專利名稱：副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基、檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文涉及一種微生物顯色培養(yǎng)基、檢測試劑盒及檢測方法，尤其涉及副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基、檢測試劑盒及檢測方法，屬于食品微生物安全監(jiān)測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
“民以食為天”，食品是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，食品安全是關(guān)系人類健康和社會發(fā)展的重大問題。近年來，國內(nèi)外食品安全的惡性事件不斷發(fā)生，尤其以沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌等引起的食源性疾病最為突出。據(jù)統(tǒng)計，發(fā)達國家每年約有1/3的人患食源性疾病，美國每年約有7600萬例食源性疾病患者，食源性疾病已成為國內(nèi)外普遍關(guān)心的問題。
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，簡稱VP)是人類常見的重要食源性致病菌之一，廣泛存在于世界各國的沿海地區(qū)，是一種嗜鹽性細菌。消費者多因食用了污染此菌的海產(chǎn)品如魚、蝦、貝、蟹等引起食物中毒。由副溶血性弧菌引起的食物中毒在細菌性食物中毒中占的比例非常高，僅次于大腸桿菌、沙門氏菌和葡萄球菌。我國沿海地區(qū)每年都有副溶血性弧菌食物中毒的報道，中毒癥狀有腹瀉、水樣便、腹部痙攣、惡心、嘔吐等，給人類健康造成很大威脅，同時也給我國的經(jīng)濟和對外貿(mào)易帶來很大的負面影響。
為有效控制病原的發(fā)生和擴散，準確及時的檢測手段是預防和控制副溶血性弧菌傳播的關(guān)鍵。目前，副溶血性弧菌的檢測方法很多，傳統(tǒng)的檢測方法需要分離培養(yǎng)、鏡檢觀察、生化鑒定、嗜鹽性試驗等多個步驟，檢測周期長，整個過程大約4-7d，且操作復雜，已不能滿足食品中致病菌快速檢測的現(xiàn)實需要，而且當有溶藻弧菌、霍亂弧菌等其他雜菌存在時會影響副溶血性弧菌在傳統(tǒng)硫代硫酸鈉-檸檬酸鈉-膽鹽-蔗糖瓊脂(TCBS)平板上檢出。近年來，聚合酶鏈反應(PCR)、免疫學等方法的應用，使副溶血性弧菌的快速檢測有了很大發(fā)展。但是這些技術(shù)也存在一定缺陷，如技術(shù)要求較高，設(shè)備操作復雜，需要專業(yè)的技術(shù)人員進行操作，以及檢測費用昂貴等。PCR方法需要先進行細菌富集，不能區(qū)分活菌和死菌，容易產(chǎn)生假陽性；免疫學方法還需要制備高純度的抗體，因此這些技術(shù)很難滿足企業(yè)和政府監(jiān)管部門對大批食品樣本檢測需要。
目前法國科瑪嘉公司已開發(fā)出副溶血性弧菌的顯色培養(yǎng)基，但是價格昂貴，配套產(chǎn)品和試劑需要進口，檢測成本很高，因此，國內(nèi)一些基層檢測機構(gòu)很少采用。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種選擇性高、檢測周期短、成本低、可操作性強，適用于處理大通量樣本的副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基、檢測試劑盒及檢測方法。
所述的副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基，其配方為蛋白胨10～15g、酵母粉3～5g、NaCl 9～11g、蔗糖類18～20g、單糖0.11～0.13g、檸檬酸鈉9～11g、硫代硫酸鈉9～11g、膽鹽5～8g、混合顯色底物Y-glucoside 0.05～0.95g、瓊脂12～15g、NaCO31～1.5g。
上述顯色培養(yǎng)基優(yōu)選的配方為蛋白胨15g、酵母粉3g、NaCl 10g、蔗糖類20g、單糖0.11g、檸檬酸鈉10g、硫代硫酸鈉10g、膽鹽8g、混合顯色底物Y-glucoside 0.35g、瓊脂12g、NaCO31g。
所述的副溶血性弧菌檢測試劑盒，其組成為上述副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基、增菌液A和B。
其中，增菌液A為滅菌處理的胰酪胨液體培養(yǎng)基(TSB)；
增菌液B為高壓滅菌的氯化鈉多粘菌素B肉湯(3.5％NaCL PolyB)。
所述的副溶血性弧菌檢測方法，其具體步驟為(1)制備顯色平板每1000mL水中加入77～98g顯色培養(yǎng)基干粉，混合均勻后煮沸1～2min，待冷至40～50℃，倒平板，備用；(2)一步增菌(非選擇性增菌)將樣品置于增菌液A中，混合均勻后37℃培養(yǎng)6～8h；(3)二步增菌(選擇性增菌)取一步增菌液1mL加入到9mL增菌液B中，混合均勻后37℃培養(yǎng)15～17h；(4)接種培養(yǎng)將二步增菌液接種顯色平板上，37℃培養(yǎng)18～24h；(5)結(jié)果分析若顯色平板上出現(xiàn)光滑、略凸起、直徑2-3mm、邊緣整齊的紫色菌落，說明該樣品存在副溶血性弧菌。
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，從生物化學的角度出發(fā)，利用細菌特異性酶對其進行快速檢測。首先，在分析副溶血性弧菌特異性生化反應的基礎(chǔ)上，篩選出細菌特異性酶，然后通過在分離培養(yǎng)基上加入細菌特異性酶的顯色底物，研制出顯色培養(yǎng)基，直接根據(jù)菌落顏色就可對菌株作出鑒定，同時結(jié)合高效的樣本前處理技術(shù)，建立特異性顯色生化檢測方法，并開發(fā)配套的試劑盒，用于副溶血性弧菌的快速診斷和監(jiān)控，可大大節(jié)省檢測成本和時間，具有更廣泛的應用前景。
本發(fā)明通過篩選副溶血性弧菌特異性酶及顯色底物，開發(fā)了副溶血性弧菌的顯色培養(yǎng)基，克服了已有顯色培養(yǎng)基價格昂貴和傳統(tǒng)培養(yǎng)基選擇性差等缺點；并通過對比各種標準方法的樣本處理技術(shù)，建立了一套系統(tǒng)的副溶血性弧菌顯色生化快速檢測方法，提高了檢測效率；所建立的副溶血性弧菌顯色生化快速檢測方法和試劑盒，可對食品和環(huán)境中副溶血性弧菌進行全面、系統(tǒng)、準確的檢測和鑒定，為微生物快速檢測提供了新的途徑。
本發(fā)明所述的試劑盒配置簡單，檢測方法檢測靈敏高，周期短、可操作性強、適用于處理大通量的樣本、易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，可以廣泛推廣應用到食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。
具體實施方式實施例1本發(fā)明所述的副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基特異性的驗證1、副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基的配制取蛋白胨15g、酵母粉3g、NaCl 10g、蔗糖類20g、單糖0.11g、檸檬酸鈉10g、硫代硫酸鈉10g、膽鹽8g、混合顯色底物Y-glucoside(美國sigma公司)0.35g、瓊脂12g、NaCO3 1g、水1000mL，混合后加熱至瓊脂完全溶解，煮沸1～2min，調(diào)pH 8.6±0.2，待冷卻至40～50℃，倒平板，備用。
2、接種將副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、霍亂弧菌(Vibriocholera)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)、擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)在3.5％NaCl營養(yǎng)瓊脂，大腸桿菌(Eschetichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)在營養(yǎng)瓊脂，單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)在腦心浸液瓊脂復蘇24h后，分別劃線接種上述顯色培養(yǎng)基平板，36℃培養(yǎng)18～24h。
3、結(jié)果及分析在副溶血性弧菌的顯色平板上，出現(xiàn)紫色菌落；霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌的顯色平板上均出現(xiàn)藍綠色菌落，溶藻弧菌的顯色平板上出現(xiàn)白色菌落，大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌的顯色平板上均無生長現(xiàn)象，說明顯色培養(yǎng)基對副溶血性弧菌具有較高的特異性。
實施例2本發(fā)明所述的副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基靈敏度及特異性的驗證
1、副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基的配制取蛋白胨15g、酵母粉3g、NaCl 10g、蔗糖類20g、單糖0.11g、檸檬酸鈉10g、硫代硫酸鈉10g、膽鹽8g、混合顯色底物Y-glucoside(美國sigma公司)0.35g、瓊脂12g、NaCO3 1g、水1000mL，混合后加熱至瓊脂完全溶解，煮沸1～2min，調(diào)pH 8.6±0.2，待冷卻至40～50℃，倒平板，備用。
2、接種將副溶血性弧菌在3.5％NaCl營養(yǎng)瓊脂中復蘇24h后，接種環(huán)挑取1環(huán)，加入到10mL 0.85％生理鹽水中配成原液，然后進行10倍梯度稀釋，取10-4-10-6濃度菌液各1mL，分別涂布上述顯色培養(yǎng)基平板、傳統(tǒng)的TCBS平板及科瑪嘉公司生產(chǎn)的副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)18～24h。
將副溶血性弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌混合，進行梯度稀釋，取104-105cfu/mL混合菌液，分別涂布步驟1制備的顯色培養(yǎng)基平板，觀察。
3、結(jié)果及分析純菌液涂布各平板結(jié)果如表1，對30-300之間的菌落數(shù)進行方差分析，表明本發(fā)明所述的副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基與傳統(tǒng)的TCBS平板、科瑪嘉公司生產(chǎn)的副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基的副溶血性弧菌檢出率沒有顯著差異(P＞0.05)，三種培養(yǎng)基可以達到相同的檢測限。
表1副溶血性弧菌在各培養(yǎng)基上的菌落數(shù)(均值±Sd)
混合菌液涂布平板上，副溶血性弧菌仍呈特殊的紫色菌落，其他弧菌呈現(xiàn)藍色或白色菌落。表明其他弧菌基本不影響副溶血性弧菌的檢測，顯色培養(yǎng)基對副溶血性弧菌的特異性高。
實施例3本發(fā)明所述的副溶血性弧菌檢測方法與國家標準檢測法(簡稱國標法)的比較從市場采集大量海產(chǎn)品、淡水魚等，分別采用國標法(GB/T4789.7-2003，食品衛(wèi)生微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗)和本發(fā)明所述的檢測方法對副溶血性弧菌進行檢測，檢測陽性樣本用法國梅里埃細菌鑒定系統(tǒng)-API試劑條進行驗證，比較兩種檢測方法的靈敏度。
(1)國標法樣本—氯化鈉多粘菌素B肉湯(或氯化鈉結(jié)晶紫)增菌24h--劃線接種TCBS平板—藍綠色菌落--生化鑒定。
(2)本發(fā)明所述的檢測法樣本—含3.5％NaCl的TSB肉湯前增菌6h-氯化鈉多粘菌素B肉湯選擇性增菌16h—劃線接種本發(fā)明所述的顯色培養(yǎng)基—直接觀察有無紫色菌落。
通過325份市場和超市海產(chǎn)品、淡水魚類等代表性食品中副溶血性弧菌的國標法和本發(fā)明所述的檢測方法，結(jié)果如表2，說明用本發(fā)明所述的副溶血性弧菌檢測方法比國標法具有更高的檢出率，且檢測時間更短。
實施例4魚肉中副溶血性弧菌檢測的模擬試驗
1、制備顯色平板稱取89.36g顯色培養(yǎng)基干粉，加入1000mL水，煮沸1～2min，待冷至40～50℃，倒平板，備用。
2、一步增菌稱取25g魚肉樣品，將1～10cfu副溶血性弧菌加入25g樣品中，模擬實際樣品混合2h，無菌操作將樣品放到盛有225mL TSB增菌液的三角瓶，37℃一步增菌(非選擇性增菌)培養(yǎng)6h。
3、二步增菌取1mL樣品一步增菌液加入到9mL氯化鈉多粘菌素B肉湯中進行二步增菌，37℃培養(yǎng)16h。
4、接種培養(yǎng)取1環(huán)二步增菌液，劃線接種顯色培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察記錄菌落大小、顏色和形態(tài)。
5、結(jié)果觀察和分析顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)光滑、略凸起、直徑2-3mm、邊緣整齊的紫色菌落。檢測過程中，一步增菌需6h，二步增菌16h，顯色平板培養(yǎng)18～24h，陽性結(jié)果時間最長需46h。檢測檢測靈敏度可以達到1～10cfu。
實施例5貝類中副溶血性弧菌的檢測1、制備顯色平板稱取89.36g顯色培養(yǎng)基干粉，加入1000mL水，煮沸1～2min，待冷至40～50℃，倒平板，備用。
2、一步增菌在無菌條件下，稱取25g貝肉，剪碎，加入到盛有225mL TSB增菌液的三角瓶中，37℃一步增菌(非選擇性增菌)培養(yǎng)6h。
3、二步增菌取1mL樣品一步增菌液加入到9mL氯化鈉多粘菌素B肉湯中進行二步增菌(選擇性增菌)，37℃培養(yǎng)16h。
4、接種培養(yǎng)接種環(huán)取1環(huán)二步增菌液，劃線接種顯色培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18-24h，觀察記錄菌落顏色和形態(tài)。以副溶血性弧菌標準菌株劃線接種顯色培養(yǎng)基作對照，對比分析檢測結(jié)果。
4、結(jié)果分析顯色平板上呈現(xiàn)紫色、光滑、邊緣整齊、直徑2-3mm的紫色菌落，菌落顏色和形態(tài)與標準菌株相符，說明貝類樣品中存在副溶血性弧菌。
權(quán)利要求
1.一種副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的配方為蛋白胨10～15g、酵母粉3～5g、NaCl 9～11g、蔗糖類18～20g、單糖0.11～0.13g、檸檬酸鈉9～11g、硫代硫酸鈉9～11g、膽鹽5～8g、混合顯色底物Y-glucoside 0.05～0.95g、瓊脂12～15g、NaCO31～1.5g。
2.如權(quán)利要求1所述的副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的配方為蛋白胨15g、酵母粉3g、NaCl 10g、蔗糖類20g、單糖0.11g、檸檬酸鈉10g、硫代硫酸鈉10g、膽鹽8g、混合顯色底物Y-glucoside 0.35g、瓊脂12g、NaCO31g。
3.一種副溶血性弧菌檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括增菌液A胰酪胨液體培養(yǎng)基，增菌液B氯化鈉多粘菌素B肉湯，及如權(quán)利要求1或2所述的顯色培養(yǎng)基干粉。
4.一種使用如權(quán)利要求3所述的試劑盒檢測副溶血性弧菌的方法，其特征在于包括以下步驟(1)制備顯色平板每1000mL水中加入77～98g顯色培養(yǎng)基干粉，混合后煮沸1～2min，待冷至40～50℃，倒平板，備用；(2)一步增菌將樣品置于增菌液A中，混合均勻后37℃培養(yǎng)6～8h；(3)二步增菌取一步增菌液1mL加入到9mL增菌液B中，混合均勻后37℃培養(yǎng)15～17h；(4)接種培養(yǎng)將二步增菌液接種顯色平板上，37℃培養(yǎng)18～24h；(5)結(jié)果分析若顯色平板上出現(xiàn)光滑、略凸起、直徑2-3mm、邊緣整齊的紫色菌落，說明該樣品存在副溶血性弧菌。
全文摘要
本文涉及一種副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基、檢測試劑盒及檢測方法，屬于食品微生物安全監(jiān)測領(lǐng)域。檢測試劑盒由加入了0.05～0.95g細菌特異性酶的混合顯色底物Y－glucoside的顯色培養(yǎng)基與增菌液A胰酪胨液體培養(yǎng)基，增菌液B氯化鈉多粘菌素B肉湯組成；檢測時，先后利用增菌液A、B對樣品進行增菌培養(yǎng)，最后將二次增菌液接種至顯色培養(yǎng)基上培養(yǎng)，若出現(xiàn)光滑、略凸起、直徑2－3mm、邊緣整齊的紫色菌落，說明樣品存在副溶血性弧菌。所述的顯色培養(yǎng)基成本低廉，試劑盒配置簡單，檢測方法檢測靈敏高，周期短、可操作性強、適用于處理大通量的樣本、易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，可以廣泛推廣應用到食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。
文檔編號C12R1/63GK1974784SQ20061012407
公開日2007年6月6日 申請日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日
發(fā)明者曾婧, 張淑紅, 張菊梅, 傅嵐 申請人:廣東實驗中學, 廣東省微生物研究所