本發(fā)明屬于環(huán)境與新能源技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高拜氏梭菌產(chǎn)電的方法。

背景技術(shù)：

微生物燃料電池(microbialfuelcell，mfc)是一種以產(chǎn)電微生物為陽極催化劑將有機物中的化學(xué)能直接轉(zhuǎn)化為電能的裝置，微生物能夠?qū)㈦娮又苯愚D(zhuǎn)移給化合物或者間接電子受體，進而在mfc中起作用(bioresourcetechnol.,2009,101(6):1533–1543)。目前，微生物燃料電池(microbialfuelcell，mfc)技術(shù)日益成熟，并得到重視。微生物燃料電池在替代能源、生物傳感器和廢水處理等方面具有潛在的應(yīng)用價值(microbecol.,2004,48(2):178-190)。

目前，已發(fā)現(xiàn)很多產(chǎn)電微生物如希瓦氏菌、地桿菌、克雷伯氏桿菌等，產(chǎn)電微生物大多是厭氧微生物，并且大都為革蘭氏陰性細菌，利用革蘭氏陽性細菌產(chǎn)電的報道不多。liujun等人也研究了拜氏梭菌的mfc產(chǎn)電情況，拜氏梭菌突變株利用甲基紫精作為電子介體，葡萄糖作為碳源時獲得最大電壓230mv，最大輸出功率密度79.2mw/m²。(biotechnologylett.,2015,37:95-100)。科研工作者初步揭示了微生物產(chǎn)電的機制，但具體機理仍不清晰，mfc中微生物產(chǎn)電能力較弱，成為mfc產(chǎn)電技術(shù)發(fā)展的瓶頸問題之一?；谖⑸锂a(chǎn)電機理的研究，通過分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)改造微生物，進而提高微生物的產(chǎn)電效率；將有力促進mfc的應(yīng)用與推廣。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一株產(chǎn)電拜氏梭菌。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述產(chǎn)電拜氏梭菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述產(chǎn)電拜氏梭菌在微生物燃料電池中的應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一株產(chǎn)電拜氏梭菌，它是在拜氏梭菌中失活cbei_2996基因，使該基因在拜氏梭菌中不能正常表達。所述cbei_2996基因是依賴于nadh的輔酶q氧化還原酶亞基a，失活的方法選自堿基突變失活、堿基插入失活、堿基缺失失活

其中，所述cbei_2996基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。

其中，所述拜氏梭菌為拜氏梭菌ncimb8052。

其中，所述在拜氏梭菌中失活cbei_2996基因，是在cbei_2996基因中第62bp和63bp之間插入內(nèi)含子序列。

其中，所述內(nèi)含子序列如seqidno：2所示。

上述產(chǎn)電拜氏梭菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)將內(nèi)含子序列構(gòu)建到二型內(nèi)含子基因敲除質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒；

(2)將步驟(1)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化拜氏梭菌，篩選得到cbei_2996基因失活的菌株，既得到產(chǎn)電拜氏梭菌。

其中，所述二型內(nèi)含子基因敲除質(zhì)粒為pwj質(zhì)粒。

其中，所述內(nèi)含子序列如seqidno：2所示，內(nèi)含子的插入位點為cbei_2996基因中第62bp和63bp之間。

上述產(chǎn)電拜氏梭菌的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的產(chǎn)電拜氏梭菌在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

上述產(chǎn)電拜氏梭菌在微生物燃料電池中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

有益效果：

(1)本發(fā)明將拜氏梭菌中編碼依賴于nadh的輔酶q氧化還原酶亞基a基因cbei_2996進行插入失活后，使得此基因不能正常表達，獲得cbei_2996基因插入失活的重組菌株。

(2)本發(fā)明提供了一種簡單、高效的提高拜氏梭菌產(chǎn)電的方法，借助此方法得到的重組菌株2996在1g/l葡萄糖種子液中，0.1g/l甲基紫精(mv)為電子介體時，最大輸出電壓高達194mv；同等條件下，出發(fā)菌株8052的最大輸出電壓只有85mv；重組菌株2996的最大輸出電壓是出發(fā)菌株的2.3倍。

附圖說明

圖1為質(zhì)粒pwj的質(zhì)粒圖譜；

圖2為本發(fā)明使用二型內(nèi)含子插入失活的機理圖；

圖3為轉(zhuǎn)化子菌落pcr電泳圖，泳道1為marker，泳道2為插入失活突變株，泳道3為野生型菌株cbei_2996基因；

圖4為本發(fā)明拜氏梭菌2996與初始菌株ncimb8052利用1g/l葡萄糖為燃料的產(chǎn)電電壓情況。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

實施例1：拜氏梭菌cbei_2996基因失活突變株的構(gòu)建方法

(1)設(shè)計內(nèi)含子：

根據(jù)ncbi數(shù)據(jù)庫收錄的拜氏梭菌的cbei_2996基因序列(如seqidno：1所示)，即編碼輔酶q氧化還原酶亞基a的堿基序列(nuoa)，借助軟件設(shè)計合適的插入基因位點(http://www.clostron.com)，通過前期的實驗篩選和驗證，選擇插入在cbei_2996基因序列第62和63個堿基之間，并生成內(nèi)含子序列，合成的內(nèi)含子為s-62，其序列如seqidno：2所示。

(2)cbei_2996插入失活載體的構(gòu)建：

用xhoⅰ和bsrgⅰ分別雙酶切載體pwj(上海生科院楊晟老師提供，其序列如seqidno：5所示，pwj的質(zhì)粒圖譜如圖1所示)和dna片段s-62。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒(takara)純化后，通過t4連接酶(takara)過夜連接。將連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌e.colidh5a(本實驗室)，涂布到含有50ug/ml氨芐霉素抗性lb平板，37℃培養(yǎng)12-16h，挑取轉(zhuǎn)化子，接到液體含有50ug/ml氨芐霉素lb培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)12h，提取重組質(zhì)粒(axygen質(zhì)粒提取試劑盒)，測序驗證，獲得cbei_2996基因的二型內(nèi)含子基因敲除載體pwj-62。

(3)載體pwj-62甲基化：

制備含有pan2質(zhì)粒的e.colitop10(本實驗室)的化學(xué)感受態(tài)，將測序成功的cbei_2996插入失活載體pwj-62轉(zhuǎn)化到大腸桿菌e.colitop10，由于pan2質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性，故涂布到含有50μg/ml氨芐霉素和10μg/ml四環(huán)素雙抗性lb平板，37℃培養(yǎng)12-16h，挑取轉(zhuǎn)化子，接到液體含有50ug/ml氨芐霉素和10ug/ml四環(huán)素lb培養(yǎng)基中，37℃、200r培養(yǎng)12h，提取甲基化的載體pwj-62(pan2質(zhì)粒含有一個枯草芽孢桿菌噬菌體基因，能編碼甲基轉(zhuǎn)移酶，能實現(xiàn)外源質(zhì)粒在大腸桿菌中的甲基化)。

(4)電轉(zhuǎn)化甲基化的敲除質(zhì)粒至拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckiincimb8052)：

1)將clostridiumbeijerinckiincimb8052(本實驗室常期存有的常用菌株)接種至yps種子培養(yǎng)基(酵母粉3g/l，蛋白胨5g/l，可溶性淀粉10g/l，乙酸銨2g/l，nacl3g/l，mgso4·7h2o3g/l，kh2po41g/l，k2hpo41g/l，feso4·7h2o0.1g/l)37℃過夜培養(yǎng)，次日以5％比例接種到y(tǒng)ps培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6-8h，以10％接種到2×ytg培養(yǎng)基(酵母粉16g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖5g/l，氯化鈉5g/l)37℃培養(yǎng)3h，od600＝1。

2)取50ml菌液，5000rpm，4℃離心10min，棄上清。再用etm緩沖液(270mm蔗糖，0.6mmna2hpo4，4.4mmna2hpo4，10mmmgcl2·7h2o)重懸；同上離心，去上清，再次以etm緩沖液重懸，同上離心，徹底取上清。

3)取1μg甲基化的pwj-62質(zhì)粒加入到0.2cm預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯；再用1mlet緩沖液(270mm蔗糖，0.6mmna2hpo4，4.4mmna2hpo4)重懸步驟2)菌泥，取200μl加入到電轉(zhuǎn)杯，輕輕混勻。

4)使用micropulsertm電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)，條件為電壓1.8kv，電阻200ω，電容2.5μf，電擊后立刻加入1ml2×ytg培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到無菌離心管中復(fù)蘇2-3h。

5)取200ul上述菌液，涂布到含有10μg/ml紅霉素的yps固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)2-3天。

(5)篩選cbei_2996插入失活突變株：

挑取轉(zhuǎn)化子，使用引物cbei-2996-t-s(其序列如seqidno：3所示)和cbei-2996-t-a(其序列如seqidno：4所示)，對轉(zhuǎn)化子進行菌落pcr驗證，篩選出內(nèi)含子插入基因組的突變株(插入后，pcr擴增出基因條帶電泳圖上比野生型大約1kbp，如圖3所示)。將正確插入的突變株傳代三次，同時涂布在含有紅霉素抗性和沒有紅霉素抗性的yps固體培養(yǎng)基上，篩選出敲除質(zhì)粒丟失的突變株(在紅霉素抗性平板上不能生長的突變株)，本發(fā)明使用二型內(nèi)含子插入失活的機理圖如圖2所示。

實施例2：

本實施例說明拜氏梭菌作為陽極催化劑利用1g/l葡糖糖的產(chǎn)電實驗。

(1)構(gòu)建微生物燃料電：

本實施例按照現(xiàn)有的技術(shù)和方法建立了利用拜氏梭菌為陽極催化劑發(fā)電的微生物燃料電池，如附圖2所示，包括陽極室、陰極室、質(zhì)子交換膜和外電路四個部分。陽極電極和陰極電極均為pan基石墨軟氈(5×5cm)，以鈦絲作為外接電路，外接電阻為1000ω，質(zhì)子交換膜為杜邦nafionn117，采用數(shù)據(jù)采集器為keithley系列。

(2)培養(yǎng)基配方：

yps種子培養(yǎng)基：酵母粉3g/l，蛋白胨5g/l，葡萄糖1g/l，乙酸銨2g/l，氯化鈉3g/l，七水合硫酸鎂3g/l，磷酸二氫鉀1g/l，磷酸氫二鉀1g/l，七水合硫酸亞鐵0.1g/l，ph＝6。

雙室mfc中陽極液：酵母粉3g/l，蛋白胨5g/l，葡萄糖1g/l，乙酸銨2g/l，氯化鈉3g/l，七水合硫酸鎂3g/l，磷酸二氫鉀1g/l，磷酸氫二鉀1g/l，七水合硫酸亞鐵0.1g/l，甲基紫精(3304-mfc中mv濃度為0.4g/l，8052-mfc中mv濃度為0.1g/l)，ph＝6。

雙室mfc中陰極液：二水合磷酸二氫鈉2.772g/l，十二水合磷酸氫二鈉11.5g/l，氯化鉀0.13g//l，鐵氰化鉀40mm，ph＝7。

(3)在yps種子液中活化高產(chǎn)電重組菌株3304和初始菌株8052，培養(yǎng)溫度37℃，厭氧培養(yǎng)時間12h。然后進行250ml雙室mfc技術(shù)，向陽極室中接入陽極液225ml，甲基紫精(mv)，通入n23分鐘，再接入25ml的拜氏梭菌(接種量10％(v/v))，通入n23分鐘，排出溶液中的氧，迅速密封陽極室，向陰極室加入陰極液，迅速密封陰極室，培養(yǎng)溫度30℃，產(chǎn)電檢測時間33h，最終結(jié)果如圖4所示。

本發(fā)明重組菌株3304最大輸出電壓高達409mv，比初始菌株8052提高了3.13倍，最大輸出功率密度為144.4mw/m²，比初始菌株8052提高了1.71倍。

sequencelisting

<110>南京中泰生物科技有限公司

<120>一株產(chǎn)電拜氏梭菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

<130>sg20170725001

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>357

<212>dna

<213>cbei_2996基因核苷酸序列

<400>1

atgatacaagattatttgattattggaatttttcttatagcttcatttatttttggaatg60

gtcgtcttattaacggcttcattagtaagaccgaagaagccaaataaagaaaaattatct120

acttatgagtgtggtgttgaaactactggttcaacgtggattagatttaaggtcagttac180

tttatgtacggcttagtatttctactctttgatgttgaaacagtatttttattgccatgg240

gcagtgaaatttaaatcattaggattattcgcactttttgaaatggttatttttataggt300

attttaatcattgggttatggtatgcgtggaaagagggggcattagagtggaagtaa357

<210>2

<211>344

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>內(nèi)含子s-62核苷酸序列

<400>2

ctcgagataattatccttagttaacaagacggtgcgcccagatagggtgttaagtcaagt60

agtttaaggtactactctgtaagataacacagaaaacagccaacctaaccgaaaagcgaa120

agctgatacgggaacagagcacggttggaaagcgatgagttacctaaagacaatcgggta180

cgactgagtcgcaatgttaatcagatataaggtataagttgtgtttactgaacgcaagtt240

tctaatttcgattttaactcgatagaggaaagtgtctgaaacctctagtacaaagaaagg300

taagttagtcgtcttgacttatctgttatcaccacatttgtaca344

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>cbei-2996-t-s

<400>3

atgatacaagattatttgat20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>cbei-2996-t-a

<400>4

ttacttccactctaatgccc20

<210>5

<211>8601

<212>dna

<213>pwj質(zhì)粒核苷酸序列

<400>5

tacagaggaagaacagaaaaaagaacgtacatgcattaaatattatgcaaggagctttaa60

aaaagctcatgtaaagaagagtaaaaagaaaaaataatttatttattaatttaatattga120

gagtgccgacacagtatgcactaaaaaatatatctgtggtgtagtgagccgatacaaaag180

gatagtcactcgcattttcataatacatcttatgttatgattatgtgtcggtgggacttc240

acgacgaaaacccacaataaaaaaagagttcggggtagggttaagcatagttgaggcaac300

taaacaatcaagctaggatatgcagtagcagaccgtaaggtcgttgtttaggtgtgttgt360

aatacatacgctattaagatgtaaaaatacggataccaatgaagggaaaagtataatttt420

tggatgtagtttgtttgttcatctatgggcaaactacgtccaaagccgtttccaaatctg480

ctaaaaagtatatcctttctaaaatcaaagtcaagtatgaaatcataaataaagtttaat540

tttgaagttattatgatattatgtttttctattaaaataaattaagtatatagaatagtt600

taataatagtatatacttaatgtgctgcagtataaaatataaataattttctaaaaaact660

taacttcatgtgaaaagtttgttaaaatataaatgagcacgttaatcatttaacatagat720

aattaaatagtaaaagggagtgtcgaggatcctcgagataattatccttaaaggacgtag780

atgtgcgcccagatagggtgttaagtcaagtagtttaaggtactactctgtaagataaca840

cagaaaacagccaacctaaccgaaaagcgaaagctgatacgggaacagagcacggttgga900

aagcgatgagttacctaaagacaatcgggtacgactgagtcgcaatgttaatcagatata960

aggtataagttgtgtttactgaacgcaagtttctaatttcggtttccttccgatagagga1020

aagtgtctgaaacctctagtacaaagaaaggtaagttaacatctacgacttatctgttat1080

caccacatttgtacaatctgtaggagaacctatgggaacgaaacgaaagcgatgccgaga1140

atctgaatttaccaagacttaacactaactggggataccctaaacaagaatgcctaatag1200

aaaggaggaaaaaggctatagcactagagcttgaaaatcttgcaagggtacggagtactc1260

gtagtagtctgagaagggtaacgccctttacatggcaaaggggtacagttattgtgtact1320

aaaattaaaaattgattagggaggaaaacctcaaaatgaaaccaacaatggcaattttag1380

aaagaatcagtaaaaattcacaagaaaatatagacgaagtttttacaagactttatcgtt1440

atcttttacgtccagatatttattacgtggcgacgcgttgggaaatggcaatgatagcga1500

aacaacgtaaaactcttgttgtatgctttcattgtcatcgtcacgtgattcataaacaca1560

agtgaatgtcgacagtgaatttttacgaacgaacaataacagagccgtatactccgagag1620

gggtacgtacggttcccgaagagggtggtgcaaaccagtcacagtaatgtgaacaaggcg1680

gtacctccctacttcaccatatcattttctgcagccccctagaaataattttgtttaact1740

ttaagaaggagatatacatatatggctagatcgtccattccgacagcatcgccagtcact1800

atggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatgcaatttctatgcactcgtagtagtctga1860

gaagggtaacgccctttacatggcaaaggggtacagttattgtgtactaaaattaaaaat1920

tgattagggaggaaaacctcaaaatgaaaccaacaatggcaattttagaaagaatcagta1980

aaaattcacaagaaaatatagacgaagtttttacaagactttatcgttatcttttacgtc2040

cagatatttattacgtggcgtatcaaaatttatattccaataaaggagcttccacaaaag2100

gaatattagatgatacagcggatggctttagtgaagaaaaaataaaaaagattattcaat2160

ctttaaaagacggaacttactatcctcaacctgtacgaagaatgtatattgcaaaaaaga2220

attctaaaaagatgagacctttaggaattccaactttcacagataaattgatccaagaag2280

ctgtgagaataattcttgaatctatctatgaaccggtattcgaagatgtgtctcacggtt2340

ttagacctcaacgaagctgtcacacagctttgaaaacaatcaaaagagagtttggcggcg2400

caagatggtttgtggagggagatataaaaggctgcttcgataatatagaccacgttacac2460

tcattggactcatcaatcttaaaatcaaagatatgaaaatgagccaattgatttataaat2520

ttctaaaagcaggttatctggaaaactggcagtatcacaaaacttacagcggaacacctc2580

aaggtggaattctatctcctcttttggccaacatctatcttcatgaattggataagtttg2640

ttttacaactcaaaatgaagtttgaccgagaaagtccagaaagaataacacctgaatatc2700

gggagctccacaatgagataaaaagaatttctcaccgtctcaagaagttggagggtgaag2760

aaaaagctaaagttcttttagaatatcaagaaaaacgtaaaagattacccacactcccct2820

gtacctcacagacaaataaagtattgaaatacgtccggtatgcggacgacttcattatct2880

ctgttaaaggaagcaaagaggactgtcaatggataaaagaacaattaaaactttttattc2940

ataacaagctaaaaatggaattgagtgaagaaaaaacactcatcacacatagcagtcaac3000

ccgctcgttttctgggatatgatatacgagtaaggagatctggaacgataaaacgatctg3060

gtaaagtcaaaaagagaacactcaatgggagtgtagaactccttattcctcttcaagaca3120

aaattcgtcaatttatttttgacaagaaaatagctatccaaaagaaagatagctcatggt3180

ttccagttcacaggaaatatcttattcgttcaacagacttagaaatcatcacaatttata3240

attctgaactccgcgggatttgtaattactacggtctagcaagtaattttaaccagctca3300

attattttgcttatcttatggaatacagctgtctaaaaacgatagcctccaaacataagg3360

gaacactttcaaaaaccatttccatgtttaaagatggaagtggttcgtgggggatcccgt3420

atgagataaagcaaggtaagcagcgccgttattttgcaaattttagtgaatgtaaatccc3480

cttatcaatttacggatgagataagtcaagctcctgtattgtatggctatgcccggaata3540

ctcttgaaaacaggttaaaagctaaatgttgtgaattatgtgggacgtctgatgaaaata3600

cttcctatgaaattcaccatgtcaataaggtcaaaaatcttaaaggcaaagaaaaatggg3660

aaatggcaatgatagcgaaacaacgtaaaactcttgttgtatgctttcattgtcatcgtc3720

acgtgattcataaacacaagtgaatgtcgagcacccgttctcggagcactgtccgaccgc3780

tttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgcgatc3840

atggcgaccacacccgtcctgtggatcgccaagccgccgatggtagtgtggggtctcccc3900

atgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgg3960

gcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccg4020

ggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggagggtggcgggcaggacgcccgcca4080

taaactgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgttt4140

ctacaaactcttcctgtcgtcatatctacaagcatatggtgcactctcagtacaatctgc4200

tctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctga4260

cgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgc4320

atgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgata4380

cgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcact4440

tttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatg4500

tatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagt4560

atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcct4620

gtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgca4680

cgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgcccc4740

gaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcc4800

cgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttg4860

gttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaatta4920

tgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatc4980

ggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgcctt5040

gatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatg5100

cctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagct5160

tcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgc5220

tcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtct5280

cgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctac5340

acgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcc5400

tcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgat5460

ttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatg5520

accaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatc5580

aaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaa5640

ccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaag5700

gtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagtta5760

ggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgtta5820

ccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatag5880

ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttg5940

gagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacg6000

cttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagag6060

cgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgc6120

cacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaa6180

aacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatg6240

ttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagct6300

gataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaa6360

gagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctgg6420

cacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttag6480

ctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtgga6540

attgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctt6600

tggctaacacacacgccattccaaccaatagttttctcggcataaagccatgctctgacg6660

cttaaatgcactaatgccttaaaaaaacattaaagtctaacacactagacttatttactt6720

cgtaattaagtcgttaaaccgtgtgctctacgaccaaaagtataaaacctttaagaactt6780

tcttttttcttgtaaaaaaagaaactagataaatctctcatatcttttattcaataatcg6840

catcagattgcagtataaatttaacgatcactcatcatgttcatatttatcagagctcgt6900

gctataattatactaattttataaggaggaaaaaataaagagggttataatgaacgagaa6960

aaatataaaacacagtcaaaactttattacttcaaaacataatatagataaaataatgac7020

aaatataagattaaatgaacatgataatatctttgaaatcggctcaggaaaagggcattt7080

tacccttgaattagtacagaggtgtaatttcgtaactgccattgaaatagaccataaatt7140

atgcaaaactacagaaaataaacttgttgatcacgataatttccaagttttaaacaagga7200

tatattgcagtttaaatttcctaaaaaccaatcctataaaatatttggtaatatacctta7260

taacataagtacggatataatacgcaaaattgtttttgatagtatagctgatgagattta7320

tttaatcgtggaatacgggtttgctaaaagattattaaatacaaaacgctcattggcatt7380

atttttaatggcagaagttgatatttctatattaagtatggttccaagagaatattttca7440

tcctaaacctaaagtgaatagctcacttatcagattaaatagaaaaaaatcaagaatatc7500

acacaaagataaacagaagtataattatttcgttatgaaatgggttaacaaagaatacaa7560

gaaaatatttacaaaaaatcaatttaacaattccttaaaacatgcaggaattgacgattt7620

aaacaatattagctttgaacaattcttatctcttttcaatagctataaattatttaataa7680

gtaagttaagggatgcataaactgcatcccttaacttgtttttcgtgtacctattttttg7740

tgaatcgataatttacagaaaagaaaattatagaatttagtatgattaattatactcatt7800

tatgaatgtttaattgaatacaaaaaaaaatacttgttatgtattcaattacgggttaaa7860

atatagacaagttgaaaaatttaataaaaaaataagtcctcagctcttatatattaagct7920

accaacttagtatataagccaaaacttaaatgtgctaccaacacatcaagccgttagaga7980

actctatctatagcaatatttcaaatgtaccgacatacaagagaaacattaactatatat8040

attcaatttatgagattatcttaacagatataaatgtaaattgcaataagtaagatttag8100

aagtttatagcctttgtgtattggaagcagtacgcaaaggcttttttatttgataaaaat8160

tagaagtatatttattttttcataattaatttatgaaaatgaaagggggtgagcaaagtg8220

acagaggaaagcagtatcttatcaaataacaaggtattagcaatatcattattgacttta8280

gcagtaaacattatgacttttatagtgcttgtagctaagtagtacgaaagggggagcttt8340

aaaaagctccttggaatacatagaattcataaattaatttatgaaaagaagggcgtatat8400

gaaaacttgtaaaaattgcaaagagtttattaaagatactgaaatatgcaaaatacattc8460

gttgatgattcatgataaaacagtagcaacctattgcagtaaatacaatgagtcaagatg8520

tttacataaagggaaagtccaatgtattaattgttcaaagatgaaccgatatggatggtg8580

tgccataaaaatgagatgttt8601