白色念珠菌快速培養(yǎng)并顯色的培養(yǎng)基及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)領(lǐng)域，特別是醫(yī)學(xué)微生物標本、藥品及醫(yī)療器械衛(wèi)生檢驗 樣品、公共衛(wèi)生監(jiān)測樣品和食品（包括化妝品）衛(wèi)生檢驗樣品中白色念珠菌的培養(yǎng)和鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] 念珠菌是一種腐物寄生菌，廣泛存在于自然界。是人體正常菌群之一，平時主要生 存于人體的口腔、皮膚、粘膜、消化道、陰道及其他臟器中。正常人群白色的帶菌率可高達 40% ;從陰道粘膜分離出來的念珠菌85%~90%為白色，而白色念珠菌(Candidaalbican) 的致病性最強。白色念珠菌（簡稱白念，Candidaalbicans，CA)、熱帶假絲酵母菌（簡稱熱 帶，Candidatropicalis，CT)和光滑假絲酵母菌（簡稱光滑，Candidaglabrata，CG)是其中 的主要致病菌，其分布廣泛，感染類型多祥，已成為臨床抗感染治療的難點。
[0003]雖然目前PCR快速檢測技術(shù)具有較好的準確性，但是由于PCR檢測需要對儀器和設(shè) 備有較高的要求，采購成本也高，并不適合大面積的推廣。而目前對念珠菌的檢測以傳統(tǒng)方 法為主，采取分離培養(yǎng)、鏡檢觀察、生化鑒定等多個步驟，檢測周期長，整個過程大約4-7天。
[0004]利用酶活性測定鑒別細菌是診斷微生物的一種有效手段，但過去由于底物種類較 少、受PH影響較大、不穩(wěn)定等缺點限制了這一技術(shù)的發(fā)展。隨著對致病菌研究的深入，陸續(xù) 發(fā)現(xiàn)了更多反映細菌屬性的'特異性酶;通過化學(xué)合成技術(shù)合成的一系列新型酶底物，為這 一技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，因此，基于傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)理論，將人工合成的酶底物與支持細菌 生長的多種營養(yǎng)物質(zhì)相結(jié)合，開發(fā)出了顯色培養(yǎng)基，使細菌在分離的同時得到有效鑒別，操 作簡便，大大提高了工作效率。
[0005] 在分離與鑒別念珠菌屬細菌的培養(yǎng)基方面，加拿大專利CA2634325描述了利用甜 土豆浸粉、酵母浸粉為培養(yǎng)基基礎(chǔ)的主要原料，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加顯色劑和熒光底物，通 過觀察菌落色澤（藍色、黃色和白色）以及菌落是否產(chǎn)生熒光將念珠菌幾個主要種區(qū)分開 來，但一方面熒光不能通過肉眼直接觀察，不太便利，另一方面淺黃色和乳白色不易分辨， 這會導(dǎo)致在結(jié)果判斷上出現(xiàn)偏差。日本專利JP2003310298,描述了一種通過5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷(X-gluc)底物將白色念珠菌和熱帶念珠菌與其它真菌區(qū)分開來的 方法，但不能鑒別該屬的其他種。
[0006]因此，本領(lǐng)域需要一種高效、快速、低廉、操作簡便的方法，進行念珠菌的檢測，特 別是致病性較強的白色念珠菌的特異性快速培養(yǎng)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于，提供一種選擇性高、檢測周期短、成本低、可操作性強，適用于 白色念珠菌的分離與鑒別。
[0008]本發(fā)明的另一個目的在于，提供快速、簡便、高效地檢測樣本中念珠菌的方法。
[0009]本發(fā)明的還一個目的在于，提供本發(fā)明的白色念珠菌顯色培養(yǎng)基或白色念珠菌檢 測試劑盒在制備用于檢測白色念珠菌的診斷劑中的應(yīng)用。
[0010] 針對上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0011] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種白色念珠菌顯色培養(yǎng)基，其由如下組分組 成：
[0012]酵母粉20g，蛋白胨15g，氯化鋰lg，多粘菌素B0.5g，葡萄糖5g，4-甲基傘形酮-D-葡萄糖苷0.2g，5溴-6氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷0.lg，碳酸鈉3.8g，瓊脂20g，氯霉素0.5g，甘 氨酸0.5g，谷胱甘肽2g，硫酸鋅4g，pH6.0，超純水補足至1000ml。
[0013]另一方面，本發(fā)明提供檢測白色念珠菌的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的白色 念珠菌顯色培養(yǎng)基或檢測試劑盒。
[0014] 本發(fā)明的方法可以用于所有領(lǐng)域，包括醫(yī)學(xué)微生物標本、藥品及醫(yī)療器械衛(wèi)生檢 驗樣品、公共衛(wèi)生監(jiān)測樣品和食品（包括化妝品）衛(wèi)生檢驗樣品中白色念珠菌的檢測和鑒 定。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法用于工業(yè)制品中的念珠菌的檢測。
[0015]具體實施
[0016] 方式
[0017]實施例！.培養(yǎng)基配制
[0018]按酵母粉20g，蛋白胨15g，氯化鋰lg，多粘菌素B0.5g，葡萄糖5g，4-甲基傘形酮-D-葡萄糖苷0.2g，5溴-6氯-3吲哚-β-D-葡萄糖苷0.lg，碳酸鈉3.8g，瓊脂20g，氯霉素0.5g， 甘氨酸〇.5g，谷胱甘肽2g，硫酸鋅4g的配方稱取各組分，定容至1000mL，配制成培養(yǎng)基，滅 囷，倒平板，備用。
[0019]實施例2白色念珠菌培養(yǎng)實驗 [0020] 1.接種
[0021 ] 將白色念珠菌ATCC10231、熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌、光滑念珠菌、大腸桿菌接種 于酵母肉湯，30°C培養(yǎng)48h，然后用接種環(huán)取一環(huán)劃線接種于顯色培養(yǎng)基上，翻轉(zhuǎn)平板于30 °C培養(yǎng)24h。
[0022] 1.結(jié)果
[0023] 2.

[0026]實施例3:本發(fā)明所述的白色念珠菌顯色培養(yǎng)基與現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基的靈敏度比 較試驗
[0027] 1.本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基平板制備:按照實施例1的方法制備。
[0028] 2.對照培養(yǎng)基平板制備
[0029] (I)沙保羅培養(yǎng)基(美國BD公司，貨號:210950，以下簡稱SDA)
[0030]稱取47g干粉(BD公司產(chǎn)品，編號：210950，酪胨5.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖20.0g，瓊 月旨17.0g)，加入1000mL蒸懼水，121°C高壓15min，冷卻至50°C，倒平板，備用。
[0031 ] (2)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基(〇?0]\^8&1'0&11(1丨(1&培養(yǎng)基，來自法國13；[0]\161'丨61^，以下簡 稱CHR)
[0032] 在可配制1000mL的干粉（蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，混合顯色劑2.0g，氯霉素 〇.5g，瓊脂15.0g)中加1000mL蒸懼水，煮沸2min，冷卻至50°C，倒平板，備用。
[0033] (3)念珠菌顯色培養(yǎng)基:取酵母粉3.0g、麥芽浸粉3.0g，蛋白胨5.0g、葡萄糖20.0g， 瓊脂15g、氯霉素0.05g、混合顯色底物2.0g、甘氨酸1.OgdjClOOOmL,加熱融化后，調(diào)整pH為 6.4，煮沸2min，冷卻至50°C，倒平板，備用。
[0034] 3.接種
[0035]將白色念珠菌ATCC10231接種于酵母肉湯，35°C培養(yǎng)24_48h，然后取少量培養(yǎng)液制 成1〇2菌懸液，然后進行10倍梯度稀釋，取菌液O.lmL分別涂布于本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基平板 以及以上制備的現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基平板上，翻轉(zhuǎn)平板于35°C培養(yǎng)24h，同時做另外一組，分 別在于30°C培養(yǎng)24h。
[0036]4.結(jié)果分析
[0037]
[0038]由此可以看出，本申請的培養(yǎng)基具有特異性的鑒定白色念珠菌的能力，白色念珠 菌在該培養(yǎng)基上具有較快的生長速度，并且能夠通過顏色快速的鑒定。
[0039]實施例4:本發(fā)明所述的白色念珠菌顯色培養(yǎng)基與現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基的準確性試 驗
[0040]將實施例3中培養(yǎng)出的單菌落，采用菌落PCR的方法，直接進行PCR鑒定，堅定40個 但菌落（具體方法參見熊延婧等，J of Wannan Medical college, 2011,30(5)所述的方 法），鑒定結(jié)果如下：
[0041]本申請培養(yǎng)基:40個結(jié)果都是陽性，準確率100% ;
[0042]沙保羅培養(yǎng)基:38個為陽性，準確率95% ;
[0043]科瑪嘉:38個為陽性，準確率95%;
[0044]念珠菌顯色培養(yǎng)基:37個為陽性，92.5%。
[0045]由此說明，本發(fā)明的培養(yǎng)基具有較好的特異性，可以實現(xiàn)特異性的分別鑒定白色 念珠菌。
【主權(quán)項】
1. 一種白色念珠菌快速培養(yǎng)并顯色的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基包含以下成份： 酵母粉20g，蛋白胨15g，氯化鋰lg，多粘菌素B0.5g，葡萄糖5g，4-甲基傘形酮-D-葡萄糖苷 〇.28,5溴-6氯-3吲噪-0-〇-葡萄糖苷〇.]^，碳酸鈉3.88，瓊脂2(^，氯霉素〇.58，甘氨酸〇.5區(qū)， 谷胱甘肽2g，硫酸鋅4g，pH6.0，超純水補足至1000ml。2. 白色念珠菌檢測試劑盒，其包含權(quán)利要求1所述的白色念珠菌快速培養(yǎng)并顯色培養(yǎng) 基。3. -種檢測念珠菌的方法，所述方法使用權(quán)利要求1或2所述的白色念珠菌快速培養(yǎng)并 顯色培養(yǎng)基或權(quán)利要求2所述的白色念珠菌檢測試劑盒。4. 如權(quán)利要求4所述的方法，所述方法用于藥品、食品和化妝品的檢測。
【專利摘要】本發(fā)明涉及白色念珠菌快速培養(yǎng)并顯色的培養(yǎng)基、檢測試劑盒及檢測方法，屬于微生物培養(yǎng)領(lǐng)域。本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基由能夠快速培養(yǎng)白色念珠菌的各個組分構(gòu)成，這些特定的組分構(gòu)成的顯色特性培養(yǎng)基能夠快速鑒定白色念珠菌。為醫(yī)學(xué)診斷提供了快速便捷的診斷途徑。本發(fā)明所述的白色念珠菌快速培養(yǎng)并顯色的培養(yǎng)基成本低、配置簡單，所述方法能夠快速、簡便、準確地用于白色念珠菌的分離和鑒定。
【IPC分類】C12R1/725, C12Q1/04
【公開號】CN105463056
【申請?zhí)枴緾N201610040807
【發(fā)明人】郎紅娟, 姜雪, 汪定成, 戈偉
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2016年1月21日