專利名稱：在細菌細胞中擴增基因座的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供在不使用抗生素的情況下擴增基因座的方法。具體而言，本發(fā)明涉及 在體內(nèi)擴增編碼目的多肽的DNA序列的方法、包含多個拷貝所述經(jīng)擴增的DNA序列的細胞， 和包含待用于所述方法的DNA構(gòu)建體的載體。此外，本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)如上文所述的細 胞來產(chǎn)生目的多肽(例如酶)的方法。
背景技術(shù)：
外源多肽的表達和重組產(chǎn)生是廣泛使用的技術(shù)。眾所周知，可以用編碼外源目的 多肽的核酸轉(zhuǎn)化細胞來表達和產(chǎn)生大量所希望的多肽。在一些應(yīng)用中，用該方法產(chǎn)生超過 由起源生物自然產(chǎn)生的量的大量多肽。事實上，外源核酸序列的表達以及內(nèi)源序列的過量 表達已廣泛用于現(xiàn)代生物技術(shù)中。盡管有在分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程中的進步，但任然存在對提高多肽在宿主細胞 中的表達水平的方法和組合物的需要。發(fā)明概述本文提供擴增基因座的方法。在某些實施方案中，該方法可以包括a)將細菌宿 主細胞群體與必需酶的抑制劑接觸，其中所述細菌宿主細胞包含結(jié)構(gòu)為A1-P-M-A2的基因 座，其中A1和A2是同向重復(fù)，P包含目的多肽的編碼序列，M包含所述必需酶的編碼序列， 和b)選擇對該抑制劑具有抗性的細胞；其中對該抑制劑具有抗性的細胞具有多個拷貝的 擴增單位。雖然考慮其他細菌細胞類型(例如鏈霉菌屬物種(Str印tomyces sp.))，但細菌 宿主細胞可以是芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)細胞。在一些實施方案中，目的多肽是枯 草蛋白酶，例如SEQ ID NO :8的枯草蛋白酶，或SEQID NO :12中所示的其成熟形式。在某 些情況下，該方法避免使用抗生素標記和抗生素，提供基于抗生素的擴增系統(tǒng)之外的另一 種選擇。在某些實施方案中，必需酶具有細胞內(nèi)源酶(例如野生型酶)的氨基酸序列。在 具體實施方案中，用于該方法的細菌宿主細胞可以包含或不包含失活的編碼該必需酶的內(nèi) 源基因，其中失活的基因可以處于與結(jié)構(gòu)SA1-P-M-A2的基因座不同的基因座。在某些情況 下，雖然可以使用其他酶/抑制劑組合，但必需酶可以是丙氨酸消旋酶(例如SEQ ID NO 11)，抑制劑可以是β-氯-D-丙氨酸或環(huán)絲氨酸。在一些實施方案中，擴增單位包含SEQ ID NO 7中所示的序列。擴增單位提供由M區(qū)編碼的必需酶的表達。在具體實施方案中，M可以包含必需 酶的編碼序列和有效連接至該編碼序列的啟動子，其中該啟動子是必需酶的編碼序列的天 然啟動子。在某些實施方案中，編碼序列和啟動子可以是宿主細胞內(nèi)源的。擴增單位還提 供由P區(qū)編碼的目的蛋白質(zhì)的表達。在具體實施方案中，P的編碼序列可以有效連接至存 在于相鄰?fù)蛑貜?fù)(A1)中的內(nèi)源或非內(nèi)源啟動子。在其他實施方案中，P的啟動子可以不 存在于相鄰?fù)蛑貜?fù)中。相反，該啟動子存在于P區(qū)中。
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在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含含有結(jié)構(gòu)為A1-P-M-A2的擴增單位的基因座 的細菌宿主細胞，其中A1和A2是同向重復(fù)，P包含目的多肽的編碼序列，也提供包含必需酶 的編碼序列的M。在這個實施方案中，擴增單位提供了必需酶的顯著表達。雖然考慮其他細 菌細胞類型(例如鏈霉菌屬物種)，但細菌宿主細胞可以是芽孢桿菌屬物種細胞。在一些 實施方案中，目的多肽是枯草蛋白酶，例如SEQ ID NO 8的枯草蛋白酶，或SEQ IDNO 12中 所示的其成熟形式。在某些情況下，該方法避免使用抗生素標記和抗生素，提供基于抗生素 的擴增系統(tǒng)之外的另一種選擇。在某些實施方案中，必需酶具有細胞內(nèi)源酶(例如野生型 酶)的氨基酸序列。在具體實施方案中，細菌宿主細胞可以包含或不包含失活的編碼該必 需酶的內(nèi)源基因，其中失活的基因可以處于與結(jié)構(gòu)為A1-P-M-A2的基因座不同的基因座。在 某些情況下，雖然可以使用其他酶/抑制劑組合，但必需酶可以是谷氨酸消旋酶(例如SEQ ID NO :11)，抑制劑可以是β-氯-D-丙氨酸或環(huán)絲氨酸。在一些實施方案中，擴增單位包 含SEQ ID NO 7中所示的序列。在其他實施方案中，本發(fā)明的細菌宿主細胞包含多個拷貝含有結(jié)構(gòu)為A1-P-M-A2 的擴增單位的基因座，其中A1和A2是同向重復(fù)，P包含目的多肽的第一編碼序列，M包含必 需酶的第二編碼序列。在一些實施方案中，擴增單位包含SEQ ID NO :7中所示的多核苷酸 序列。在一些實施方案中，將第一編碼序列有效連接至存在于同向重復(fù)A1中的啟動子。在 具體實施方案中，細菌宿主細胞包含多個拷貝含有式(A1-P-M)n-A2K描述的擴增單位的基 因座，其中η為至少2，A1和A2是同向重復(fù)，P包含目的多肽的編碼序列，M包含必需酶的編 碼序列，其中M的編碼序列有效連接至內(nèi)源或非內(nèi)源啟動子。在一個實施方案中，M的編碼 序列和啟動子可以是宿主細胞內(nèi)源的。在一些實施方案中，細菌宿主細胞包含多個拷貝含 有SEQ IDNO 7的擴增單位(例如至少2個拷貝)的基因座。擴增單位提供目的多肽(例如 枯草蛋白酶)和必需酶二者的表達。在一些實施方案中，所表達的目的多肽是SEQ ID NO 8中所示的枯草蛋白酶FNA，或SEQ ID NO 12中所示的其成熟形式，必需酶是SEQ ID NO 11中所示的丙氨酸消旋酶。在具體實施方案中，有效連接至P的編碼序列的啟動子可以是 相鄰?fù)蛑貜?fù)(A1)的部分。在另一個實施方案中，有效連接至P區(qū)編碼序列的啟動子存在 于P區(qū)中而不是相鄰?fù)蛑貜?fù)中。在另一個實施方案中，本發(fā)明包含細菌細胞培養(yǎng)物，其包含培養(yǎng)基和細菌宿主細 胞群體，該細菌宿主細胞包含結(jié)構(gòu)為A1-P-M-A2的擴增單位的至少1個、至少2個或更多個 拷貝，其中A1和A2是同向重復(fù)，P包含用于目的蛋白質(zhì)的第一編碼序列，M包含用于必需酶 的第二編碼序列。如上文所述，擴增單位提供目的多肽(例如枯草蛋白酶)和必需酶二者 的表達。在一些實施方案中，所表達的目的多肽是SEQ ID N0:8中所示的枯草蛋白酶FNA， 或SEQ ID NO :12中所示的其成熟形式，必需酶是SEQ ID NO :11中所示的丙氨酸消旋酶。 還在另一個實施方案中，可以在蛋白質(zhì)產(chǎn)生方法中使用細菌細胞培養(yǎng)物，該方法包括在適 合產(chǎn)生由編碼序列編碼的目的多肽的條件下維持受試細胞的培養(yǎng)物。在具體實施方案中， 此方法還可以包括從培養(yǎng)基中回收目的多肽。附圖簡述

圖1圖示說明本文所述實施方案的一些特征。圖 2 顯示 pBSFNAalr 質(zhì)粒(SEQ ID NO 2)的圖譜。圖3顯示qPCR校準曲線。
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圖4是顯示來自多種宿主菌株的枯草蛋白酶FNA表達水平的圖表。定義除非本文另作定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員的通常理解相同的意義。雖然可將類似或等同于本文所述方法和材料的任意方 法和材料用于實施或測試本發(fā)明，但描述了優(yōu)選的方法和材料。本文提到的所有專利和出版物，包含在這類專利和出版物中公開的所有序列在此 明確引入作為參考。數(shù)值范圍包含定義該范圍的數(shù)值。除非另行說明，核酸按5'至3'的方向從左向 右書寫；氨基酸序列按氨基至羧基的方向從左向右書寫。本文給出的標題不是對本發(fā)明的多個方面或?qū)嵤┓桨傅南拗?。因此，以下術(shù)語通 過參考說明書整體而得到更充分的定義。除非另作定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員的通常理解相同的意義。Singleton等，DICTI0NARY0F MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，第二版，JohnWiley 和 Sons，New York(1994)禾Π Hale & Markham，THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,N. Y. (1991)為技術(shù)人員提供 了本文所用的許多術(shù)語的一般意義。但是，為了清楚和便于參考的緣故，下文定義了某些術(shù) 語。術(shù)語“重組體”指并非天然存在于宿主細胞中的多核苷酸或多肽。重組分子可以 包含以非天然存在的方式連接在一起的兩條或更多條天然存在的序列。重組細胞包含重組 多核苷酸或重組多肽。術(shù)語“異源的”指正常情況下不彼此結(jié)合的元件。例如，若宿主細胞產(chǎn)生異源蛋白 質(zhì)，則正常情況下該蛋白質(zhì)不在該宿主細胞中產(chǎn)生。同樣，有效連接至異源編碼序列的啟動 子是這樣的啟動子，其有效連接至編碼序列，而在野生型宿主細胞中通常不有效連接至該 編碼序列。關(guān)于多核苷酸或蛋白質(zhì)，術(shù)語“同源的”指天然存在于宿主細胞中的多核苷酸或 蛋白質(zhì)。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可互換使用?！靶盘栃蛄小笔谴嬖谟诘鞍踪|(zhì)N端部分的氨基酸序列，其促進成熟形式的蛋白質(zhì)從 細胞分泌。信號序列的定義是功能性定義。胞外蛋白質(zhì)的成熟形式無信號序列，其在分泌 過程中被切除。術(shù)語“核酸”包含單鏈或雙鏈的DNA、RNA及其化學(xué)修飾物。術(shù)語“核酸”和“多核 苷酸”在本文中可互換使用?！拜d體”指設(shè)計用于將核酸引入一個或多個宿主細胞的多核苷酸。在某些實施方案 中，載體可在不同宿主細胞中自主復(fù)制，其包含克隆載體、表達載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌 體粒子、盒等。在其他實施方案中，載體可以整合入宿主細胞基因組?！皢幼印笔瞧鹗枷掠魏怂徂D(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“有效連接”指使元件在功能上相關(guān)的元件排列。例如，若啟動子控制編碼序 列的轉(zhuǎn)錄，則啟動子有效連接至該序列。術(shù)語“選擇標記”指能夠在宿主中表達的蛋白質(zhì)，其便于包含引入的核酸或載體的 那些宿主的篩選。選擇標記的實例包含但不限于抗微生物劑(例如潮霉素、博來霉素或氯
5霉素)和/或賦予宿主細胞代謝優(yōu)勢(如營養(yǎng)優(yōu)勢)的基因。本文所用的術(shù)語“回收的”、“分離的”和“分開的”指從至少一種其天然結(jié)合的成
分移出的蛋白質(zhì)、細胞、核酸或氨基酸。如本文所用，提到細胞時使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)基因的”指該 細胞具有整合入其基因組或作為附加型質(zhì)粒保持多代的非天然(例如異源的)核酸序列。本文所用的術(shù)語“表達”指通過其來根據(jù)基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過程。該過 程包含轉(zhuǎn)錄和翻譯二者。在將核酸序列插入細胞的背景中，術(shù)語“引入的”指“轉(zhuǎn)染”、“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，且包 含對核酸序列整合入真核或原核細胞的指代，其中該核酸序列可以整合入細胞基因組(例 如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)、轉(zhuǎn)變?yōu)樽灾鲝?fù)制子或瞬時表達(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。術(shù)語“雜交”指核酸鏈通過本領(lǐng)域已知的堿基配對與其互補鏈連接的過程。若核 酸與參考序列核酸在中度到高度嚴格的雜交和漂洗條件下特異性地彼此雜交，則認為這兩 條序列“可選擇性雜交”。中度和高度嚴格的雜交條件是已知的(見例如Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology,第三版,Wiley & Sons 1995禾口Sambrook等，Molecular Cloning =ALaboratory Manual，第三版，2001冷泉港，紐約)。高度嚴格的條件的一個實例 包含在約42°C下在50%甲酰胺、5X SSC、5X Denhardt，s溶液、0. 5% SDS和100ug/ml變性 載體DNA中雜交，然后在室溫下在2X SSC和0.5% SDS中漂洗兩次，在42 °C下在0. IX SSC 和0. 5% SDS中漂洗另外兩次。“編碼序列”是編碼多肽的DNA片段。如本文所用，“表達盒”指DNA構(gòu)建體，其包含有效連接至適合的控制序列的蛋白質(zhì) 編碼區(qū)，該控制序列能夠影響蛋白質(zhì)在適合的宿主細胞中的表達。此類控制序列可以包含 引起轉(zhuǎn)錄的啟動子、控制轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生mRNA的可選的操縱基因序列、編碼適合的mRNA上的核 糖體結(jié)合位點的序列、增強子，和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的其他序列?！八拗骷毎奶烊弧倍嚯幕蚨嗪塑账峋哂信c未被改變的宿主細胞中存在的多肽或 多核苷酸相同的氨基酸或核苷酸序列。在某些情況下，細胞可包含重組核酸，該重組核酸包 含該細胞的天然多核苷酸(例如編碼序列)。在這些情況下，細胞在不同的基因座包含重組 核酸，該重組核酸包含具有也存在于未被改變的宿主細胞版本(即不包含任意基因敲除的 宿主細胞)中的核苷酸序列的多核苷酸。在某些情況下，細胞可包含編碼細胞的天然多肽 的重組核酸。在這些情況下，細胞包含編碼多肽的核酸，該多肽具有與見于未被改變的宿主 細胞版本(即不包含任意基因敲除的宿主細胞)中的多肽相同的氨基酸序列。術(shù)語“內(nèi)源 的”與術(shù)語“天然的”是同義詞。關(guān)于有效連接至其天然啟動子的編碼序列，“天然啟動子”指野生型宿主細胞的啟 動子，其在該細胞中有效連接至該編碼序列。術(shù)語“同向重復(fù)”指在細胞中以相同取向存在并可以進行同源重組的至少兩個序 列元件。同向重復(fù)具有超過至少50個核苷酸(例如至少100、至少200或至少500或更多 個核苷酸)的相同或幾乎相同的核苷酸序列(例如至少98%或99%序列同一性)。術(shù)語“抑制劑”指通過競爭性抑制或非競爭性抑制(例如變構(gòu)抑制)可逆地抑制 酶的化合物。術(shù)語“必需酶”是細胞生長必需的酶。
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若細胞中內(nèi)源必需酶的基因是野生型(即未失活)，則術(shù)語“提供必需酶的顯著表 達的表達盒”指提供超過內(nèi)源必需酶水平50% (例如至少70%、至少90%或至少100%，高 達1000% )的必需酶表達水平的表達盒。術(shù)語“丙氨酸消旋酶”指催化L-丙氨酸和D-丙氨酸互變的酶。丙氨酸消旋酶具 有如EC 5. 1. 1. 1所述的活性(根據(jù)IUBMB酶命名法)。編碼丙氨酸消旋酶的基因可以表示 為 “alr”、“alrA” 或 “dal” 基因。術(shù)語的其他定義可以在整篇說明書中出現(xiàn)。示例性實施方案的詳述如上文所述，提供擴增基因座的方法。在圖1中說明本方法的幾個一般特征。參 照圖1，在該方法中使用的細菌宿主細胞可以包含含有結(jié)構(gòu)為A1-P-M-A2的擴增單位的基因 座，其中A1和A2是同向重復(fù)，P包含目的多肽的編碼序列，M包含細胞必需的酶的編碼序列。 式A1-P-M-A2旨在包含含有以相對于P和M的任一方向定位的同向重復(fù)的基因座。擴增單位提供目的多肽和必需酶在細胞中的表達。在某些情況下，P區(qū)和M區(qū)可 以分別獨立地包含目的多肽和必需酶的表達盒(即有效連接至啟動子的編碼序列)。在一 些實施方案中，擴增單位包含用于表達目的多肽的第一表達盒和用于表達必需酶的第二表 達盒。在其他實施方案中，可以將P區(qū)的編碼序列有效連接至存在于相鄰?fù)蛑貜?fù)中的啟 動子。在此實施方案中和如將在下文中更詳細地討論，同向重復(fù)和必需酶編碼序列的組合 核苷酸序列可以是細胞內(nèi)源的，即其見于宿主細胞的基因組。在具體實施方案中，有效連接 至M區(qū)編碼序列的啟動子可以是該編碼序列內(nèi)源的或非內(nèi)源的。在具體實施方案中，可以 由有效連接至P的編碼序列的啟動子驅(qū)動M區(qū)的編碼序列。如顯而易見，P和M在本文所述任意核酸中的方向可以是相反方向(即 A1-M-P-A2)。在此相反方向中和在一些實施方案中，可以將M區(qū)的編碼序列有效連接至同向 重復(fù)A1中的啟動子。備選地，可以將M區(qū)的編碼序列有效連接至存在于M區(qū)中的啟動子。將這類細胞的群體與必需酶的抑制劑接觸，選擇對抑制劑具有抗性的細胞(即 可以在抑制劑存在的情況下生長和分裂形成菌落的細胞)。如圖1中所示，選擇的細胞 具有多個拷貝包含擴增單位的基因座，該基因座可以通過式(A1-P-M)n-A2描述，其中A1和 A2是同向重復(fù)，η是至少2。η可以是例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或至少10，例如在10-50 或50-100的范圍內(nèi)或更多。相對于未選擇的細胞，選擇的細胞在必需酶的編碼序列(例 如在抑制劑的結(jié)合位點)中或在連接至該編碼序列的啟動子中無突變。然而，選擇的細 胞在擴增單位的拷貝數(shù)上有增加，這允許細胞在抑制劑存在的情況下生長。在某些情況 下，可以對細胞群體進行幾輪選擇，每一輪選擇使用濃度依次提高的抑制劑(例如抑制劑 濃度依次加倍)。在一些實施方案中，A1-P-M-A2擴增單位包含SEQ ID NO :7中所示的多 核昔酸序歹丨J :tccattttcttctRctatcaaaataacaRactcRtRattttccaaacRaRctttcaaaaaaRcc tctRccccttRcaaatcRRatRcctRtctataaaattcccRatattRRttaaacaRCRRCRcaatRRCRRCCRca tctRatRtctttRcttRRCRaatRttcatcttatttcttcctccctctcaataattttttcattctatccctttt CtRtaaaRtttatttttcaRaatacttttatcatcatRctttRaaaaaatatcacRataatatccattRttctca CRRaaRcacacRcaRRtcatttRaacRaattttttcRacaRRaatttRccRRRactcaRRaRcatttaacctaaa aaaRcatRacatttcaRcataatRaacatttactcatRtctattttcRttcttttctRtatRaaaataRttattt CRaRtctctacRRaaataRcRaRaRRtRatatacctaaataRaRataaaatcatctcaaaaaaatR GGTCTA
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cttttaagtaagtctactctgaattttttta(SEQ ID NO :7)其中重復(fù)單位~和4以下劃線顯示，編碼目的蛋白質(zhì)(即枯草蛋白酶FNA)的多 核苷酸序列以黑體字母表示，編碼必需酶(例如丙氨酸消旋酶)的多核苷酸序列以斜體顯 示。啟動子序列以黑體大寫字母顯示。由于通過該方法產(chǎn)生的宿主細胞包含第一表達盒的更多個拷貝，細胞可以產(chǎn)生比 具有單拷貝A1-P-M-A2擴增單位的宿主細胞更多的由第一表達盒編碼的目的多肽。在具體 實施方案中，與具有單拷貝A1-P-M-A2擴增單位的其他相同宿主細胞相比，獲得的宿主細胞 可以產(chǎn)生多至少20 %、至少40 %、至少60 %、至少80 %、至少100 %、至少2倍、至少3倍、至 少4倍、至少5倍或至少10倍、高達約100倍的蛋白質(zhì)。在本方法中使用的抑制劑的濃度可以隨所用必需酶和抑制劑潛能而變化。在具體 實施方案中，雖然考慮這些范圍外的濃度，但抑制劑可以處于1 μ M-IOOmM范圍內(nèi)的濃度，例如在5μΜ-10πιΜ、20μΜ-1πιΜ的范圍內(nèi)?？梢詫⒁种苿┘尤胍后w培養(yǎng)物，或抑制劑可以存 在于細菌生長于其上的固體培養(yǎng)基(例如瓊脂培養(yǎng)基)中。如上文所指出，可以對細胞群 體進行幾輪選擇，每一輪選擇使用濃度依次提高的抑制劑(例如抑制劑濃度依次加倍)。在具體實施方案中，擴增單位不包含抗生素抗性標記，且可以在無抗生素的培養(yǎng) 基中進行細胞選擇。下文更詳細地描述了第一和第二表達盒及宿主細胞。表送盒如上文所指出，擴增單位提供目的多肽和必需酶的表達。因此，擴增單位一般包含 至少兩個表達盒用于目的多肽表達的第一表達盒和用于必需酶基因表達的第二表達盒。 每個表達盒包含處于有效連接中的啟動子、編碼序列和終止子。在某些情況下，擴增單位的 P區(qū)可以包含第一表達盒，擴增單位的M區(qū)可以包含第二表達盒。在其他情況下和如上文所 指出，鄰近P區(qū)的同向重復(fù)可以包含有效連接至P區(qū)編碼序列的啟動子。在某些情況下，P 區(qū)和鄰近P區(qū)的正向重復(fù)的連續(xù)的核苷酸序列可以是宿主細胞內(nèi)源的(即存在于宿主細胞 基因組中)。在具體實施方案中，可以將M區(qū)的編碼序列有效連接至P區(qū)的啟動子。本文討論的每一表達盒可以包含處于有效連接中的以下元件啟動子、編碼序列 和終止子序列，其中該表達盒足以在宿主細胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。如下文將更詳細地討論，第一 表達盒的編碼序列可以編碼重組蛋白質(zhì)，例如治療性蛋白質(zhì)或所謂的“工業(yè)酶”。在具體實 施方案中，該編碼序列可以編碼具有提供蛋白質(zhì)從細胞分泌的信號序列的蛋白質(zhì)。如上文 所指出和如將在下文中更詳細地討論，第二表達盒提供必需酶的表達。若使用啟動子、終止子和信號序列，則它們的選擇主要取決于所使用的宿主細胞。 宿主細胞包含芽孢桿菌屬物種宿主細胞、鏈霉菌屬物種宿主細胞、大腸桿菌(E. coli)和 其他細菌宿主細胞。如上文所指出，在示例性實施方案中，可以使用鏈霉菌屬宿主細胞， 在這種情況下，若使用信號序列，則其可以是celA信號序列。在某些情況下，celA信號序 列可以是如Klu印fel等(Nature Biotechnol. 199614 756-759)所述的由變鉛青鏈霉菌 (S. Iividans)纖維素酶A基因CelA編碼的信號序列。在使用芽孢桿菌屬宿主細胞的其他示 例性實施方案中，信號序列可以是能夠指導(dǎo)融合蛋白質(zhì)進入芽孢桿菌屬宿主細胞的分泌途 徑的任意氨基酸序列。在某些情況下，可以使用的信號序列包含從野生型芽孢桿菌屬細胞 分泌的蛋白質(zhì)的信號序列。這類信號序列包含由α-淀粉酶、蛋白酶(例如aprE或枯草蛋 白酶E)或β -內(nèi)酰胺酶基因編碼的信號序列。示例性信號序列包含但不限于由α -淀粉酶 基因、枯草蛋白酶基因、β-內(nèi)酰胺酶基因、中性蛋白酶基因(例如nprT、nprS、nprM)或來自 任意適合的芽孢桿菌屬物種(包含但不限于嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophiIus), 地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)、克勞氏芽孢桿菌(B. clausii)、枯草芽孢桿菌 (B. subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens))的prsA基因編碼的信號序 列。在一個實施方案中，信號序列由枯草芽孢桿菌的aprE基因編碼(如Appl. Microbiol. Biotechnol. 200362 :369_73 中所述)。Simonen 禾口 Palva (MicrobiologicalReviews 1993 57 109-137)和其他參考文獻描述了其他信號肽。適合用于芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬宿主細胞中的啟動子和終止子是已知的，包含 apr(堿性蛋白酶)、npr(中性蛋白酶)、amy ( α -淀粉酶)和β-內(nèi)酰胺酶基因以及枯 草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因
10(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽淀粉酶(maltogenic amylase)基因(amyM)、解淀粉芽孢 桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和 xylB基因的啟動子和終止子；WO 93/10249、WO 98/07846和W099/43835中所述的啟動子 和終止子。可以用描述于例如 Hopwood 等(Genetic Manipulation of Streptomyces :A Laboratory Manual ；冷泉港實驗室，1985) ；Hopwood 等(Regulation of Gene Expression inAntibiotic-producing Streptomyces.在 Booth, I.禾口 Higgins, C.(編輯)Symposium of the Society for General Microbiology, Regulation of GeneExpression,劍橋大學(xué) 出版社，1986，251-276 頁中)；Fornwald 等(Proc. Natl. Acad. Sci. 198784 :2130_2134)； Pulido 等(Gene. 198756 :277-82) ；Dehottay 等(Eur. J. Biochem. 1987166 :345_50)； Taguchi(Gene. 198984 :279_86) ；Schmitt-John 等(Appl. Microbiol. Biotechnol. 199236 493-8) ；Motamedi (Gene 1995160 :25_31)和Binnie(Protein Expr. Purif. 199711 :271_8) 中的啟動子和終止子構(gòu)建用于鏈霉菌屬宿主細胞中的表達盒。在一個實施方案中，可以使 用描述于WO 06/054997中的A4啟動子，WO 06/054997在此引用作為參考。在某些實施方案中，可以針對目的多肽在所用宿主細胞中的表達，對任一編碼序 列進行密碼子優(yōu)化。由于列出每一密碼子在許多細胞中的使用的密碼子選擇表為本領(lǐng)域已 知(見例如Nakamura等，Nucl. Acids Res. 200028 292)或易于推導(dǎo)，給出待表達蛋白質(zhì)的 氨基酸序列后可以容易地設(shè)計這類核酸。用于在鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬宿主細胞中表達重組蛋白質(zhì)的系統(tǒng)為本領(lǐng)域公知， 不需比上文所述更詳細地對其進行討論。第一表達盒第一表達盒可以包含啟動子和編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸(即編碼序列)，其中 啟動子和多核苷酸有效連接，以使分離的核酸引起多核苷酸的轉(zhuǎn)錄和目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。所編碼的目的蛋白質(zhì)可以是所謂的“工業(yè)酶”、治療性蛋白質(zhì)、報道蛋白質(zhì)、食品添 加劑或食品等。在一個實施方案中，目的蛋白質(zhì)可以是例如酶，如糖酶，如液化和糖化α-淀粉 酶、堿性α-淀粉酶、β-淀粉酶、纖維素酶；葡聚糖酶、α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、葡 糖淀粉酶、半纖維素酶、戊聚糖酶、木聚糖酶、轉(zhuǎn)化酶、乳糖酶、柚苷酶(naringanase)、果膠 酶或支鏈淀粉酶；蛋白酶，如酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無花果蛋白酶、中性蛋 白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、肽酶、粗制凝乳酶、凝乳酶(rermin)、凝乳酶(chymosin)、枯 草蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或胰蛋白酶；脂肪酶或酯酶，如甘油三酯酶、磷脂 酶、pregastric esterase、磷酸酶、肌醇六磷酸酶、酰胺酶、亞胺酰基酶(iminoacylase)、谷 氨酰胺酶、溶菌酶或青霉素?；?；異構(gòu)酶，如葡萄糖異構(gòu)酶；氧化還原酶，例如氨基酸氧 化酶、過氧化氫酶、氯過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、羥類固醇脫氫酶或過氧化物酶；裂合酶， 如乙酰乳酸脫羧酶、天冬氨酸β-脫羧酶、延胡索酸酶或組氨酸酶(histadase)；轉(zhuǎn)移酶，如 環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶；或連接酶。在具體實施方案中，蛋白質(zhì)可以是例如氨肽酶、羧肽酶、幾丁 質(zhì)酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酶、漆酶、甘露 糖苷酶、齒斑葡聚糖酶、果膠分解酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶或轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。在具體實施方案中，由第一表達盒編碼的目的蛋白質(zhì)是清潔劑添加劑蛋白質(zhì)， 即a)從細胞分泌且b)將其加至衣物清洗劑的蛋白質(zhì)(例如酶)。示例性清潔劑添加劑
11蛋白質(zhì)包含蛋白酶，例如枯草蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶。枯草蛋白酶(即胞外堿性 絲氨酸蛋白酶)尤其重要?？莶莸鞍酌缚梢跃哂幸娪谝吧突蚪M的氨基酸序列(即 枯草蛋白酶可以是天然存在的枯草蛋白酶)，或可以是天然存在的枯草蛋白酶的變體， 從而可以包含與由野生型基因組編碼的枯草蛋白酶至少80%、至少90%、至少95%或 至少98%—致的氨基酸序列。示例性枯草蛋白酶包含Alcanase (Novozymes)、 FNA (Genencor)、Savinase (NovOZymes)、Purafect (Genencor), KAP (Kao), Everlase (Novozymes)、Purafect OxP (Genencor)、FN4 (Genencor)、BLAP S (Henkel)、BLAP X (Henkel)、Esperase (Novozymes)、Kannase (Novozymes)和 Prosperase (Genencor)。在其他實施方案中，枯草蛋白酶可以是枯草蛋白酶168、枯草蛋 白酶BPN，、枯草蛋白酶0^1讓吐8、枯草蛋白酶0￥、枯草蛋白酶147或枯草蛋白酶309 (見例 如 EP414279B、W089/06279 和 Stahl 等，J. Bacteriol. 1984159 :811_818)。在一些實施方 案中，由第一表達盒編碼的枯草蛋白酶是FNA
VRSKKLWISLLFALALIFTMAFGSTSSAQAAGKSNGEKKYIVGFKQTMSTMSAAKKKDVI
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AQ(SEQIDNO: 8)?？莶莸鞍酌傅那霸瓍^(qū)(pre-pro region)以斜體顯示，成熟區(qū)以
黑體字母顯示(SEQ ID NO:12 )。編碼FNA的多核苷酸實例是gtgagaagCaaaaaattgtg
gatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatggcgttcggcagcacatcctctgcccaggcggcaggga
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tttctactatggaaaagggctgatcaacgtacaggcggcagctcagtaa(SEQ ID NO 9). 本文可以使用的示例性枯草蛋白酶和其他蛋白酶包含描述于W099/20770、WO99/20726、WO 99/20769、WO 89/06279、RE 34，606、美國專利號 4，914，031、美國專利號 4，980，288、美國專利號5，208，158、美國專利號5，310，675、美國專利號5，336，611、美國專 利號5，399，283、美國專利號5，441，882、美國專利號5，482，849、美國專利號5，631，217、 美國專利號5，665，587、美國專利號5，700, 676、美國專利號5，741，694、美國專利號 5，858，757、美國專利號5，880，080、美國專利號6，197，567和美國專利號6，218，165中的 枯草蛋白酶和其他蛋白酶?？莶莸鞍酌敢话阍敿毜鼐C述在Siezen(Protein Sci. 1997 6 501-523)中，清潔劑添加劑枯草蛋白酶綜述于Bryan(Biochim. Biophys. Acta 2000 1543 203-222) ；Maurer(CurrentOpinion in Biotechnology 2004 15:330—334)禾口 Gupta(Appl MicrobiolBiotechnol. 2002 59:15-32)中。某些目的枯草蛋白酶具有如 EC 3.4.4. 16(根 據(jù)IUBMB酶命名法)所述的活性。在其他實施方案中，目的蛋白質(zhì)可以是治療性蛋白質(zhì)(即具有治療性生物學(xué)活性 的蛋白質(zhì))。適合的治療性蛋白質(zhì)的實例包含促紅細胞生成素、細胞因子，如干擾素- α、 干擾素_ β、干擾素_ Y、干擾素-ο和粒細胞CSF、GM-CSF ；凝血因子，如VIII因子、IX因子 和人蛋白C、抗凝血酶III、凝血酶、可溶性IgE受體α -鏈、IgG、IgG片段、IgG融合蛋白質(zhì)、 IgM、IgA、白細胞介素、尿激酶、糜蛋白酶和尿素胰蛋白酶抑制劑、IGF結(jié)合蛋白質(zhì)、表皮生長 因子、生長激素釋放因子、膜聯(lián)蛋白V融合蛋白質(zhì)、制管張素、血管內(nèi)皮生長因子_2、骨髓祖 細胞抑制因子-1、護骨蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、甲胎蛋白、DNA酶II、三環(huán)人纖維蛋白溶酶 原(kringle 3 ofhuman plasminogen)、葡糖腦苷脂酶、TNF結(jié)合蛋白質(zhì)1、促卵泡激素、細 胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4-Ig、跨膜激活劑和鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)蛋白配體、可溶性TNF受 體Fc融合蛋白質(zhì)、胰高血糖素樣蛋白質(zhì)1和IL-2受體激動劑?？贵w蛋白質(zhì)(例如可以人 源化的單克隆抗體)尤其重要。在另一個實施方案中，目的蛋白質(zhì)可以是報道蛋白質(zhì)。這類報道蛋白質(zhì)可以是 例如光學(xué)可檢測的或生色的。在這個實施方案中，蛋白質(zhì)可以是半乳糖苷酶(IacZ)、 β-葡萄糖醛酸酶(GUS)、熒光素酶、堿性磷酸酶、胭脂堿合酶(NOS)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 (CAT)、辣根過氧化物酶(HRP)或熒光蛋白質(zhì)，例如綠色熒光蛋白(GFP)或其衍生物。如上文所指出，編碼序列可以編碼融合蛋白質(zhì)。在這些實施方案的一些中，融合蛋 白質(zhì)可以提供目的蛋白質(zhì)從其在其中表達的宿主細胞的分泌，因此，融合蛋白質(zhì)可以包含 有效連接至目的蛋白質(zhì)N端的信號序列，其中信號序列包含將蛋白質(zhì)導(dǎo)向宿主細胞分泌途 徑的氨基酸序列，其導(dǎo)致蛋白質(zhì)從宿主細胞分泌進入宿主細胞在其中生長的培養(yǎng)基。目的 蛋白質(zhì)分泌前從融合蛋白質(zhì)切除信號序列。第二表達盒第二表達盒提供必需酶的表達，其中，如上文所指出，必需酶是細胞進行細胞生長 所需的。在具體實施方案中，必需酶可以是條件性必需的，由此其僅在某些條件下為細胞生 長所需(例如在缺乏使必需酶的任意喪失無效的外源化合物的情況下)。在某些情況下，通 過加入外源化合物(其在某些情況下可以是酶的產(chǎn)物或另一碳源)，缺乏條件性必需酶活 性的細胞(其可以通過失活編碼該酶的基因或通過將細胞與該酶的抑制劑接觸來產(chǎn)生)可 以在培養(yǎng)物中生長。因此，在某些情況下，用于第二表達盒中的必需酶可以是當其從細胞中 缺失時使細胞成為特定化合物的營養(yǎng)缺陷型或不能利用一種或多種特定碳源的酶。這類必需酶/抑制劑組合的實例是已知的并包含例如涉及氨基酸合成的酶和它
13們各自的抑制劑；涉及特定碳源利用的酶和它們各自的抑制劑。下文給出了這類酶/抑制 劑組合的實例。編碼涉及氨基酸合成的酶的基因的失活引起對該氨基酸的輔源營養(yǎng)。同樣， 編碼涉及特定碳源利用的酶的基因的失活引起對另一碳源的輔源營養(yǎng)。酶不切割抑制劑。 然而，抑制劑可逆和特異地競爭性或非競爭性抑制酶的催化活性。在一個實施方案中，酶可以是S-腺苷-甲硫氨酸合成酶(由metE編碼；GenBank 檢索號 U52812 ；見 Yocum 等，Cloning and characterization of themetE gene encoding
5-adenosylmethioninesynthetase from Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 1996 178 4604)，胃"SJMI^^F 畠 MSI (Chiang 等 Molecularcharacterization of Plasmodium falciparum S-adenosylmethioninesynthetase. Biochem J. 1999 344 571-6)以及甲 硫氨酸類似物、嘌呤類似物、8-氮鳥嘌呤和咪唑硫嘌呤(Berger等Characterisation of methionineadenosyltransferase from Mycobacterium smegmatis and Μ. tuberculosisBMC Microbiol. 2003 ；3 12)抑制。S-腺苷-甲硫氨酸合成酶基因的失活 引起甲硫氨酸輔源營養(yǎng)。在另一個實施方案中，酶可以是3-異丙基蘋果酸脫氫酶，其催化3-羧基-2-羥 基-4-甲基戊酸向3-羧基-4-甲基-2-氧戊酸的轉(zhuǎn)變。該酶由IeuB編碼，IeuB缺陷的 菌株是亮氨酸營養(yǎng)缺陷型。3-異丙基蘋果酸脫氫酶可以被例如0-isobutenyl oxalyl hydroxamate(Singh 等，The High-resolution Structureof LeuB (Rv2995c)from Mycobacterium tuberculosis, Journal ofMolecular Biology 2005 346 :1_11 頁)抑制。在另一個實施方案中，酶可以是二氨基庚二酸脫羧酶，其催化內(nèi)消旋_2，
6-diaminoheptanedioate向L-賴氨酸的轉(zhuǎn)變，由IysA編碼。IysA缺陷的菌株將是賴氨酸 營養(yǎng)缺陷型。二氨基庚二酸脫羧酶的抑制劑包含二氨基庚二酸的類似物，其包含但不限于 羊毛硫氨酸亞砜、羊毛硫氨酸砜的內(nèi)消旋和LL異構(gòu)體、羊毛硫氨酸、包含N-羥二氨庚二酸 4和N-氨基二氨庚二酸5的N修飾的類似物(見Kelland等J. Biol. Chem. 1986 Analogs ofdiaminopimelic acid as inhibitors of meso-diaminopimelate decarboxylasefrom Bacillus sphaericus and wheat germ 261 :13216-13223)。在另一個實施方案中，酶可以是谷氨酰-tRNA還原酶，其催化5-氨基乙酰丙酸的 合成，由hemA編碼。hemA缺陷的菌株是5-氨基乙酰丙酸或氯化血紅素的營養(yǎng)缺陷型。該酶 可以被戊二霉素抑制(Schauer 等 Escherichia coli Glutamyl-tRNA Reductase J. Biol. Chem. 2002 277 48657-48663)。在另一個實施方案中，酶可以是D-丙氨酸消旋酶，其催化L-丙氨酸和D-丙氨酸 的互變，由alr(也稱為dal)編碼。air缺陷的菌株是D-丙氨酸(其為細胞壁生物合成所 需)的營養(yǎng)缺陷型。D-丙氨酸消旋酶的抑制劑包含但不限于D-環(huán)絲氨酸、β-氯-D丙氨 酸和鄰氨基甲酰-D-絲氨酸(見例如Manning等，Inhibition of Bacterial Growth by β -chloro-D-alaninePNAS 1974 71:417-421)。在一些實施方案中，第二表達盒包含多核 苷酸，例如atgagcacaaaacctttt tacagagata cgtgggcgga aattgacttg tccgcgataa aggaaaatgt cagcaatatg aaaaaacatatcggtgaaca tgtccacttg atggcagttg tgaaagcaaa cgcctacggg catggtgatg cagaaacagc aaaggctgct
14
cttgacgcag gtgcttcatg cttggccgtg gccattttgg atgaagcgat ttcactgcgc aaaaagggat tgaaggcgcctatattggtg cttggcgcgg ttcccccgga gtatgtggca atcgctgctg agtatgacgt gaccttaaca ggttattctgttgaatggct tcaggaggca gcccgccaca cgaaaaaagg ttctcttcat tttcatctga aggtcgatac ggggatgaacagacttggtg taaaaacaga ggaagaagtt cagaacgtga tggcaattct tgaccgcaac cctcgtttaa agtgcaaaggggtatttacc cattttgcga cagcggatga aaaagaaaga ggctatttct taatgcagtt tgagcgcttt aaagagctgattgetccget gccgttaaag aatctaatgg tccactgcgc gaacagcgcc gctggactcc ggctgaaaaa aggcttttttaatgcagtca gattcggcat cggcatgtat ggccttcgcc cgtctgctga catgtcggac gagataccgt ttcagctgcgtccggcattt accctgcatt cgacactgtc acatgtcaaa ctgatcagaa aaggcgagag cgtcagctac ggagccgagtacacagcgga aaaagacaca tggatcggga cggtgcctgt aggctatgcg gacggctggc tccgaaaattgaaagggacc gacatccttg tgaagggaaa acgcctgaaa attgccggcc gaatttgcat ggaccaattt atggtggagctggatcagga atatccgccg ggcacaaaag tcacattaat aggccggcag ggggatgaat atatttccat ggatgagattgcaggaaggc tcgaaaccat taactatgag gtggcctgta caataagttc ccgtgttccc cgtatgtttt tggaaaatgg
gagtataatg gaagtaagaa atcctttatt gcaggtaaat ataagcaatt aa (SEQ ID N0:10)，其編碼D-丙氨酸消旋酶MSTKPFYRDTWAEIDLSAIKENVSNMKKHIGEHVHLMAVVKANAYGHGDAETAKAALDAGASCLAVAILDEAISLRKKGLKAPILVLGAVPPEYVAIAAEYDVTLTGYSVEWLQEAARHTKKGSLHFHLKVDTGMNRLGVKTEEEVQNVMAILDRNPRLKCKGVFTHFATADEKERGYFLMQFERFKELIAPLPLKNLMVHCANSAAGLRLKKGFFNAVRFGIGMYGLRPSADMSDEIPFQLRPAFTLHSTLSHVKLIRKGESVSYGAEYTAEKDTWIGTVPVGYADGWLRKLKGTDILVKGKRLKIAGRICMDQFMVELDQEYPPGTKVTLIGRQ⑶EYISMDEIAGRLETINYEVACTISSRVPRMFLENGSIMEVRNPLLQVNISN (SEQ ID NO 11).可以對其使用抑制劑的其他必需酶包含例如木糖異構(gòu)酶(xylA)、葡糖酸激酶 (EC 2. 7. 1. 12)、葡糖酸通透酶(gntK或gntP)、甘油激酶、甘油脫氫酶(例如glpP、glpF、 glpK或glpD)、阿拉伯糖異構(gòu)酶(araA)。在具體實施方案中，第二表達盒提供必需酶的顯著表達，由此若細胞中內(nèi)源必需酶的基因是野生型的(即未失活)，則必需酶以內(nèi)源必需酶水平的超過50% (例如至少約 70%、至少約90%、高達至少約100% )的水平產(chǎn)生。在某些實施方案中，由M區(qū)編碼的必需酶可以是天然存在的，由此其具有野生型 必需酶的氨基酸序列。在其他實施方案中，由M區(qū)編碼的必需酶可以是天然存在的酶的變 體，例如其可以具有與天然存在的必需酶至少約80 %相同、至少約90 %相同、至少約95 % 相同、至少約98%相同或至少約99%相同的氨基酸序列。在具體實施方案中，必需酶可以具有天然存在的氨基酸序列，且在某些實施方案 中，其可以是宿主細胞內(nèi)源的，由此其具有任意失活突變前的宿主細胞基因組編碼的氨基 酸序列。在具體實施方案中，表達盒的核苷酸序列(即啟動子、編碼序列和終止子)可以屬 于任意失活突變前的宿主細胞內(nèi)源基因。這種基因可以位于與表達盒的基因座不同的基因座。雖然不是實施本方法所需的，但是可以通過突變失活必需酶的內(nèi)源基因(即存在 于尚未包含A1-P-M-A2基因座的宿主細胞中的基因)。特異性失活細菌基因的方法(例如 通過缺失、置換或插入)為本領(lǐng)域公知。宿主細胞本文使用的細菌宿主細胞可以是革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌，并包含但不限 于芽孢桿菌屬物種細菌，例如克勞氏芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、 燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿 菌、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金 芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細菌；鏈霉菌屬物種細菌，例如變鉛青鏈霉菌、 (S. carbophilus)、淡蠟黃鏈霉菌(S. helvaticus)、銹赤鏈霉菌(S. rubiginosus)或鼠灰鏈 霉菌(S.murinus)細菌；假單胞菌屬物種(Pseudomonas sp.)細菌和大腸桿菌。在具體情 況下，細菌宿主細胞可以是具有GRAS資格的(即FDA認定的公認為安全的)用來進行蛋白 質(zhì)產(chǎn)生的歷史的菌株?？莶菅挎邨U菌宿主細胞包含但不限于描述于美國專利號5，264，366和 4, 760, 025 (RE 34, 606)中的枯草芽孢桿菌宿主細胞，以及 1A6 (ATCC39085)、168 (1A01)、 SB19、W23、Ts85、B637、PB1753 至 PB1758、PB3360、JH642、1A243 (ATCC 39，087)、ATCC 21332,ATCC 6051、MI113、DE100 (ATCC 39，094)、GX4931、PBT 110 禾口 PEP 211 菌株(見例如 Hoch 等，Genetics 197373 :215_228 ；美國專利號 4，450，235 ；美國專利號 4，302，544 ；和 EP 0134048)。例如Palva等和其他人也描述了枯草芽孢桿菌作為表達宿主的用途(見Palva 等，Gene 1982 19 :81_87 ；還見 Fahnestock 和 Fischer，J. Bacteriol. 1986 165 :796_804 ； 和 Wang 等，Genel988 69 :39_47)。在具體實施方案中，可以改造芽孢桿菌屬宿主細胞以最大化蛋白質(zhì)表達，因此， 芽孢桿菌屬宿主細胞可以在以下基因的至少一個中包含失活改變degU、degS、degR和 degQo 見 Msadek 等(J. Bacteriol. 1990 172 :824_834)和 Olmos 等(Mol. Gen. Genet. 1997 253:562-567)。一個菌株屬于枯草芽孢桿菌物種且攜帶degU32 (Hy)突變。在另一個實 施方案中，芽孢桿菌屬宿主細胞可以在scoC4(見Caldwell等，J. Bacteriol. 2001 183
167329-7340)、spoIIE (見 Arigoni 等，Mol. Microbiol. 1999 31 1407-1415)、oppA 或 opp 操 縱子中的其他基因(見Perego等，Mol. Microbiol. 1991 5:173-185)中包含突變或缺失?？梢酝ㄟ^將重組核酸插入細菌宿主細胞的基因組來產(chǎn)生用于本方法中的細菌細 胞。在具體實施方案中，可以使用類似于已建立的方法的方法，通過同源或非同源重組 來產(chǎn)生該細胞，該已建立的方法如Jung等(J. Gen. Appl. Microbiol. 1998 44 107-111)； Tangney 等(FEMS Microbio. Lett. 1995125 107-114) ；Petit 等(EMBO J.1992 11: 1317-1326)；美國專利5，733，753和已公開的美國專利申請20070134760中的方法。宿主細胞可以具有或不具有失活的編碼必需酶的內(nèi)源基因。蛋白質(zhì)產(chǎn)生方法提供使用上述細胞的方法。在某些實施方案中，本方法包括培養(yǎng)細胞群體以產(chǎn)生 由第一表達盒編碼的目的蛋白質(zhì)。在某些實施方案中和如上文所討論，目的蛋白質(zhì)可以分 泌進入培養(yǎng)基。本方法的具體實施方案包含從培養(yǎng)基回收目的蛋白質(zhì)的步驟?？梢酝ㄟ^任意方便的方法從生長培養(yǎng)基回收目的蛋白質(zhì)，例如通過沉淀、離心、親 和力、過濾或本領(lǐng)域已知的任意其他方法。例如，可以使用親和層析(Tilbeurgh等，(1984) FEBS Lett. 16 215)；離子交換層析方法(Goyal 等，(1991)Biores. Technol. 36 37 ；Fliess 等，(1983)Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17 :314 ;Bhikhabhai 等，(1984) J. Appl. Biochem. 6 336 ；禾口 Ellouz 等，(1987)Chromatography 396 307)，其包含使用具有高分 辨力的材料的離子交換(Medve等，(1998) J. Chromatography A808 153)；疏水作用層析 (Tomaz 禾口Queiroz，(1999) J. Chromatography A865 123)；兩相分配(Brumbauer 等，(1999) Bioseparation 7 287)；乙醇沉淀；反相HPLC ；二氧化硅或如DEAE的陽離子交換樹脂上的 層析；層析聚焦；SDS-PAGE ；硫酸銨沉淀；和使用例如S印hadex G-75的凝膠過濾。在具體 實施方案中，清潔劑添加劑蛋白質(zhì)可以在不從培養(yǎng)基的其他成分純化的情況下使用。在某 些實施方案中，可以簡單地濃縮培養(yǎng)基的成分，例如，然后在不進一步從生長培養(yǎng)基的其他 成分純化蛋白質(zhì)的情況下使用。在一些實施方案中，可以在分批或連續(xù)發(fā)酵條件下培養(yǎng)細胞。經(jīng)典的分批發(fā)酵法 使用封閉系統(tǒng)，其中在發(fā)酵運行開始之前配制培養(yǎng)基，用所希望的一種或多種生物接種培 養(yǎng)基，并在隨后未向培養(yǎng)基加入任意成分的條件下發(fā)生發(fā)酵。在某些情況下，可以在分批方 法的過程中改變生長培養(yǎng)基的PH和氧含量，而不改變碳源含量。分批系統(tǒng)的代謝產(chǎn)物和細 胞生物量不斷變化直至發(fā)酵終止時。在分批系統(tǒng)中，細胞通常從靜止的延遲期行進至高生 長對數(shù)期，并最終行進至其中生長速率降低或停止的穩(wěn)定期，若不處理，穩(wěn)定期中的細胞最 終死亡。概括地說，對數(shù)期中的細胞產(chǎn)生最多的蛋白質(zhì)?！把a料分批發(fā)酵”系統(tǒng)是標準分批系統(tǒng)的變異。在此系統(tǒng)中，只有當其在培養(yǎng)物中 的濃度降至閾值以下時，才加入營養(yǎng)物(例如碳源、氮源、鹽類、O2或其他營養(yǎng)物)。補料分 批系統(tǒng)在分解代謝物阻抑有抑制細胞代謝的傾向時和希望培養(yǎng)基中具有有限量的營養(yǎng)物 時有用。根據(jù)可測量因素(如PH、溶解氧和廢氣(如CO2)的分壓)的變化來估計補料分批 系統(tǒng)中實際營養(yǎng)物濃度的測量值。分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵是本領(lǐng)域常見和已知的。連續(xù)發(fā)酵是開放系統(tǒng)，其中不斷地往生物反應(yīng)器加入確定的培養(yǎng)基，同時移出等 量的條件培養(yǎng)基用于加工。連續(xù)發(fā)酵一般將培養(yǎng)物維持于恒定的高密度，其中細胞主要處 于對數(shù)期生長中。
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連續(xù)發(fā)酵允許影響細胞生長和/或終產(chǎn)物濃度的一個因素或任意數(shù)目的因素的 調(diào)節(jié)。例如，在一個實施方案中，將如碳源或氮源的限制性營養(yǎng)物維持于固定比例，允許調(diào) 節(jié)所有其他參數(shù)。在其他系統(tǒng)中，可以不斷改變影響生長的許多因素，同時保持通過培養(yǎng)基 濁度測量的細胞濃度恒定。連續(xù)系統(tǒng)力圖維持穩(wěn)態(tài)生長條件。因此，可以針對發(fā)酵中的細 胞生長速率來平衡培養(yǎng)基排出引起的細胞損失。已知調(diào)節(jié)連續(xù)發(fā)酵法的營養(yǎng)物和生長因素 的方法，以及用于最大化產(chǎn)物形成速率的技術(shù)。實驗提供以下實施例的目的在于舉例和進一步說明本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案和方 面，不解釋為限制其范圍。材料和方法用來操作DNA的實驗技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的標準技術(shù)(Sambrook等 Molecular cloning :A Laboratory Manual)。用 Qiagen 試齊[J盒(Qiagen Inc.)制備質(zhì)粒 和純化插入片段。限制性內(nèi)切酶和其他酶購自Roche Applied Science (Indianapolis, IN)，并按廠商所推薦使用。按 Ferrari Ε.和 B. Miller 所述(Bacillus expression a Gram-Positive Model. InGene Expression Systems :Using Nature for the Art of Expression. 1999. Academic Press, N. Y.)制備感受態(tài)枯草芽孢桿菌細胞。按照廠商的說明用Herculase酶(Stratagene)進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)包含 200nM的每種引物、1單位的Herculase和200μΜ的每種dNTP。按以下循環(huán)使用來自 Hybaid(Thermo)的 PxE Thermal Cycler :94°C變性 3 分鐘，然后 30 個循環(huán)的 94°C變性 30 秒、55°C退火30秒和72°C延伸1分鐘/Ikbp待擴增序列。然后在來自Invitrogen的0. 8% 瓊脂糖e-gel上分析PCR反應(yīng)。用Eppendorf Phase Lock Gel 管(Eppendorf)及其實驗流程制備基因組 DNA。D-丙氨酸、D-環(huán)絲氨酸和β -氯-D-丙氨酸獲自Sigma。枯草蛋白酶的測定枯草蛋白酶的測定如之前所述(Estell，D.V.，Graycar, T. P.，Wells, J. Α. (1985) J. Biol. Chem. 260,6518-6521)在含 1. 6mM N-琥珀酰-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-對硝基 苯胺(P-nitroanilide) (VegaBiochemicals)的 0. IM Tris 緩沖液，pH 8. 6 中進行。該測 定測量對硝基苯胺釋放引起的在410nm處的吸光度的增加。在初始速度條件下進行測定。 蛋白酶單位定義為25°C下在光程為Icm的比色杯中，使上述標準溶液在410nm處的吸光度 每分鐘增加1吸光度單位(AU)的蛋白酶的量。細菌菌株大腸桿菌(Escherichia coli)MM294 :endA thiA hsdR17 supE44?？莶菅挎邨U菌菌株BG2190(alr-)and BG2189 (alr-CmR)由 Ferrari 和 Yang (1985) (Isolation of an alanine racemase gene from Bacillus subtilisand its use for plasmid maintenance in B. subtil is. Biotechnology, 3,1003-1007 [1985])描述?？莶菅挎邨U菌菌株 BG3594 :nprE aprE spoIIE degU32 oppA?？莶菅挎邨U菌菌株BG3594comK 這是如WO 02/14490中所述的包含 xylR-PxylA-comK構(gòu)建體的枯草芽孢桿菌BG3594，該構(gòu)建體使此菌株可被制備為超級感受 態(tài)(即細胞群體的超過是可以用染色體芽孢桿菌屬DNA轉(zhuǎn)化的)。
枯草芽孢桿菌菌株CP3490 此菌株是其中air被敲減(與BG2190中相同的突變) 的枯草芽孢桿菌菌株BG3594comK。枯草芽孢桿菌菌株CP35491 此菌株是其中air被敲除(與BG2190中相同的突變) 的枯草芽孢桿菌菌株BG3594。枯草芽孢桿菌菌株MDT01-138 此菌株是具有以下結(jié)構(gòu)的可擴增盒的枯草芽孢桿 菌菌株BG3594 :aprE 5，-枯草蛋白酶FNA-氯霉素-aprE 5，。已將其擴增至Cm25。枯草芽孢桿菌菌株CP4010 此菌株是具有以下結(jié)構(gòu)的可擴增盒的枯草芽孢桿菌 菌株BG3594 comK:aprE 5’ -枯草蛋白酶FNA-alr-aprE 5’。已用β -氯-D-丙氨酸對其 進行了擴增?？莶菅挎邨U菌菌株CP4020 此菌株是具有以下結(jié)構(gòu)的可擴增盒的枯草芽孢桿菌 菌株BG3594 :aprE 5，-枯草蛋白酶FNA-alr-aprE 5，。已用β -氯-D-丙氨酸對其進行了 擴增。枯草芽孢桿菌菌株Hyperl 具有編碼枯草蛋白酶FNA且包含氯霉素標記的擴增
品.οCP3591 此菌株是在ορρΑ基因座中在aprE啟動子之后具有1拷貝枯草蛋白酶 FNA(即總計1拷貝枯草蛋白酶)的BG3594。CP3592 此菌株是在ybdL和ybdM基因之間在aprE啟動子之后具有額外的1拷貝 枯草蛋白酶FNA (即總計2拷貝枯草蛋白酶)的CP3591。CP3593 此菌株是在pps基因座中在aprE啟動子之后具有額外的1拷貝枯草蛋白 酶FNA(即總計3拷貝枯草蛋白酶)的CP3592。CP3594 此菌株是在nprE基因座中在aprE啟動子之后具有額外的1拷貝枯草蛋 白酶FNA(即總計4拷貝枯草蛋白酶)的CP3593。纖pDALsubl 已描述于 Ferrari 等 1985 中。此質(zhì)粒表達 air。(Ferrari 和 Yang， Biotechnology,3,1003-1007[1985])pBSFNACm(Seq ID NO :1)此質(zhì)粒是 pBluescript 的衍生物(Alting-Mees， Μ. Α.禾口Short,J. Μ· pBluescript II :gene mapping vectors. Nucleic Acids Res. 17(22), 9494 (1989))，其包含f I(IG)-噬菌體Π的整合區(qū)；r印(pMBl)-負責(zé)噬菌粒復(fù)制的pMBl復(fù) 制子；bla (ApR)-編碼賦予氨芐青霉素抗性的β -內(nèi)酰胺酶的基因；編碼β-半乳糖苷酶N 端片段的IacZ基因的5'端部分；包含aprE 5’區(qū)、編碼枯草蛋白酶(FNA)的基因、具有其 啟動子的來自PC194的氯霉素抗性基因、aprE 5’區(qū)的重復(fù)的多肽表達盒。此質(zhì)粒用于將 表達盒整合入5’ aprE區(qū)。pBSFNAalr (Seq ID NO 2)此質(zhì)粒是上述pBSFNACm的衍生物。在此質(zhì)粒中，具有 其自身啟動子的枯草芽孢桿菌air基因替換氯霉素抗性基因。此質(zhì)粒用于將表達盒整合入 5' aprE 區(qū)。培養(yǎng)基LB 禾Π LB 瓊脂如 Ausubel，EM.等(編輯)"Current Protocols inMolecular Biology”. John Wiley 和 Sons，1995 中所述。LBG 1 %是補充 lOg/L 葡萄糖的 LB。LBSM 是 補充1.6%脫脂乳的LB瓊脂。用來研究蛋白酶產(chǎn)生的FNII培養(yǎng)基描述于W005052146A2
19中。在LB瓊脂+100mg/L D-丙氨酸上繁殖Alr-菌株。適合時，將氯霉素、氨芐青霉素、環(huán)絲氨酸或β _氯-D-丙氨酸加至平板或培養(yǎng)液。定量 PCR(aPCR)在 ABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems, Foster City, CA)上進行定量編碼待產(chǎn)生的目的多肽(例如枯草蛋白酶)的基因拷貝數(shù)的qPCR。 按廠商(Applied Biosystems,Foster City,CA)的說明使用Taq]Man Gene Expression Master Mix 試劑盒。2M.在37°C和250轉(zhuǎn)/分下，于10ml管中將待測試菌株接種入5ml LBG%中。0D_ 為 1時，在250ml的Erlenmeyer搖瓶中用2. 5ml培養(yǎng)物接種25ml FNII培養(yǎng)基。在37°C 和250轉(zhuǎn)/分孵育搖瓶，并定期取出培養(yǎng)液樣品以測量枯草蛋白酶活性。實施例1枯草芽孢桿菌BG3594和BG3594、pDALsubl對β -氯-D-丙氨酸(CDA)的敏感件 閾倌的測定在第一個階段中，通過將LB中生長的菌株BG3594的稀釋液涂布在包含不同濃度 CDA的LB瓊脂平板上，測定抑制枯草芽孢桿菌生長必需的β-氯-D-丙氨酸(CDA)的濃度。 如表1中所示，雖然BG3594在20mg/L的濃度下仍然可以生長，但是在50mg/L的濃度下生 長完全被抑制。在第二個階段中，將PDalsubl轉(zhuǎn)化入BG3594，以測定air的過量表達是否 可以回復(fù)在CDA抑制濃度上生長。如表1中所示，air表達質(zhì)粒的存在允許在所測試的所 有CDA濃度上生長。此結(jié)果表明，只要發(fā)生擴增，包含染色體編碼的表達盒“目的多肽-air” 的菌株可以在高于20mg/L的CDA濃度上生長?？梢杂闷渌彼嵯敢种苿?如環(huán)絲 氨酸)代替CDA。表 1BG3594和BG3594、pDALsubl對LB瓊脂平板中濃度增加的β -氯-D-丙氨酸的抗
權(quán)利要求
擴增基因座的方法，其包括(a)將包含結(jié)構(gòu)為A1 P M A2的基因座的細菌宿主細胞的群體與必需酶的抑制劑接觸，其中A1和A2是同向重復(fù)，P包含目的蛋白質(zhì)的編碼序列，M包含所述必需酶的編碼序列；和(b)選擇對所述抑制劑具有抗性的細胞，其中對所述抑制劑具有抗性的細胞具有多個拷貝所述擴增單位。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細菌宿主細胞是芽孢桿菌屬物種細胞。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述必需酶是所述細胞內(nèi)源的野生型酶。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述細菌宿主細胞還包含編碼所述必需酶的失 活的基因，其中所述失活的基因是所述細胞內(nèi)源的且位于與所述結(jié)構(gòu)SA1-P-M-A2的基因 座不同的基因座。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中P包含表達盒。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中A1包含有效連接至P的編碼序列的啟動子。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述必需酶的所述編碼序列連接至所述編碼序 列內(nèi)源的啟動子。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述目的蛋白質(zhì)是枯草蛋白酶。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述必需酶是D-丙氨酸消旋酶。
10.權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中所述必需酶是D-丙氨酸消旋酶且所述抑制劑 是β-氯-D-丙氨酸。
11.細菌宿主細胞，其包含含有結(jié)構(gòu)為A1-P-M-A2的擴增單位的基因座，其中A1和A2是 同向重復(fù)，P包含目的蛋白質(zhì)的編碼序列，M包含必需酶的編碼序列。
12.細菌宿主細胞，其包含多個拷貝含有結(jié)構(gòu)SA1-P-M-A2的擴增單位的基因座，其中 A1和A2是同向重復(fù)，P包含用于目的蛋白質(zhì)的第一編碼序列，M包含用于必需酶的第二編碼 序列，其中所述第一編碼序列有效連接至存在于同向重復(fù)A1中的啟動子。
13.權(quán)利要求11或12的細菌宿主細胞，其中所述目的蛋白質(zhì)是枯草蛋白酶，且所述必 需酶是丙氨酸消旋酶。
14.權(quán)利要求11-13中任一項的細菌宿主細胞，其中所述擴增單位具有SEQID Ν0:7中 所示的序列。
15.細菌細胞培養(yǎng)物，其包含生長培養(yǎng)基；和權(quán)利要求11-14中任一項的細菌細胞的群體。
16.包括在適合產(chǎn)生所述目的蛋白質(zhì)的條件下維持權(quán)利要求15的細胞培養(yǎng)物的方法。
17.權(quán)利要求16的方法，其還包括從所述培養(yǎng)基回收所述目的蛋白質(zhì)。
全文摘要
此公開的某些方面涉及擴增基因座的方法。在某些實施方案中，該方法可以包括a)將細菌宿主細胞的群體與必需酶的抑制劑接觸，其中所述細菌宿主細胞包含結(jié)構(gòu)為A1-P-M-A2的基因座，其中A1和A2是同向重復(fù)，P包含多肽的編碼序列，M包含所述必需酶的編碼序列；和b)選擇對所述抑制劑具有抗性的細胞；其中對所述抑制劑具有抗性的細胞具有多個拷貝的擴增單位。
文檔編號C12P21/02GK101981193SQ200980111288
公開日2011年2月23日 申請日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者C·佩雷斯, E·費拉里 申請人:丹尼斯科美國公司