本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
造血干細(xì)胞是血液系統(tǒng)中的成體干細(xì)胞，是一個(gè)異質(zhì)性的群體，具有長(zhǎng)期自我更新的能力和分化成各類(lèi)成熟血細(xì)胞的潛能。它是研究歷史最長(zhǎng)且最為深入的一類(lèi)成體干細(xì)胞，對(duì)研究各類(lèi)干細(xì)胞，包括腫瘤干細(xì)胞，具有重要指導(dǎo)意義。
血液系統(tǒng)中的成熟細(xì)胞壽命極短，因此在人的一生中，造血干細(xì)胞需要根據(jù)機(jī)體的生理需求適時(shí)的補(bǔ)充血液系統(tǒng)各個(gè)成熟細(xì)胞組分。同時(shí)在損傷、炎癥等應(yīng)激狀態(tài)下，造血干細(xì)胞也扮演著調(diào)節(jié)和維持體內(nèi)血液系統(tǒng)各個(gè)細(xì)胞組分的生理平衡的角色。1961年tillje,mccullochea用小鼠體內(nèi)脾結(jié)節(jié)方法第一次證實(shí)了造血干細(xì)胞的存在。八十年代后，weissman等多個(gè)實(shí)驗(yàn)室相繼通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記分離出高度純化的不同階段的造血干祖細(xì)胞。在小鼠造血干細(xì)胞的研究中，造血干細(xì)胞的分離是通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記lineagesca-1c-kit或者細(xì)胞代謝方面的特性(側(cè)群細(xì)胞)借助于流式細(xì)胞儀實(shí)現(xiàn)的。九十年代通過(guò)引入cd34這個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記區(qū)分小鼠中長(zhǎng)期造血干細(xì)胞和短期造血干細(xì)胞。進(jìn)入二十一世紀(jì)后，基于slam家族分子(cd41，cd48和cd150)進(jìn)一步富集造血干細(xì)胞，slam分子在造血干細(xì)胞的表達(dá)比較穩(wěn)定，并且能夠廣泛的應(yīng)用于各品系的實(shí)驗(yàn)小鼠。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞的方法，所述制備方法為大量獲取造血干細(xì)胞提供了一種有效途徑，對(duì)臨床治療中造血干細(xì)胞的移植具有重要意義。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞的方法，該方法具體步驟如下：
s1、取人體胚胎干細(xì)胞接種在bg02培養(yǎng)基上；
s2、培養(yǎng)過(guò)程中每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合狀態(tài)后，消化后接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，傳代比例1:5-6；
s3、取生長(zhǎng)良好的胚胎干細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種至六孔培養(yǎng)板中，六孔培養(yǎng)板中加入dmem/f12培養(yǎng)液，培養(yǎng)3-4d對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)；
s4、將s3中預(yù)誘導(dǎo)結(jié)束的細(xì)胞pbs反復(fù)吹打，離心沉淀后加入胰蛋白酶消化，之后3-4×107/l的細(xì)胞密度接種至0.9％甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基中，每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合狀態(tài)后，37℃條件下加入2-3mg/ml膠原酶ⅳ進(jìn)行消化傳代，接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，傳代比例1:5，得到造血干細(xì)胞。
進(jìn)一步地，s1中所述培養(yǎng)基成分為：dmem/f12培養(yǎng)基中加入0.5％n2，0.5％b27，20-30ng/mlbfgf和2-5ng/mltgfβ。
進(jìn)一步地，所述s2中37℃條件下加入1mg/mltryple細(xì)胞消化酶進(jìn)行消化傳代。
進(jìn)一步地，s3中所述dmem/f12培養(yǎng)液中加入0.1mol/l的地塞米松、50μg/ml鏈霉素和50μg/ml青霉素。
進(jìn)一步地，所述半固體培養(yǎng)基中加入15％fbs、30-40ng/mlscf、1000-1200u/mlil-3、10-15ng/mlil-6。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明提供了一種胚胎干細(xì)胞通過(guò)人工誘導(dǎo)分化為造血干細(xì)胞的方法，體外培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞通過(guò)dmem/f12培養(yǎng)基一步誘導(dǎo)后，繼續(xù)接種至半固體培養(yǎng)基中，胚胎干細(xì)胞具有非特異性，能夠進(jìn)行長(zhǎng)期的增殖和自我更新，同時(shí)還具有分化能力，所述制備方法為大量獲取造血干細(xì)胞提供了一種有效途徑，對(duì)臨床治療中造血干細(xì)胞的移植具有重要意義。
當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
本發(fā)明為一種人工誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為造血干細(xì)胞的方法，該方法具體步驟如下：
實(shí)施例1
s1、取人體胚胎干細(xì)胞接種在bg02培養(yǎng)基上，其中培養(yǎng)液成分為：dmem/f12培養(yǎng)基中加入0.5％n2，0.5％b27，20ng/mlbfgf和2ng/mltgfβ；
s2、培養(yǎng)基置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合狀態(tài)后，37℃條件下加入1mg/mltryple細(xì)胞消化酶進(jìn)行消化傳代，接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，傳代比例1:5；
s3、取生長(zhǎng)良好的胚胎干細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種至六孔培養(yǎng)板中，六孔培養(yǎng)板中加入dmem/f12培養(yǎng)液，培養(yǎng)3d對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，其中dmem/f12培養(yǎng)液中加入0.1mol/l的地塞米松、50μg/ml鏈霉素和50μg/ml青霉素；
s4、將s3中預(yù)誘導(dǎo)結(jié)束的細(xì)胞pbs反復(fù)吹打，離心沉淀后加入胰蛋白酶消化，之后3×107/l的細(xì)胞密度接種至0.9％甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入15％fbs、30ng/mlscf、1000u/mlil-3、10ng/mlil-6,置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合狀態(tài)后，37℃條件下加入2mg/ml膠原酶ⅳ進(jìn)行消化傳代，接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，傳代比例1:5，得到造血干細(xì)胞。
實(shí)施例2
s1、取人體胚胎干細(xì)胞接種在bg02培養(yǎng)基上，其中培養(yǎng)液成分為：dmem/f12培養(yǎng)基中加入0.5％n2，0.5％b27，30ng/mlbfgf和5ng/mltgfβ；
s2、培養(yǎng)基置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合狀態(tài)后，37℃條件下加入1mg/mltryple細(xì)胞消化酶進(jìn)行消化傳代，接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，傳代比例1:6；
s3、取生長(zhǎng)良好的胚胎干細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種至六孔培養(yǎng)板中，六孔培養(yǎng)板中加入dmem/f12培養(yǎng)液，培養(yǎng)4d對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，其中dmem/f12培養(yǎng)液中加入0.1mol/l的地塞米松、50μg/ml鏈霉素和50μg/ml青霉素；
s4、將s3中預(yù)誘導(dǎo)結(jié)束的細(xì)胞pbs反復(fù)吹打，離心沉淀后加入胰蛋白酶消化，之后4×107/l的細(xì)胞密度接種至0.9％甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入15％fbs、40ng/mlscf、1200u/mlil-3、15ng/mlil-6,置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合狀態(tài)后，37℃條件下加入3mg/ml膠原酶ⅳ進(jìn)行消化傳代，接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，傳代比例1:5，得到造血干細(xì)胞。
實(shí)施例3
s1、取人體胚胎干細(xì)胞接種在bg02培養(yǎng)基上，其中培養(yǎng)液成分為：dmem/f12培養(yǎng)基中加入0.5％n2，0.5％b27，25ng/mlbfgf和3ng/mltgfβ；
s2、培養(yǎng)基置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合狀態(tài)后，37℃條件下加入1mg/mltryple細(xì)胞消化酶進(jìn)行消化傳代，接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，傳代比例1:5.5；
s3、取生長(zhǎng)良好的胚胎干細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種至六孔培養(yǎng)板中，六孔培養(yǎng)板中加入dmem/f12培養(yǎng)液，培養(yǎng)3.5d對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，其中dmem/f12培養(yǎng)液中加入0.1mol/l的地塞米松、50μg/ml鏈霉素和50μg/ml青霉素；
s4、將s3中預(yù)誘導(dǎo)結(jié)束的細(xì)胞pbs反復(fù)吹打，離心沉淀后加入胰蛋白酶消化，之后3.5×107/l的細(xì)胞密度接種至0.9％甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入15％fbs、35ng/mlscf、1100u/mlil-3、12ng/mlil-6,置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合狀態(tài)后，37℃條件下加入2.5mg/ml膠原酶ⅳ進(jìn)行消化傳代，接種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上，傳代比例1:5，得到造血干細(xì)胞。
以上內(nèi)容僅僅是對(duì)本發(fā)明所作的舉例和說(shuō)明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類(lèi)似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書(shū)所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。