本發(fā)明涉及鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體、其用途以及分泌所述單克隆抗體的雜交瘤細胞。
背景技術(shù):
a群輪狀病毒(grouparotavirus,rv)是引發(fā)全球兒童嚴重腹瀉的單一主因,并且可引發(fā)人類和動物急性胃腸道疾病。該病毒首先感染小腸上皮細胞,進而造成細胞毀傷,引發(fā)腹瀉,情況嚴重時將會危及生命。全球幾近每一個約5歲的孩子都曾感染過rv至少一次。與其他引發(fā)腸胃炎的病原體比擬,rv引發(fā)的如高燒、嘔吐、伴隨腹瀉的嘔吐等嚴重癥狀的頻率更高。據(jù)調(diào)查表現(xiàn),全世界每一年平均有60萬兒童死于rv感染,占全球5歲以下兒童總死亡人數(shù)的5%,有超過85%的死亡是發(fā)生在非洲及亞洲等發(fā)展中國家。在美國,因得胃腸炎而住院的患病兒童中30%-70%是因為rv感染,而在我國,該病毒感染所致的急性胃腸炎占30%-40%,每一年因此死亡的5歲以下兒童約有3萬。rv感染不但嚴重危及了嬰幼兒的健康及生存質(zhì)量,并且給家庭及社會帶來龐大的經(jīng)濟負擔(dān),rv感染已成為一項亟待解決的重要公共衛(wèi)生問題。截止到目前,市面上尚沒有能夠有效治療rv感染的特效藥,因此研究快速并準(zhǔn)確的rv早期檢測方法對于該病毒的防治具有深遠的意義。
目前在輪狀病毒的檢測技術(shù)中,可靠性和實用性符合要求的依然是世界衛(wèi)生組織who推薦的免疫學(xué)技術(shù),如elisa雙抗體夾心法。大部分免疫學(xué)技術(shù)的檢測對象是病人糞便等標(biāo)本中的rv抗原,依賴于rv抗原與單克隆抗體的結(jié)合。另外,樣品中難以避免的血紅蛋白、膽紅素、乳糜等成分,往往也會干擾單克隆抗體與抗原的結(jié)合,從而對實驗室或臨床樣品的檢測造成不良的影響。因此,檢測中使用的單克隆抗體的效價等特性,會對檢測的特異性與靈敏度造成很大的影響。
基于單克隆抗體的檢測試紙條對保存條件、操作條件要求較高。在實驗室或臨床實際操作中,特別是在實驗/醫(yī)療條件較差的偏遠地區(qū)等,保存條件以及操作人員的業(yè)務(wù)水平有時往往無法達到標(biāo)準(zhǔn)要求。例如,試劑可能會因停電或操作不當(dāng)而被反復(fù)凍融,或凍存時間過長。在炎熱的落后地區(qū)(如非洲),試劑可能會被誤置于高溫?zé)峒铀俚沫h(huán)境中。在這種情況下,常規(guī)試紙條往往會發(fā)生性狀變化,導(dǎo)致檢測結(jié)果不夠穩(wěn)定可靠,這也是人們長期以來期待解決的問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明制備的雜交瘤細胞能夠分泌出高效價的鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體應(yīng)用于快速檢驗樣品中rv的試紙條如膠體金平臺時,特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好。
本發(fā)明采用經(jīng)典的雜交瘤單克隆抗體技術(shù)。以rv抗原(杭州啟泰生物技術(shù)有限公司)免疫2只balb/c小鼠,血清篩選后選取抗體效價較好的小鼠取脾用于細胞融合,融合后經(jīng)有限稀釋法克隆、篩選出2株能穩(wěn)定分泌鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株,繼而通過制備小鼠腹水,經(jīng)純化后得到鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體,并制備成檢測試劑盒檢測臨床樣品。我們制備的可分泌鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體能與目的抗原發(fā)生高效價的特異性結(jié)合。在膠體金平臺上使用雙抗體夾心法快速定性檢測糞便中rv時,特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好。
附圖說明
圖1展示了本發(fā)明的鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體1和鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體2與兩種商業(yè)化的鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體3和鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體4的抗體效價檢測的結(jié)果。以log(稀釋度)作為橫坐標(biāo),抗體od值作為縱坐標(biāo)。
圖2展示了使用本發(fā)明的鼠抗a群輪狀病毒的單克隆抗體的膠體金檢測試紙的示意圖。1-pvc底板,2-樣品墊,3-膠體金墊,4-包被膜,5-標(biāo)記物包被區(qū)(t線),6-質(zhì)控物包被區(qū)(c線),7-吸水墊。
圖3展示了本發(fā)明檢測試紙條用于檢測時的陽性、陰性、無效結(jié)果解釋示意圖。
實施方式
本文包括以下的實施例,用于以例證的方式更清楚、明確地闡述本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的公開應(yīng)當(dāng)理解,可以在所公開的特定的實施方式中進行許多改變但是仍然獲得相似或類似的結(jié)果,而不偏離本發(fā)明的思想和范圍。本發(fā)明的具體實施方式僅用于解釋本發(fā)明,而非意圖通過任何方式限制本發(fā)明。
實施例1
雜交瘤細胞株的制備與篩選
(1)rv抗原免疫小鼠
將rv抗原(購自杭州啟泰生物技術(shù)有限公司)用生理鹽水稀釋至2.0mg/ml,與弗氏完全佐劑(購自sigma公司,貨號slbf-9338v)等體積混合,用1ml注射器乳化為油狀乳液,直至滴入水中的油狀乳液不分散方可停止乳化。將該乳液以100μl/只的劑量四肢腋窩皮下施給balb/c小鼠(購自成都達碩實驗動物中心,6周齡雌性,2只)。第一次免疫14天后增強免疫,取抗原與弗氏不完全佐劑(購自sigma公司,貨號slbm9367v)等體積混合后乳化,免疫劑量為50μl/只。以后每隔一周增強免疫一次,每次免疫之前采尾血,分離血清,用間接elisa法測定效價。免疫5次后,2只小鼠血清效價均大于1:106,即可用于融合。融合前3天,取rv抗原用生理鹽水稀釋至2.0mg/ml,再與生理鹽水等體積混合尾靜脈追加免疫,劑量為50μl/只。
(2)雜交瘤細胞系的制備
①飼養(yǎng)細胞的制備
以正常的10周齡balb/c鼠腹腔巨噬細胞作飼養(yǎng)細胞。在融合前1天,balb/c取眼血拉頸處死,0.1%新潔爾滅浸泡1分鐘,轉(zhuǎn)入75%酒精浸泡1分鐘。超凈臺內(nèi)無菌操作下用剪刀剪開腹部皮膚,暴露腹膜,用注射器腹腔注入rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液3ml,后以滴管取出,再加入rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液7ml反復(fù)沖洗?;厥諞_洗液,1000rpm離心5分鐘留沉淀,用已加入20%新生牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液重懸,調(diào)整細胞濃度為3-5×105個/ml,加入96孔板,100μl/孔,37℃、5%co2培養(yǎng)。
②免疫脾細胞的制備
小鼠追加免疫三天后,在無菌條件下取出脾臟,置于平皿中,rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗一次,剪碎、研磨、過濾后得到分散的脾細胞,1000rpm離心5分鐘留沉淀,rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸,3%乙酸稀釋計數(shù)。
③骨髓瘤細胞的制備
小鼠骨髓瘤細胞sp2/0(購自中國科學(xué)院細胞庫)經(jīng)8-氮鳥嘌呤篩選后,培養(yǎng)至對數(shù)生長期,取6大瓶(75cm2)制成細胞懸液,1000rpm離心5分鐘留沉淀,用rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸、計數(shù),按0.5-2×105個/ml的細胞濃度進行分瓶培養(yǎng)(一般情況每1-2天更換一次15-30ml完全1640培養(yǎng)基)。
④細胞融合及hat選擇培養(yǎng)雜交瘤
將骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1:8的比例混合,在50ml錐形離心管內(nèi)用rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗1次,1000rpm離心5分鐘留沉淀。將細胞混勻,緩慢加入1.2ml50%的peg4000融合,融合1分鐘后加入30ml的rpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止細胞融合。700rpm/min離心5分鐘后重懸于含有1%hat與20%新生牛血清的1640培養(yǎng)基中,平均滴入30套96孔細胞培養(yǎng)板。37℃,5%co2培養(yǎng),次日補加含有1%hat與20%新生牛血清的1640培養(yǎng)基至孔滿。5天后半換培養(yǎng)基,7天后再次半換培養(yǎng)基。
⑤陽性細胞株的篩選
用0.06mph9.6碳酸緩沖溶液稀釋rv抗原(杭州啟泰生物技術(shù)有限公司)至5μg/ml,96孔酶標(biāo)板中每孔包被100μl,用于檢測細胞培養(yǎng)上清。放置于冰箱中2-8℃過夜,第二天拋棄孔中液體,elisa洗液洗板三次,拍干,用含10%小牛血清的0.01mph7.2的pbs150μl/孔,37℃封閉2小時,拍干,真空封裝待用。脾細胞融合后第九天,取細胞上清100μl于上述96孔檢測板中,37℃孵育40分鐘,elisa洗板機洗五次后加入5000倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠igg(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)100μl,37℃孵育30分鐘同上洗板后,每孔加入100μl顯色液(含0.1%(m/v)鄰苯二胺,0.1%(v/v)雙氧水,ph5.0檸檬酸磷酸緩沖液),37℃孵育10分鐘,每孔加入50μl2m硫酸溶液終止反應(yīng),測450nm吸收值。以融合時小鼠血清稀釋至100倍為陽性對照,rpmi1640完全培養(yǎng)液作為陰性對照,陰性對照od值<0.2,陽性對照od值>1.8為檢測系統(tǒng)有效,樣品od值≥2×陰性對照od值時,為陽性,反之為陰性。分泌抗體陽性細胞孔以1個細胞/孔在96孔培養(yǎng)板上用有限稀釋法克隆,篩選陽性孔依上法連續(xù)克隆四次,使其達到100%單克隆,轉(zhuǎn)入24孔繼續(xù)培養(yǎng),待細胞長滿80%時轉(zhuǎn)入細胞瓶擴大培養(yǎng),待細胞長滿細胞瓶80%時分瓶傳代,傳代的細胞生長至對數(shù)期時,用適量無血清rpmi-1640培養(yǎng)基分散細胞瓶內(nèi)細胞,收集細胞懸液于錐形離心管中,記錄細胞懸液體積v,取適量細胞懸液進行細胞計數(shù),得到細胞懸液密度(個/ml),其余1000rpm離心5min后棄上清液,根據(jù)細胞密度和離心前體積算出沉淀的細胞數(shù),向細胞沉淀中加入適量凍存液調(diào)整細胞密度至4-8×106個/ml,然后分裝于無菌凍存管中,每只凍存管加細胞液0.5ml。細胞融合共獲得2株能穩(wěn)定分泌鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株rvab-1與雜交瘤細胞株rvab-2,且分別分泌的抗體以雙抗體夾心法檢測rv抗原可配對,并于2017年3月30日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國,武漢,武漢大學(xué)),保藏號分別為cctccno:c201743、cctccno:c201744。
實施例2
單克隆抗體的制備
選取6-8周健康的balb/c小鼠,每只小鼠腹腔注射0.5ml液體石蠟(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司),7天后每只小鼠腹腔注射0.5~1×106個雜交瘤細胞株rvab-1或雜交瘤細胞株rvab-2。接種細胞7-10天后產(chǎn)生腹水,密切觀察小鼠的健康狀況與腹水征象,待腹水盡可能多,而小鼠瀕死之前,處死小鼠,用滴管將腹水吸入試管中,兩株細胞分別收集8ml與10ml腹水。收集的腹水4000rpm離心10min后取上清,分別取小樣放于-20℃冰箱保存。腹水用硫酸氨飽和沉淀后,再用蛋白a親合層析柱純化,sds-page檢測得到的兩株單克隆抗體純度均大于90%。
實施例3
效價檢測
(1)雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價檢測
用0.06mph9.6碳酸緩沖溶液稀釋rv抗原(杭州啟泰生物技術(shù)有限公司)至5μg/ml,96孔酶標(biāo)板中每孔包被100μl。放置于冰箱中2-8℃過夜,第二天拋棄孔中液體,elisa洗板機洗三次,拍干,用含10%小牛血清的0.01mph7.2的pbs,150μl/孔,37℃封閉2小時棄液體,拍干,用于檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價、腹水效價、純化后的抗體效價。雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價檢測第一孔為原倍上清培養(yǎng)液,從第二孔至第四孔以0.01mph7.2的pbs緩沖液10倍逐級稀釋,第五孔至第十孔以2倍逐級稀釋。第十一孔以融合時小鼠血清稀釋至100倍作陽性對照,第十二孔以rpmi1640完全培養(yǎng)液作陰性對照,每孔樣品體積為100μl。37℃孵育40分鐘,elisa洗板機洗五次后加入5000倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠igg(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)100μl,37℃孵育30分鐘同上洗后,每孔加入100μl含0.1%(m/v)鄰苯二胺,0.1%(v/v)雙氧水,ph5.0檸檬酸磷酸緩沖液,37℃孵育10分鐘,每孔加入50μl2m硫酸溶液終止反應(yīng),測450nm吸收值。陰性對照od值<0.2,陽性對照od值>1.8為檢測系統(tǒng)有效,當(dāng)od值≥2×陰性對照od值時,為陽性,反之為陰性。檢測值最低陽性孔所對應(yīng)的稀釋比例即為雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價,雜交瘤細胞株rvab-1培養(yǎng)上清效價大于1:1024,雜交瘤細胞株rvab-2培養(yǎng)上清效價大于1:512。
(2)腹水效價檢測
elisa檢測方法同上文第(1)部分中所述。稀釋方法不同,具體為:第一孔為原倍腹水,以0.01mph7.2的pbs緩沖液從第二孔至第七孔10倍逐級稀釋,從第八孔至第十一孔以2倍逐級稀釋。檢測值最低陽性孔所對應(yīng)的稀釋比例即為腹水效價,雜交瘤細胞株rvab-1與雜交瘤細胞株rvab-2所制備的腹水效價均大于1:5×105。
(3)抗體效價檢測
先將本發(fā)明的兩株鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體(四川邁克生物新材料技術(shù)有限公司)以0.01mph7.2的pbs緩沖液統(tǒng)一稀釋為1mg/ml,后再稀釋100倍作為初始第一孔,從第二孔開始至第十一孔作3倍逐級稀釋,每孔加樣體積為100μl。37℃孵育50分鐘,elisa洗板機洗五次后加入12000倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠igg(四川邁克生物新材料技術(shù)有限公司)100μl,37℃孵育1h同上洗后,每孔加入100μl含0.1%(m/v)鄰苯二胺,0.1%(v/v)雙氧水,ph5.0檸檬酸磷酸緩沖液,37℃孵育15分鐘,每孔加入50μl2m硫酸溶液終止反應(yīng),檢測450nm吸收值。陰性對照od值<0.2,陽性對照od值>1.8為檢測系統(tǒng)有效。抗體效價判定標(biāo)準(zhǔn):以log(稀釋度)為橫坐標(biāo),以抗體od值為縱坐標(biāo)作曲線,曲線方程為y=min+(max-min)/(1+10^((logec50-x)×hillslope)),通過sigmaplot數(shù)據(jù)處理軟件擬合曲線,取中值效價=10logec50。結(jié)果顯示本發(fā)明的兩株鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體的中值效價均大于6×104。以同樣方法對照檢測已商業(yè)化的杭州啟泰生物技術(shù)有限公司的可雙抗體夾心法檢測rv抗原的配對鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體,通過擬合,中值效價為6-8×103,均顯著均低于本發(fā)明雜交瘤細胞獲得的兩株配對抗體。表1與圖1列出了效價測定結(jié)果。
表1抗體效價檢測
實施例4
檢測試紙條的制備及使用
(1)檢測試紙條的制備
本發(fā)明的雜交瘤細胞株rvab-1與雜交瘤細胞株rvab-2分別分泌的鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體1與鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體2能應(yīng)于膠體金平臺快速定性檢測糞便中的rv。該檢測試紙條由包含在pvc底板上順次固定且端部互相連接的樣品墊、膠體金墊、包被膜、吸水墊組成,所述膠體金墊包被有鼠抗a群輪狀病毒抗原單克隆抗體2的膠體金復(fù)合物,所述包被膜上沿著從樣品墊到吸水墊的方向在膜本體上順次分布有互相間隔開的包被有鼠抗a群輪狀病毒抗原單克隆抗體1的標(biāo)記物包被區(qū)(t線),以及質(zhì)控物包被區(qū)(c線)。標(biāo)記濃度、包被濃度、劃膜間距優(yōu)選方案見下表2、3、4。本發(fā)明的試紙條中,質(zhì)控包被物選自抗鼠igg、抗兔igg、兔igg、生物素、親和素、或結(jié)合有生物素或親和素的蛋白等,優(yōu)選抗鼠igg。圖2為該試紙條的示意圖,1-底板,2-樣品墊,3-膠體金墊,4-包被膜,包被有鼠抗a群輪狀病毒抗原單克隆抗體2(rvab-2分泌)的膠體金復(fù)合物,5-標(biāo)記物包被區(qū)(t線),包被有鼠抗a群輪狀病毒抗原單克隆抗體1(rvab-1分泌),6-質(zhì)控物包被區(qū)(c線),7-吸水墊。圖3為本發(fā)明的陰性、陽性、無效結(jié)果解釋示意圖。
表2標(biāo)記濃度
表3包被濃度
表4劃膜間距
替代方案:抗鼠igg可被抗兔igg、兔igg、生物素、親和素以及結(jié)合有生物素或親和素的蛋白替代。
(2)檢測本發(fā)明檢測試紙條的抗干擾能力
將陰性與陽性參考品中分別加入血紅蛋白、膽紅素、乳糜,然后按上述方案制備本發(fā)明的檢測試紙條并檢驗以上經(jīng)處理的參考品,各重復(fù)10次檢測,其結(jié)果顯色一致。結(jié)果表明血紅蛋白、膽紅素、乳糜對本發(fā)明的檢測試紙條無影響。以同樣條件利用杭州啟泰生物技術(shù)有限公司的可雙抗體夾心法檢測rv抗原的鼠抗a群輪狀病毒配對抗體制備檢測試紙條,其檢測結(jié)果判定正確,但存在顯色不一致的現(xiàn)象,表明血紅蛋白、膽紅素、乳糜對杭州啟泰生物技術(shù)有限公司的可雙抗體夾心法檢測rv抗原的鼠抗a群輪狀病毒配對抗體制備的試紙條有一定影響,在下表5中列出了檢測結(jié)果。
表5抗干擾能力檢測
(3)靈敏度檢測
采用上述方案制備的檢測試紙條分別檢驗100例陽性樣品與100例陰性樣品。表6列出了本發(fā)明的單克隆抗體制備的檢測試紙條與商業(yè)化試紙條(北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司)的比較實驗,檢驗結(jié)果表明本發(fā)明的鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體1與鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體2制備的檢測試紙條其靈敏度及特異性均高于商業(yè)化試紙條,在表6中列出了檢測結(jié)果。
表6陽性與陰性樣品檢驗
(4)穩(wěn)定性檢測
將本發(fā)明的鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體1與鼠抗a群輪狀病毒單克隆抗體2在以下條件下處理:a-20℃反復(fù)凍融3次;b-20℃反復(fù)凍融4次;c-20℃反復(fù)凍融5次;d-20℃保存12個月;e37℃熱加速7天;f37℃熱加速20天,其他條件不變,按上述方法制備成檢測試紙條分別檢驗10份陽性參考品與10份陰性參考品,符合率均為100%。表明本發(fā)明的兩株抗體穩(wěn)定性良好,且利用本發(fā)明抗體制備的檢測試紙條穩(wěn)定性、精密性良好。在同樣條件下處理商業(yè)化的b廠家(杭州啟泰生物技術(shù)有限公司)的可雙抗體夾心法檢測rv抗原的抗a群輪狀病毒配對抗體,并制備檢測試紙條,分別檢測此10份陽性參考品與10份陰性參考品。結(jié)果顯示其反復(fù)凍融4至5次或-20℃保存12個月或熱加速7天后已部分開始降解,檢驗結(jié)果與參考品不完全符合。在表7中列出了檢測結(jié)果。
表7穩(wěn)定性檢驗
由此可見,本發(fā)明制得的單克隆抗體在多變、嚴苛的條件下仍然保持了很高的穩(wěn)定性。這一特性保證了制成用于檢測樣品中的rv的檢測試紙條時,制得的檢測試紙條可以適用于多種實驗室和臨床條件,并且在低溫保存、反復(fù)凍融、熱加速之后仍然保持其穩(wěn)定的可靠性。