本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種永久細(xì)胞系，具體涉及一種用于羊口瘡病毒增殖的永久細(xì)胞系及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

羊傳染性膿皰又稱羊口瘡(orfvirus)，是一種由羊口瘡病毒所致的人獸共患傳染病。本病幾乎分布于世界所有養(yǎng)羊國(guó)家，自然情況下主要侵害綿羊和山羊，尤其山羊最為易發(fā)。本病流行無(wú)明顯季節(jié)性，但春秋季相對(duì)較易發(fā)生。常呈群發(fā)性流行，3～6月齡羔羊最易感染，病羊和帶毒羊是本病的傳染源。健康羊與病羊直接接觸，或接觸被病羊污染的用具、飲水、飼槽、飼料等而感染。病毒可隨病羊的膿皰、水皰分泌物和唾液以及脫落的痂皮排出，其傳播途徑主要是經(jīng)損傷的皮膚或黏膜而感染。

隨著我國(guó)肉用羊、奶山羊及毛用羊養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，我國(guó)已成為世界第一養(yǎng)羊大國(guó)，養(yǎng)羊業(yè)已成為我國(guó)許多地方的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源和增加收入的主要方式。與此同時(shí)，羊的疫病控制問(wèn)題日趨凸顯，尤其是羊口瘡已成了威脅養(yǎng)羊業(yè)的主要疫病之一。養(yǎng)羊戶急需質(zhì)優(yōu)價(jià)廉高效的羊口瘡疫苗。

但目前市場(chǎng)上卻沒(méi)有羊口瘡疫苗可供用戶使用，主要原因是羊口瘡疫苗生產(chǎn)沒(méi)有實(shí)用的細(xì)胞系，而原代細(xì)胞如牛睪丸原代細(xì)胞、羊胎兒鼻甲細(xì)胞、羊胎兒皮膚成纖維細(xì)胞制備過(guò)程又存在很多問(wèn)題：如樣品數(shù)量有限、制備過(guò)程復(fù)雜、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，批次間質(zhì)量不穩(wěn)定等，導(dǎo)致企業(yè)實(shí)現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)難度大；同時(shí)能用于接種羊口瘡的細(xì)胞系(mdbk)的增殖病毒的滴度不高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題與缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種用于增殖羊口瘡病毒的永久細(xì)胞系，其利用該細(xì)胞系接種羊口瘡病毒(疫苗株)，達(dá)到穩(wěn)定增殖病毒的目的。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于增殖羊口瘡病毒的永久細(xì)胞系，該細(xì)胞系的名稱為山羊睪丸細(xì)胞gt26，已于2017年3月1日保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號(hào)：cctccno：c201734。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述用于增殖羊口瘡病毒的永久細(xì)胞系建立方法，包括以下步驟：

1)羊睪丸細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：

無(wú)菌條件下，含1％雙抗pbs沖洗睪丸3次，剪去睪丸實(shí)質(zhì)上的附睪及白膜，pbs沖洗睪丸實(shí)質(zhì)，直至眼觀無(wú)血液，將其移至無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)。

pbs沖洗將剪成2mm大小的睪丸實(shí)質(zhì)，加入1倍體積的0.5g/li膠原酶，37℃培養(yǎng)箱靜止2h，輕輕吹打5次，加入3倍體積的ph7.4，0.15％的胰蛋白酶8℃靜置12h后，加入含8％血清和1％雙抗dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)基，在50ml離心管輕輕將細(xì)胞吹散，以1500rpm離心8min，加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度到0.5×10⁶/ml，37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2)羊睪丸細(xì)胞永生化的建立：培養(yǎng)的羊睪丸細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶的70％～80％時(shí)，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)馴化的羊睪丸細(xì)胞傳至30代后細(xì)胞生長(zhǎng)呈鋪路石樣。建系過(guò)程中使用培養(yǎng)基添加0.1％dmso和1ug/ml氫化可的松。

在細(xì)胞密度到達(dá)80％～90％時(shí)進(jìn)行傳代，棄去原培養(yǎng)基，用pbs洗滌3次，使用0.15％胰酶消化細(xì)胞至變圓收縮，補(bǔ)新鮮完全培養(yǎng)基拍下混勻細(xì)胞后，置于含37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即為一次細(xì)胞傳代。

注：一般細(xì)胞生長(zhǎng)3天即可傳代，若間隔3天細(xì)胞密度稍低(＜70％)，可棄去部分舊培養(yǎng)基，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞傳代時(shí)間間隔不應(yīng)大于10天。

3)羊睪丸永生化細(xì)胞的低血清馴化：在細(xì)胞密度到達(dá)90％～95％時(shí)進(jìn)行傳代，先棄去舊培養(yǎng)基，用pbs洗滌2～3次，使用0.15％胰酶消化細(xì)胞至變圓收縮，補(bǔ)加含不同血清濃度培養(yǎng)基血清拍下混勻細(xì)胞，依次使用含血清濃度為8％、6％、4％、3％、2％的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

注：1：每個(gè)血清濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞3代；2：在使用較低血清傳代前先使用低血清的培養(yǎng)基，使細(xì)胞適應(yīng)培養(yǎng)基。

步驟1)中羊睪丸細(xì)胞的培養(yǎng)液為m199、dmem高糖或mem培養(yǎng)基。

步驟3)中在羊睪丸細(xì)胞永久化細(xì)胞低血清培養(yǎng)，利用連續(xù)漸進(jìn)降低培養(yǎng)基中血清濃度獲得，羊睪丸細(xì)胞系的培養(yǎng)(正常)結(jié)果。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述永久細(xì)胞系在制備基于羊口瘡病毒的疫苗中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下：

本發(fā)明分離最大限度分離到羊睪丸中的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)自然傳代獲得羊睪丸永生化細(xì)胞并經(jīng)過(guò)降低其培養(yǎng)的血清濃度，建立低血清培養(yǎng)的羊睪丸細(xì)胞系。利用此羊睪丸細(xì)胞系接種羊口瘡病毒(疫苗株)，病毒(疫苗株)能夠在該系細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中穩(wěn)定增殖，并可減少對(duì)于血清的使用。為羊口瘡病毒弱毒疫苗研制和生產(chǎn)提供了穩(wěn)定的細(xì)胞環(huán)境和標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)方法，可用于羊口瘡疫苗的大量生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為羊睪丸細(xì)胞系的培養(yǎng)(正常)結(jié)果；

圖2為羊睪丸細(xì)胞系接種羊口瘡病毒疫苗株72h后的細(xì)胞病變結(jié)果；

圖3所示為羊睪丸細(xì)胞系接種羊口瘡病毒疫苗株96h后的細(xì)胞病變結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，這些實(shí)例僅用于例證，不限制本發(fā)明保護(hù)范圍。若未特別指明，實(shí)施實(shí)例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域常用技術(shù)方法。

本發(fā)明的一種用于增殖羊口瘡病毒的永久細(xì)胞系，該細(xì)胞系的名稱為山羊睪丸細(xì)胞gt26，已于2017年3月1日保存在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號(hào)：cctccno：c201734，保藏地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)。

本發(fā)明一種用于增殖羊口瘡病毒的永久細(xì)胞系建立方法，具體包括下列步驟：

無(wú)菌條件下，含1％雙抗pbs沖洗睪丸3次，剪去睪丸實(shí)質(zhì)上的附睪及白膜，pbs沖洗睪丸實(shí)質(zhì)，直至眼觀無(wú)血液，將其移至無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)。

pbs沖洗將剪成2mm大小的睪丸實(shí)質(zhì)，加入1倍體積的0.5g/li膠原酶，37℃培養(yǎng)箱靜止2h，輕輕吹打5次，加入3倍體積的ph7.4，0.15％的胰蛋白酶8℃靜置12h后，加入含8％血清和1％雙抗dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)基，在50ml離心管輕輕將細(xì)胞吹散，以1500rpm離心8min，加入完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度到0.5×10⁶/ml，37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2)羊睪丸細(xì)胞永生化的建立：培養(yǎng)的羊睪丸細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶的70％～80％時(shí)，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)馴化的羊睪丸細(xì)胞傳至30代后細(xì)胞生長(zhǎng)呈鋪路石樣。建系過(guò)程中使用培養(yǎng)基添加0.1％dmso和1ug/ml氫化可的松。

在細(xì)胞密度到達(dá)80％～90％時(shí)進(jìn)行傳代，棄去原培養(yǎng)基，用pbs洗滌3次，使用0.15％胰酶消化細(xì)胞至變圓收縮，補(bǔ)新鮮完全培養(yǎng)基拍下混勻細(xì)胞后，置于含37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，即為一次細(xì)胞傳代。

注：一般細(xì)胞生長(zhǎng)3天即可傳代，若間隔3天細(xì)胞密度稍低(＜70％)，可棄去部分舊培養(yǎng)基，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞傳代時(shí)間間隔不應(yīng)大于10天。

3)羊睪丸永生化細(xì)胞的低血清馴化：在細(xì)胞密度到達(dá)90％～95％時(shí)進(jìn)行傳代，先棄去舊培養(yǎng)基，用pbs洗滌2～3次，使用0.15％胰酶消化細(xì)胞至變圓收縮，補(bǔ)加含不同血清濃度培養(yǎng)基血清拍下混勻細(xì)胞，依次使用含血清濃度為8％、6％、4％、3％、2％的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

注：1：每個(gè)血清濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞3代；2：在使用較低血清傳代前先使用低血清的培養(yǎng)基，使細(xì)胞適應(yīng)培養(yǎng)基。

步驟1)中羊睪丸細(xì)胞的培養(yǎng)液為m199、dmem高糖或mem培養(yǎng)基。

步驟3)中在羊睪丸細(xì)胞永久化細(xì)胞低血清培養(yǎng)，利用連續(xù)漸進(jìn)降低培養(yǎng)基中血清濃度獲得的如圖1所示，羊睪丸細(xì)胞系的培養(yǎng)(正常)結(jié)果。

4)羊口瘡病毒的穩(wěn)定增殖

將凍存細(xì)胞復(fù)蘇后，用含2％犢牛血清的mem培養(yǎng)基細(xì)胞，于37℃，5％co2培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80％～90％時(shí)，將5～10％的羊口瘡疫苗株病毒接種于細(xì)胞，于37℃，5％co2培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)72～96h，觀察病變?nèi)鐖D2和圖3所示為羊睪丸細(xì)胞系接種羊口瘡病毒疫苗株72h后的細(xì)胞病變，細(xì)胞出現(xiàn)變圓、破碎；待培養(yǎng)細(xì)胞病變70％左右時(shí)，反復(fù)凍融整個(gè)培養(yǎng)物三次后，7000～10000rpm離心10min，收集上清用于測(cè)定其中病毒滴度。

5)病毒滴度測(cè)定(tcid50檢測(cè))

1、將細(xì)胞消化后加生長(zhǎng)培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為1～2×10⁵個(gè)/ml，接種到96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100ul，待細(xì)胞融合度達(dá)到70％左右可接毒。

2、將病毒用維持培養(yǎng)基連續(xù)10倍稀釋，分別為、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10，將稀釋的病毒按照順序依次接種到96孔板，每個(gè)濃度接種一縱列共8孔，每孔100ul。

設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，正常細(xì)胞對(duì)照作兩縱排；為100ul生長(zhǎng)液+100ul細(xì)胞懸液；37℃，5％co2培養(yǎng)，逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5～7天，其結(jié)果見(jiàn)表1。

表1為羊口瘡病毒接種羊睪丸細(xì)胞系后72h的滴度測(cè)定結(jié)果。

從表1可以看出，本發(fā)明的羊睪丸細(xì)胞系使用效果要比原代睪丸細(xì)胞好。