一種暗色唇魚肝臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用暗色唇魚肝臟組織建立細(xì)胞系的方法，屬于淡水水生生物細(xì) 胞培養(yǎng)的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 暗色唇魚SemilabeoobscurusLin，隸屬于鯉科（Cyprinidae)野鏡亞科 (Labeoninae)唇魚屬（Semilabeo)。由于該魚體肥、肉嫩、味美，成了捕攜的首選目標(biāo)。又 因其具有群居巖洞的生活習(xí)性，便成為不法分子電、毒、炸的最大受害者，隨著魚類資源的 利用強(qiáng)度加大和捕撈技術(shù)的更新，魚類生物多樣性呈下降趨勢(shì)，暗色唇魚已成為李仙江流 域珍稀瀕危物種。且暗色唇魚1989年被列入云南省II級(jí)保護(hù)動(dòng)物，1998年被列入《中國(guó) 瀕危動(dòng)物紅皮書》。為了保護(hù)、開發(fā)利用這一珍稀的土著魚類資源，2007年由云南省環(huán)保局 批準(zhǔn)立項(xiàng)，云南大唐國(guó)際李仙江流域水電開發(fā)有限公司委托中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研宄所開 展了暗色唇魚的人工增殖放流研宄，最終于2010年突破了暗色唇魚的人工繁殖技術(shù)，并于 2012年將暗色唇魚魚苗放流回李仙江流域，完成了這一土著珍稀魚類人工增殖放流的全過 程。
[0003] 暗色唇魚野外生存環(huán)境的不斷惡劣，盡管已實(shí)現(xiàn)了暗色唇魚的人工增殖放流，但 野外種群數(shù)量仍在銳減，因此，除加強(qiáng)野外引種，使更多的野外種群在保育研宄基地得以存 活外，暗色唇魚野外種群的種質(zhì)資源保存已刻不容緩。細(xì)胞培養(yǎng)和凍存是種質(zhì)資源保存中 應(yīng)用最為廣泛的一種技術(shù)，但此技術(shù)在淡水魚類尤其是云南土著珍稀魚類種質(zhì)資源保存的 應(yīng)用很少，暗色唇魚的細(xì)胞研宄亦是一片空白。
[0004] 另外，由于養(yǎng)殖魚類本身的局限性，塘養(yǎng)環(huán)境下人工繁殖易造成染色體異常，如多 倍化和異倍化，需要細(xì)胞短期培養(yǎng)以用于核型分析以檢測(cè)人工繁殖品種的質(zhì)量，保證放流 個(gè)體的成活率和繁殖率。而對(duì)于暗色唇魚這種幼體生長(zhǎng)較慢，個(gè)體較小，血液量較少的魚類 而言，傳統(tǒng)的血液短期培養(yǎng)不能滿足核型分析的需要，因此有必要尋找能快速獲得細(xì)胞的 方法，以滿足暗色唇魚細(xì)胞的短期培養(yǎng)用于核型分析。
[0005] 魚類肝臟組織含有較多的膠原和纖維組織，而因魚類肝臟組織不同魚哺乳動(dòng)物肝 臟，無法使用目前構(gòu)建哺乳動(dòng)物肝臟細(xì)胞系常用的灌注消化法進(jìn)行細(xì)胞系建立?，F(xiàn)有的專 利或發(fā)表文章中的魚類細(xì)胞系的構(gòu)建方法中，酶消化法處理后，肝臟細(xì)胞的獲得量少且不 易貼壁，而采用酶消化法和機(jī)械剪碎法聯(lián)合作用，操作較為復(fù)雜，因此，需要研宄一種快速 有效的暗色唇魚肝臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法，以建立暗色唇魚的肝臟細(xì)胞系。在暗色唇魚細(xì)胞 系建立實(shí)踐中，細(xì)胞系能否建立成功除與建立方法密切相關(guān)外，暗色唇魚的生活狀態(tài)也是 決定其成功與否的關(guān)鍵，這是很多專利或文章中并未提及或忽略的一環(huán)，因此，暗色唇魚肝 臟細(xì)胞系的構(gòu)建是建立在對(duì)野生和塘養(yǎng)暗色唇魚生態(tài)習(xí)性極度熟悉的基礎(chǔ)之上。經(jīng)文獻(xiàn)檢 索，未見與本發(fā)明的相同報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便易行的暗色唇魚肝臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法，以滿 足對(duì)暗色唇魚快速核型分析、種質(zhì)資源保存和理論研宄的需要。
[0007] 本發(fā)明提供了一種暗色唇魚肝臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括如下步驟：
[0008] 1)暗色唇魚肝臟的獲取：先用10-20mg/L亞甲基藍(lán)浸泡暗色唇魚10-30分鐘，對(duì) 魚進(jìn)行整體消毒；整體消毒后，用紗布擦除魚體表粘液；再以75%酒精消毒魚體后，加入 HBSS消毒液浸泡肝臟組織；浸泡15-20分鐘后，將肝臟組織用HBSS消毒液清洗；
[0009] 2)原代培養(yǎng)：將所述肝臟組織剪成約100mm3的組織小塊，并將其接種于細(xì)胞培養(yǎng) 瓶中，在24-30°C培養(yǎng)箱中倒置過夜，次日再加入原代培養(yǎng)液，在24-30°C培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原 代培養(yǎng)，每三天半量更換所述原代培養(yǎng)液，第5-7天細(xì)胞開始從組織塊中迀移，15天長(zhǎng)成細(xì) 胞單層；
[0010] 3)傳代培養(yǎng)：原代肝臟細(xì)胞鋪滿瓶底80%后開始傳代，先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培 養(yǎng)液，以含〇. 2%的胰蛋白酶的胰酶消化法傳代懸起細(xì)胞，首次傳代按1:1傳，此后按1:2進(jìn) 行傳代，于24-30°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每4-5天傳代一次，傳至第6代時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液換成 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，所述暗色唇魚肝臟細(xì)胞系建立成功。
[0011] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述HBSS消毒液為含有濃度為100-300yg/ml的硫酸 卡那霉素和濃度為100-300yg/ml的硫酸鏈霉素的Hanks平衡鹽溶液。優(yōu)選地，硫酸卡那 霉素的濃度為200yg/ml，硫酸鏈霉素的濃度為200yg/ml。
[0012] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含有占總體積的10-15%的胎牛血 清的高糖DMEM培養(yǎng)液。
[0013] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述原代培養(yǎng)液為含有占總體積的20%的胎牛血清、 濃度為150-200yg/ml的硫酸卡那霉素以及濃度為50-150yg/ml的硫酸鏈霉素的高糖 DMEM培養(yǎng)液。優(yōu)選地，硫酸卡那霉素的濃度為150yg/ml，硫酸鏈霉素的濃度為100yg/ml。
[0014] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述傳代培養(yǎng)液為含有占總體積的20 %的胎牛血清、 濃度為50-150yg/ml的硫酸卡那霉素以及濃度為30-60yg/ml的硫酸鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)液。優(yōu)選地，硫酸卡那霉素的濃度為100ug/ml，硫酸鏈霉素的濃度為50yg/ml。
[0015] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述消毒液或者培養(yǎng)液的pH值為7. 0-7. 4。
[0016] 本發(fā)明又提供了一種暗色唇魚肝臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法還可以包括如 下細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的步驟：
[0017] 1)配制細(xì)胞凍存保護(hù)液：凍存液包括胎牛血清和DMSO,按13:1的體積比混合，現(xiàn) 用現(xiàn)配；
[0018] 2)細(xì)胞凍存：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細(xì)胞懸液1000-1200rpm 離心7-10分鐘，棄掉上清液；向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度 約為IX106個(gè)/ml，將lml細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8ml凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒 中，-80°C過夜，然后放入液氮中長(zhǎng)期保存；
[0019] 3)細(xì)胞復(fù)蘇：將上述凍存管從液氮中取出，放入37°C水浴鍋中快速搖晃至融化； 然后在無菌操作臺(tái)中，將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，并加入等量高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng) 液，800-1000rpm離心6-8分鐘，除上清液；用所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng) 瓶中，24-30 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5-7天細(xì)胞即長(zhǎng)成單層。
[0020] 本發(fā)明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。
[0021] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0022] 1.本發(fā)明的構(gòu)建方法操作簡(jiǎn)便易行，并且構(gòu)建方法重復(fù)性，構(gòu)建的細(xì)胞系穩(wěn)定性 好。
[0023] 2.相對(duì)于用于核型分析的血液短期培養(yǎng)，采用本發(fā)明的構(gòu)建方法獲得的肝臟組織 塊中剛迀移出來的細(xì)胞具有活性，且細(xì)胞量大，可用于染色體分析。
[0024] 3.本發(fā)明的構(gòu)建方法所獲得的肝臟細(xì)胞系原代培養(yǎng)耗時(shí)短，且不需要生長(zhǎng)因子。
[0025] 4.本發(fā)明構(gòu)建的暗色唇魚肝臟細(xì)胞系形態(tài)為不規(guī)則多角形，能夠連續(xù)傳代，迄今 已傳代50代，因此能夠提供大量的暗色唇魚肝臟細(xì)胞。此外，本發(fā)明構(gòu)建的暗色唇魚肝臟 細(xì)胞能夠直接應(yīng)用于生物學(xué)特性研宄，滿足了對(duì)暗色唇魚種質(zhì)資源保存和理論研宄及應(yīng)用 的需要。
[0026] 5.本發(fā)明的構(gòu)建方法也適用于其他魚類構(gòu)建肝臟的細(xì)胞系。
【附圖說明】
[0027] 圖1是示出不同培養(yǎng)基液對(duì)暗色唇魚肝臟細(xì)胞生長(zhǎng)的影響的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 從下文的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述方面和本發(fā)明的其他方面將是明顯的。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 1.制備HBSS消毒液和細(xì)胞培養(yǎng)液
[0031] HBSS消毒液：向Hanks平衡鹽溶液中加入抗生素，使硫酸卡那霉素的濃度為 100yg/ml，硫酸鏈霉素濃度為100yg/ml。
[0032] 基礎(chǔ)培養(yǎng)液：向高糖DMEM培養(yǎng)液中加入胎牛血清，使胎牛血清占總體積的10%。
[0033] 原代培養(yǎng)液：向高糖DMEM培養(yǎng)液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占總體積 的20%，硫酸卡那霉素的濃度為150yg/ml，硫酸鏈霉素濃度為50yg/ml。
[0034] 傳代培養(yǎng)液：向高糖DMEM培養(yǎng)液中加入胎牛血清和抗生素，使胎牛血清占總體積 的20%，硫酸卡那霉素的濃度為50yg/ml，硫酸鏈霉素濃度為30yg/ml。
[0035] 調(diào)節(jié)上述培養(yǎng)液的pH值為7. 0,放置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0036] 2?原代培養(yǎng)
[0037] 先用10mg/L亞甲基藍(lán)浸泡鮮活暗色唇魚30分鐘，對(duì)魚進(jìn)行整體消毒；整體消毒 后，用紗布擦除體表粘液；再次以75%酒精消毒魚體后，置于超凈工作臺(tái)中，用無菌解剖器 械取其肝臟，置于12孔板中，加入HBSS消毒液浸泡肝臟組織。浸泡20分鐘后，將肝臟組織 用HBSS消毒液清洗5次，剪成約100mm3的組織小塊，并將其接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在 24°C培養(yǎng)箱中倒置過夜，次日再加入原代培養(yǎng)液3ml，在24°C培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)，每三 天半量更換培養(yǎng)液，第7天細(xì)胞開始從組織塊中迀移，20天長(zhǎng)成細(xì)胞單層。
[0038] 3?傳代培養(yǎng)
[0039] 原代肝臟細(xì)胞鋪滿瓶底80%后開始傳代。傳代培養(yǎng)具體方法如下，先吸出培養(yǎng)瓶 中的原代培養(yǎng)液，加入〇. 2 %的胰蛋白酶和0. 1 %的EDTA溶液lml，消化2分鐘，細(xì)胞變圓 后，加入傳代培養(yǎng)液1. 5ml以中和胰酶反應(yīng)，輕輕吹打瓶底，使貼壁細(xì)胞脫落，首次傳代按 1:1傳，此后按1:2進(jìn)行傳代，于24°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每5天傳代一次，傳至第6代時(shí)， 細(xì)胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，此時(shí)，細(xì)胞系建立成功。目前，細(xì)胞傳代已傳至50代。
[0040] 4.細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
[0041] (a)配制細(xì)胞凍存保護(hù)液：凍存液包括胎牛血清和DMSO,按13:1的體積比混合， 現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0042] (b)細(xì)胞凍存：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細(xì)胞懸液lOOOrpm離 心10分鐘，棄掉上清液。向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度約為 1X106個(gè)/ml，將lml細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1. 8ml凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，-80°C 過夜，然后放入液氮中長(zhǎng)期保存。
[0043] (c)細(xì)胞復(fù)蘇：將上述凍存管從液氮中取出，放入37°C水浴鍋中快速搖晃至融化。 然后在無菌操作臺(tái)中，將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，并加入等量高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng) 液，800rpm離心8分鐘，除上清液。用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，24°C培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7天細(xì)胞即長(zhǎng)成單層。