本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種潛在的肝癌標(biāo)記物oxct1，oxct1基因在導(dǎo)致肝癌過程中發(fā)揮作用，并且涉及oxct1在肝癌診斷、治療以及預(yù)后中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類的健康，并已超過心血管疾病成為致死的首要因素。根據(jù)2012年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告:全世界肝癌當(dāng)年死亡69.5萬人，在所有癌癥中死亡率中列居第三位。更為嚴(yán)重的是，中國是全球肝癌發(fā)病率最高以及致死數(shù)最多的國家，我國的肝癌患者約占全球肝癌患者的52.7％。并且我國的肝癌患者每年都在快速增長，預(yù)計(jì)2015年，中國男性肝癌發(fā)病人數(shù)為326,698，女性肝癌發(fā)病人數(shù)為111,017，兩者相加437,715人。因此，探索肝癌發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制以及尋找新型有效治療方法對肝癌病人的健康具有重要意義。

由于肝癌具有如此驚人地增長速度和致死率，使得早期診斷和預(yù)后判斷對于提高肝癌患者的生存率具有十分重要的意義。目前的肝癌診斷手段包括血清檢查、甲胎蛋白測定、超聲檢查、ct檢查等，但是這些檢測手段存在靈敏度和特異性有限的缺點(diǎn)，常常出現(xiàn)假陽性的情況。因此，發(fā)現(xiàn)新的高效的肝癌特異表達(dá)靶標(biāo)對于肝癌的早期診斷和及時(shí)治療具有重要作用。

肝癌的治療主要是早期手術(shù)切除和晚期化療的方法，具體治療策略決定于肝癌的發(fā)生階段以及肝癌病人不同的分子分型，往往由于診斷時(shí)肝癌已處于晚期，腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去了手術(shù)機(jī)會(huì)，并且針對性的化療方案也很難提高病人的生存率。在腫瘤的治療研究中，隨著基因工程的廣泛應(yīng)用和實(shí)踐，針對腫瘤特異表達(dá)基因的基因治療方法也開始登上腫瘤治療的舞臺(tái)。通過導(dǎo)入特定的與靶分子mrna互補(bǔ)的dna或rna，來阻斷異 常表達(dá)的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯過程，抑制異常表達(dá)基因，最終實(shí)現(xiàn)針對特定表達(dá)基因而治療腫瘤。因此，尋找出肝癌中特異且惡性表達(dá)的基因并闡明其相關(guān)的分子機(jī)制，對癌癥的有效治療十分重要。

肝臟是合成酮體最主要的器官，肝細(xì)胞應(yīng)對饑餓，合成酮體并快速對其他組織提供應(yīng)急能源。由于肝臟中缺乏利用酮體的關(guān)鍵限速酶oxct1(蛋白名為scot)，導(dǎo)致肝臟本身不能利用酮體。目前，oxct1在人類肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況和作用機(jī)制還不明了。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人在肝癌臨床病人的肝癌組織和對應(yīng)的癌旁組織中比較oxct1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)oxct1基因和蛋白在肝癌組織中顯著上調(diào)。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)血清饑餓可以顯著誘導(dǎo)oxct1基因和蛋白在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，進(jìn)而通過體內(nèi)、體外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在肝癌細(xì)胞中oxct1蛋白的過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖，自噬密切相關(guān)。而通過抑制oxct1蛋白在癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，可以有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖和血清饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的敏感性。

因此，本發(fā)明第一方面提供一種肝癌生物標(biāo)志物，所述標(biāo)志物是oxct1基因/蛋白。

本發(fā)明的第二方面提供oxct1基因/蛋白在制備檢測肝癌的試劑盒中的用途。

本發(fā)明的第三個(gè)方面提供一種用于肝癌檢測或肝癌預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒使用oxct1基因/蛋白作為檢測靶標(biāo)。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包含可以用于特異擴(kuò)增oxct1基因的引物對，或特異識(shí)別/結(jié)合oxct1蛋白的試劑。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑是抗體。

本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本領(lǐng)域中已知的引物設(shè)計(jì)方法即可設(shè)計(jì)出適用于擴(kuò)增oxct1基因的引物對。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體或多克隆抗體，優(yōu)選多克隆抗體。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何獲得特異識(shí)別/結(jié)合oxct1蛋白的抗體。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述引物對包括seqidno：1和seqidno：2所示的序列。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過基因手段，如多種pcr手段，例如熒光實(shí)時(shí)定量pcr，使用所述引物進(jìn)行檢測，也可以通過免疫手段，如蛋白質(zhì)印跡、免疫組化、免疫熒光等檢測oxct1蛋白。

本發(fā)明的第四個(gè)方面提供治療肝癌/增加肝癌細(xì)胞自噬的藥物，所述藥物可以抑制oxct1基因/蛋白的功能。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物是抑制oxct1基因/蛋白表達(dá)的sirna和/或中和性抗體和/或其他抑制和/或中和性抗體的化合物。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肝癌為人肝癌。

綜上所述，目前用于肝癌臨床輔助診斷的標(biāo)記物或技術(shù)尚不完善，而oxct1基因和蛋白在體內(nèi)肝癌腫瘤中的表達(dá)較正常肝組織中明顯上調(diào)，使得oxct1可以成為腫瘤輔助診斷標(biāo)記物。并且根據(jù)本發(fā)明人的研究，抑制內(nèi)源性oxct1可顯著降低細(xì)胞增殖，使得oxct1可以成為腫瘤治療有效靶點(diǎn)。本發(fā)明人同時(shí)發(fā)現(xiàn)oxct1蛋白表達(dá)越高的肝癌患者其生存率越低，即oxct1蛋白過表達(dá)明確指示較差的生存預(yù)后，即oxct1基因/蛋白可以成為肝癌患者生存預(yù)后指標(biāo)。

因此，本發(fā)明為肝癌治療提供新的理論依據(jù)和全新靶標(biāo)，本發(fā)明還為肝癌提供了新的輔助診斷和預(yù)后診斷的方法。

附圖說明

圖1為oxct1蛋白在正常哺乳動(dòng)物不同組織的表達(dá)情況；顯示為oxct1蛋白在腦，心臟，腎臟，胃組織中過表達(dá)，在肺組織中表達(dá)水平一般，在肝臟中缺失表達(dá)；

圖2為oxct1蛋白在多種肝癌細(xì)胞系中血清饑餓條件下的表達(dá)情況；顯示為oxct1蛋白在永生化的正常肝細(xì)胞中表達(dá)量低且不受血清饑餓上調(diào)，而在不同的肝癌細(xì)胞系中血清饑餓顯著上調(diào)其表達(dá)；

圖3顯示在臨床肝癌病人組織樣品中oxct1的mrna水平過表達(dá)(a)；并且在臨床肝癌病人組織樣品中oxct1的蛋白水平也過表達(dá)(b)；

圖4顯示在肝癌病人臨床分期中，肝癌惡性程度越高oxct1的蛋白表達(dá) 量越高(a)，在79例肝癌臨床腫瘤樣本中oxct1蛋白過表達(dá)與患者10年總生存率(os)顯著負(fù)相關(guān)(b)；

圖5為體外實(shí)驗(yàn)中的各組細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)，在hepg2(a)和hep3b(b)兩種肝癌細(xì)胞系中顯示抑制oxct1(shrna)能阻止肝癌細(xì)胞在血清饑餓時(shí)的生長，而外源過表達(dá)oxct1基因/蛋白有利于肝癌細(xì)胞在血清饑餓時(shí)的生長；

圖6為裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示敲低oxct1基因/蛋白顯著抑制了肝癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力，而外源過表達(dá)oxct1基因/蛋白則顯著增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力；其中a為腫瘤注射入小鼠皮下后各組小鼠體內(nèi)的成瘤情況，b為注射腫瘤30天取出后的鼠的體重和皮下腫瘤的凈重；

圖7為通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)和顯微熒光照片統(tǒng)計(jì)檢測顯示敲低oxct1基因/蛋白能夠進(jìn)一步增強(qiáng)血清饑餓誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬的能力；而外源過表達(dá)oxct1基因/蛋白能夠顯著減少血清饑餓所導(dǎo)致的肝癌細(xì)胞的自噬，其中a為體外肝癌細(xì)胞系中的檢測結(jié)果；b為小鼠體內(nèi)皮下移植肝癌腫瘤樣本的檢測結(jié)果；c為體外培養(yǎng)的細(xì)胞在不同條件下的自噬情況檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明內(nèi)容。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1：oxct1基因/蛋白在肝癌中受到血清饑餓刺激后表達(dá)上調(diào)，且在肝癌臨床樣品中表達(dá)上調(diào)

1.免疫印跡實(shí)驗(yàn)(westernblot)檢測小鼠不同組織中基因oxct1的蛋白表達(dá)情況

方法：通過解剖裸鼠獲得其腦、心臟、肝臟、腎臟、肺及胃組織樣品，用組織破碎儀將各組織破碎為組織勻漿，進(jìn)而通過細(xì)胞裂解液(50mmtris-cl,ph8.0,150mmnacl,5mmedta,0.1％sds,1％np-40，proteasecocktails)使各組分細(xì)胞破碎，細(xì)胞內(nèi)容物(包括蛋白質(zhì))融入細(xì)胞裂解液中，在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞溶解液蛋白質(zhì)定量，最終將同等量的各組分樣品通過westernbolt檢測分析，具體步驟為：應(yīng)用sds-page電 泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶封閉蛋白；用分別與oxct1，bdh1，acat1和actin這四種蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體(購自proteintech，#12175-1-ap，#15417-1-ap，#16215-1-ap和#60008-1-ig)與其充分結(jié)合后，再用與一抗特異性結(jié)合的二抗(購自bio-rad，抗兔和抗小鼠)與其結(jié)合后，進(jìn)行熒光顯影，定影；將圖片掃描后進(jìn)行分析。

結(jié)果：如圖1所示，oxct1蛋白在腦，心臟，腎臟，胃組織中過表達(dá)，在肺組織中表達(dá)水平較低，而在肝臟中缺失表達(dá)。

結(jié)果分析：肝臟是機(jī)體產(chǎn)生酮體的最主要器官，為了防止酮體在肝臟中被循環(huán)利用而浪費(fèi)能量，正常肝臟組織中利用酮體代謝的關(guān)鍵限速酶oxct1蛋白表達(dá)被抑制，也就是oxct1蛋白被阻止表達(dá)是正常肝組織中的顯著特點(diǎn)，可以用其來區(qū)分正常肝臟組織和肝癌腫瘤組織。

2.免疫印跡實(shí)驗(yàn)(westernblot)檢測血清饑餓條件下肝癌細(xì)胞中oxct1蛋白表達(dá)情況

方法：將不同肝癌腫瘤細(xì)胞系和永生化的正常肝細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓處理，即相對于正常10％胎牛血清(gibcobrl)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上將培養(yǎng)細(xì)胞的胎牛血清降低為0％。以此方式血清饑餓處理細(xì)胞24，48和72小時(shí)后收獲細(xì)胞，通過細(xì)胞裂解液使各組分細(xì)胞破碎，使細(xì)胞內(nèi)容物(包括蛋白質(zhì))融入細(xì)胞裂解液中，在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞溶解液蛋白質(zhì)定量調(diào)整，最終將統(tǒng)一蛋白含量的各組分樣品通過westernbolt檢測分析，具體步驟為：應(yīng)用sds-page電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶封閉蛋白；用分別與oxct1和actin這兩個(gè)蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體(購自proteintech，#12175-1-ap和#60008-1-ig)與其充分結(jié)合后，再用與一抗特異性結(jié)合的二抗(購自bio-rad，抗兔和抗小鼠)與其結(jié)合后，進(jìn)行熒光顯影，定影；將圖片掃描后進(jìn)行分析。

結(jié)果：如圖2所示，oxct1蛋白在多種肝癌細(xì)胞系(hepg2，hep3b，plc)中在血清饑餓條件下表達(dá)顯著升高；然而在永生化的正常肝細(xì)胞(thle-3)中表達(dá)量低且不受血清饑餓影響。

結(jié)果分析：血清饑餓是腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生長時(shí)經(jīng)常遭遇的營養(yǎng)壓力之一，血清饑餓能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中oxct1蛋白的過表達(dá)，但并不影響正常 肝臟細(xì)胞中oxct1蛋白的表達(dá)，說明肝癌細(xì)胞中被激活的oxct1蛋白是特異的，是可以和正常肝臟細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分的。

3.熒光實(shí)時(shí)定量pcr(real-timepcr)檢測oxct1基因在臨床肝癌樣品中的表達(dá)水平

方法：通過real-timepcr檢測10例肝癌組織和對應(yīng)10例癌旁組織中的oxct1mrna表達(dá)水平。oxct1的引物序列,包括oxct1的正向引物序列：gttggtggttttgggctatgt(seqidno：1)；以及反向引物序列：agaccatgcgttttatctgctt(seqidno：2)。不同組間比較用獨(dú)立t檢驗(yàn)(常變量)，兩組間均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，分類變量的比較用χ2檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。數(shù)值用均數(shù)±sd表示。

結(jié)果：如圖3-a所示，real-timepcr分析顯示10例肝癌病人臨床組織樣品中oxct1的mrna表達(dá)水平顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織樣品。

結(jié)果分析：oxct1在臨床肝癌樣品中過表達(dá)。因此，用含有特異性結(jié)合oxct1的引物(上游引物5'-gttggtggttttgggctatgt-3'(seqidno：1)；下游引物5'-agaccatgcgttttatctgctt-3'(seqidno：2)的輔助診斷試劑盒檢測臨床樣本中oxct1的擴(kuò)增表達(dá)情況，為肝癌的臨床診斷提供證據(jù)。臨床樣本的分析進(jìn)一步提示oxct1可作為輔助診斷的靶點(diǎn)。

4.免疫印跡實(shí)驗(yàn)(westernblot)檢測基因oxct1在臨床肝癌樣品中的表達(dá)水平

將各組分臨床肝癌腫瘤組織及相對應(yīng)的正常肝組織，用組織破碎儀破碎為組織勻漿，進(jìn)而通過細(xì)胞裂解液使各組分細(xì)胞破碎，細(xì)胞內(nèi)容物(包括蛋白質(zhì))融入細(xì)胞裂解液中，在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞溶解液蛋白質(zhì)定量調(diào)整，最終將統(tǒng)一蛋白含量的各組分樣品通過westernbolt檢測分析，具體步驟為：應(yīng)用sds-page電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶封閉蛋白；用分別與oxct1和actin這兩種蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體(購自proteintech，#12175-1-ap和#60008-1-ig)與其充分結(jié)合后，再用與一抗特異性結(jié)合的二抗(購自bio-rad，抗兔和抗小鼠)與其結(jié)合后，進(jìn)行熒光顯影，定影；將圖片掃描后進(jìn)行分析。

結(jié)果：如圖3-b所示，westernblot分析顯示8例肝癌病人臨床組織樣 品中oxct1的蛋白表達(dá)水平顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織樣品。

結(jié)果分析：oxct1蛋白在臨床肝癌樣品中過表達(dá)。因此，用含有特異性識(shí)別oxct1蛋白的ihc抗體的輔助診斷試劑盒檢測到臨床切片樣本中oxct1蛋白的異常過表達(dá)，更能確診為該組織樣本為腫瘤樣本。臨床樣本的分析進(jìn)一步提示oxct1蛋白可作為輔助診斷的靶點(diǎn)。

5.oxct1蛋白過表達(dá)的臨床意義

方法：所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。采用kaplan-meier方法繪制生存分析曲線，并采用log-rank檢驗(yàn)方法檢測其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。檢驗(yàn)系數(shù)p<0.05認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。運(yùn)用spss統(tǒng)計(jì)軟件分析oxct1蛋白的表達(dá)與肝癌患者10年總生存率(overallsurvival，os)的關(guān)系。

結(jié)果：如圖4所示，在79例肝癌病人的腫瘤組織中，oxct1蛋白過表達(dá)的肝癌病人比oxct1蛋白低表達(dá)的肝癌病人的10年總生存率(os)明顯降低。其中oxct1蛋白的過表達(dá)和低表達(dá)按照oxct1蛋白表達(dá)水平的中位數(shù)來劃定。

結(jié)果分析：spss統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示oxct1蛋白過表達(dá)與肝癌病人10年總生存率呈負(fù)相關(guān)(p<0.05)，oxct1蛋白過表達(dá)明確指示較差的生存預(yù)后。因此，oxct1蛋白可作為患者生存預(yù)后的潛在指標(biāo)。

實(shí)施例2：構(gòu)建穩(wěn)定敲低oxct1的細(xì)胞系和穩(wěn)定過表達(dá)oxct1的細(xì)胞系。

1.構(gòu)建穩(wěn)定敲低oxct1mrna和蛋白的細(xì)胞株

(1)構(gòu)建shoxct1的表達(dá)質(zhì)粒

制備敲低oxct1基因表達(dá)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpinstructure)shoxct1，發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpinstructure)整合到細(xì)胞基因組后能表達(dá)sirna，sirna與risc通過抑制mrna翻譯或切割mrna，從而降低目的基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。上述shoxct1可由相關(guān)生物公司進(jìn)行合成，本發(fā)明所用到的shoxct1包括廣譜性敲低oxct1基因表達(dá)的shrna以及敲低內(nèi)源oxct1基因表達(dá)的shrna。廣譜性敲低oxct1的shrna購買于sigma公司shrna庫，共兩個(gè)shrna質(zhì)粒，包括oxct1-敲低1(trc_id：trcn0000036035)和oxct1-敲低2(trc_id：trcn0000036037)。購買 的廣譜性敲低oxct1質(zhì)粒為plko-lenti-puro表達(dá)載體，陰性對照ntccontrol的序列為隨機(jī)序列。敲低內(nèi)源oxct1基因表達(dá)的shrna是根據(jù)oxct1mrna的3‘-utr序列設(shè)計(jì)的，因此使用的shrna只針對內(nèi)源oxct1基因的表達(dá)有抑制作用，而對外源無3‘-utr區(qū)域的oxct1表達(dá)無影響。shoxct1的senseseq：5’-agggctgtgggataatttacc-3’(seqidno：3)，而陰性對照ntccontrol的序列為隨機(jī)序列。將純化的oxct1的發(fā)卡結(jié)構(gòu)正向+反向序列或者對照control的隨機(jī)序列構(gòu)建到plko-lenti-puro表達(dá)載體(購自addgene)中，獲得shoxct1表達(dá)質(zhì)粒plko-lenti-puro-shoxct1。

(2)病毒感染人肝癌細(xì)胞

分別利用lipofectamine2000(invitrogen，#11668)，將獲得的plko-lenti-puro-shoxct1和作為對照的plko-lenti-puro-隨機(jī)序列(ntc)轉(zhuǎn)入hek293細(xì)胞。并于6小時(shí)后更換dmem培養(yǎng)基(dmem；gibcobrl)輔以10％的胎牛血清(gibcobrl)。48小時(shí)及72小時(shí)后收集慢病毒上清，并感染肝癌細(xì)胞hepg2或hep3b細(xì)胞。用puromycin(0.5μg/ml；sigma-aldrich)篩選10天左右可得到穩(wěn)定敲低oxct1蛋白的細(xì)胞株hepg2/hep3b-shoxct1，對照細(xì)胞株為轉(zhuǎn)入空載體的穩(wěn)定細(xì)胞株hepg2/hep3b-ntccontrol。

(3)培養(yǎng)穩(wěn)定的敲低oxct1的肝癌細(xì)胞株

使用dmem培養(yǎng)基(dmem；gibcobrl)輔以10％的胎牛血清(gibcobrl)和半抑制濃度puromycin的培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌細(xì)胞hepg2或hep3b，并在37℃的含5％濃度二氧化碳的無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.構(gòu)建穩(wěn)定的oxct1mrna和蛋白過表達(dá)的細(xì)胞株

(1)構(gòu)建oxct1的表達(dá)質(zhì)粒

用pcr擴(kuò)增oxct1cds區(qū)域的cdna序列(seqidno:4)，將純化的oxct1的cds序列構(gòu)建到psin-lenti-puro表達(dá)載體(購自addgene)，獲得oxct1過表達(dá)質(zhì)粒psin-lenti-puro-oxct1。

(2)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞

分別利用lipofectamine2000(invitrogen，#11668)，將獲得的psin-lenti-puro-oxct1和作為對照的psin-lenti-puro-隨機(jī)序列轉(zhuǎn)入 hek293細(xì)胞。并于6小時(shí)后更換dmem培養(yǎng)基(dmem；gibcobrl)輔以10％的胎牛血清(gibcobrl)。48小時(shí)及72小時(shí)后收集慢病毒上清，并感染人肝癌細(xì)胞hepg2或hep3b細(xì)胞。用puromycin(0.5μg/ml；sigma-aldrich)篩選10天左右可得到穩(wěn)定的oxct1mrna和蛋白過表達(dá)的細(xì)胞株hepg2/hep3b-oxct1，對照細(xì)胞株為轉(zhuǎn)入psin-lenti-puro空載體后構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞株hepg2/hep3b-evcontrol。

(3)培養(yǎng)穩(wěn)定的過表達(dá)oxct1mrna和蛋白的細(xì)胞株

使用dmem培養(yǎng)基(dmem；gibcobrl)輔以10％的胎牛血清(gibcobrl)和半抑制濃度puromycin的培養(yǎng)基培養(yǎng)肝癌細(xì)胞hepg2或hep3b，并在37℃的含5％濃度二氧化碳的無菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

實(shí)施例3：oxct1蛋白在肝癌細(xì)胞中的功能研究

1.檢測腫瘤細(xì)胞增殖

(1)體外實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)

通過溴酚藍(lán)染色的方法對不同組的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)，檢測敲低oxct1基因/蛋白和外源過表達(dá)oxct1基因/蛋白的肝癌細(xì)胞生長速率的變化。簡述如下：將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(hepg2/hep3b-shoxct1和hepg2/hep3b-oxct1)或?qū)φ战M細(xì)胞(hepg2/hep3b-ntccontrol和hepg2-evcontrol)按5×10⁴個(gè)/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，24小時(shí)后將dmem培養(yǎng)基(dmem；gibcobrl)中的10％胎牛血清(gibcobrl)替換為0％或1％，每隔24小時(shí)將對應(yīng)孔中的細(xì)胞消化吹散成單個(gè)細(xì)胞，用溴酚藍(lán)稀釋至一定倍數(shù)后將細(xì)胞稀釋懸液滴加入血球計(jì)數(shù)板中，在顯微鏡下對細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最后與稀釋倍數(shù)相乘得到每孔細(xì)胞數(shù)，本實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

結(jié)果：如圖5-a和5-b所示較對照組細(xì)胞hepg2/hep3b-ntccontrol和hepg2/hep3b-evcontrol(圖中ntc和ev曲線)，敲低oxct1蛋白的肝癌細(xì)胞在血清饑餓后增殖明顯減慢(圖中oxct1敲低1/2曲線),而在敲低內(nèi)源oxct1后過表達(dá)外源oxct1基因/蛋白的肝癌細(xì)胞增殖明顯加快(圖中oxct1過表達(dá)曲線)。

結(jié)果分析：細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低oxct1蛋白能抑制肝癌細(xì)胞hepg2或hep3b在血清饑餓條件下的生長，而過表達(dá)oxct1蛋白能促進(jìn)肝癌細(xì)胞hepg2或hep3b在血清饑餓條件下的生長。

(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

方法：將5×10⁶個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(hepg2-shoxct1和hepg2-oxct1)或?qū)φ战M細(xì)胞(hepg2-ntccontrol和hepg2-evcontrol)分別注射到6只4周齡左右裸鼠的右測背部皮下部位。追蹤注射后1個(gè)月內(nèi)腫瘤的形成情況和腫瘤的大小。

結(jié)果：如圖6-a和6-b所示，在小鼠體重沒有明顯差異的情況下，敲低oxct1的肝癌細(xì)胞(hepg2-shoxct1)形成的腫瘤體積和重量明顯小于對照組(hepg2-ntccontrol)，而過表達(dá)oxct1基因/蛋白的細(xì)胞(hepg2-oxct1)形成的腫瘤體積和重量明顯大于對照組(hepg2-evcontrol)。

結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低oxct1基因/蛋白的表達(dá)減弱了肝癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力，而過表達(dá)oxct1基因/蛋白增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。

2.檢測細(xì)胞自噬

(1)通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)(westernblot)的方式檢測oxct1基因/蛋白對于體外肝癌細(xì)胞自噬的影響

lc3蛋白是細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志物，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，胞漿型lc3(即lc3-i)會(huì)酶解掉一段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型lc3(即lc3-ii)，通過檢測lc3-ii/i比值的大小可以得到細(xì)胞自噬水平的高低情況。

方法：將肝癌細(xì)胞(hepg2-shoxct1和hepg2-oxct1)或?qū)φ战M細(xì)胞(hepg2-ntccontrol和hepg2-evcontrol)分別進(jìn)行血清饑餓處理48小時(shí)，進(jìn)而通過細(xì)胞裂解液使各組分細(xì)胞破碎，細(xì)胞內(nèi)容物(包括蛋白質(zhì))融入細(xì)胞裂解液中，在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞溶解液蛋白質(zhì)定量調(diào)整，最終將統(tǒng)一蛋白含量的各組分樣品通過westernbolt檢測分析，具體步驟為：應(yīng)用sds-page電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶封閉蛋白；用分別與lc3，oxct1和actin這三種蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體(購自proteintech，#12135-1-ap，#12175-1-ap和#60008-1-ig)與其充分結(jié)合后，再用與一抗特異性結(jié)合的二抗(購自bio-rad，抗兔和抗小鼠)與其結(jié)合后，進(jìn)行熒光顯影，定影；將圖片掃描后進(jìn)行分析。

結(jié)果：如圖7-a所示，在血清饑餓條件下敲低oxct1基因/蛋白的肝癌細(xì)胞(hepg2-shoxct1)中l(wèi)c3-ii/i的比值明顯大于對照組(hepg2-ntccontrol)，而過表達(dá)oxct1蛋白的肝癌細(xì)胞(hepg2-oxct1)中l(wèi)c3-ii/i的比值明顯小于對照組(hepg2-evcontrol)。

結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低oxct1基因/蛋白的表達(dá)增加了肝癌細(xì)胞在血清饑餓下的自噬水平，而過表達(dá)oxct1基因/蛋白減少了肝癌細(xì)胞在血清饑餓下的自噬水平。

(2)通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)(westernblot)的方式檢測oxct1對于體內(nèi)肝癌組織細(xì)胞自噬的影響

方法：將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中裸鼠皮下形成的肝癌組織(hepg2-shoxct1和hepg2-oxct1)或?qū)φ战M組織(hepg2-ntccontrol和hepg2-evcontrol)分別進(jìn)行勻漿超聲破碎，進(jìn)而通過細(xì)胞裂解液使各組分細(xì)胞破碎，細(xì)胞內(nèi)容物(包括蛋白質(zhì))融入細(xì)胞裂解液中，在相同條件下進(jìn)行細(xì)胞溶解液蛋白質(zhì)定量調(diào)整，最終將統(tǒng)一蛋白含量的各組分樣品通過westernbolt檢測分析，具體步驟為：應(yīng)用sds-page電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶封閉蛋白；用分別與lc3，oxct1和actin這三種蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體(購自proteintech，#12135-1-ap，#12175-1-ap和#60008-1-ig)與其充分結(jié)合后，再用與一抗特異性結(jié)合的二抗(購自bio-rad，抗兔和抗小鼠)與其結(jié)合后，進(jìn)行熒光顯影，定影；將圖片掃描后進(jìn)行分析。

結(jié)果：如圖7-b所示，敲低oxct1基因的小鼠體內(nèi)肝癌組織(hepg2-shoxct1)中l(wèi)c3-ii/i的比值明顯大于對照組(hepg2-ntccontrol)，而過表達(dá)oxct1的體內(nèi)肝癌組織(hepg2-oxct1)中l(wèi)c3-ii/i的比值明顯小于對照組(hepg2-evcontrol)。

結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲低oxct1基因/蛋白的表達(dá)增加了體內(nèi)肝癌組織細(xì)胞的自噬水平，而過表達(dá)oxct1減少了體內(nèi)肝癌組織細(xì)胞的自噬水平。

(3)通過肝癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)gfp-lc3結(jié)合熒光共聚焦顯微鏡檢測oxct1對肝癌細(xì)胞自噬的影響

方法：首先構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)lc3-gfp質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞株：用pcr擴(kuò)增 lc3cds區(qū)域的cdna序列(seqidno：5)，將純化的lc3的cds序列構(gòu)建到psin-gfp-lenti-puro表達(dá)載體(購自addgene)，獲得lc3過表達(dá)質(zhì)粒psin-gfp-lenti-puro-lc3。利用lipofectamine2000(invitrogen，#11668)，將獲得的psin-gfp-lenti-puro-lc3體轉(zhuǎn)入hek293細(xì)胞。并于6小時(shí)后更換dmem培養(yǎng)基(dmem；gibcobrl)輔以10％的胎牛血清(gibcobrl)。48小時(shí)及72小時(shí)后收集慢病毒上清，并感染肝癌細(xì)胞hepg2-shoxct1，hepg2-shoxct1，以及對照hepg2-ntccontrol，hepg2-evcontrol細(xì)胞。

然后對相應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓處理，48小時(shí)后在共聚焦熒光顯微鏡下觀察，最后統(tǒng)計(jì)散點(diǎn)狀lc3-gfp和融合狀lc3-gfp的比例。

結(jié)果：如圖7-c所示，在血清饑餓的條件下，敲低oxct1的肝癌細(xì)胞(hepg2-shoxct1)中散點(diǎn)狀lc3-gfp和融合狀lc3-gfp的比例明顯大于對照組(hepg2-ntccontrol)，而過表達(dá)oxct1基因/蛋白的肝癌細(xì)胞(hepg2-oxct1)中散點(diǎn)狀lc3-gfp和融合狀lc3-gfp的比例明顯小于對照組(hepg2-evcontrol)。

結(jié)果分析：在血清饑餓的條件下，敲低oxct1基因/蛋白的表達(dá)增加了肝癌細(xì)胞的自噬水平，而過表達(dá)oxct1基因/蛋白減少了肝癌細(xì)胞的自噬水平。