘度的增加。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為1至24小時(shí)。當(dāng)時(shí)間少于1小時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)化率可能較低。當(dāng)時(shí)間大于24小時(shí)時(shí)，則可能發(fā)生副反應(yīng)。
在反應(yīng)中，可以在反應(yīng)之前進(jìn)行共沸除去水等從原材料中除去水的操作。此外，可以加入抗氧化劑如2，6-二叔丁基-對(duì)甲酚。而且，隨著反應(yīng)的進(jìn)行和化學(xué)式(7)的化合物的形成，形成鹽，反應(yīng)結(jié)束后可以直接進(jìn)入下一步驟，或該鹽可以通過過濾除去，或在過濾以后，化學(xué)式(7)的化合物可以通過提取、再結(jié)晶、吸附處理、再沉淀、柱色譜法、或超臨界提取等純化方法加以純化。
步驟(B2)把由化學(xué)式(8)表示的化合物加入到化學(xué)式(7)的化合物中，并在20至80℃下使它們起反應(yīng)以獲得化學(xué)式(4)的化合物。此時(shí)，每個(gè)加入物的摩爾比率滿足以下關(guān)系式Vd＞VcVd由化學(xué)式(8)表示的化合物的摩爾數(shù)更優(yōu)選的，滿足以下關(guān)系式10Vc＞Vd＞Vc。
R-OM.....(8)在化學(xué)式(8)中，R是如上所述而M是鈉或鉀，優(yōu)選鈉。
當(dāng)Vd不大于Vc時(shí)，烷基醚化并不充分地進(jìn)行，并在氧化烯鏈末端殘留反應(yīng)基如甲磺酸鹽基。當(dāng)反應(yīng)基仍然殘留在氧化烯鏈末端時(shí)，如上所述，會(huì)形成多官能化合物并在與生物相關(guān)物質(zhì)結(jié)合時(shí)引起嚴(yán)重的副反應(yīng)。此外，當(dāng)Vd不小于10Vc時(shí)，過量的醇化物混入后步驟，從而在其后的過程中引起副反應(yīng)。
只要是疏質(zhì)子溶劑并不特別限制在反應(yīng)中使用的溶劑，但優(yōu)選為甲苯。在反應(yīng)中使用的溶劑量?jī)?yōu)選為化學(xué)式(7)的化合物的0.5至10倍量。在化學(xué)式(7)的化合物具有較大分子量的情況下，反應(yīng)液體的粘度會(huì)增加，因而優(yōu)選用溶劑稀釋反應(yīng)液體。
并不特別限制反應(yīng)溫度，但優(yōu)選為80℃或更低以便抑制副反應(yīng)，并且優(yōu)選為20℃或更高以便抑制反應(yīng)液體粘度的增加。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為1至24小時(shí)。當(dāng)時(shí)間少于1小時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)化率可能較低。當(dāng)時(shí)間大于24小時(shí)時(shí)，則可能發(fā)生副反應(yīng)。在反應(yīng)中，可以在反應(yīng)之前進(jìn)行共沸除去水等從原材料中除去水的操作。
步驟(B3)將反應(yīng)液體過濾，或用濃度為10wt％或更高的無機(jī)鹽水溶液洗滌反應(yīng)液體。
在該步驟中，并不特別限制無機(jī)鹽但優(yōu)選為氯化鈉。當(dāng)濃度小于10wt％時(shí)，靶子化合物遷移進(jìn)入水層從而顯著降低過程產(chǎn)率。用水洗滌的操作可以重復(fù)若干次。進(jìn)行步驟(B3)是為了除去過量加入的原材料和產(chǎn)生的作為副產(chǎn)物的鹽等。省略該步驟，在再次進(jìn)行步驟(B1)至(B3)的情況下引起副反應(yīng)。在進(jìn)行脫芐基步驟作為下一步驟的情況下，這些雜質(zhì)起催化毒物的作用，因而可以影響轉(zhuǎn)化率。
此外，為了提高氧化烯鏈末端的烷基醚化率，優(yōu)選再次重復(fù)步驟(B1)至(B3)。當(dāng)氧化烯鏈末端的烷基醚化率較低時(shí)，如上所述，可能會(huì)形成多官能雜質(zhì)。
如此獲得的化學(xué)式(4)的化合物可以通過提取、再結(jié)晶、吸附處理、再沉淀、柱色譜法、或超臨界提取等純化方法加以純化。
通過連續(xù)脫芐基作用來制備化合物(p)并不受到特別限制，但可以利用氫化還原催化劑和氫供體并通過以下步驟(A)的氫化作用來制備。
步驟(A)在反應(yīng)系統(tǒng)中的含水量為1％或更少的條件下，使由化學(xué)式(4)表示的化合物進(jìn)行氫化還原反應(yīng)。當(dāng)在反應(yīng)系統(tǒng)中的含水量大于1％時(shí)，會(huì)發(fā)生聚氧化烯鏈的分解反應(yīng)。因?yàn)橥ㄟ^分解形成的聚亞烷基二醇具有羥基，所以在下一步驟中被官能化從而形成活性低分子量雜質(zhì)。如上所述，這類活性低分子量雜質(zhì)與生物相關(guān)物質(zhì)起反應(yīng)，因而改變制劑的物理性能。
氫化還原催化劑優(yōu)選為鈀。并不特別限制載體但優(yōu)選為氧化鋁或碳，更優(yōu)選為碳。鈀的量，優(yōu)選為化學(xué)式(4)的化合物的1至20wt％。當(dāng)該量小于1wt％時(shí)，去保護(hù)的轉(zhuǎn)化率會(huì)降低，因而在下一步驟中官能作用的比率可能會(huì)降低。然而，當(dāng)該量大于20wt％時(shí)，發(fā)生聚亞烷基二醇鏈的分解反應(yīng)，因而可能產(chǎn)生作為副產(chǎn)物的上述活性低分子量化合物。只要在反應(yīng)系統(tǒng)中的含水量小于1％并不特別限制反應(yīng)溶劑，但優(yōu)選包括甲醇、乙醇、2-丙醇等，并且更優(yōu)選的是甲醇。并不特別限制氫供體，包括氫氣、環(huán)己烷、2-丙醇等。反應(yīng)溫度優(yōu)選為40℃或更低。當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，可以發(fā)生聚亞烷基二醇鏈的分解反應(yīng)，因而作為副產(chǎn)物可能產(chǎn)生活性低分子量化合物。并不特別限制反應(yīng)時(shí)間，當(dāng)使用大量的催化劑時(shí)，反應(yīng)在較短的時(shí)間內(nèi)完成，但當(dāng)使用的催化劑量較少時(shí)，則需要較長(zhǎng)的時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為1至5小時(shí)。當(dāng)時(shí)間少于1小時(shí)時(shí)，轉(zhuǎn)化率可能較低。當(dāng)時(shí)間大于5小時(shí)時(shí)，發(fā)生聚亞烷基二醇的分解反應(yīng)。
生成的化學(xué)式(p)的化合物可以通過提取、再結(jié)晶、吸附處理、再沉淀、柱色譜法、或超臨界提取等純化方法加以純化。
如此獲得的化合物是由以下化學(xué)式(p)表示并基本上不含有仲羥基的聚亞烷基二醇衍生物
(式中，R是具有1至24個(gè)碳原子的烴基，OA1和OA2各自為具有2至4個(gè)碳原子的氧化烯基，R和OA2在一個(gè)分子中是彼此相同或不同，n和m各自為加入的氧化烯基的摩爾平均數(shù)，n表示0至1000，以及m表示10至1000。)因?yàn)榛瘜W(xué)式(p)的化合物不含有仲羥基，所以其后官能團(tuán)引入反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高并可以獲得高純度聚亞烷基二醇衍生物。在存在仲羥基的情況下，其后官能團(tuán)引入反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率會(huì)較低，并且經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)的中間體的純度會(huì)降低，因而可能產(chǎn)生雜質(zhì)混入到藥物等中的污染問題。
本發(fā)明的化學(xué)式(p)的化合物滿足以下關(guān)系式Hrd/Mp×1000000≤3其中Mp是對(duì)應(yīng)于峰頂部的分子量，其獲自化學(xué)式(p)的聚亞烷基二醇衍生物的凝膠滲透色譜，而Hrd是殘留羥基的比率，該羥基包含在聚氧化烯鏈末端的2和3位的烷基R中。
更優(yōu)選地，滿足以下關(guān)系式Hrd÷Mp×1000000≤2Mp指在峰中最大折射率點(diǎn)的重均分子量，其中排除由在凝膠滲透色譜中使用的顯影溶劑引起的峰以及由使用的柱和裝置引起的基線波動(dòng)所產(chǎn)生的假峰。在本發(fā)明中，凝膠滲透色譜是利用SHODEX GPC SYSTEM-11作為GPC系統(tǒng)來進(jìn)行，而測(cè)量是在以下條件下進(jìn)行
顯影溶劑四氫呋喃；流速1ml/min；柱SHODEX KF-801、KF-803、KF-804(內(nèi)徑8mm×30cm)；柱溫度40℃；檢測(cè)器RI×8；試樣量1mg/g，100μl。
包含在烷基R中的殘留羥基的比率Hrd是在化學(xué)式(4)的化合物的甲磺?；院筮M(jìn)行測(cè)量，其中化學(xué)式(4)的化合物是去保護(hù)之前的前體。以下將說明R是甲基的情況。
把5Ve克的甲苯加入至Ve克的化學(xué)式(4)的化合物中，接著在常壓下回流除去水。在冷卻到40℃以后，將20mol的三乙胺加入至1mol的化學(xué)式(4)的化合物中，并在充分?jǐn)嚢韬?，在其中加?mol的甲磺酰氯。此時(shí)，優(yōu)選是在用甲苯稀釋或不進(jìn)行稀釋以后將其滴入。然后，在40℃下進(jìn)行反應(yīng)3小時(shí)，并通過過濾除去甲磺酸的三乙胺鹽。然后，把10Ve至20Ve克的乙酸乙酯加入至濾液中，并冷卻到室溫后，逐漸地加入己烷直到晶體沉淀。通過過濾收集生成的晶體，并再次把10Ve至20Ve克的乙酸乙酯加入至晶體，加熱溶解，在冷卻到室溫后，逐漸地加入己烷直到晶體沉淀。過濾收集晶體并干燥，把得到的20mg干燥產(chǎn)物溶解于氘化氯仿中并測(cè)量1H核磁共振譜。Hrd由以下關(guān)系式表示Hrd＝Mms/(Mms+Mme)其中將TMS基峰作為0ppm，Mme是在3.38ppm檢測(cè)的氧化烯鏈末端的甲基的峰積分值，而Mms是在3.08ppm檢測(cè)的通過甲磺酰基化氧化烯鏈末端的剩余羥基所形成的甲磺?；姆宸e分值。
當(dāng)R是不同于甲基的基團(tuán)時(shí)，通過適當(dāng)識(shí)別峰位置(在此處檢測(cè)烷基)以及應(yīng)用質(zhì)子數(shù)，利用同樣的公式可以確定Hrd。
當(dāng)如此確定的Hrd滿足以下關(guān)系式時(shí)
Hrd/Mp×1000000＞3，該情況意味著含有大量的羥基殘留在聚氧化烯鏈末端的2-和3-位的雜質(zhì)。當(dāng)存在這類雜質(zhì)時(shí)，聚氧化烯鏈末端的羥基還在其后的步驟中被官能化從而形成多官能雜質(zhì)。如上所述，在與生物相關(guān)物質(zhì)結(jié)合時(shí)，這類雜質(zhì)可以起交聯(lián)劑的作用從而引起副反應(yīng)。
關(guān)于本發(fā)明的化學(xué)式(p)的化合物，在凝膠滲透色譜的測(cè)量中，在從洗脫起點(diǎn)至洗脫終點(diǎn)的所有峰中多分散性Mw/Mn滿足以下關(guān)系式Mw/Mn≤1.07，更優(yōu)選的是滿足以下關(guān)系式的情況Mw/Mn≤1.05。
在Mw/Mn大于1.07的情況下，它意味著存在大量的上述高分子量雜質(zhì)或低分子量雜質(zhì)，并且當(dāng)化合物與生物相關(guān)物質(zhì)結(jié)合時(shí)，則可能增加副產(chǎn)物的形成從而導(dǎo)致純度不足。此外，當(dāng)純度不足時(shí)，如果用作醫(yī)用產(chǎn)品，該產(chǎn)物可以引起副作用。
本發(fā)明的化學(xué)式(p)的化合物滿足以下關(guān)系式M2/(M1+M2)×100≤10當(dāng)由化學(xué)式(p)表示的化合物與甲磺酰氯起反應(yīng)以獲得甲磺酰基化化合物，并在氘化甲醇溶液中獲得1H核磁共振譜時(shí)，M1表示大約在3.13ppm檢測(cè)的甲基的積分值，該甲基起源于甲磺?；?，而該甲磺酰基衍生自直接結(jié)合于n為0的甘油骨架的1-位的羥基；以及M2表示大約在3.12ppm檢測(cè)的甲基的積分值，該甲基起源于甲磺酰基，而該甲磺?；苌跃蹃喭榛兼湹牧u基。
更優(yōu)選地，滿足以下關(guān)系式M2/(M1+M2)×100≤8。
下面將說明M1和M2的計(jì)算方法。
把4Vf克的甲苯加入Vf克的化學(xué)式(p)的化合物，接著在常壓下共沸地除去水。在冷卻到40℃以后，將20mol的三乙胺加入到1mol的化學(xué)式(p)的化合物中，并在充分?jǐn)嚢韬笤谄渲屑尤?mol的甲磺酰氯。此時(shí)，最好是在用甲苯稀釋或不進(jìn)行稀釋以后將它滴入。然后，在40℃下進(jìn)行反應(yīng)3小時(shí)，并通過過濾除去甲磺酸的三乙胺鹽，其后，把10Vf至20Vf克的乙酸乙酯加入到濾液中，并在冷卻到室溫后，逐漸地加入己烷直到晶體沉淀。通過過濾收集生成的晶體，并再次把10Vf至20Vf克的乙酸乙酯加入到晶體中，接著加熱以將其溶解。在冷卻到室溫后，逐漸地加入己烷直到晶體沉淀。通過過濾收集晶體并干燥。把20mg生成的干燥產(chǎn)物溶解于氘化甲醇中并測(cè)量1H核磁共振譜。M1確定為在大約3.13ppm檢測(cè)的甲基的積分值，在n為0的情況下，其起源于甲磺?；?，而甲磺?；苌栽谥苯咏Y(jié)合于甘油骨架的1-位的羥基，TMS基峰是0ppm。此外，M2確定為在大約3.12ppm檢測(cè)的甲基的積分值，其起源于甲磺?；谆酋；苌杂煞纸夥磻?yīng)形成的聚亞烷基二醇鏈末端或聚亞烷基二醇鏈。
在滿足以下關(guān)系式的情況下M2/(M1+M2)×100＞10
其是衍生自如此確定的M1和M2，生成的經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)的純度傾向于降低，這是因?yàn)樵撐镔|(zhì)被以下說明的大量雜質(zhì)所污染。
即，該情況意味著存在大量的在聚氧化烯鏈末端具有羥基的雜質(zhì)，其起源于以下雜質(zhì)(A)具有羥基并且分子量為化合物(p)0.5倍的雜質(zhì)，其是在化學(xué)式(9)的化合物的醇化時(shí)，進(jìn)行分解反應(yīng)，烯化氧與生成的芐醇的加聚、以及在其后步驟中芐基的去保護(hù)所形成；(B)在2-或3-位具有殘留羥基并且分子量和化合物(p)相同的雜質(zhì)，其是在化學(xué)式(5)的化合物的烷基醚化過程中所形成；(C)具有羥基以及低分子量的雜質(zhì)，其是在化學(xué)式(4)的化合物的脫芐基作用中通過分解聚氧化烯鏈所形成；以及類似雜質(zhì)。
本發(fā)明的脫芐基反應(yīng)可廣泛應(yīng)用于其他衍生物。
更具體地說，它是制備化學(xué)式(11)的聚亞烷基二醇衍生物的方法，其包括以下步驟(AA)步驟(AA)在反應(yīng)系統(tǒng)中的含水量為1％或更少的條件下，使化學(xué)式(10)表示的化合物進(jìn)行氫化還原反應(yīng)
(式中，G是具有2至4個(gè)羥基的化合物的殘基；R2是具有1至4個(gè)碳原子的烴基；m1、m2、以及m3各自表示加入的氧化乙烯基的摩爾平均數(shù)，并滿足以下關(guān)系式0≤m1≤1000、0≤m2≤1000、0≤m3≤1000、10≤m1+m2+m3≤1000；X1是氨基、羧基、或這些的保護(hù)基。g1、g2、以及g3各自表示整數(shù)，并滿足以下關(guān)系式1≤g1≤3、0≤g2、0≤g3、2≤g1+g2+g3≤4。)在G中，更加具體的具有2至4個(gè)羥基的化合物的殘基包括乙二醇、甘油、季戊四醇、雙甘油等等，而更優(yōu)選的是乙二醇或甘油。
更加具體的R2包括甲基、乙基、丙基、異丙基、叔丁基等等，而優(yōu)選的是甲基。
關(guān)于m1、m2、以及m3，它們并不受到特別限制，只要滿足以下關(guān)系式0≤m1≤1000、0≤m2≤1000、0≤m3≤1000、10≤m1+m2+m3≤1000但優(yōu)選為20≤m1+m2+m3≤1000的情況，更優(yōu)選為40≤m1+m2+m3≤1000的情況，以及最優(yōu)選為100≤m1+m2+m3≤1000的情況。
具體的X1包括氨基、Boc氨基、Fmoc氨基、羧基等等，以及更優(yōu)選的是Boc氨基，其中Boc指叔丁氧基羰基而Fmoc指9-芴基甲氧基羰基。
反應(yīng)系統(tǒng)中的含水量、催化劑量、反應(yīng)時(shí)間、溶劑等等和上述步驟(A)相同。可以利用氫化還原催化劑進(jìn)行氫化還原反應(yīng)。氫化還原催化劑優(yōu)選為鈀。
本發(fā)明的烷基醚化可以廣泛應(yīng)用于其他衍生物。
更具體地說，它是制備由化學(xué)式(16)表示的聚亞烷基二醇衍生物的方法，其中進(jìn)行以下步驟(BB1)至(BB3)。
步驟(BB1)把脫鹵劑以及由化學(xué)式(14)表示的化合物加入到由化學(xué)式(12)表示的化合物中，并在20至60℃下使它們起反應(yīng)以獲得化學(xué)式(13)的化合物。此時(shí)，每個(gè)加入的摩爾比率滿足以下關(guān)系式Vj≥1.5×Vh×g5Vi＞VjVh由化學(xué)式(12)表示的化合物的摩爾數(shù)Vi脫鹵劑的摩爾數(shù)Vj由化學(xué)式(14)表示的化合物的摩爾數(shù)步驟(BB2)把由化學(xué)式(15)表示的化合物加入到化學(xué)式(13)的化合物中，并在20至80℃下使它們起反應(yīng)以獲得化學(xué)式(16)的化合物。此時(shí)，每個(gè)加入的摩爾比率滿足以下關(guān)系式
Vk＞VjVk由化學(xué)式(15)表示的化合物的摩爾數(shù) (式中，G、m1、m2、m3、以及X1和上述相同，而g4、g5、以及g6各自表示整數(shù)并滿足以下關(guān)系式0≤g4、1≤g5≤3、0≤g6、2≤g4+g5+g6≤4。) (式中，G、m1、m2、m3、以及X1和上述相同，W是選自Cl、Br、以及I的鹵素原子，而R3是具有1至10個(gè)碳原子的烴基。)R2-OM.....(15)
(式中，R2和上述相同，而M是鉀或鈉。) (式中，G、R2、m1、m2、m3、以及X1和上述相同。)步驟(BB3)過濾反應(yīng)液體，或用濃度為10wt％或更高的無機(jī)鹽水溶液洗滌反應(yīng)液體。
在化學(xué)式(14)的化合物中，W優(yōu)選為Cl或Br，而R3優(yōu)選為甲基、苯基、或?qū)谆交?，以及最?yōu)選的是甲磺酰氯，其中W是Cl而R3是甲基。
并不特別限制無機(jī)鹽，但優(yōu)選為氯化鈉(食鹽)。
此外，由于上述原因，為了提高氧化乙烯鏈末端的烷基醚化的比率，優(yōu)選再次重復(fù)步驟(BB1)至(BB3)。
反應(yīng)系統(tǒng)中的含水量、催化劑量、反應(yīng)時(shí)間、溶劑等等和上述步驟(B1)至(B3)相同。
以下表示化合物(p)的反應(yīng)途徑。
下面將描述把反應(yīng)基引入至通過脫芐基反應(yīng)形成的化合物(p)的羥基。
(制備(b)、(d)、(h)、以及(i)的方法)在疏質(zhì)子溶劑中如甲苯、苯、二甲苯、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、叔丁基甲醚、四氫呋喃、氯仿、二氯甲烷、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、或二甲基乙酰胺，或在沒有溶劑的條件下，通過使化合物(p)與有機(jī)堿(如三乙胺、吡啶、或4-二甲基氨基吡啶)或無機(jī)堿(如碳酸鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、乙酸鈉、碳酸鉀、或氫氧化鉀)以及任何一種由以下通式(b1)、(d1)、(h1)、以及(i1)表示的化合物起反應(yīng)，就可以分別引入(b)、(d)、(h)、以及(i)。此外，也可以不使用以上有機(jī)堿或無機(jī)堿。有機(jī)堿或無機(jī)堿的使用比率并不受到特別限制，但優(yōu)選為化合物(p)的等摩爾或更多。而且，有機(jī)堿可以用作溶劑。在(b1)或(d1)中W是選自Cl、Br、以及I的鹵素原子，并且優(yōu)選為Cl。由通式(b1)、(d1)、(h1)、以及(i1)表示的化合物的使用比率并不受到特別限制，但優(yōu)選為化合物(p)的等摩爾或更多，更優(yōu)選為等摩爾至50摩爾。反應(yīng)溫度優(yōu)選為0至300℃，更優(yōu)選為20至150℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至24小時(shí)。形成的化合物可以通過提取、再結(jié)晶、吸附處理、再沉淀、柱色譜法、或超臨界提取等純化方法加以純化。
(其中W是選自Cl、Br、以及I的鹵素原子。)(制備(a)和(k)的方法)琥珀酰亞胺化合物(a)可以通過以下方法獲得化合物(p)與二羧酸酐如琥珀酸酐或戊二酸酐起反應(yīng)以獲得羧基化合物(k)，接著在存在縮合劑如DCC或EDC的條件下與N-羥基琥珀酰亞胺縮合?；衔?p)與二羧酸酐的反應(yīng)是在上述疏質(zhì)子溶劑中或沒有溶劑下進(jìn)行。二羧酸酐的使用比率并不受到特別限制，但優(yōu)選為化合物(p)的等摩爾或更多，更優(yōu)選為等摩爾至5摩爾。反應(yīng)溫度優(yōu)選為0至200℃，更優(yōu)選為20至150℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至12小時(shí)。在反應(yīng)中，作為催化劑可以使用有機(jī)堿如三乙胺、吡啶、或二甲基氨基吡啶，或無機(jī)堿如碳酸鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、乙酸鈉、碳酸鉀、或氫氧化鉀。催化劑的使用比率優(yōu)選為0.1至50wt％，更優(yōu)選為0.5至20wt％。如此形成的羧基化合物(k)可以通過上述純化方法加以純化或可以直接用在接著的縮合反應(yīng)中。
其后的縮合反應(yīng)也是在上述疏質(zhì)子溶劑中或沒有溶劑下進(jìn)行。并不特別限制縮合劑，但優(yōu)選為DCC。DCC的使用比率優(yōu)選為化合物(p)的等摩爾或更多，更優(yōu)選為等摩爾至5摩爾。N-羥基琥珀酰亞胺的使用比率優(yōu)選為化合物(p)的等摩爾或更多，更優(yōu)選為等摩爾至5摩爾。反應(yīng)溫度優(yōu)選為0至100℃，更優(yōu)選為20至80℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至12小時(shí)。形成的化合物可以通過上述純化方法加以純化。
(制備(g)和(j)的方法)胺化合物(g)可以通過以下方法獲得在溶劑如水或乙腈中，利用無機(jī)堿如氫氧化鈉或氫氧化鉀作為催化劑，化合物(p)與丙烯腈或類似物起反應(yīng)以獲得腈化合物，然后在高壓釜中并在有鎳或鈀催化劑的情況下，對(duì)其進(jìn)行腈基的氫化作用。為獲得腈化合物的無機(jī)堿的使用比率并不受到特別限制，但優(yōu)選為化合物(p)的0.01至50wt％。丙烯腈或類似物的使用比率并不受到特別限制，但優(yōu)選為化合物(p)的0.5至5倍重量，更優(yōu)選為1至4倍重量。此外，丙烯腈可以用作溶劑。反應(yīng)溫度優(yōu)選為-50至100℃，更優(yōu)選為-20至60℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至24小時(shí)。在其后氫化反應(yīng)中的反應(yīng)溶劑只要它不參與反應(yīng)并不受到特別限制，但優(yōu)選為甲苯。鎳或鈀催化劑的使用比率并不受到特別限制，但可以為腈化合物的0.05至30wt％，優(yōu)選為0.5至20wt％。反應(yīng)溫度優(yōu)選為20至200℃，更優(yōu)選為50至150℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至24小時(shí)。氫氣壓力優(yōu)選為2至10MPa，更優(yōu)選為3至8MPa。此外，為了防止二聚作用，可以把氨加入反應(yīng)系統(tǒng)。在加入氨的情況下，氨壓力并不受到特別限制，但可以為0.1至10MPa，優(yōu)選為0.3至2MPa。形成的化合物可以通過上述純化方法加以純化。
上述胺化合物(g)或(j)也可以通過(b)與氨水起反應(yīng)而獲得。該反應(yīng)是在氨水中進(jìn)行，而氨濃度并不受到特別限制，但優(yōu)選在10至40％的范圍內(nèi)。氨水的使用比率優(yōu)選為(b)重量的1至300倍。反應(yīng)溫度優(yōu)選為0至100℃，更優(yōu)選為20至80℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至72小時(shí)，更優(yōu)選為1小時(shí)至36小時(shí)。另外，胺化合物(g)或(j)也可以通過在高壓釜中(b)與氨起反應(yīng)而獲得。反應(yīng)溶劑并不受到特別限制，但優(yōu)選為甲醇或乙醇。氨的量?jī)?yōu)選為(b)的10至300wt％，更優(yōu)選為20至200wt％。反應(yīng)溫度優(yōu)選為50至200℃，更優(yōu)選為80至150℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至24小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至12小時(shí)。形成的化合物可以通過上述純化方法加以純化。
(制備(e)的方法)此外，馬來酰亞胺化合物(e)可以通過以下方法獲得在上述疏質(zhì)子溶劑中或沒有溶劑下，生成的胺(g)與馬來酐起反應(yīng)以獲得馬來酰胺化合物，然后利用乙酐或乙酸鈉作為催化劑對(duì)其進(jìn)行閉環(huán)反應(yīng)。在馬來酰胺化反應(yīng)中的馬來酐的使用比率并不受到特別限制，但優(yōu)選為化合物(p)的等摩爾或更多，更優(yōu)選為等摩爾至5摩爾。反應(yīng)溫度優(yōu)選為0至200℃，更優(yōu)選為20至120℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至12小時(shí)。形成的馬來酰胺化合物可以通過上述純化方法加以純化或可以直接用于接著的閉環(huán)反應(yīng)。
在其后閉環(huán)反應(yīng)中的反應(yīng)溶劑并不受到特別限制，但優(yōu)選為疏質(zhì)子溶劑或乙酐。乙酸鈉的使用比率并不受到特別限制，但優(yōu)選為馬來酰胺化合物的等摩爾或更多，更優(yōu)選為等摩爾至50摩爾。反應(yīng)溫度優(yōu)選為0至200℃，更優(yōu)選為20至150℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至12小時(shí)。形成的化合物可以通過上述純化方法加以純化。
上述馬來酰亞胺化合物也可以通過以下化學(xué)式(e1)的化合物與上述胺(g)或(j)起反應(yīng)而獲得。反應(yīng)是在上述疏質(zhì)子溶劑中或沒有溶劑下進(jìn)行，然后以(g)或(j)的胺的等摩爾或更多的量加入化合物(e1)?；衔?e1)的使用比率優(yōu)選為(g)或(j)的胺的等摩爾或更多，更優(yōu)選為等摩爾至5摩爾。反應(yīng)溫度優(yōu)選為0至200℃，更優(yōu)選為20至80℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至12小時(shí)。在反應(yīng)期間，可以進(jìn)行光屏蔽。形成的化合物可以通過上述純化方法加以純化。
(其中Q表示具有1至7個(gè)碳原子的烴基。)
(制備(f)的方法)醛化合物(f)可以通過以下方法獲得化合物(b)與縮醛化合物(fl)起反應(yīng)以獲得縮醛化合物，然后在酸性條件下對(duì)其進(jìn)行水解。如上所述制備化合物(b)。縮醛化反應(yīng)可以在上述疏質(zhì)子溶劑中或沒有溶劑下通過化合物(b)與等摩爾或更多、優(yōu)選等摩爾至50摩爾的化合物(f1)起反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。利用鈉、鉀、氫化鈉、甲醇鈉、叔丁醇鉀、或類似物，可以從相應(yīng)的醇制備化合物(fl)。反應(yīng)溫度優(yōu)選為0至300℃，更優(yōu)選為20至150℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至24小時(shí)。
在使用化合物(f2)的情況下，縮醛化合物可以通過以下方法獲得通過上述方法把化合物(p)的羥基轉(zhuǎn)化成醇化物，然后在上述疏質(zhì)子溶劑中或沒有溶劑下其與等摩爾或更多量的、優(yōu)選等摩爾至100摩爾量的化合物(f2)起反應(yīng)。反應(yīng)溫度優(yōu)選為0至300℃，更優(yōu)選為20至150℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至24小時(shí)。
在使用化合物(f3)的情況下，縮醛化合物可以通過化合物(f3)與化合物(a)、(b)、(d)、(h)、(i)、或(k)起反應(yīng)而獲得。如上所述制備化合物(a)、(b)、(d)、(h)、(i)、或(k)。在與化合物(f3)的反應(yīng)中，溶劑并不特別受到限制，但反應(yīng)優(yōu)選在上述疏質(zhì)子溶劑中進(jìn)行。化合物(f3)的加入比率優(yōu)選為化合物(a)、(b)、(d)、(h)、(i)、或(k)的等摩爾或更多、更優(yōu)選為等摩爾至10摩爾。反應(yīng)溫度優(yōu)選為-30至200℃，更優(yōu)選為0至150℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至24小時(shí)。在使用化合物(k)的情況下，可以適當(dāng)?shù)厥褂每s合劑如DCC或EDC。任何縮醛化反應(yīng)可以在光屏蔽下進(jìn)行。如此獲得的縮醛化合物可以通過上述純化方法加以純化或直接可以用在接著的醛形成反應(yīng)中。
醛化合物可以通過在0.1至50％的水溶液中水解縮醛化合物進(jìn)行制備，其中水溶液用乙酸、磷酸、硫酸、或鹽酸等調(diào)節(jié)到pH1至4。反應(yīng)溫度優(yōu)選為-20至100℃，更優(yōu)選為0至80℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至24小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至10小時(shí)。該反應(yīng)可以在光屏蔽下進(jìn)行。形成的化合物可以通過上述純化方法加以純化。
(式中，R1和R2各自是具有1至3個(gè)碳原子的烴基并且彼此可以相同或不同，以及它們可以一起形成環(huán)；M是鈉或鉀；W是選自Cl、Br、以及I的鹵素原子；以及t是1至5的整數(shù)。)(制備(c)的方法)巰基化合物(c)可以通過化合物(b)與硫羥形成劑如硫脲起反應(yīng)而獲得。如上所述制備化合物(b)。硫羥形成反應(yīng)是在水、乙醇、或乙腈等溶劑中或在沒有溶劑的條件下進(jìn)行。硫脲的使用比率是化合物(b)的等摩爾或更多、優(yōu)選等摩爾至50摩爾。反應(yīng)溫度優(yōu)選為0至300℃，更優(yōu)選為20至150℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至24小時(shí)。反應(yīng)后，巰羥化合物可以通過對(duì)生成的噻唑鹽進(jìn)行堿解而獲得。形成的化合物可以通過上述純化方法加以純化。
此外，上述巰羥化合物也可以通過化合物(b)與下述化合物(c1)起反應(yīng)、接著用伯胺進(jìn)行分解而獲得?；衔?b)與化合物(c1)的反應(yīng)是在上述疏質(zhì)子溶劑中或沒有溶劑下進(jìn)行。化合物(c1)的使用比率是化合物(b)的等摩爾或更多、優(yōu)選等摩爾至50摩爾。反應(yīng)溫度優(yōu)選為0至300℃，更優(yōu)選為20至80℃。反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10分鐘至48小時(shí)，更優(yōu)選為30分鐘至24小時(shí)。其后的用伯胺進(jìn)行的堿分解是在上述疏質(zhì)子溶劑中或沒有溶劑下進(jìn)行。要使用的伯胺并不受到特別限制，但優(yōu)選包括氨、甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、己胺、環(huán)己胺、乙醇胺、丙醇胺、以及丁醇胺。當(dāng)然，可以使用這些伯胺作為溶劑。形成的化合物可以通過上述純化方法加以純化。
根據(jù)本發(fā)明，可以獲得用支鏈聚亞烷基二醇氧基修飾的生物相關(guān)物質(zhì)。該生物相關(guān)物質(zhì)除了與聚亞烷基二醇氧基的連接部分之外都通過醚鍵所形成，因此可以預(yù)期較高的穩(wěn)定性而不會(huì)分解成單鏈。所以，通過用支鏈聚亞烷基二醇經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)，就可以提供具有改善體內(nèi)行為的生物相關(guān)物質(zhì)。本發(fā)明的生物相關(guān)物質(zhì)的中間體是新穎的的化合物，具有可以在甘油骨架1-位的伯碳與生物相關(guān)物質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)基，并在2-位和3-位具有聚亞烷基二醇鏈。
實(shí)施例下面將基于實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明。并且，使用1H-NMR和GPC來分析和鑒定實(shí)施例中的化合物。
1H-NMR分析的方法在1H-NMR分析中，使用由Nippon enshi Datum K.K.制造的JNM-ECP400。在NMR數(shù)據(jù)中的積分值是理論值。
GPC分析方法
在GPC分析中，采用SHODEX GPC SYSTEM-11作為GPC系統(tǒng)，并在下述條件下進(jìn)行測(cè)量顯影溶劑四氫呋喃；流速1ml/min；柱SHODEX KF-801、KF-803、KF-804(內(nèi)徑8mm×30cm)；柱溫度40℃；檢測(cè)器RI×8；試樣量1mg/g，100μl。
在GPC測(cè)定值中，同時(shí)記錄了主峰的分析值和全部峰的分析值，該主峰是通過在轉(zhuǎn)折點(diǎn)垂直于基線切割洗脫曲線而獲得以除去高分子量雜質(zhì)和低分子量雜質(zhì)，以及全部峰是從洗脫起點(diǎn)至洗脫終點(diǎn)的所有峰。
Mn表示數(shù)均分子量，Mw表示重均分子量，以及Mp表示峰頂部分子量。
為了測(cè)量含水量，使用Karl Fisher水分儀(由Metrome-Shibata制造的7S8/3-20型)以及使用由Sigma Aldrich制造的“HYDRANAL-composite 2”作為Karl Fisher試劑。
(實(shí)施例1)化合物(p)的合成(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量約＝10000的情況)(實(shí)施例1-1)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、以及攪拌器?000ml圓底燒瓶中加入132.2g(1.0mol)的2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇、231.4g(1.2mol)28％的甲醇鈉甲醇溶液、以及500ml甲苯，在往其中引入氮?dú)獾那闆r下，減壓回流甲苯1小時(shí)以通過蒸餾除去甲醇。在保持溶液在80℃的同時(shí)，利用滴液漏斗經(jīng)兩小時(shí)滴加126.6g(1.0mol)芐基氯，接著再反應(yīng)兩小時(shí)。從反應(yīng)液體除去溶劑并蒸餾純化(沸點(diǎn)93-95℃/266Pa)，獲得4-(芐氧甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)1.36，1.42(3H，3H，s，C(CH3)2)，3.45-3.57(2H，m，CH2O-C(CH3)2)，3.73-3.76(1H，m，CHO-C(CH3)2)，4.03-4.07，4.28-4.32(2H，m，CH2O-CH2Ph)，4.57(2H，q，-CH2Ph)，7.15-7.40(5H，m，-CH2Ph)(Ph表示苯基)。
(實(shí)施例1-2)在1L燒杯中加入222g(1.0mol)在實(shí)施例1-1中純化的4-(芐氧甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)、250ml乙醇、以及400ml蒸餾水，然后用磷酸調(diào)節(jié)到pH2。在往其中引入氮?dú)獾那闆r下，加熱溶液到70℃。在反應(yīng)1.5小時(shí)后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液到pH7.0，把生成的鹽吸附到吸附劑“KYOWAAD 1000”(由協(xié)和化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)上，然后除去溶劑，獲得3-芐氧基-1，2-丙二醇。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.50-3.71(4H，m，CH2OH，CH2O-CH2Ph)，3.86-3.91(1H，m，CHOH)，4.54(2H，m，-CH2Ph)，7.27-7.38(5H，m，-CH2Ph)。
(實(shí)施例1-3)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍堋⒁约皵嚢杵鞯?00ml圓底燒瓶中加入27.3g(0.15mol)的3-芐氧基-1，2-丙二醇、127g無水甲苯、以及0.9g(39mmol26mol％)金屬鈉。在往其中引入氮?dú)獾那闆r下，在室溫下進(jìn)行攪拌直到金屬鈉溶解。把該溶液加入到5L高壓釜中并用氮?dú)馓鎿Q大氣，接著加熱到100℃。然后，在100至150℃并在壓力為1MPa或更低的條件下往其中加入1473g(33.5mol)環(huán)氧乙烷，接著再繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)。在減壓下除去未反應(yīng)的環(huán)氧乙烷氣體，然后冷卻到60℃并用85％的磷酸水溶液調(diào)節(jié)到pH7.5，獲得以下化合物(p1)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.40-3.80(901H，m，-CH2O(CH2CH2O)mH，CHO(CH2CH2O)mH，CH2O CH2Ph)，4.54(2H，s，-CH2Ph)，7.27-7.38(5H，m，-CH2Ph)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)9978；重均分子量(Mw)10171；多分散性(Mw/Mn)1.019；峰頂部分子量(Mp)10044；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)9865；重均分子量(Mw)10114；多分散性(Mw/Mn)1.025；峰頂部分子量(Mp)10044。
(p1)m＝約112(實(shí)施例1-4)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍堋嚢杵?、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的500ml圓底燒瓶中加入100g(10mmol)上述化合物(p1)和320g甲苯，然后加熱回流以共沸除去水。在冷卻到室溫后，往其中加入10.12g(100mmol)三乙胺和6.87g(60mmol)甲磺酰氯，接著在40℃反應(yīng)6小時(shí)。過濾反應(yīng)液體，并把濾液轉(zhuǎn)移到裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍堋嚢杵?、以及冷凝管?00ml圓底燒瓶中。然后，往其中加入19.3g(100mmol)28％的甲醇鈉甲醇溶液，接著在70℃反應(yīng)6小時(shí)。其后，把27g吸附劑“KYOWAAD 700”(由協(xié)和化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)加入反應(yīng)液體，并進(jìn)一步在70℃下攪拌1小時(shí)以吸附過量的甲醇鈉。在過濾反應(yīng)液體后，把濾液加入到1L燒杯并通過加入300g乙酸乙酯和350g己烷進(jìn)行結(jié)晶。把沉淀的晶體過濾收集到1L燒杯中，并加入400g乙酸乙酯在40℃下加熱溶解。其后，加入300g己烷并再次進(jìn)行結(jié)晶。過濾收集沉淀的晶體并干燥，獲得以下化合物(p2)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(901H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，CH2OCH2Ph)，4.54(2H，s，-CH2Ph)，7.27-7.38(5H，m，-CH2Ph)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)10320；重均分子量(Mw)10551；多分散性(Mw/Mn)1.022；峰頂部分子量(Mp)10390；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)10128；重均分子量(Mw)10452；多分散性(Mw/Mn)1.032；峰頂部分子量(Mp)10390。
(P2)m＝約112(實(shí)施例1-5)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍堋嚢杵?、以及冷凝管?00ml圓底燒瓶中加入15g上述化合物(p2)、以及15g 5％的鈀-碳(50％水合產(chǎn)物)。在用氮?dú)馓鎿Q后，往其中加入300ml甲醇和150ml環(huán)己烯，并加熱至52至55℃溫和回流，反應(yīng)5小時(shí)。在反應(yīng)混合物冷卻到室溫后，過濾除去鈀-碳并濃縮濾液。通過加入50ml乙酸乙酯和50ml己烷使?jié)饪s物結(jié)晶。過濾收集生成的晶體并干燥，獲得以下化合物(p3)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(901H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，CH2OH)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)10069；重均分子量(Mw)10227；多分散性(Mw/Mn)1.016；峰頂部分子量(Mp)10351；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)9860；重均分子量(Mw)10294；多分散性(Mw/Mn)1.044；峰頂部分子量(Mp)10351。
(P3)m＝約112(實(shí)施例2)甲磺酸鹽化合物的合成(組I(b)，Y＝CH3)(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量約＝10000的情況)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的200ml圓底燒瓶中加入20g(2mmol)上述化合物(p3)和75g甲苯，然后加熱回流以共沸除去水。在冷卻到室溫后，往其中加入1.012g(10mmol)三乙胺和0.687g(6mmol)甲磺酰氯，接著在40℃反應(yīng)6小時(shí)并在50℃再反應(yīng)1小時(shí)。過濾反應(yīng)液體，并把1.0g吸附劑“KYOWAAD1000”(由協(xié)和化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)加入濾液，然后進(jìn)一步在60℃攪拌1小時(shí)以吸附作為副產(chǎn)物的甲磺酸的三乙胺鹽。在過濾反應(yīng)液體后，把濾液加入到500ml燒杯中并通過加入100ml乙酸乙酯和150ml己烷進(jìn)行結(jié)晶。把沉淀的晶體過濾收集到300ml燒杯中，并加入100ml乙酸乙酯在40℃加熱溶解。其后，加入100ml己烷再次進(jìn)行結(jié)晶。過濾收集沉淀的晶體并干燥，獲得以下甲磺酸鹽化合物(p4)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.08(3H，s，-SO3CH3)，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(899H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，4.27-4.44(2H，m，-CH2OSO3CH3)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)10054，重均分子量(Mw)10214，多分散性(Mw/Mn)1.016，峰頂部分子量(Mp)10442；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)9778，重均分子量(Mw)10252，多分散性(Mw/Mn)1.049，峰頂部分子量(Mp)10442。
(P4)m＝約112(實(shí)施例3)氨基化合物的合成(組II(j))(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量約＝10000的情況)在裝有溫度計(jì)、攪拌器、以及冷凝管的100ml圓底燒瓶中加入1g(0.1mmol)上述甲磺酸鹽化合物(p4)和50ml的28％氨水，在50℃下攪拌36小時(shí)。液體溫度提高到65℃并通過往其中引入氮?dú)?小時(shí)來除去氨。在冷卻到室溫后，往其中加入10g氯化鈉，接著用10ml氯仿提取三次。用硫酸鈉干燥生成的氯仿層并在過濾后蒸發(fā)除去氯仿。然后，將100ml己烷加入到生成的濃縮物以實(shí)現(xiàn)再沉淀。過濾收集沉淀的晶體并干燥，獲得以下化合物(p5)。
1H-NMR(D2O，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)H2O＝4.7ppm)；δ(ppm)3.38(6H，s，-CH3)，2.93-3.11(2H，m，-CH2NH2)，3.40-3.80(899H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3)。
(P5)m＝約112(實(shí)施例4)醛化合物的合成(組I(f))(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量約＝10000的情況)(實(shí)施例4-1)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的200ml圓底燒瓶中加入10g(1mmol)上述甲磺酸鹽化合物(p4)和40ml甲苯，然后加熱回流以共沸除去水，接著冷卻到室溫。另一方面，在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的100ml圓底燒瓶中加入14.8g(0.1mol)的3，3-乙氧基-1-丙二醇和40ml甲苯，然后加熱回流以共沸除去水。在冷卻到室溫后，加入0.36g(15.6mmol)金屬鈉并在室溫下攪拌2小時(shí)直到它被溶解。在證實(shí)金屬鈉溶解后，把反應(yīng)液體加入到包含化合物(p4)的圓底燒瓶(如上所述已從其中除去水)，接著在110℃反應(yīng)12小時(shí)。在反應(yīng)液體冷卻到40℃以后，加入0.36g(20mmol)離子交換水，并攪拌30分鐘。然后，往其中加入50ml的20％氯化鈉水溶液并用85％磷酸將水層調(diào)節(jié)到pH7.0。在分離上部甲苯層以后，用氯仿提取水層兩次。合并甲苯層和氯仿層并用硫酸鈉干燥。過濾后，蒸發(fā)除去甲苯和氯仿以進(jìn)行濃縮。加入50ml乙酸乙酯加熱溶解濃縮物，然后加入50ml己烷以沉淀晶體。過濾收集生成的晶體并加入50ml乙酸乙酯加熱溶解，然后加入50ml己烷以再次沉淀晶體。此再沉淀操作重復(fù)三次。其后，過濾收集沉淀的晶體并干燥，獲得以下縮醛化合物(p6)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)1.20(6H，t，-CH2CH2CH(OCH2CH3)2)，1.88-1.92(2H，m，-CH2CH2CH(OCH2CH3)2)，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(907H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3)，CHO(CH2CH2O)mCH3，-CH2-O-CH2CH2CH(OCH2CH3)2)，4.64(1H，t，-CH2CH2CH(OCH2CH3)2)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)9898，重均分子量(Mw)10076，多分散性(Mw/Mn)1.018，峰頂部分子量(Mp)10215；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)9297，重均分子量(Mw)9932，多分散性(Mw/Mn)1.068，峰頂部分子量(Mp)10215。
(P6)m＝約112
(實(shí)施例4-2)在200ml燒杯中稱量4g生成的縮醛化合物(p6)。然后，加入80g離子交換水以溶解晶體并用85％磷酸將溶液調(diào)節(jié)到pH1.5，接著在室溫?cái)嚢?小時(shí)。其后，加入16g氯化鈉并溶解，然后用30％氫氧化鈉水溶液將整體調(diào)節(jié)到pH7.0，接著用氯仿提取。用硫酸鈉干燥生成的氯仿層，并在過濾后，蒸發(fā)除去氯仿以進(jìn)行濃縮。在濃縮液中加入30ml甲苯和30ml乙酸乙酯加熱溶解，然后加入60ml己烷以沉淀晶體，其通過過濾加以收集。把生成的晶體加入到200ml燒杯并加入30ml甲苯和30ml乙酸乙酯加熱溶解，然后加入60ml己烷以再次沉淀晶體，過濾收集沉淀的晶體并干燥，獲得以下醛化合物(p7)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)2.65(2H，m，CH2COH)，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(903H，m，-CH2O(CH2CH2O)m，CHO(CH2CH2O)m，CH2OCH2CH2COH)，9.78(1H，m，CH2COH)。
(P7)m＝約112(實(shí)施例5)在50ml的100mM磷酸二氫鈉中加入并溶解63mg(20mM)氰基三氫硼酸鈉。在1ml的該溶液中加入5.0mg(0.1μmol)的OVA(ALUBUMIN，CHIKEN EGG，分子量約40000)和100mg的醛化合物(p7)，接著在室溫?cái)嚢?2小時(shí)。用離子交換水將反應(yīng)液體稀釋5倍，然后將20μl稀釋溶液與20μl的Tris-SDS試樣處理液混合，接著在沸水浴上加熱2.5分鐘。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(4至20％)對(duì)經(jīng)處理的液體進(jìn)行分析。該凝膠通過CBB染色進(jìn)行染色。結(jié)果示于圖1。(A)是OVA+醛化合物，(B)是單獨(dú)OVA，以及(C)是標(biāo)記(Bio-rad Broad range SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)物)，其從頂部顯示分子量201000、130000、94000、48600、36400、29800、20600、以及6600的帶。
根據(jù)這些結(jié)果，在(A)中，原料OVA的帶沒有殘留，但觀察到對(duì)應(yīng)于在每OVA1分子的1至15個(gè)地方用化合物(p6)修飾的情況的分子量的帶。
(實(shí)施例6)為了評(píng)價(jià)本發(fā)明的化合物的穩(wěn)定性，合成了以下典型化合物并比較其穩(wěn)定性。
(實(shí)施例6-1)在50ml甲醇中溶解63mg(20mM)氰基三氫硼酸鈉。在2ml的該溶液中加入0.5g醛化合物(p7)和50μl正丁胺，接著在室溫?cái)嚢?8小時(shí)。蒸發(fā)除去甲醇以進(jìn)行濃縮，然后通過加入20ml氯仿和20ml的20％氯化鈉溶液對(duì)濃縮物進(jìn)行提取。提取操作重復(fù)三次。用硫酸鈉干燥生成的氯仿層，并在過濾后進(jìn)行濃縮。通過加入20ml乙酸乙酯加熱溶解生成的濃縮物，然后加入30ml己烷以沉淀晶體，其通過過濾加以收集。把生成的晶體加入到100ml燒杯并加入20ml乙酸乙酯加熱溶解，然后加入20ml己烷以再次沉淀晶體，其通過過濾加以收集并干燥，獲得以下化合物(p8)。
(P8)m＝約112(實(shí)施例6-2)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)(加速老化試驗(yàn))稱量以上合成的化合物(p8)12mg，然后往其中加入1ml的100mM磷酸鹽緩沖液(pH＝8.8)，接著在75℃的水浴上攪拌12小時(shí)。在開始攪拌前和完成攪拌后進(jìn)行GPC測(cè)量。結(jié)果示于圖2和圖3。圖2是開始前試樣的GPC圖而圖3是加熱后(p8)試樣的GPC圖。
(比較實(shí)施例1)稱量107mg分子量約為10700的以下化合物(p9)(購(gòu)自Shearwater Polymers公司)，然后往其中加入10μl正丁胺和1ml氯仿，接著在室溫?cái)嚢?8小時(shí)。蒸發(fā)除去氯仿以進(jìn)行濃縮，加入20ml乙酸乙酯加熱溶解濃縮物，然后加入30ml己烷以沉淀晶體，通過過濾加以收集。把生成的晶體加入到100ml燒杯并加入20ml乙酸乙酯加熱溶解，然后加入20ml己烷以再次沉淀晶體，通過過濾加以收集并干燥，獲得以下化合物(p10)。
(P9)m＝約118 (P10)m＝約118利用上述合成的化合物(p10)，進(jìn)行和實(shí)施例6-2相同的操作并進(jìn)行GPC測(cè)量。結(jié)果示于圖4和圖5。圖4是開始前(p10)試樣的GPC圖而圖5是加熱后(p10)試樣的GPC圖。
根據(jù)圖2和圖3的結(jié)果，本發(fā)明的化合物并不水解并呈現(xiàn)較高的穩(wěn)定性。另一方面，根據(jù)圖4和圖5的結(jié)果，在比較實(shí)施例(p10)中，形成了具有1/2分子量的化合物，數(shù)量為約25％，尿烷鍵被裂解并且支鏈聚乙二醇被分解成單鏈。
(實(shí)施例7)化合物(p)的合成(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量約＝19000的情況)(實(shí)施例7-1)以與實(shí)施例1-3相同的操作，加入2850g(64.8mol)環(huán)氧乙烷并獲得以下化合物(p11)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.40-3.80(1733H，m，-CH2O(CH2CH2O)mH，CHO(CH2CH2O)mH，CH2OCH2Ph)，4.54(2H，s，-CH2Ph)，7.27-7.38(5H，m，-CH2Ph)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)18521，重均分子量(Mw)18758，多分散性(Mw/Mn)1.013，峰頂部分子量(Mp)19108；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)18403，重均分子量(Mw)18913，多分散性(Mw/Mn)1.028，峰頂部分子量(Mp)19108。
(P11)m＝約216(實(shí)施例7-2)以與實(shí)施例1-4相同的操作，使用100g(5mmol)(p11)、320g甲苯、5.06g(50mmol)三乙胺、3.44g(30mmol)甲磺酰氯、以及9.65g(50mmol)的28％甲醇鈉甲醇溶液，獲得以下化合物(p12)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1733H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，CH2OCH2Ph)，4.54(2H，s，-CH2Ph)，7.27-7.38(5H，m，-CH2Ph)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)18365，重均分子量(Mw)18602，多分散性(Mw/Mn)1.013，峰頂部分子量(Mp)18992；
<全峰>數(shù)均分子量(Mn)18290，重均分子量(Mw)18861，多分散性(Mw/Mn)1.031，峰頂部分子量(Mp)18992。
(P12)m＝約216(實(shí)施例7-3)以與實(shí)施例1-5相同的操作獲得以下化合物(p13)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1733H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，CH2OH)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)18395，重均分子量(Mw)18632，多分散性(Mw/Mn)1.013，峰頂部分子量(Mp)18989；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)18146，重均分子量(Mw)18750，多分散性(Mw/Mn)1.033，峰頂部分子量(Mp)18989。
(P13)m＝約216
(實(shí)施例8)羧基化合物(組II(k))和琥珀酰亞胺酯化合物(組I(a))的合成(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量約＝19000的情況)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的200ml圓底燒瓶中加入20g(1.0mmol)上述化合物(p13)、50mg乙酸鈉、以及100ml甲苯，然后回流加熱以共沸除去水。然后，把137mg(1.2mmol)戊二酸酐加入反應(yīng)液體，接著在105℃反應(yīng)12小時(shí)。完成反應(yīng)后，反應(yīng)液體冷卻到40℃，然后往其中加入150mg(1.3mmol)N-羥基琥珀酰亞胺和289mg(1.4mmol)二環(huán)己基碳二亞胺，接著反應(yīng)6小時(shí)。過濾反應(yīng)液體以除去沉淀的尿素，并在濾液中加入50ml乙酸乙酯后，加入150ml己烷以沉淀晶體。過濾收集沉淀的晶體并加入400ml乙酸乙酯加熱溶解。然后，往其中加入100ml己烷以再次對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)晶。過濾收集沉淀的晶體并干燥，獲得以下琥珀酰亞胺酯化合物(p14)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(PPm)2.07(2H，m，-OCOCH2CH2CH2COON-)，2.50(2H，t，-OCOCH2CH2CH2COON-)，2.72(2H，t，-OCOCH2CH2CH2COON-)，2.84(4H，s，succinimide(琥珀酰亞胺))，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1731H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3)，4.10-4.30(2H，m，-CH2OCOCH2CH2CH2COON-)。

(P14)m＝約216(實(shí)施例9)碳酸對(duì)硝基苯酯化合物(組II(d))的合成(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量約＝19000的情況)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍堋嚢杵?、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的200ml圓底燒瓶中加入20g(1.0mmol)上述化合物(p13)以及100ml甲苯，然后回流加熱以共沸除去水。反應(yīng)液體冷卻到80℃，然后往其中加入三乙胺和氯甲酸對(duì)硝基苯酯，接著在80℃反應(yīng)5小時(shí)。完成反應(yīng)后，過濾反應(yīng)液體，并在濾液中加入100ml乙酸乙酯后，加入200ml己烷以沉淀晶體。過濾收集沉淀的晶體并加入100ml乙酸乙酯加熱溶解。然后，往其中加入100ml己烷以再次對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)晶。結(jié)晶操作總計(jì)重復(fù)5次。干燥過濾收集的晶體，獲得以下碳酸對(duì)硝基苯酯化合物(p15)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1731H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3)，4.30-4.50(2H，m，-CH2OCOOPhNO2)，7.39(2H，d，-PhNO2)，8.28(2H，d，-PhNO2)。
(P15)m＝約216
(實(shí)施例10)化合物(p)的合成(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝約15，以及分子量約＝19500的情況)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍堋嚢杵?、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的500ml圓底燒瓶中加入67g(3.5mmol)在實(shí)施例7-3中獲得的化合物(p13)以及400ml甲苯，然后加熱回流以共沸除去水。反應(yīng)液體冷卻到40℃，然后往其中加入0.41g(2.1mmol)的28％甲醇鈉甲醇溶液。加熱到70℃以后，通過氮?dú)夥序v蒸發(fā)除去約200ml甲苯-甲醇混合溶液。把該溶液加入到5L高壓釜并用氮?dú)馓鎿Q大氣，接著加熱到100℃。然后，在100至150℃并在1MPa或更低的壓力下往其中加入9.2g(0.2mol)環(huán)氧乙烷，接著再繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。減壓除去未反應(yīng)的環(huán)氧乙烷氣體和甲苯，然后冷卻到60℃并用85％磷酸水溶液調(diào)節(jié)到pH7.5，獲得以下化合物(p16)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1853H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，-CH2O(CH2CH2O)nH)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)19153，重均分子量(Mw)19462，多分散性(Mw/Mn)1.016，峰頂部分子量(Mp)19612；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)18473，重均分子量(Mw)19087，多分散性(Mw/Mn)1.033，峰頂部分子量(Mp)19612。

(P16)m＝約216 n＝約15(實(shí)施例11)甲磺酸鹽(酯)化合物的合成(組I(b)，Y＝CH3)(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n約＝15，以及分子量約＝19500的情況)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的200ml圓底燒瓶中加入10g(0.5mmol)上述化合物(p16)和75g甲苯，然后加熱回流以共沸除去水。在冷卻到室溫后，往其中加入0.253g(2.5mmol)三乙胺和0.172g(1.5mmol)甲磺酰氯，接著在40℃反應(yīng)6小時(shí)并在50℃再反應(yīng)1小時(shí)。過濾反應(yīng)液體，并把0.5g吸附劑“KYOWAAD 1000”加入到濾液中，然后在60℃下攪拌1小時(shí)，吸附作為副產(chǎn)物的甲磺酸的三乙胺鹽。在過濾反應(yīng)液體后，把濾液加入到300ml燒杯并通過加入50ml乙酸乙酯和70ml己烷進(jìn)行結(jié)晶。把沉淀的晶體過濾收集到300ml燒杯中并加入50ml乙酸乙酯在40℃加熱條件下溶解。其后，加入50ml己烷并再次進(jìn)行結(jié)晶。過濾收集沉淀的晶體并干燥，獲得以下甲磺酸酯化合物(p17)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.08(3H，s，-SO3CH3)，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1851H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，-CH2O(CH2CH2O)nSOOCH3)，4.37-4.39(2H，m，-CH2O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OSOOCH3)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)19253，重均分子量(Mw)19601，多分散性(Mw/Mn)1.018，峰頂部分子量(Mp)19770；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)18400，重均分子量(Mw)19140，多分散性(Mw/Mn)1.040，峰頂部分子量(Mp)19770。
(P17)m＝約216 n＝約15(實(shí)施例12)醛化合物的合成(組I(f))(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n約＝15，以及分子量約＝19500的情況)(實(shí)施例12-1)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍堋嚢杵?、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的200ml圓底燒瓶中加入10g(0.5mmol)上述甲磺酸酯化合物(p17)和40ml甲苯，然后加熱回流下以共沸除去水，接著冷卻到室溫。另一方面，在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的100ml圓底燒瓶中加入7.4g(50mmol)的3，3-二乙氧基-1-丙醇和40ml甲苯，然后加熱回流以共沸除去水。在冷卻到室溫后，加入0.17g(7.4mmol)金屬鈉并在室溫下攪拌2小時(shí)直到它被溶解。在證實(shí)金屬鈉溶解后，把反應(yīng)液體加入到包含化合物(p17)的圓底燒瓶(如上所述已從其中除去水)，接著在70℃反應(yīng)4小時(shí)。在反應(yīng)液體冷卻到40℃以后，加入0.18g(10mmol)離子交換水，并攪拌30分鐘。然后，往其中加入30ml的20％氯化鈉水溶液并用85％磷酸將水層調(diào)節(jié)到pH7.0。在分離上部甲苯層以后，用氯仿提取水層兩次。合并甲苯層和氯仿層并用硫酸鈉干燥。過濾后，蒸發(fā)除去甲苯和氯仿以進(jìn)行濃縮。加入50ml乙酸乙酯加熱溶解濃縮物，然后加入50ml己烷以沉淀晶體。過濾收集生成的晶體，加入50ml乙酸乙酯加熱溶解，然后加入50ml己烷以再次沉淀晶體。此再沉淀操作重復(fù)三次。其后，過濾收集沉淀的晶體并干燥，獲得以下縮醛化合物(p18)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)1.20(6H，t，-CH2CH2CH(OCH2CH3)2)，1.88-1.92(2H，m，-CH2CH2CH(OCH2CH3)2)，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1857H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，-CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2CH(OCH2CH3)2)，4.64(1H，t，-CH2CH2CH(OCH2CH3)2)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)19318，重均分子量(Mw)19699，多分散性(Mw/Mn)1.020，峰頂部分子量(Mp)19770；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)18302，重均分子量(Mw)19168，多分散性(Mw/Mn)1.047，峰頂部分子量(Mp)19770。
(P18)m＝約216n＝約15(實(shí)施例12-2)在100ml燒杯中稱量2g生成的縮醛化合物(p18)。然后，加入40g離子交換水以溶解晶體并用85％磷酸將溶液調(diào)節(jié)到pH1.5，接著在室溫?cái)嚢?小時(shí)。其后，加入8g氯化鈉并溶解，然后用30％氫氧化鈉水溶液將整體調(diào)節(jié)到pH7.0，接著用氯仿提取三次。用硫酸鈉干燥生成的氯仿層，并在過濾后，蒸發(fā)除去氯仿以進(jìn)行濃縮。加入30ml甲苯和30ml乙酸乙酯加熱溶解濃縮物，然后加入60ml己烷以沉淀晶體，通過過濾加以收集。把生成的晶體加入到200ml燒杯并加入30ml甲苯和30ml乙酸乙酯加熱溶解，然后加入60ml己烷以再次沉淀晶體，其通過過濾加以收集并干燥，獲得以下醛化合物(p19)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)2.66-2.69(2H，m，CH2COH)，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1855H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，-CH2O(CH2CH2O)nCH2CH2COH)，9.79(1H，t，-CH2CH2COH)。
(P19)m＝約216 n＝約15(實(shí)施例13)甲磺酸酯化合物的合成(組I(b)，Y＝CH3)(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量約＝19000的情況)利用化合物(p13)作為原料，以與實(shí)施例2同樣的方法，獲得以下甲磺酸酯化合物(p20)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.08(3H，s，-SO3CH3)，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1731H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3)，4.27-4.44(2H，m，-CH2OSO3CH3)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)18435，重均分子量(Mw)18682，多分散性(Mw/Mn)1.013，峰頂部分子量(Mp)18740；
<全峰>數(shù)均分子量(Mn)18081，重均分子量(Mw)18721，多分散性(Mw/Mn)1.035，峰頂部分子量(Mp)18740。
(P20)m＝約216(實(shí)施例14)氨基化合物的合成(組II(j))(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量＝約19000的情況)利用化合物(p20)作為原料，以與實(shí)施例3相同的方法，獲得以下氨基化合物(p21)。
1H-NMR(D2O，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)H2O＝4.7ppm)；δ(ppm)3.38(6H，s，-CH3)，2.93-3.11(2H，m，-CH2NH2)，3.40-3.80(1731H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3)。
(P21)m＝約216
(實(shí)施例15)馬來酰亞胺化合物的合成(組I(e))(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量＝約19000的情況)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、以及冷凝管?00ml圓底燒瓶中加入7.5g(0.35mmol)上述化合物(p21)、35ml乙酸乙酯、以及73μl三乙胺，接著在45℃加熱溶解。然后，往其中加入0.14g(0.525mmol)N-琥珀酰亞胺基3-馬來酰亞胺基丙酸酯(Succinimidyl 3-maleimidopropionate)，接著在45℃反應(yīng)4小時(shí)。在完成反應(yīng)后，往其中加入0.5g吸附劑“KYOWAAD 700”和0.5g“KYOWAAD 1000”并在45℃攪拌1小時(shí)。過濾反應(yīng)液體并把50ml己烷加入到濾液中以沉淀晶體，通過過濾加以收集。把生成的晶體加入到200ml燒杯并加入50ml乙酸乙酯加熱溶解。然后加入50ml己烷以再次沉淀晶體，通過過濾加以收集并干燥，獲得以下馬來酰亞胺化合物(p22)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)2.51(2H，t，-NHCOCH2CH2)，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1735H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，CH2NHCOCH2CH2)，6.69(2H，s，CH＝CH)，6.86(1H，t，CH2NHCOCH2CH2)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)18425，重均分子量(Mw)18672，多分散性(Mw/Mn)1.013，峰頂部分子量(Mp)18742；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)17924，重均分子量(Mw)19086，多分散性(Mw/Mn)1.065，峰頂部分子量(Mp)18742。
(P22)m＝約216(實(shí)施例16)化合物(p)的合成(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量＝約20000、約45000的情況)(實(shí)施例16-1)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、以及攪拌器?000ml圓底燒瓶中加入132.2g(1.0mol)的2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)-4-甲醇、202.5g(1.05mol)28％的甲醇鈉甲醇溶液、以及500ml甲苯。在往其中引入氮?dú)獾那闆r下，減壓回流甲苯1小時(shí)以通過蒸餾除去甲醇。在保持溶液在80℃的同時(shí)，利用滴液漏斗經(jīng)兩小時(shí)滴加126.6g(1.0mol)芐基氯，接著再反應(yīng)兩小時(shí)。完成反應(yīng)后，溫度降低到60℃并加入10g KYOWAAD 600，接著攪拌1小時(shí)。在過濾反應(yīng)液體后，除去溶劑并通過蒸餾純化殘余物(沸點(diǎn)93-95℃/266Pa)，獲得4-(芐氧甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)。
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)1.36，1.42(3H，3H，s，C(CH3)2)，3.45-3.57(2H，m，CH2O-C(CH3)2)，3.73-3.76(1H，m，CHO-C(CH3)2)，4.03-4.07，4.28-4.32(2H，m，CH2O-CH2Ph)，4.57(2H，q，-CH2Ph)，7.15-7.40(5H，m，-CH2Ph)(Ph表示苯基)。
(實(shí)施例16-2)在222g(1.0mol)4-(芐氧甲基)-2，2-二甲基-1，3-二氧戊環(huán)中加入400g蒸餾水，然后用磷酸調(diào)節(jié)到pH2。在往其中引入氮?dú)獾那闆r下，加熱溶液到70℃。在反應(yīng)2小時(shí)后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液到pH7.0。往其中加入1L氯仿并進(jìn)行提取。然后，用硫酸鎂干燥氯仿層并濃縮。其后，過濾濃縮物以除去鹽，從而獲得3-芐氧基-1，2-丙二醇。其NMR數(shù)據(jù)和實(shí)施例1-2相同。
(實(shí)施例16-3)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、以及減壓導(dǎo)管的300ml圓底燒瓶中加入27.3g(0.15mol)的3-芐氧基-1，2-丙二醇、200g無水甲苯、以及0.77g(33.4mmol22.3mol％)金屬鈉。在往其中引入氮?dú)獾那闆r下，把溫度提高到35℃以溶解金屬鈉。把溶液加入到預(yù)先已充分干燥的5L高壓釜中并用氮?dú)馓鎿Q大氣，接著加熱到100℃。然后，在100至150℃并在壓力為1MPa或更低的條件下往其中加入3090g環(huán)氧乙烷，接著再繼續(xù)反應(yīng)1.5小時(shí)。減壓除去未反應(yīng)的環(huán)氧乙烷氣體和甲苯，然后冷卻到70℃，從高壓釜中取2.0kg反應(yīng)液體，并用85％的磷酸水溶液把取出的反應(yīng)液體調(diào)節(jié)到pH7.5，獲得以下化合物(p23)。
(P23) m＝約221
1H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.40-3.80(1773H，m，-CH2O(CH2CH2O)mH，CHO(CH2CH2O)mH，CH2OCH2Ph)，4.54(2H，s，-CH2Ph)，7.27-7.38(5H，m，-CH2Ph)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)18920，重均分子量(Mw)19154，多分散性(Mw/Mn)1.012，峰頂部分子量(Mp)19639；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)18777，重均分子量(Mw)19086，多分散性(Mw/Mn)1.017，峰頂部分子量(Mp)19639。
(實(shí)施例16-4)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍堋嚢杵?、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的2L圓底燒瓶中加入200g(10mmol)上述化合物(p23)和1000g甲苯，然后加熱回流以共沸除去200g甲苯和水。在冷卻到室溫后，加入10.12g(100mmol)三乙胺并加熱到40℃。然后往其中滴入6.87g(60mmol)甲磺酰氯，接著在40℃反應(yīng)3小時(shí)。完成反應(yīng)后，在反應(yīng)液體中加入19.28g(100mmol)28％的甲醇鈉甲醇溶液，接著在40℃反應(yīng)3小時(shí)。降低壓力同時(shí)保持反應(yīng)液體在40℃以蒸發(fā)除去約200g甲醇/甲苯混合溶液，然后過濾除去鹽。然后，把500g甲苯加入到濾液中并把混合物轉(zhuǎn)移到裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的2L圓底燒瓶中。加熱回流以共沸除去200g甲苯和水。在冷卻到室溫后，加入10.12g(100mmol)三乙胺并加熱到40℃。然后往其中加入8.89g(60mmol)甲磺酰氯，接著在40℃反應(yīng)3小時(shí)。完成反應(yīng)后，在反應(yīng)液體中加入19.28g(100mmol)28％的甲醇鈉甲醇溶液，接著在40℃反應(yīng)3小時(shí)。降低壓力同時(shí)保持反應(yīng)液體在40℃以蒸發(fā)除去約200g甲醇/甲苯混合溶液，然后過濾除去鹽。將濾液加熱到50℃，然后往其中加入200g的25％氯化鈉溶液。攪拌后，放置使分層，然后除去下部水層。用水進(jìn)行的洗滌操作重復(fù)兩次。用硫酸鎂干燥上部甲苯層并過濾，然后在濾液中加入1L乙酸乙酯。然后，往其中加入己烷直到結(jié)晶沉淀。過濾收集晶體并干燥，獲得以下化合物(p24)。
(P24)m＝2211H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1773H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，CH2OCH2Ph)，4.54(2H，s，-CH2Ph)，7.27-7.38(5H，m，-CH2Ph)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)19070，重均分子量(Mw)19306，多分散性(Mw/Mn)1.012，峰頂部分子量(Mp)19786；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)18911，重均分子量(Mw)19256，多分散性(Mw/Mn)1.018，峰頂部分子量(Mp)19786。
(實(shí)施例16-5)在壓濾器中加入120g的5％鈀-碳(50％水合產(chǎn)物，由N.E.M.Cat制造)，然后在用氮?dú)馓鎿Q下用500ml無水甲醇進(jìn)行溶劑替換四次以從鈀-碳除去水。在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍堋嚢杵?、以及冷凝管?L圓底燒瓶中加入100g上述化合物(p24)、以及所有已進(jìn)行溶劑替換的鈀-碳。在用氮?dú)馓鎿Q后，往其中加入1200ml無水甲醇和500ml環(huán)己烯，并加熱到30℃反應(yīng)3.5小時(shí)。過濾反應(yīng)液體，然后通過Karl Fisher水分儀測(cè)量濾液的含水量，并測(cè)得為1259ppm。濃縮濾液并加入1L乙酸乙酯，接著加入己烷直到結(jié)晶沉淀。過濾收集生成的晶體并干燥，獲得以下化合物(p25)。
(P25)m＝2211H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1773H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，CH2OH)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)18971，重均分子量(Mw)19204，多分散性(Mw/Mn)1.012，峰頂部分子量(Mp)19687；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)18811，重均分子量(Mw)19158，多分散性(Mw/Mn)1.018，峰頂部分子量(Mp)19687。
(實(shí)施例16-6)在實(shí)施例16-3中，把2.0kg無水甲苯加入到留在高壓釜中的約1kg反應(yīng)液體中。在高壓釜溫度為95℃并在稍微減壓下蒸發(fā)除去1.0kg甲苯，然后用氮?dú)馓鎿Q高壓釜的空氣。在加熱到120℃以后，在100至150℃并在壓力為1MPa或更低的條件下往其中加入1260g環(huán)氧乙烷，接著再繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)。在完成反應(yīng)后，冷卻到70℃，然后用85％的磷酸水溶液把反應(yīng)液體調(diào)節(jié)到pH7.5，獲得以下化合物(p26)。

(P26)m＝約5051H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.40-3.80(4045H，m，-CH2O(CH2CH2O)mH，CHO(CH2CH2O)mH，CH2OCH2Ph)，4.54(2H，s，-CH2Ph)，7.27-7.38(5H，m，-CH2Ph)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)41830，重均分子量(Mw)42621，多分散性(Mw/Mn)1.019，峰頂部分子量(Mp)44594；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)40548，重均分子量(Mw)42059，多分散性(Mw/Mn)1.037，峰頂部分子量(Mp)44594。
(實(shí)施例16-7)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的2L圓底燒瓶中加入270g(6mmol)上述化合物(p26)和1000g甲苯，然后加熱回流以共沸除去200g甲苯和水。在冷卻到室溫后，加入6.65g(65.7mmol)三乙胺并加熱到40℃。然后往其中加入4.51g(39.4mmol)甲磺酰氯，接著在40℃反應(yīng)3小時(shí)。完成反應(yīng)后，在反應(yīng)液體中加入25.3g(131.4mmol)28％的甲醇鈉甲醇溶液，接著在40℃反應(yīng)3小時(shí)。降低壓力同時(shí)保持反應(yīng)液體在40℃以蒸發(fā)除去約200g甲醇/甲苯混合溶液，然后過濾除去鹽。然后，把500g甲苯加入到濾液中并把混合物轉(zhuǎn)移到裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的2L圓底燒瓶中。加熱回流以共沸除去200g甲苯和水。在冷卻到室溫后，加入6.65g(65.7mmol)三乙胺并加熱到40℃。然后往其中再次滴入4.51g(39.4mmol)甲磺酰氯，接著在40℃反應(yīng)3小時(shí)。完成反應(yīng)后，在反應(yīng)液體中加入25.3g(131.4mmol)28％的甲醇鈉甲醇溶液，接著在40℃反應(yīng)3小時(shí)。降低壓力同時(shí)保持反應(yīng)液體在40℃以蒸發(fā)除去約200g甲醇/甲苯混合溶液，然后過濾除去鹽。將濾液加熱到50℃，然后往其中加入200g的25％氯化鈉溶液。攪拌后，放置使分層，然后除去下部水層。用水進(jìn)行的洗滌操作重復(fù)兩次。用硫酸鎂干燥上部甲苯層，然后在濾液中加入1L乙酸乙酯。然后，往其中加入己烷直到結(jié)晶沉淀。過濾收集晶體并干燥，獲得以下化合物(p27)。
(P27) m＝約5051H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(4045H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，CH2OCH2Ph)，4.54(2H，s，-CH2Ph)，7.27-7.38(5H，m，-CH2Ph)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)42206，重均分子量(Mw)43056，多分散性(Mw/Mn)1.020，峰頂部分子量(Mp)45057；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)40990，重均分子量(Mw)42519，多分散性(Mw/Mn)1.037，峰頂部分子量(Mp)45057。
(實(shí)施例16-8)在壓濾器中加入120g的5％鈀-碳(50％水合產(chǎn)物，由N.E.M.Cat制造)，然后在用氮?dú)馓鎿Q下用500ml無水甲醇進(jìn)行溶劑替換四次以從鈀-碳除去水。在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、以及冷凝管?L圓底燒瓶中加入100g上述化合物(p27)、以及所有已進(jìn)行溶劑替換的鈀-碳。在用氮?dú)馓鎿Q后，往其中加入1200ml無水甲醇和500ml環(huán)己烯，并加熱到30℃反應(yīng)3.5小時(shí)。過濾反應(yīng)液體，然后通過Karl Fisher水分儀測(cè)量濾液的含水量，并測(cè)得為2215ppm。濃縮濾液并加入1L乙酸乙酯，接著加入己烷直到結(jié)晶沉淀。過濾收集生成的晶體并干燥，獲得以下化合物(p28)。
(P28)m＝5051H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(4045H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，CH2OH)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)42121，重均分子量(Mw)42946，多分散性(Mw/Mn)1.020，峰頂部分子量(Mp)45057；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)41021，重均分子量(Mw)42450，多分散性(Mw/Mn)1.035，峰頂部分子量(Mp)45057。
(實(shí)施例17)氨基化合物的合成(組II(g))(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量＝約45000的情況)(實(shí)施例17-1)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、以及冷凝管?00ml圓底燒瓶中加入70g上述化合物(p28)和70g離子交換水，然后加熱到40℃以將它們?nèi)芙狻Ｔ谌芙夂?，溶液冷卻到10℃或更低并往其中加入4.38g的50％氫氧化鉀水溶液。其后，經(jīng)2小時(shí)滴加210g丙烯腈同時(shí)保持5至10℃的溫度。在滴加后，再反應(yīng)2小時(shí)并滴加26.25g的8.5％磷酸水溶液，接著中和。在把140g離子交換水加入到反應(yīng)液體中后，混合物被轉(zhuǎn)移到分液漏斗并加入210ml乙酸乙酯。在攪拌后，放置并丟棄上部乙酸乙酯層。用乙酸乙酯進(jìn)行的提取重復(fù)六次。在完成提取后，把65g氯化鈉加入到水層并溶解于其中，然后用280ml氯仿提取。用硫酸鎂干燥生成的氯仿層，過濾，然后濃縮。其后，將700ml乙酸乙酯加入到濃縮液中，溶解于其中。然后，往其中加入己烷直到晶體沉淀。過濾收集晶體并再次在加熱下溶解于700ml乙酸乙酯。在冷卻到室溫后，往其中加入己烷直到結(jié)晶沉淀。過濾收集晶體并干燥，獲得以下腈化合物(p29)。
( P29)m＝5051H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)2.59-2.66(2H，m，-CH2CH2CN)，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(4047H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，CH2OCH2CH2CN)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)41849，重均分子量(Mw)42666，多分散性(Mw/Mn)1.020，峰頂部分子量(Mp)44594；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)40271，重均分子量(Mw)41980，多分散性(Mw/Mn)1.042，峰頂部分子量(Mp)44594。
(實(shí)施例17-2)在1L高壓釜中加入50g化學(xué)式(p29)的腈化合物、500g甲苯、以及4.5g鎳(由N.E.M.Cat制造，5136p)，然后加熱到60℃。用氨加壓高壓釜直到內(nèi)壓達(dá)到0.7MPa，然后用氫氣加壓高壓釜直到內(nèi)壓達(dá)到4.5MPa，接著在130℃反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)后，反應(yīng)液體冷卻到70℃，并重復(fù)用氮?dú)馇宄钡桨蔽断?。取出所有反?yīng)液體并過濾。在濾液冷卻到室溫后，加入己烷直到晶體沉淀。過濾收集晶體并干燥，獲得以下胺化合物(p30)。
(P30)m＝5051H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)1.82-1.90(2H，m，-CH2CH2CH2NH2)，2.90-2.97(2H，m，-CH2CH2CH2NH2)，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(4047H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，CH2OCH2CH2CH2NH2)。
(實(shí)施例18)馬來酰亞胺化合物的合成(組I(e))(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量＝約45000的情況)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、以及冷凝管?00ml圓底燒瓶中加入45g(1mmol)化合物(p30)、42ml乙腈、以及84ml甲苯，然后加熱到40℃以將它們?nèi)芙狻Ｔ诶鋮s到室溫后，在光屏蔽下往其中加入0.51g(5mmol)的N-甲基嗎啉和399mg(1.5mmol)N-琥珀酰亞胺基3-馬來酰亞胺基丙酸酯，接著反應(yīng)3.5小時(shí)。在過濾反應(yīng)液體后，往其中加入840ml乙酸乙酯并加入己烷直到晶體沉淀。過濾收集晶體并加入42ml乙腈和840ml乙酸乙酯，加熱溶解后，加入己烷直到晶體沉淀。然后，過濾收集晶體并干燥，獲得以下化合物(p31)。
(P31)m＝5051H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)1.70-1.78(2H，m，-CH2CH2CH2N)，2.45-2.53(2H，m，-NHCOCH2CH2N)，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(4051H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3，-CH2OCH2CH2CH2NHCOCH2CH2)，6.44(1H，m，NHCO)，6.71(2H，s，-CH＝CH-)。
GPC分析<主峰>數(shù)均分子量(Mn)41918，重均分子量(Mw)42709，多分散性(Mw/Mn)1.019，峰頂部分子量(Mp)44594；<全峰>數(shù)均分子量(Mn)40231，重均分子量(Mw)42602，多分散性(Mw/Mn)1.059，峰頂部分子量(Mp)44594。
(實(shí)施例19)琥珀酰亞胺化合物的合成(組I(a))(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量＝約20000的情況)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的200ml圓底燒瓶中加入10g(0.5mmol)化合物(p25)、0.1g乙酸鈉、以及100ml甲苯，接著進(jìn)行回流以除去水。然后，在反應(yīng)液體中加入285mg(2.5mmol)戊二酸酐，接著在110℃反應(yīng)12小時(shí)。在反應(yīng)液體冷卻后，往其中加入518mg(4.5mmol)N-羥基琥珀酰亞胺和934mg(4.55mmol)DCC，接著在40℃反應(yīng)2小時(shí)。過濾反應(yīng)液體，然后加入己烷直到晶體沉淀。過濾收集晶體并再次溶解于100ml乙酸乙酯和10ml乙腈中。然后，把己烷加入到溶液中直到晶體沉淀。過濾收集晶體并干燥，獲得以下琥珀酰亞胺化合物(p32)。
(P32) m＝2211H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)2.07(2H，m，-OCOCH2CH2CH2COON-)，2.50(2H，t，-OCOCH2CH2CH2COON-)，2.72(2H，t，-OCOCH2CH2CH2COON-)，2.84(4H，s，succinimide(琥珀酰亞胺))，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(1771H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3)，4.10-4.30(2H，m，-CH2OCOCH2CH2CH2COON-)。
(實(shí)施例20)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍堋⒁约皵嚢杵鞯?00ml圓底燒瓶中加入27.3g(0.15mol)3-芐氧基-1，2-丙二醇、135g無水甲苯、以及0.9g(39mmol26mol％)金屬鈉。在往其中引入氮?dú)獾那闆r下，在80℃下進(jìn)行攪拌直到金屬鈉溶解。溶解后，在80℃進(jìn)一步攪拌溶液2小時(shí)。
把反應(yīng)液體加入到預(yù)先充分干燥的5L高壓釜中并進(jìn)行和實(shí)施例16-3、16-6、16-7、以及16-8中相同的操作，獲得和(p28)具有相同結(jié)構(gòu)的化合物(p33)。
(實(shí)施例21)對(duì)在實(shí)施例1-3中用鈉醇化的3-芐氧基-1，2-丙二醇溶液、在實(shí)施例16-3中用鈉醇化的3-芐氧基-1，2-丙二醇溶液、以及在實(shí)施例20中在加入高壓釜以前用鈉醇化的3-芐氧基-1，2-丙二醇溶液進(jìn)行取樣并在下述條件下轉(zhuǎn)化成衍生物，然后通過氣相色譜法(GC)對(duì)它們進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量結(jié)果列于表3。
稱量每種試樣0.2g并通過加入1.0ml吡啶進(jìn)行溶解，然后往其中加入0.8ml六甲基二硅氮烷。在溶液中加入0.4ml三甲基氯硅烷，接著攪拌30分鐘。通過注濾器(PTFE，0.45μm)過濾反應(yīng)液體并在下述條件下進(jìn)行GC測(cè)量GC系統(tǒng)HP6890；柱HP-5(0.25μm×30cm)；檢測(cè)器FID；注射溫度320℃；注射不分流；注射量0.2μl；載體氣體氦；流速23cm/sec；柱溫度80℃(0min)→15℃/min→320℃(24min)；檢測(cè)器溫度320℃。
表3

根據(jù)表3的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，如在實(shí)施例1-3和實(shí)施例16-3中的在用鈉進(jìn)行處理的條件下，很難產(chǎn)生引起形成活性低分子量雜質(zhì)的芐醇和引起形成非活性高分子量雜質(zhì)的甘油。
(實(shí)施例22)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的200ml圓底燒瓶中加入10g(1mmol)在實(shí)施例1-4中獲得的化合物(p2)以及50g甲苯，接著加熱回流以共沸除去水。在冷卻到室溫后，往其中加入2.02g(20mmol)三乙胺并加熱到40℃。然后，往其中滴入0.687g(6mmol)甲磺酰氯，接著在40℃反應(yīng)3小時(shí)。在完成反應(yīng)后，過濾除去鹽酸鹽并把100ml乙酸乙酯加入到濾液中，接著加入己烷直到晶體沉淀。過濾收集生成的晶體并在加熱下把晶體溶解于200ml乙酸乙酯。在冷卻到室溫后，加入己烷直到晶體沉淀。過濾收集晶體并干燥。采集20mg生成的晶體并溶解于氘化氯仿中，然后進(jìn)行1H核磁共振測(cè)量(累計(jì)128次)以獲得核磁共振譜。此時(shí)，Mme為6而Mms為0.073。
(實(shí)施例23)使用10g(0.5mmol)在實(shí)施例7-2中獲得的化合物(p12)、1.01g(10mmol)三乙胺、以及0.344g(3mmol)甲磺酰氯，進(jìn)行和在實(shí)施例22中相同的操作。然后進(jìn)行核磁共振測(cè)量(累計(jì)256次)以獲得核磁共振譜。此時(shí)，Mme為6而Mms為0.102。
(實(shí)施例24)使用10g(0.5mmol)在實(shí)施例16-4中已兩次烷基醚化的化合物(p24)、1.01g(10mmol)三乙胺、以及0.344g(3mmol)甲磺酰氯，進(jìn)行和在實(shí)施例22中相同的操作。然后進(jìn)行核磁共振測(cè)量(累計(jì)256次)以獲得核磁共振譜。此時(shí)，Mme為6而Mms為0.019。
(實(shí)施例25)使用11.3g(0.25mmol)在實(shí)施例16-7中已兩次烷基醚化的化合物(p27)、0.506g(5mmol)三乙胺、以及0.172g(1.5mmol)甲磺酰氯，進(jìn)行和在實(shí)施例22中相同的操作。然后進(jìn)行核磁共振測(cè)量(累計(jì)256次)以獲得核磁共振譜。此時(shí)，Mme為6而Mms為0.026。
(實(shí)施例26)利用在每個(gè)實(shí)施例22至25中獲得的Mme、Mms、以及峰頂部分子量(Mp)，計(jì)算Hrd和Hrd/Mp×1000000。使用(p3)、(p13)、(p25)、以及(p28)的數(shù)據(jù)分別作為峰頂部分子量。結(jié)果列于表4。因此，結(jié)果表明，本發(fā)明的由化學(xué)式(p)表示的化合物的烷基醚化比率較高，而在重復(fù)烷基醚化作用的情況下，轉(zhuǎn)化甚至更高并羥基的殘留少。
表4

(實(shí)施例27)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍堋嚢杵?、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的200ml圓底燒瓶中加入10g(1mmol)在實(shí)施例1-5中獲得的化合物(p3)以及50g甲苯，接著加熱回流以共沸除去水。在冷卻到室溫后，往其中加入2.02g(20mmol)三乙胺并加熱到40℃。然后，往其中滴入0.687g(6mmol)甲磺酰氯，接著在40℃反應(yīng)3小時(shí)。在完成反應(yīng)后，過濾除去鹽酸鹽并把100ml乙酸乙酯加入到濾液中，接著加入己烷直到晶體沉淀。過濾收集生成的晶體并在加熱下把晶體溶解于200ml乙酸乙酯。在冷卻到室溫后，加入己烷直到晶體沉淀。過濾收集晶體并干燥。采集20mg生成的晶體并溶解于氘化甲醇中，然后進(jìn)行1H核磁共振測(cè)量(累計(jì)128次)以獲得核磁共振譜。此時(shí)，當(dāng)將在3.132ppm檢測(cè)的M1作為3時(shí)，在3.117ppm檢測(cè)的M2為0.295。
(實(shí)施例28)使用10g(0.5mmol)在實(shí)施例16-5中獲得的化合物(p25)、1.01g(10mmol)三乙胺、以及0.344g(3mmol)甲磺酰氯，進(jìn)行和在實(shí)施例27中相同的操作。然后進(jìn)行核磁共振測(cè)量(累計(jì)256次)以獲得核磁共振譜。此時(shí)，M1為3而M2為0.091。
(實(shí)施例29)使用11.3g(0.25mmol)在實(shí)施例16-8中獲得的化合物(p28)、0.51g(5mmol)三乙胺、以及0.172g(1.5mmol)甲磺酰氯，進(jìn)行和在實(shí)施例27中相同的操作。然后進(jìn)行核磁共振測(cè)量(累計(jì)256次)以獲得核磁共振譜。此時(shí)，M1為3而M2為0.112。
(實(shí)施例30)使用11.3g(0.25mmol)在實(shí)施例20中獲得的化合物(p33)、0.51g(5mmol)三乙胺、以及0.172g(1.5mmol)甲磺酰氯，進(jìn)行和在實(shí)施例27中相同的操作。然后進(jìn)行核磁共振測(cè)量(累計(jì)256次)以獲得核磁共振譜。此時(shí)，M1為3而M2為0.212。
(實(shí)施例31)利用在實(shí)施例27至30中獲得的M1和M2計(jì)算了M2/(M1+M2)×100。結(jié)果列于表5。因此，結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物具有較高純度。此外，從實(shí)施例29和實(shí)施例30的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，通過在降低的溫度下醇化由化學(xué)式(9)表示的化合物可以獲得更高的純度。
表5

(實(shí)施例32)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍?、攪拌器、以及冷凝管?L圓底燒瓶中加入100g上述化合物(p27)并直接加入200g 5％的鈀-碳(50％水合產(chǎn)物，由N.E.M.Cat制造)水合產(chǎn)物，并以和實(shí)施例16-8相同的方式進(jìn)行脫芐基作用以獲得和(p28)具有相同結(jié)構(gòu)的化合物(p34)。此時(shí)，通過Karl Fisher水分儀測(cè)量了反應(yīng)系統(tǒng)中的含水量并測(cè)得為4.17％。
使用11.3g(0.25mmol)生成的化合物(p34)、0.51g(5mmol)三乙胺、以及0.172g(1.5mmol)甲磺酰氯，進(jìn)行和在實(shí)施例27中相同的操作。然后進(jìn)行核磁共振測(cè)量(累計(jì)256次)以獲得核磁共振譜。此時(shí)，M1為3而M2為0.162。
如表5所示，從實(shí)施例29和實(shí)施例32的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，通過降低在反應(yīng)系統(tǒng)中的含水量至1％或更低，可以獲得更高純度的化學(xué)式(p)的化合物。
(實(shí)施例33)(肽的修飾)用10mM磷酸鹽緩沖液(pH＝6.4)把Humanin肽(Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala)(分子量2687.2)調(diào)節(jié)到0.5μM。在200μl該溶液中加入4mg化學(xué)式(p31)的化合物，接著在室溫反應(yīng)4小時(shí)。然后，將200μl反應(yīng)液體加入到SP-Sepharose FF(由Amersham制造)柱，用20mM Tris-HCl緩沖液(pH＝8.2)加以平衡。在平衡以后，將把NaCl加入到緩沖液中而得到的1N溶液通過柱并用UV監(jiān)測(cè)洗脫液，獲得用(p31)修飾的肽的級(jí)分。其后，20μl的級(jí)分與20μl的Tris-SDS試樣處理液混合，接著在沸水浴上加熱2.5分鐘。然后，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(4-20％)對(duì)20μl的該溶液進(jìn)行分析。染色是通過CBB染色進(jìn)行。結(jié)果示于圖6。
因此，發(fā)現(xiàn)肽的巰基(半胱氨酸)與(p31)的馬來酰亞胺起反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)修飾。
(實(shí)施例34)琥珀酰亞胺化合物的合成(組I(a))(R＝甲基，A1O、A2O＝氧化乙烯基，n＝0，以及分子量＝約45000的情況)在裝有溫度計(jì)、氮?dú)庖牍堋嚢杵?、迪?斯達(dá)克管、以及冷凝管的200ml圓底燒瓶中加入11.3g(0.25mmol)化合物(p28)、0.1g乙酸鈉、以及100ml甲苯，接著進(jìn)行回流以除去水。然后，在反應(yīng)液體中加入285mg(2.5mmol)戊二酸酐，接著在110℃反應(yīng)12小時(shí)。在反應(yīng)液體冷卻后，往其中加入518mg(4.5mmol)N-羥基琥珀酰亞胺和934mg(4.55mmol)DCC，接著在40℃反應(yīng)2小時(shí)。過濾反應(yīng)液體，然后加入己烷直到晶體沉淀。過濾收集晶體并再次溶解于200ml乙酸乙酯和20ml乙腈中。然后，把己烷加入溶液直到晶體沉淀。過濾收集晶體并干燥，獲得以下琥珀酰亞胺化合物(p35)。
(P35)m＝5051H-NMR(CDCl3，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)TMS)；δ(ppm)2.07(2H，m，-OCOCH2CH2CH2COON-)，2.50(2H，t，-OCOCH2CH2CH2COON-)，2.72(2H，t，-OCOCH2CH2CH2COON-)，2.84(4H，s，succinimide(琥珀酰亞胺))，3.38(6H，s，-CH3)，3.40-3.80(4043H，m，-CH2O(CH2CH2O)mCH3，CHO(CH2CH2O)mCH3)，4.10-4.30(2H，m，-CH2OCOCH2CH2CH2COON-)。
(實(shí)施例35)胰島素的修飾利用在實(shí)施例19獲得的(p32)的琥珀酰亞胺以及在實(shí)施例34獲得的(p35)的琥珀酰亞胺，對(duì)胰島素(重組人體胰島素，Mw 5800，由SEROLOGICALS CORPORATION制造)進(jìn)行修飾。
使用0.1N碳酸鈉緩沖液(pH＝9.0)，制備了胰島素的10mg/ml緩沖溶液。在100μl該溶液中加入6.8mg化學(xué)式(p32)的化合物，接著在4℃反應(yīng)20小時(shí)。然后，將所有的反應(yīng)液體加入到Q-Sepharose FF(由Amersham制造)柱，用20mM Tris-HCl緩沖液(pH＝8.2)加以平衡。在平衡以后，將把NaCl加入到緩沖液中而得到的1N溶液通過柱并用UV監(jiān)測(cè)洗脫液獲得用(p32)修飾的肽的級(jí)分。其后，20μl的級(jí)分與20μl的Tris-SDS試樣處理液混合，接著在沸水浴上加熱2.5分鐘。然后，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(4-20％)對(duì)20μl的該溶液進(jìn)行分析。染色是通過CBB染色進(jìn)行。
同樣，在(p35)的情況下，把13.6mg化學(xué)式(p35)的化合物加入到100μl胰島素的10mg/ml緩沖溶液中并以相同方式進(jìn)行處理。
結(jié)果示于圖7。因此，發(fā)現(xiàn)胰島素被化學(xué)式(p32)或(p35)的化合物所修飾。
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)，其中在分子中結(jié)合至少一個(gè)由以下化學(xué)式(1)表示的聚亞烷基二醇氧基 式中，R是具有1至24個(gè)碳原子的烴基，OA1和OA2為具有2至4個(gè)碳原子的氧化烯基，R和OA2在一個(gè)分子中是彼此相同或不同，n和m為加入的氧化烯基的摩爾平均數(shù)，n表示0至1000，以及m表示10至1000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)，其中在化學(xué)式(1)中，R是甲基，OA1和OA2為氧化乙烯基，n是0至50，以及m是20至800。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)，其中在化學(xué)式(1)中，n是0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)，其中在化學(xué)式(1)中，n是1至50。
5.一種經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)的中間體，其由以下化學(xué)式(2)表示 式中，R是具有1至24個(gè)碳原子的烴基，OA1和OA2為具有2至4個(gè)碳原子的氧化烯基，R和OA2在一個(gè)分子中是彼此相同或不同，n和m為加入的氧化烯基的摩爾平均數(shù)，n表示0至1000，m表示10至1000，以及X表示能夠與未經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中間體，其中在化學(xué)式(2)中，R是甲基，OA1和OA2為氧化乙烯基，n是0至50，以及m是20至800。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的中間體，其中在化學(xué)式(2)中，n是0。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或權(quán)利要求6所述的中間體，其中在化學(xué)式(2)中，n是1至50。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)所述的中間體，其中X是選自組(I)的基團(tuán)組(I) 在組(I)中，Z表示簡(jiǎn)單亞烷基或含有醚鍵、酯鍵、尿烷鍵、酰胺鍵、碳酸酯鍵、或仲氨基的亞烷基，以及Y表示具有1至10個(gè)碳原子的可以含有氟原子的烴基。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供具有支鏈聚亞烷基二醇氧基的生物相關(guān)物質(zhì)，其由穩(wěn)定鍵形成并很難分解為單鏈；以及其制備方法。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供具有反應(yīng)基的聚亞烷基二醇衍生物，該反應(yīng)基可以在甘油骨架1位的伯碳與生物相關(guān)物質(zhì)結(jié)合，并在2位和3位具有聚亞烷基二醇鏈。由于為解決上述問題而進(jìn)行廣泛研究的結(jié)果，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)一種新穎的具有支鏈聚亞烷基二醇氧基的生物相關(guān)物質(zhì)、其制備方法、以及作為其中間體的聚亞烷基二醇衍生物，因而完成本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)，其中在分子中結(jié)合有至少一個(gè)聚亞烷基二醇氧基，其由以下化學(xué)式(1)表示 (式中，R是具有1至24個(gè)碳原子的烴基，OA1和OA2各自為具有2至4個(gè)碳原子的氧化烯基，R和OA2在一個(gè)分子中是彼此相同或不同，n和m各自為加入的氧化烯基的摩爾的平均數(shù)，n表示0至1000，以及m表示10至1000。)此外，本發(fā)明涉及用于經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)的中間體，其由以下的化學(xué)式(2)表示 式中，R是具有1至24個(gè)碳原子的烴基，OA1和OA2為具有2至4個(gè)碳原子的氧化烯基，R和OA2在一個(gè)分子中是彼此相同或不同，n和m為加入的氧化烯基的摩爾平均數(shù)，n表示0至1000，以及m表示10至1000。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的聚亞烷基二醇衍生物，其中在化學(xué)式(p)中，R是甲基，OA1和OA2為氧化乙烯基，n是0至50，以及m是20至800。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的聚亞烷基二醇衍生物，其中在化學(xué)式(p)中，n是0。
16.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的聚亞烷基二醇衍生物，其中在化學(xué)式(p)中，n是1至50。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)所述的聚亞烷基二醇衍生物，其中在由化學(xué)式(p)表示的聚亞烷基二醇衍生物的凝膠滲透色譜中，在從洗脫起點(diǎn)至洗脫終點(diǎn)的所有峰中多分散性Mw/Mn滿足以下關(guān)系式Mw/Mn≤1.07。
18.根據(jù)權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)所述的聚亞烷基二醇衍生物，其利用化學(xué)式(4)的化合物作為原料制成，并滿足以下參數(shù)Hrd/Mp×1000000≤3Mp對(duì)應(yīng)于峰頂部的分子量，其獲自化學(xué)式(p)的凝膠滲透色譜，Hrd在化學(xué)式(4)的化合物的2-和3-位的聚氧化烯鏈末端中，被包含在烷基R中的羥基殘基的比率； 式中，R、OA1、OA2、n、以及m和上述相同。
19.根據(jù)權(quán)利要求15、17、或18所述的聚亞烷基二醇衍生物，其滿足以下參數(shù)M2/(M1+M2)×100≤10M1當(dāng)由化學(xué)式(p)表示的化合物與甲磺酰氯起反應(yīng)以獲得甲磺?；衔?，并在氘化甲醇溶液中獲得核磁共振譜時(shí)，所述M1表示甲基的積分值，所述甲基起源于甲磺?；?，而所述甲磺?；苌灾苯咏Y(jié)合于甘油骨架的1-位的羥基；M2所述M2表示甲基的積分值，所述甲基起源于甲磺?；黾谆酋；苌运鼍蹃喭榛兼湹牧u基。
20.一種制備經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)的中間體的方法，所述中間體由化學(xué)式(2)表示，其中將根據(jù)權(quán)利要求13至19中任一項(xiàng)所述的聚亞烷基二醇衍生物用作原料 式中，R是具有1至24個(gè)碳原子的烴基，OA1和OA2為具有2至4個(gè)碳原子的氧化烯基，R和OA2在一個(gè)分子中是彼此相同或不同，n和m為加入的氧化烯基的摩爾平均數(shù)，n表示0至1000，m表示10至1000，以及X表示能夠與未經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法所獲得的經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)的中間體。
22.一種制備化學(xué)式(p)的聚亞烷基二醇衍生物的方法，包括以下步驟(A)步驟(A)在反應(yīng)系統(tǒng)中的含水量為1％或更少的條件下，使由化學(xué)式(4)表示的化合物進(jìn)行氫化還原反應(yīng)的步驟， 式中，R是具有1至24個(gè)碳原子的烴基，OA1和OA2為具有2至4個(gè)碳原子的氧化烯基，R和OA2在一個(gè)分子中是彼此相同或不同，n和m為加入的氧化烯基的摩爾平均數(shù)，n表示0至1000，以及m表示10至1000。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中在所述步驟(A)中，將鈀用作氫化還原催化劑，鈀的加入量為化學(xué)式(4)的化合物的1至20wt％，以及所述反應(yīng)是在40℃或更低的溫度下進(jìn)行。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中作為所述步驟(A)的之前步驟，進(jìn)行以下步驟(B1)和(B2)步驟(B1)把脫鹵劑和由化學(xué)式(6)表示的化合物加入到由化學(xué)式(5)表示的化合物中，并在20至60℃下使它們起反應(yīng)，獲得化學(xué)式(7)的化合物，各個(gè)加入的摩爾比率滿足以下關(guān)系式Vc≥3VaVb＞VcVa由化學(xué)式(5)表示的化合物的摩爾數(shù)Vb脫鹵劑的摩爾數(shù)Vc由化學(xué)式(6)表示的化合物的摩爾數(shù)步驟(B2)把由化學(xué)式(8)表示的化合物加入到化學(xué)式(7)的化合物中，并在20至80℃下使它們起反應(yīng)，獲得化學(xué)式(4)的化合物，各個(gè)加入的摩爾比率滿足以下關(guān)系式Vd＞VcVd由化學(xué)式(8)表示的化合物的摩爾數(shù) 式中，OA1、OA2、n、以及m和上述相同，W是選自Cl、Br、以及I的鹵素原子，以及R1是具有1至10個(gè)碳原子的烴基；R-OM.....(8)式中，R是具有1至24個(gè)碳原子的烴基，而M是鉀或鈉。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，包括步驟(B3)作為所述步驟(B2)的后續(xù)步驟步驟(B3)過濾反應(yīng)液體或用濃度為10wt％或更高的無機(jī)鹽水溶液洗滌反應(yīng)液體。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中在所述步驟(B3)之后重復(fù)所述步驟(B1)至(B3)。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的方法，其中作為所述步驟(B1)至(B3)的之前步驟，進(jìn)行以下步驟(C1)和(C2)步驟(C1)將5至50mol％的鈉或鉀加入到由化學(xué)式(9)表示的化合物中，在10至50℃溶解；步驟(C2)在50至130℃下反應(yīng)烯化氧， 式中，OA1和上述相同。
28.一種制備化學(xué)式(11)的聚亞烷基二醇衍生物的方法，包括以下步驟(AA)步驟(AA)在反應(yīng)系統(tǒng)中的含水量為1％或更少的條件下，使由化學(xué)式(10)表示的化合物進(jìn)行氫化還原反應(yīng)，其中加入化學(xué)式(10)的化合物的1至20wt％的鈀，以及所述反應(yīng)是在40℃或更低的溫度下進(jìn)行， 式中，G是具有2至4個(gè)羥基的化合物的殘基；R2是具有1至4個(gè)碳原子的烴基；m1、m2、以及m3表示加入的氧化乙烯基的摩爾平均數(shù)并滿足以下關(guān)系式0≤m1≤1000、0≤m2≤1000、0≤m3≤1000、10≤m1+m2+m3≤1000；X1是氨基、羧基、或這些的保護(hù)基團(tuán)；以及g1、g2、以及g3表示整數(shù)并滿足以下關(guān)系式1≤g1≤3、0≤g2、0≤g3、2≤g1+g2+g3≤4。
29.一種制備由化學(xué)式(16)表示的聚亞烷基二醇衍生物的方法，其中包括以下步驟(BB1)至(BB3)步驟(BB1)把脫鹵劑以及由化學(xué)式(14)表示的化合物加入到由化學(xué)式(12)表示的化合物中，并在20至60℃下使它們起反應(yīng)，獲得化學(xué)式(13)的化合物，各個(gè)加入的摩爾比率滿足以下關(guān)系式Vj≥1.5×Vh×g5Vi＞VjVh由化學(xué)式(12)表示的化合物的摩爾數(shù)Vi脫鹵劑的摩爾數(shù)Vj由化學(xué)式(14)表示的化合物的摩爾數(shù)；步驟(BB2)把由化學(xué)式(15)表示的化合物加入到化學(xué)式(13)的化合物中，并在20至80℃下使它們起反應(yīng)，獲得化學(xué)式(16)的化合物，各個(gè)加入的摩爾比率滿足以下關(guān)系式Vk＞VjVk由化學(xué)式(15)表示的化合物的摩爾數(shù)，步驟(BB3)過濾反應(yīng)液體或用濃度為10wt％或更高的無機(jī)鹽水溶液洗滌反應(yīng)液體； R2-OM.....(15) 式中，G是具有2至4個(gè)羥基的化合物的殘基；R2是具有1至4個(gè)碳原子的烴基；m1、m2、以及m3表示加入的氧化乙烯基的摩爾平均數(shù)并滿足以下關(guān)系式0≤m1≤1000、0≤m2≤1000、0≤m3≤1000、10≤m1+m2+m3≤1000；X1是氨基、羧基、或這些的保護(hù)基團(tuán)；g4、g5、以及g6各自表示整數(shù)并滿足以下關(guān)系式0≤g4、1≤g5≤3、0≤g6、2≤g4+g5+g6≤4；W是選自Cl、Br、以及I的鹵素原子；R3是具有1至10個(gè)碳原子的烴基；以及M是鉀或鈉。
全文摘要
一種經(jīng)修飾的生物相關(guān)物質(zhì)，其中在分子中結(jié)合至少一個(gè)由以下化學(xué)式(1)表示的聚亞烷基二醇氧基式中，R是具有1至24個(gè)碳原子的烴基，OA
文檔編號(hào)C08G65/28GK1714116SQ20038010379
公開日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2003年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月20日
發(fā)明者中本憲一郎, 大橋俊輔, 山本裕二, 坂上研二, 伊藤智佳, 安河內(nèi)徹 申請(qǐng)人:日本油脂株式會(huì)社