基于鏈侵入的dna擴(kuò)增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及通過(guò)基于鏈侵入的DNA擴(kuò)增檢測(cè)產(chǎn)毒艱難梭菌（Clostridium difficile,C.difficile)的方法。本發(fā)明還涉及適用于該方法的寡核苷酸、組合物和試劑 盒，以及它們用于檢測(cè)產(chǎn)毒艱難梭菌的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 梭菌屬是革蘭氏陽(yáng)性、形成孢子的厭氧菌。致病的梭菌屬菌種產(chǎn)生蛋白毒素，其中 大的梭菌細(xì)胞毒素（LCT)的組由具有高體內(nèi)毒性以及高結(jié)構(gòu)和序列同源性的非常大的毒 素組成（vonEichel-Streiberetal, 1996)。艱難梭菌毒素A和毒素B是艱難梭菌致病性 的主要原因。長(zhǎng)期以來(lái)，毒素A被認(rèn)為是主要的毒力因子，但是越來(lái)越多的證據(jù)表明，事實(shí) 上毒素B在艱難梭菌感染中發(fā)揮主要作用（Lyrasetal, 2009;Carteretal·，2012)。
[0003] 艱難梭菌毒素A和B分別由基因tcdA和tcdB編碼，所述基因位于~19. 6kb的致 病性基因座（PaLoc)中。所述PaLoc還包含兩個(gè)調(diào)控基因，即tcdC和tcdR，它們分別充當(dāng) 毒素表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子和正調(diào)控因子。也包括在PaLoc中的tcdE編碼毒素A和B分泌必 需的穿孔素（holin)樣蛋白。在非產(chǎn)毒的菌株中，所述PaLoc被115bp的序列替換（Braun etal, 1996)。DNA擴(kuò)增已被用于檢測(cè)產(chǎn)毒艱難梭菌菌株（Wrenetal, 1990;McMillinet al, 1991；McMillinetal, 1992)〇
[0004] 一種依賴于上游引物、下游引物和鏈侵入系統(tǒng)的等溫DNA擴(kuò)增方法記載于TO 2009/150467 中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及檢測(cè)產(chǎn)毒艱難梭菌的靶核酸序列，以使得能夠確定樣品中產(chǎn)毒艱難梭 菌的存在。本發(fā)明的方法使用上游引物、下游引物和鏈侵入寡核苷酸，每一種均包含與所述 靶核酸序列互補(bǔ)的區(qū)域。組合起來(lái)，所述引物和鏈侵入寡核苷酸確保實(shí)現(xiàn)對(duì)所述靶核酸序 列的擴(kuò)增。所述鏈侵入寡核苷酸使至少一部分所述靶核酸序列成為單鏈，以允許結(jié)合所述 上游引物和下游引物，從而允許DNA擴(kuò)增。通常，在等溫條件下進(jìn)行所述擴(kuò)增，而不需要進(jìn) 行雙鏈DNA的熱變性。
[0006] 如果檢測(cè)到所述靶核酸序列的擴(kuò)增，這指示所述樣品中存在靶病原體艱難梭菌的 產(chǎn)毒菌株，不存在艱難梭菌的非產(chǎn)毒、非致病菌株或其他梭菌屬（Clostridium)菌種。本發(fā) 明人已證明，本發(fā)明的方法使得能夠高度特異性和靈敏性地檢測(cè)產(chǎn)毒艱難梭菌的不同靶核 酸序列。
[0007] 本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品中的產(chǎn)毒艱難梭菌的靶核酸序列的方法，所述方法包 括在促進(jìn)所述靶核酸序列擴(kuò)增的條件下使所述樣品與至少一種上游引物、至少一種下游引 物和至少一種鏈侵入寡核苷酸接觸，其中每種所述引物和所述寡核苷酸包含與所述靶核酸 序列互補(bǔ)的區(qū)域；并且其中所述鏈侵入寡核苷酸使得至少一部分所述靶核酸序列成為單 鏈，以允許結(jié)合所述上游引物和下游引物。
[0008] 本發(fā)明還提供了組合物和試劑盒，每一種均包括至少兩種選自（a)上游引物、（b) 下游引物和（c)鏈侵入寡核苷酸的寡核苷酸，其中：
[0009] -(I)所述上游引物是長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDN0:2或 其變體的序列；所述下游引物是長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDN0:3或 其變體的序列；所述鏈侵入寡核苷酸是長(zhǎng)度大于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQID N0:4或其變體的序列，并且在其3'區(qū)域還包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸；或
[0010] -(II)所述上游引物是長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDN0:7或 其變體的序列；所述下游引物是長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDN0:8或 其變體的序列；所述鏈侵入寡核苷酸是長(zhǎng)度大于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQID NO:9或其變體的序列，并且在其3'區(qū)域還包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸。
[0011] 本發(fā)明還提供了每一種均如以上（I)中所定義的或每一種均如以上（II)中所定 義的上游引物、下游引物和鏈侵入寡核苷酸在用于檢測(cè)艱難梭菌的方法中的用途。
[0012] 本發(fā)明額外地提供了用于診斷受試者中的艱難梭菌感染的方法，其包括在來(lái)自所 述受試者的樣品中實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)毒艱難梭菌的靶核酸序列的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1示出了 ： (A)tcdB測(cè)定擴(kuò)增曲線。使用SybrGreenI進(jìn)行檢測(cè)，并使用實(shí)時(shí)PCR 儀器測(cè)量熒光。X軸：時(shí)間（分鐘），Y軸：SybrGreenI熒光（熒光強(qiáng)度，任意單位）。上方曲 線：在tcdBSIBA測(cè)定中用作模板的10000個(gè)基因組拷貝（cp)的艱難梭菌BAA-1382 (630) gDNA。下方曲線=無(wú)模板對(duì)照（NTC)未擴(kuò)增。（B)tcdB反應(yīng)的熔解曲線分析。X軸：溫度 (攝氏度），Y軸：(_d(熒光）/d(溫度），任意單位）。使用SybrGreenI的擴(kuò)增后熔解曲 線分析表明在使用艱難梭菌BAA-1382 (630)gDNA作為模板的tcdB反應(yīng)中單個(gè)特異性擴(kuò)增 子的擴(kuò)增。無(wú)模板對(duì)照（NTC)顯示沒(méi)有擴(kuò)增。（C)來(lái)自陽(yáng)性和陰性tcdB反應(yīng)的電泳圖。X 軸：迀移指數(shù)（％，下位內(nèi)標(biāo)（lowermarker)為0%，上位內(nèi)標(biāo)（uppermarker)為100% )， Y軸（熒光強(qiáng)度，任意單位）。下方曲線：在tcdB測(cè)定中用作模板的lOOOOcp的艱難梭菌 BAA-1382 (630)gDNA。上方曲線=無(wú)模板對(duì)照（NTC)。使用MultiNA微芯片電泳系統(tǒng)分析 tcdB反應(yīng)。從NTC反應(yīng)中僅檢測(cè)到反應(yīng)寡核苷酸（反向和正向引物，以及侵入寡核苷酸）， 而從其中使用lOOOOcp的艱難梭菌gDNA作為模板的tcdB反應(yīng)中檢測(cè)到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0014] 圖2示出了 ：tcdB測(cè)定的特異性。X軸：時(shí)間（分鐘），Y軸：SybrGreenI熒光 (熒光強(qiáng)度，毫伏，mV)。將lOOOOcp的艱難梭菌BAA-1382 (630)和lOOOOcp的污泥梭菌 (C.sordellii)ATCC9714gDNA用作tcdB反應(yīng)的模板。僅擴(kuò)增并檢測(cè)到艱難梭菌gDNA。無(wú)模 板對(duì)照（NTC)顯示沒(méi)有擴(kuò)增。⑶tcdB測(cè)定的靈敏度。X軸：時(shí)間（分鐘），Y軸：SybrGreen I熒光（熒光強(qiáng)度，任意單位）。使用艱難梭菌BAA-1382 (630)gDNA的稀釋系列作為模板， 確定tcdB測(cè)定的靈敏度。10-10000cp的艱難梭菌gDNA顯示出通過(guò)SybrGreenI熒光的增 加而測(cè)量的擴(kuò)增，而無(wú)模板對(duì)照（NTC)和陰性對(duì)照反應(yīng)未擴(kuò)增。在0.5ng/μ1的鯡魚(yú)精子 DNA的存在下進(jìn)行所有反應(yīng)。
[0015] 圖3示出了 ： (A) tcdB測(cè)定的包容性（inclusivity)。X軸：時(shí)間（分鐘），Υ軸： SybrGreen I熒光（熒光強(qiáng)度，任意單位）。將分離自艱難梭菌毒素型0、III、VIII和X的 純培養(yǎng)物的2ng gDNA用作tcdB測(cè)定的模板。NTC (無(wú)模板對(duì)照）。所有測(cè)試的毒素型都給 出陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果。（B)用于一組毒素型的tcdB測(cè)定的包容性，細(xì)節(jié)如以上（A)中所述，但是 使用分離自如下艱難梭菌毒素型的純培養(yǎng)物的2nggDNA:艱難梭菌毒素型0、I、II、Ilia、 IIIb、IIIc、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XIa、Xlb、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII;XIX、 XX、XXI;XXII;XXIII;XXIV、XXV、XXVI、XXVII、XXVIII、XXIX、XXX、XXXI、XXXII和XXXIII。 僅有兩種毒素型，即xia和Xlb，給出陰性擴(kuò)增結(jié)果。（C)對(duì)使用分離自（A)中的不同艱難 梭菌毒素型的gDNA模板的tcdB反應(yīng)的熔解曲線分析。X軸：溫度（攝氏度），Y軸：(_d(熒 光）/d(溫度），任意單位）。所有艱難梭菌毒素型都顯示單個(gè)擴(kuò)增子的擴(kuò)增。無(wú)模板對(duì)照 (NTC)顯示未擴(kuò)增。（D)(B)的毒素型組的熔解曲線分析，細(xì)節(jié)如以上（C)中所述。熔解曲 線分析還表明毒素型Xia和Xlb未擴(kuò)增。
[0016] 圖4示出了 ： (A)tcdA測(cè)定擴(kuò)增曲線。使用SybrGreenI進(jìn)行檢測(cè)，并使用實(shí)時(shí)PCR 儀器測(cè)量熒光。X軸：時(shí)間（分鐘），Y軸：SybrGreenI熒光（熒光強(qiáng)度，任意單位）。使用 100-10000cp/反應(yīng)的艱難梭菌BAA-1382 (630)gDNA時(shí)觀察到擴(kuò)增，在0-10cp/反應(yīng)的艱難 梭菌gDNA的存在下和使用無(wú)模板對(duì)照（NTC)時(shí)未觀察到擴(kuò)增。（B)tcdA測(cè)定熔解曲線分 析。X軸：溫度（攝氏度），Y軸：(_d(熒光）/d(溫度），任意單位）。熔解曲線分析表明單 個(gè)特異性擴(kuò)增子的擴(kuò)增。無(wú)模板對(duì)照（NTC)顯示無(wú)擴(kuò)增。
[0017] 序列描沐
[0018] SEQ ID NO: 1是tcdB靶區(qū)域的核苷酸序列。
[0019] SEQIDN0:2是tcdB正向引物的核苷酸序列。
[0020] SEQIDN0:3是tcdB反向引物的核苷酸序列。
[0021] SEQIDN0:4是tcdB鏈侵入寡核苷酸的核苷酸序列。
[0022] SEQIDN0:5是經(jīng)修飾的tcdB鏈侵入寡核苷酸的核苷酸序列。
[0023] SEQIDN0:6是tcdA靶區(qū)域的核苷酸序列。
[0024] SEQID N0:7是tcdA正向引物的核苷酸序列。
[0025] SEQID N0:8是tcdA反向引物的核苷酸序列。
[0026] SEQID N0:9是tcdA鏈侵入寡核苷酸的核苷酸序列。
[0027] SEQID N0:10是經(jīng)修飾的tcdA鏈侵入寡核苷酸的核苷酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 應(yīng)理解，所公開(kāi)的方法的不同應(yīng)用可根據(jù)本領(lǐng)域中的特定需要進(jìn)行調(diào)整。還應(yīng)理 解，本文所使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案的目的，并且不意欲進(jìn)行限制。此 外，除非上下文中另有明確說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式"一"、"一個(gè)" 和"所述"包括復(fù)數(shù)指代對(duì)象。因此，例如，提及"一個(gè)多肽"包括兩個(gè)或更多個(gè)這樣的多肽， 等等。本文引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)，無(wú)論在上文或在下文，都以引用的形式全 文納入本文。
[0029] 樣品中的產(chǎn)毒艱難梭菌的檢測(cè)方法
[0030] 樣品
[0031] 通常，所述樣品是臨床樣品，例如從疑似患有或患有艱難梭菌感染的患者中獲得 的樣品。但是，可使用任何樣品，只要核酸可獲自或衍生自所述樣品。因此，特定的艱難梭菌 菌株的參照樣品或環(huán)境樣品可用于本發(fā)明中。臨床樣品的適合類型隨著存在于或疑似存在 于受試者中的特定感染類型而變化。所述樣品可以是血液、血漿、血清、尿或糞便樣品。在 一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述樣品是糞便樣品。所述糞便樣品可取自患有胃腸道感染的受 試者。所述感染可存在于患有腹瀉的患者中。
[0032] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述樣品取自動(dòng)物受試者，例如哺乳動(dòng)物受試者。所述樣品 通常取自人類受試者，但是本發(fā)明通常也適用于家養(yǎng)動(dòng)物（domestic animal)、牲畜、鳥(niǎo)類 和魚(yú)。例如，本發(fā)明可應(yīng)用于獸醫(yī)或農(nóng)業(yè)環(huán)境。
[0033] 所述樣品包含核酸，其可以是DNA或RNA。如果核酸以允許進(jìn)行本發(fā)明的檢測(cè)的適 合形式存在于樣品中，則可直接使用所述樣品。但是，通常，核酸衍生自、獲自或提取自所述 樣品。加工含核酸的樣品、提取核酸和/或純化核酸以用于檢測(cè)方法的方法是本領(lǐng)域中公 知的?？煞蛛x總核酸，或單獨(dú)分離DNA或RNA。
[0034] 通常，以適當(dāng)?shù)姆绞郊庸悠?，以使得以用于與引物和鏈侵入寡核苷酸接觸的方 便的形式提供核酸。如果所述核酸是DNA，則所述DNA通常以雙鏈形式提供。如果所述核酸 是RNA，則通常使用逆轉(zhuǎn)錄酶或具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶將其轉(zhuǎn)換為cDNA。RNA可用于細(xì) 菌檢測(cè)，因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞中存在著非常大量的核糖體，其有效地增加了靶序列的濃度。
[0035] 靶核酸序列
[0036] 所述靶核酸序列是適用于產(chǎn)毒艱難梭菌的特異性檢測(cè)的艱難梭菌基因組區(qū)域 (或擴(kuò)增子）。這使得能夠高度定性的、明確的測(cè)定樣品中產(chǎn)毒艱難梭菌的存在，即使存在 密切相關(guān)的生物。在特定病原體的產(chǎn)毒