本發(fā)明屬于生物技術(shù)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域，涉及與乳腺癌相關(guān)的microrna及其應(yīng)用。。

背景技術(shù)：

乳腺癌是女性中最常見的腫瘤，也是致死率第二高的惡性腫瘤。根據(jù)中國腫瘤登記中心發(fā)布，我國惡性腫瘤發(fā)病率前三位是肺癌、乳腺癌、胃癌。中國是乳腺癌發(fā)病率增長速度最快的國家之一，近年來乳腺癌發(fā)病率正以每年3％的速度遞增，已成為女性的第一殺手。

微小核酸(micrornas)是真核生物中廣泛存在的一類長度約18～23個核苷酸的rna分子，通過與靶基因mrna結(jié)合或促使mrna的降解或阻礙轉(zhuǎn)錄后翻譯，從而達(dá)到抑制轉(zhuǎn)錄的目的。作為基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子，mirna在細(xì)胞生長、胚胎發(fā)育、組織分化、以及疾病的發(fā)生發(fā)展等多項(xiàng)生命活動中起著極為重要的作用。mirna與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，大約50％得到注解的mirna在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)mirna在多種癌癥組織中表達(dá)失調(diào)，通過調(diào)控促癌或者抑癌信號通路的活性，起著腫瘤抑制因子或是原癌基因的功能。多種mirna在乳腺癌中表達(dá)異常，并且與乳腺癌雌激素受體er、pr以及人表皮生長因子受體her2的表達(dá)相關(guān)。例如mir-342在luminalb型er陽性和her2陽性乳腺癌中表達(dá)量最高而在三陰性乳腺癌中表達(dá)最低。而mir-21、mir-210、mir-221在三陰性(er陰性、pr陰性、her2陰性)乳腺癌中高表達(dá)，并且和預(yù)后復(fù)發(fā)率高和低生存率顯著相關(guān)，mir-10b、mir-145、mir-205、mir-205和mir-122則在這類乳腺癌中顯著低表達(dá)。這些差異表達(dá)的mirna不僅可以應(yīng)用到乳腺癌分類，還能作為預(yù)后因子或者乳腺癌治療的新切入點(diǎn)。mirna的表達(dá)還與乳腺癌的早期診斷有密切的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)let-7a的表達(dá)和乳腺癌luminal分型密切相關(guān)，mir-195能特異性區(qū)分乳腺癌和其他癌癥類別及其正常對照，mir-195、let7a和mir-155聯(lián)合監(jiān)測可使乳腺癌檢測效率達(dá)到94％。這些研究結(jié)果表明乳腺癌特異性mirna的表達(dá)與乳腺癌分子亞型、乳腺癌的診斷和預(yù)后評價(jià)具有密切關(guān)系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請發(fā)明人通過分析癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫(thecancergenomeatlas,tcga)中乳腺癌基因表達(dá)的數(shù)據(jù)資料，通過分析比較了mir-20a在694例乳腺癌組織和83例正常乳腺組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示mir-20a在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高與正常乳腺組織；發(fā)明人又對82例三陰性(基底樣型)乳腺癌和391例其它類型乳腺癌(包括luminala型,luminalb型和her2陽性)組織中mir-20a的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌組織中mir-20a的表達(dá)水平顯著高于其它類型乳腺癌組織(圖1)。

通過對30對乳腺癌病人腫瘤組織和癌旁組織中mir-20a原位雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示乳腺癌組織中mir-20a的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(圖2)。

通過分析347例乳腺癌樣本中mir-20a的表達(dá)水平和基因組不穩(wěn)定的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)mir-20a表達(dá)水平高的乳腺癌組織中基因組拷貝數(shù)變異和基因突變率都顯著高于mir-20a表達(dá)水平低的乳腺癌組織(圖3)。

用三陰性乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-231構(gòu)建人乳腺癌荷瘤小鼠模型發(fā)現(xiàn)mir-20a顯著促進(jìn)腫瘤的起始(圖4)。

綜上所述，本發(fā)明一個方面提供了一種診斷標(biāo)志物在制備用于診斷腫瘤的試劑盒中的用途，所述診斷標(biāo)志物為microrna-20a。

本發(fā)明另一個方面提供了一種診斷標(biāo)志物在制備用于判斷腫瘤愈后的試劑盒中的用途，所述診斷標(biāo)志物為microrna-20a。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述腫瘤為乳腺癌。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述的乳腺癌為三陰性乳腺癌。

本發(fā)明再一個方面提供了一種診斷標(biāo)志物在制備用于判斷腫瘤類別的試劑盒中的用途，所述診斷標(biāo)志物為microrna-20a。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述判斷腫瘤類別為判斷乳腺癌的類別。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述判斷乳腺癌的類別為區(qū)別三陰性乳腺癌和其他種類乳腺癌，優(yōu)選地，所述其他種類乳腺癌為luminala型、luminalb型和her2陽性。

本發(fā)明再一個方面提供了一種診斷乳腺癌、判斷腫瘤愈后或判斷乳腺癌類別的試劑盒，所述試劑盒中包含microrna-20a。

本發(fā)明再一個方面提供了microrna-20a的拮抗劑在制備治療乳腺癌的藥物中的用途，優(yōu)選地，所述乳腺癌為三陰型乳腺癌。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述microrna-20a的核苷酸序列為seqidno.1，

mir-20a：5′-uaaagugcuuauagugcagguag-3seqidno.1。

有益效果

發(fā)明提供了一種新型的乳腺癌診斷分子標(biāo)志物，其診斷效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)乳腺癌的分型檢測。

附圖說明

圖1.(a)分析tcga乳腺癌mirna表達(dá)數(shù)據(jù)庫，其中包括694例腫瘤組織和83例正常組織，腫瘤組織中mir-20a的表達(dá)水平顯著高于正常組織；(b)分析tcga乳腺癌mirna表達(dá)數(shù)據(jù)庫，其中包括82例三陰性乳腺癌和391例其它類型乳腺癌，mir-20a在三陰性乳腺癌中的表達(dá)高于其它類型乳腺癌。

圖2.(a)在30對乳腺癌和癌旁組織中通過原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測mir-20a,乳腺癌組織中mir-20a的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織；(b)乳腺癌組織和癌旁組織中mir-20a原位雜交和he染色示意圖。

圖3.分析tcga乳腺癌數(shù)據(jù)庫，347例乳腺癌樣本按照mir-20表達(dá)水平分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組，分別對比兩組中(a)基因組拷貝數(shù)變異和(b)突變率的差異。

圖4.(a)在三陰性人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-231細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)陰性對照mirna(negativecontrol,nc)和mir-20a，將細(xì)胞注射到裸鼠皮下構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。細(xì)胞注射8天后計(jì)算小鼠成瘤率，mir-20a促進(jìn)腫瘤的起始；(b)腫瘤生長曲線顯示mir-20a促進(jìn)腫瘤的生長。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.乳腺癌組織中mir-20a表達(dá)量分析

從癌癥基因組圖譜(thecancergenomeatlas,tcga)官網(wǎng)下載乳腺癌的mir-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。分析694例腫瘤組織與83例正常乳腺中mir-20a的表達(dá)量。分析82例三陰性乳腺癌和391例其它類型乳腺癌中mir-20a的表達(dá)量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1)mir-20a在乳腺癌組織，特別是三陰性乳腺癌組織中表達(dá)量顯著升高。

實(shí)施例2.乳腺癌組織原位雜交實(shí)驗(yàn)

將30例乳腺癌與正常乳腺臨床組織切片與10pmol的mir-20a互補(bǔ)探針(lna修飾并用dig標(biāo)記)雜交，與交聯(lián)了堿性磷酸酶的抗dig-apfab片段共同孵育后，用氮藍(lán)四唑檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)乳腺癌中mir-20a的表達(dá)顯著高于正常組織。

實(shí)施例3.乳腺癌中mir-20a表達(dá)量與基因組穩(wěn)定性分析

從癌癥基因組圖譜(thecancergenomeatlas,tcga)官網(wǎng)下載乳腺癌數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。將347例乳腺癌樣本按照mir-20表達(dá)水平分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組，分別對比兩組中基因組拷貝數(shù)變異和突變率的差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3)mir-20a高表達(dá)的乳腺癌患者，其基因組拷貝數(shù)的變化以及突變率都更高，即基因組更加不穩(wěn)定。

實(shí)施例4.小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)

通過慢病毒轉(zhuǎn)染法構(gòu)建nc與mir-20a過表達(dá)的mda-mb-231細(xì)胞系并擴(kuò)大培養(yǎng)，同時將購買的4周齡雌性balb/c裸鼠繼續(xù)飼養(yǎng)10天；消化兩種細(xì)胞、計(jì)數(shù)，pbs重懸細(xì)胞使細(xì)胞濃度為5×10⁷/ml，細(xì)胞懸液與4℃融化的基質(zhì)膠按照1:1混合，放置于冰上；將小鼠隨機(jī)分為兩組，每組12只，兩組分別注射200μl的nc與mir-20a細(xì)胞懸液于腹部皮下；對兩組小鼠分別編號，每天觀察，待腫瘤長出后，每天測量腫瘤的大小與小鼠的體重；3周后處死小鼠，對腫瘤的發(fā)生率與腫瘤體積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖4)，注射mir-20a過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的小鼠，腫瘤發(fā)生率更高，腫瘤的生長速率更快，說明mir-20a可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

sequencelisting

<110>清華大學(xué)深圳研究生院

<120>一種與乳腺癌相關(guān)的診斷標(biāo)志物及其用途

<160>1

<170>patentinversion3.3

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<212>rna

<213>人工序列

<400>1

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