一種dna擴增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種DNA擴增方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著二代測序技術(shù)的快速發(fā)展，千人基因組計劃、癌癥基因組計劃等的相繼展開，基因組研究也日趨成熟。但是，由于二代測序文庫構(gòu)建本身的特點，文庫構(gòu)建時所需要的起始DNA量要在微克水平。隨著技術(shù)的不斷進步，現(xiàn)在有些商業(yè)試劑盒已經(jīng)能將文庫構(gòu)建起始所需的DNA降低到納克水平。如何對痕量DNA(小于1納克DNA甚至單細胞基因組DNA)進行有效的文庫構(gòu)建和測序成為一個關(guān)鍵的問題。如何有效、均衡的擴增痕量DNA，成為痕量DNA測序的最大障礙。
[0003]現(xiàn)在最常用的痕量DNA擴增方式，是通過多重鏈置換反應(yīng)(MDA)。但由于MDA擴增痕量DNA存在高度不均一性，這些擴增的偏好性導(dǎo)致了很難有效的組裝微生物基因組、識別哺乳細胞中的拷貝數(shù)變異，單堿基點突變等。Chitsaz，H等通過設(shè)計耐受偏好性的算法來有效利用具有偏好性的數(shù)據(jù)。Hutchison等通過減小MDA反應(yīng)的體積來減少MDA擴增產(chǎn)生的偏好性。Pan，X等通過海藻糖優(yōu)化MDA的反應(yīng)體系來增加MDA擴增的特異性。這些方法在一定程度上改進了痕量DNA擴增均衡性的問題，但是MDA擴增的均衡性仍然是痕量DNA擴增的最大挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中DNA測序存在的均衡性問題，本發(fā)明實施例提供一種DNA擴增方法。
[0005]本發(fā)明了涉及一種DNA擴增方法，該方法基于體外轉(zhuǎn)錄的方式，線性擴增痕量DNA，有效的保證了痕量DNA擴增的均衡性。
[0006]本發(fā)明的一個方面，涉及一種DNA擴增方法，該方法包括將T7啟動子序列添加到目標(biāo)DNA末端的步驟。
[0007]所述將T7啟動子序列添加到目標(biāo)DNA末端的步驟，可以是用Ez_Tn5轉(zhuǎn)座酶將末端帶有Τ7啟動子序列的接頭轉(zhuǎn)座插入到目標(biāo)DNA，也可以是通過末端帶有Τ7啟動子序列的隨機引物通過聚合反應(yīng)加入到目標(biāo)DNA。
[0008]所述DNA測序方法還包括，通過Τ7啟動子體外轉(zhuǎn)錄的方式均衡擴增含有Τ7啟動子序列的目標(biāo)DNA的步驟。
[0009]具體來講，所述DNA擴增方法可以包括如下步驟:
[0010]合成Εζ-Τη5轉(zhuǎn)座酶能識別的末端帶有Τ7啟動子序列的鑲嵌末端(MosaicEnd)及鑲嵌末端(不含T7啟動子序列)的互補序列，將兩條序列退火后與Ez-Tn5轉(zhuǎn)座酶組裝成為含Τ7啟動子序列的轉(zhuǎn)座子；
[0011]將上述轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座插入目標(biāo)DNA(小于1納克DNA甚至單細胞裂解后的基因組DNA)，加入核酸外切酶I (切割方向3’ ->5’ )消化多余的接頭和單鏈DNA ；
[0012]通過鏈置換酶、切口轉(zhuǎn)移酶或者填充缺口的酶補平已帶有T7啟動子的目標(biāo)DNA ；
[0013]加入能消化單鏈DNA的核酸外切酶(如:RecJf外切酶)進一步消化新產(chǎn)生的單鏈 DNA ；
[0014]加入T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄試劑，進行T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄。
[0015]所述DNA測序方法還可以是包括如下步驟的:
[0016]合成末端帶有隨機引物的T7啟動子序列，該序列比如可以是SEQ ID No:2所示的序列:5’ -AATTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN-3’ )；
[0017]采用具有鏈置換活性的酶(如phi29DNA polymerase)與單鏈模板恒溫反應(yīng)，或者采用無鏈置換活性的DNA聚合酶通過PCR的方式反應(yīng)，形成末端帶T7啟動子序列的DNA片段；
[0018]加入能消化單鏈DNA的核酸外切酶，消化反應(yīng)中剩余的接頭等單鏈DNA ；
[0019]加入T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄試劑，進行T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄。
[0020]上述方法，可以在同一反應(yīng)管中完成，中間不需任何純化。反應(yīng)得到的RNA可進一步進行RNA測序文庫構(gòu)建、反轉(zhuǎn)錄為cDNA等用于測序、芯片雜交、PCR、定量PCR等實驗。
[0021]本發(fā)明提供的DNA擴增方法至少實現(xiàn)了如下有益效果:
[0022]可以基于痕量DNA，小于1納克DNA甚至單細胞基因組DNA進行擴增。
[0023]末端含有T7啟動子序列的目標(biāo)DNA實現(xiàn)了相對均勻的擴增。
[0024]本發(fā)明通過Ez_Tn5轉(zhuǎn)座酶將末端帶有Τ7啟動子序列的接頭轉(zhuǎn)座插入到目標(biāo)DNA上或者通過末端帶有17核心序列的隨機引物(6?10bp)通過聚合反應(yīng)加入到目標(biāo)DNA上，有效提高了將帶T7啟動子序列的接頭連接在DNA末端的效率，帶T7啟動子序列的目標(biāo)DNA利用T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄試劑盒可有效進行體外轉(zhuǎn)錄。T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄以一條DNA鏈為模板，T7的啟動子序列為啟動子，進行轉(zhuǎn)錄。同一條DNA模板鏈轉(zhuǎn)錄出來的RNA之間是相互獨立的，轉(zhuǎn)錄的過程是線性的，因此擴增的偏好性是遠小于指數(shù)擴增的，擴增后的DNA相對是均衡的。
[0025]可有效去除擴增過程產(chǎn)生的錯誤(如點突變，小的插入缺失等)。
[0026]本發(fā)明采用體外轉(zhuǎn)錄的方式擴增痕量的DNA，同一條DNA模板鏈轉(zhuǎn)錄出來的RNA之間是相互獨立的，轉(zhuǎn)錄的過程是線性的。如果轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的某條RNA的某個位置隨機發(fā)生了錯誤(如點突變，小的插入缺失等)，而同一模板轉(zhuǎn)錄出來其他RNA只有極小的概率會發(fā)生相同的錯誤，所以產(chǎn)出的轉(zhuǎn)錄錯誤不會激增。由于錯誤發(fā)生的概率極低，且一旦發(fā)生錯誤，錯誤不會累積，那么這種錯誤就可以在分析中被有效去除。
[0027]整個反應(yīng)可以在同一反應(yīng)管中進行，有效避免了各個步驟間的純化，提高了模板的有效利用率。
[0028]本發(fā)明所述的擴增方法，通過反應(yīng)緩沖液的有效選擇，使整個反應(yīng)在從轉(zhuǎn)座子插入到體外轉(zhuǎn)錄完成均在同一反應(yīng)管中完成，避免了各個步驟間的純化，有效地提高了模板的利用率，減少了實驗的復(fù)雜性。
【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發(fā)明的限定。
[0030]發(fā)明概述
[0031]多重鏈置換擴增，是一種恒溫的DNA擴增方法，利用phi29DNA聚合酶的鏈置換活性，實現(xiàn)DNA的大量擴增。采用單鏈DNA為模板，利用特定的引物或者隨機引物，在鏈置換酶的作用下，實現(xiàn)對環(huán)狀DNA模板的大量擴增。當(dāng)隨機引物與單鏈DNA結(jié)合后，phi29DNA聚合酶以引物為起始進行第二條鏈的合成，當(dāng)合成到另一個引物的起始位置時，phi29DNA聚合酶通過其鏈置換活性將引物所在的鏈打開，新的合成繼續(xù)進行下去。新合成的DNA單鏈又同時會與新的六隨機引物結(jié)合，進行新一輪的合成。循環(huán)往復(fù)，從而實現(xiàn)了對環(huán)狀DNA分子的有效擴增。
[0032]T7啟動子序列，序列為TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID No:1)，可以控制其下游的基因表達。
[0033]本發(fā)明的創(chuàng)新點之一在于通過轉(zhuǎn)座子或者隨機引物將體外轉(zhuǎn)錄的接頭加入到目標(biāo)DNA末端，通過體外轉(zhuǎn)錄的方式均衡的擴增痕量DNA。具體來講可通過以下方案實現(xiàn):
[0034]一、基于轉(zhuǎn)座子的方式將T7啟動子序列加入到目標(biāo)DNA末端。
[0035]帶T7啟動子序列的Ez_Tn5轉(zhuǎn)座子組裝:首先合成Εζ_Τη5轉(zhuǎn)座酶能識別的末端帶有Τ7啟動子序列的鑲嵌末端(Mosaic End)及鑲嵌末端(不含T7啟動子序列)的互補序列，將兩條序列退火后與Ez-Tn5轉(zhuǎn)座酶組裝成為含Τ7啟動子序列的轉(zhuǎn)座子。
[0036]將上述轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座插入痕量DNA(小于1納克DNA甚至單細胞裂解后的基因組DNA)，加入核酸外切酶I (切割方向3’到5’ )消化多余的接頭和單鏈DNA。
[0037]通過鏈置換酶、切口轉(zhuǎn)移酶或者填充缺口的酶補平已帶有Τ7啟動子序列的目標(biāo)DNA。
[0038]加入能消化單鏈DNA的核酸外切酶(如:RecJf外切酶)進一步消化新產(chǎn)生的單鏈 DNA。
[0039]加入T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄試劑(該試劑必須能在上述緩沖液中正常反應(yīng))，進行T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄時間根據(jù)起始DNA量的多少來控制，一般1?48小時。
[0040]二、基于隨機引物的方式將T7啟動子序列加入到目標(biāo)DNA末端。
[0041]合成末端帶有隨機引物的T7啟動子序列，該序列比如可以是SEQ ID No2所示的序列:5’ -AATTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN-3’)，其中序列末端最后兩個堿基可用硫代磷酸修飾。
[0042]采用具有鏈置換活性的酶(如phi29DNA polymerase)與單鏈模板恒溫反應(yīng)lOmin?2h或者采用無鏈置換活性的DNA聚合酶通過PCR的方式反應(yīng)2?20個循環(huán)，形成末端帶T7啟動子序列的DNA片段。
[0043]加入能消化單鏈DNA的核酸外切酶消化反應(yīng)中剩余的接頭等單鏈DNA。
[0044]加入T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄試劑(該試劑必須能在上述緩沖液中正常反應(yīng))，進行T7啟動子體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄時間根據(jù)起始DNA量的多少來控制，一般1?48小時。
[0045]實施實例1
[0046]應(yīng)用本發(fā)明方法1 (基于轉(zhuǎn)座子的方法)，擴增5皮克(pg)DNA
[0047]1，開始前準備:
[0048]引物合成:轉(zhuǎn)座子鑲嵌末端及鑲嵌末端互補序列
[0049]STT_Metl(SEQ ID No:3):
[0050]5’ -AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3，
[0051]STT_Met2(SEQ ID No:4):5， -pCTGTCTCTTATACACATCT-3，
[0052]退火形成含T7啟動子序列的雙鏈序列:STT_ME(10pmol/ul):
[0053]STT_ME 由 lOOpmol 的 STT_Metl (退火緩沖液溶解:10mM Tris-HCl (ρΗ7.5)，ImMEDTA，0.1mM NaCl)和 lOOpmol 的 STT_Met2 (退火緩沖液溶解:lOmM Tris-HCl (pH 7.5)，ImM EDTA,0.1mM NaCl)等體積混合退火(94°C 5min,以每秒(λ 1°C逐漸降溫至25°C )而成。STT_ME (50pmol/ul)用水稀釋至 10pmol/ul。
[0054]2，實驗步驟:
[0055]含T7啟動子序列的轉(zhuǎn)座子組裝:
[0056]STT_ME(10pmol/ul):0.5ul
[0057]甘油:2ul
[0058]EZ-Tn5transposase:lul(EZ-Tn5TM〈KAN_2>Insert1n Kitepicentre: Catalog#:EZI982K)
[0059]H20:l.5ul
[0060]Total:5ul
[0061]25 °C 20min
[0062]上述轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座插入基因組DNA
[0063]上述轉(zhuǎn)座子:5ul
[0064]5xLMff buffer(50mM Tris-OAc pH 8.0, 25mM Mg(OAc)2):2ul
[0065]DNA(5pg):3ul
[0066]Total:10ul
[0067]55 °C 20min 80 °C 5min,立即置于冰上。
[0068]Exo I 消化。(Exonuclease I (E.coli)NEB:Catalog#:M0293)
[0069]NEB buffer 4:1.2ul
[0070]Exo 1:0.5ul
[0071]37°C 30min 80°C 5min,立即置于冰上，完全冷卻后加入:
[0072]Exo 1:0.5ul
[0073]37°C 30min 80°C 5min,立即置于冰上，完全冷卻后加入:
[0074]Exo 1:0.5ul
[0075]37 °C 30min 80 °C 20min.
[0076]Total: 12.