專利名稱：：用于弧菌細(xì)菌的反應(yīng)培養(yǎng)基的制作方法用于弧菌細(xì)菌的^JS培養(yǎng)基本發(fā)明涉賴于檢測(cè)弧菌細(xì)菌的培養(yǎng)基。本發(fā)明還涉;5Ut種培養(yǎng)基的用途以及j^定弧菌細(xì)菌的方法?；魜y是一種由霍舌L瓜菌(K"r/oc/o/erae)這種革蘭氏陰寸沐菌引起的接觸傳染性非常強(qiáng)的腹渴疾病。同樣地，副^j6l瓜菌(k/6Wopara力ae邊o/y〃ciw)是造成急性胃腸炎的原因。作為a這些病理學(xué)狀態(tài)的原因的細(xì)菌菌株由受污染的水或食物開(kāi)始通過(guò)口^it徑傳播。由于這些疾病的流行特征，常常需要檢測(cè)在受污染的患者體內(nèi)或者在環(huán)嫂例如食物和水中的這些細(xì)菌。實(shí)際用于^;則弧菌的參照培養(yǎng)基是TCBS培養(yǎng)基(萄L^M^l檸W^汁鹽蔗糖)。TCBS瓊脂是一種選棒峰養(yǎng)基，其被推薦用于研究和分離致病性弧菌(NFISO8914標(biāo)準(zhǔn)，^#界衛(wèi)生組織*)。高M(jìn)的膽汁和+^I!l與高pH(pH-8.6)相結(jié)^vf吏得能夠除去許多細(xì)菌。主^源是蔗糖。蔗糖的用途M^pH的斷氐，以及pH指示劑由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。陽(yáng)性蔗糖菌落，例如多種弧菌屬(P76r/o)珊，特別是霍舌l(xiāng)i瓜菌，因敲現(xiàn)出黃色。陰性蔗糖菌落，例如副溶血弧菌，顯現(xiàn)出綠色。然而，這種培養(yǎng)絲不非常靈敏，也不非常特異，并iM^測(cè)出許多假陽(yáng)性(即檢測(cè)出被認(rèn)為是弧菌但并不是弧菌的細(xì)菌)。還有CHROMagarVibrio培養(yǎng)基。這種選擇法生色培養(yǎng)基使得能夠與相對(duì)于顛弧菌樹(shù)區(qū)分出副溶j6^瓜菌、創(chuàng)傷弧菌(P76rZow/i3277cws)和霍^i瓜菌。副溶血弧菌以淡紫色菌落形式出現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧茵產(chǎn)生藍(lán)色菌落，而其他物種例如解'l^fc^弧菌(W6Woa/gi加/y〃c^)形成無(wú)色菌落。這種培養(yǎng)基為粉末形式。這種培養(yǎng)基的原tt于在高M(jìn)的蔑糖存在下同時(shí)檢測(cè)P-葡糖苷酶(副溶*菌所特異的)和P-半IUt苦酶(霍舌U^菌和創(chuàng)傷弧菌所特異的)活性。然而，除了將某些樹(shù)鑒定為假陽(yáng)'^t，這種培養(yǎng)M測(cè)霍《li瓜菌的靈敏也一^本發(fā)明提出了一種用于分離和鑒定霍《li且弧菌(霍《li瓜菌/創(chuàng)傷弧菌和最小弧菌(P76r/'o)和副溶血弧菌的靈^tiL特異的培養(yǎng)基，從而解決了JW技術(shù)的這些缺陷。M方面，本發(fā)明涉及用于霍舌l(xiāng)i且細(xì)菌(霍舌L瓜菌/創(chuàng)傷弧菌和最小弧菌)和副溶血弧菌的^jS培養(yǎng)基，其包舍使得能夠^;則p-半享un苷sHI活性的底物，糖，有色指示劑。^4^發(fā)明的范圍內(nèi)，"A^培養(yǎng)基"是指含有微生物生存和/或生長(zhǎng)所需的姨成分的培養(yǎng)基。這種^i培養(yǎng)M者可以只用作揭示培養(yǎng)基，或者用作培養(yǎng)和揭示培養(yǎng)基。在第一種情況下，在接種之前進(jìn)行孩逸物培養(yǎng)；和在第二種情況下，該反應(yīng)培養(yǎng)基也是躲糾養(yǎng)基。這種M培養(yǎng)基可以是固體、半固M液體。固糾養(yǎng)基是指例如膠凝化的培養(yǎng)基。^i^，這種培養(yǎng)基由膠凝化的培養(yǎng)U誠(chéng)。瓊脂^L孩^i物學(xué)中是用于孩性物培養(yǎng)的傳統(tǒng)的膠凝劑，但是也可以使用明膠或瓊脂糖。可商購(gòu)獲得某些制劑，例如Columbia瓊脂、Trypcase-soja瓊脂、MacConkey瓊脂、Sabouraud瓊月旨，或更一^i^，在HandbookofMicrobiologicalMedia(CRC出版社)中描述的那些。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以包含可選的M添加劑，例如蛋白胨、一種或多種生長(zhǎng)因子、碳水^^的、一種或多種選#^劑、緩沖溶液、一種或多種膠凝劑等。這種培養(yǎng)基可以是液體、即用型艦(即準(zhǔn)備用于在管、瓶中或者躲養(yǎng)皿上進(jìn)行接種)的形式。當(dāng)以在瓶中的形^y^供時(shí)，^f^k^倒入培^^中之前事^H亥培^^ii^f亍再生(轉(zhuǎn)變成ioox:)。M地，本^發(fā)明的培養(yǎng)l^l選棒^浩養(yǎng)基，即含有不希望檢測(cè)出的細(xì)菌和酵母生長(zhǎng)的抑制劑的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述"底物"選自能夠^7K解^UL許直接或間4^r測(cè)p-半IUt苷,活性的產(chǎn)物的^^T底物。M地，這種底物包^:>對(duì)于待揭示的酶活性特異的第一部分。這個(gè)第一部分能與所i^目互作用，^"對(duì)于所^f究的^^物^L特異的，>充當(dāng)才科彌的第二部分，下面稱之為才斜己部分，其可以狄焚光的或生色的。作為熒itA物，尤其可以^A^于傘形酮或^^香豆素的底物，基于試鹵靈的底物或者基于熒光素的底物。本發(fā)明的酶底物在寬的pH范圍內(nèi)，特別是在pH5.5-10內(nèi)是可4M的。在該A^培養(yǎng)基中，本發(fā)明的酶底物^JL^70.01-2g/L，并JI4"利地，^^0.075g/L。狄因?yàn)椋琈:個(gè)底物艦下，獲得狄的著^t比度。才本發(fā)明的一^i^實(shí)施方式，所it^物是X-p-半IUt苷生色底物，其中X表示才科己部分。^J4，所^j]的底物是5-溴-4-氯-3-吲^J^3-D"p比喃半浮Ut普。^i^，這種底物在該培養(yǎng)基中的、;i51^0.01-2g/L，艦地0.05-1.15g/L。才娥本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，所絲物可以選自P-半專Ut香酶的底物，例如紅A-p-半孝ut苷、品紅-p-半孝ut苷，綠A-P-半孝UI普，^ix-p-半專Ut普和茜素-3-半專Ut苷，它們對(duì)于檢測(cè)霍舌Ul菌來(lái)i^i敏感的。才緣本發(fā)明的一^H^實(shí)施方式，所述糖是阿拉伯糖。^i^fc,這種糖在該培養(yǎng)基中的濃度是1-30g/L，她地5-15g/L。地，該^A大約8g/L。所i^tdi可以選自下述的糖D-甘^i瞎、D"核糖、D"纖&瞎、D"葡萄糖、葡糖S^和半享Ut。才緣本發(fā)明的一^it實(shí)施方式，所述有色指示劑是中性紅。^J^，這種有色指示劑在該培養(yǎng)基中的濃度是O.0001-0.05g/L，>^地0.002-0.010g/L，更to地0.003-0.007g/L。所述有色指示劑還可以是^&香草酚藍(lán)。才M^^發(fā)明的一，t實(shí)施方式，該^Jbl大約0.010g/L。才緣本發(fā)明的一個(gè)特別實(shí)施方式，所iiAJl培養(yǎng)絲包含第4糖，以便改善相對(duì)于在該培養(yǎng)基中可食^在的務(wù)fe細(xì)菌物種而言的檢測(cè)副溶j6^瓜菌和霍亂弧菌的特異性。^i^k>，妙4糖是葡糖醛酸。^i^，這種糖在該培養(yǎng)基中的MLAl-30g/L，^te^5-15g/L。M地，該iii^l:大約8g/L。本發(fā)明還涉及如上定義的培養(yǎng)基用于分離和鑒定霍《U且弧菌(霍亂弧菌/創(chuàng)傷孤菌和最小弧菌)和副溶血弧菌的體外用途。當(dāng)^^這種培養(yǎng)基時(shí)，通過(guò)特異的p-半IUt苷酶活性iM^測(cè)霍"Cf瓜菌，所述P-半孝Ut普酶活性使得能夠獲得藍(lán)色至綠色的菌落。通過(guò)L-阿拉伯糖的特異性^]來(lái)揭示副溶血弧菌,所述L-阿拉伯^^吏得能夠獲得^ix色的菌鋭非常強(qiáng)的著色)，itA由于該培養(yǎng)基中的酸化而i4^的，所ii^^M吏該有色指示劑(中性紅)由無(wú)色轉(zhuǎn)變成，的玫3ttl色。在膽汁鹽存在下，這種著色##集中在菌落范圍內(nèi)，這樣有助于培養(yǎng)基的閱讀。，孤菌屬Wt顯現(xiàn)出紫羅蘭色或無(wú)色。最后，本發(fā)明涉^Jf^i瓜菌和副溶血孤菌的體外鑒定方法，m^該方法，P-半孝l4t苦酶活性以鑒定出霍^i瓜菌，和檢測(cè)糖的酸化以^r測(cè)出副溶jfcL^菌。才娘本發(fā)明的一^N^實(shí)施方式，通過(guò)^JI對(duì)于P-半IUt苷酶活性特異的生色底物絲r測(cè)p-半專l4t苷酶活性以鑒定出霍-li瓜菌。這種底物是如前面定義的，并且^i4^是X-p-半專Ut普。才缺本發(fā)明的一^m實(shí)施方式，通過(guò)^JD有色指示劑，to中性紅，來(lái)^;則糖的酸化，所述有色指示劑在由于糖的酸化而引起PH變化時(shí)^;頓色。下面的實(shí)施例以示例性的方式提供而沒(méi)有^f可p艮制性特征。它們4吏得能夠更好艦解本發(fā)明。1.選擇菌脅食物樣品a-賴純菌林來(lái)"Wt種培養(yǎng)基使用69個(gè)菌林測(cè)試了本發(fā)明的培養(yǎng)基，其中包括22個(gè)弧菌屬菌株(8個(gè)霍亂弧菌、2個(gè)最小弧菌、2頓傷弧菌、4個(gè)副溶錄菌、2個(gè)解'limm菌、2個(gè)河^i瓜菌(K/7"Wa〃《)、1個(gè)霍氏弧菌(K力oh'sae)和1個(gè)麥?zhǔn)瞎戮?「/z/e"cA/j/i:ow7));8個(gè)葡萄球菌屬(5Yap力77ococo/《)菌沐6>Hg_單胞菌屬(尸se"&咖朋s)菌沐6^H^ii酵母屬(Ca/^ids)菌沐4個(gè)腸球菌屬(^7^rococcw)菌林；3個(gè)腸桿菌屬(^^wo6a"er)菌林；2個(gè)燥桿菌(&c力er/c力/aco//)菌沐2個(gè)克雷伯氏菌屬(A7e6wW/a)菌林；2個(gè)變形菌屬(Pro"M)菌林；2個(gè)沙門(mén)氏菌屬(5W/o/2e//a)菌椒2個(gè)志賀氏菌屬(幼/》e〃a)菌林；2個(gè)耶爾森氏菌屬(^rW/j/a)菌抹；2個(gè)氣單胞菌屬(yiero邊o/7M)菌林；2個(gè)莫拉氏菌屬(胞me7h)菌林；2個(gè)鄰單胞菌屬(尸7esicaw/7a;y)菌沐1個(gè)利斯特氏菌屬(Z/Wer/a)菌椒1個(gè)不動(dòng)桿菌屬(Jcine^a"er)菌林。b-4MAX污染的^^物來(lái)^Ht種培養(yǎng)基下述4種食物M被霍舌l(xiāng)i瓜菌污染4瑰、蝦、速凍的狗魚(yú)脊肉和^^海鱒魚(yú)。5種她的M,魚(yú)予鱈脊肉、冷凍的明蝦、貽貝、魚(yú)樹(shù)Terrinedepoisson)和蟹香魚(yú)肉腸(Surimi)凈皮副溶血弧菌污染。所采用的方紋NFISO8914和NFENISO6887-3標(biāo)準(zhǔn)所描述的方案，其建議在加鹽和蛋白胨的水(EauP印tom^eSaWe,EPS)中在37匸下預(yù)富集7-8小時(shí)。4狄稀^^至10-5的0.5McFarland細(xì)菌懸浮液i!Ui行人工污染。將1ml或0.1ml體積的這種稀幹液用于分別污染魚(yú)類/，曱殼類動(dòng)物和貝殼類動(dòng)物。在EPS中將這些食物^磨碎后進(jìn)^ftil種污染，并在2-8'C下I&存24小時(shí)，然后在37X:下溫育7-8小時(shí)。然后，蔣頓富集的10|i1樣7"乾^^發(fā)明的培養(yǎng)^Ji,其于37C溫育48小時(shí)。平行地，在與前面相同但沒(méi)有人工污染的務(wù)降下進(jìn)行對(duì)照測(cè)試。這一方面使得能夠證實(shí)每種基質(zhì)的自然菌叢，另一方面還使得能夠確g;^發(fā)明的培養(yǎng)基與弧菌菌^;則之間4在不相容的問(wèn)題。2.本發(fā)明培養(yǎng)基的制備本發(fā)明的培養(yǎng)基是一種選擇性培養(yǎng)基，它包含作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的Trypcase-Soja培養(yǎng)基(bioM6rieux編號(hào)430H)，并且包含下i^il分(g/L):IPTG(異丙J^L^p比喃半專Ut普)0.05膽汁鹽0.6中性紅0.005L-阿拉伯糖105-溴一4-氯一3-吲^tJ^P-D-他喃半專Ut苷0.1還添加第4糖(葡糖醛酸；10g/L)，以改4^r測(cè)副溶血弧菌和霍舌區(qū)菌的特務(wù)l"生。3.用純菌#^^培#"基將所述細(xì)菌和酵母菌林(均來(lái)自本申請(qǐng)人的保藏)在生理鹽水中制成懸浮液，并進(jìn)行接種以在該培養(yǎng)Ui提粉離的菌落。將這些培^^在37'C下溫育48小時(shí)。在溫育24小時(shí)和超過(guò)40小時(shí)后目須'J^r查所形成的菌落。*了這些菌落的著色強(qiáng)度，然后#^個(gè)菌林分成陽(yáng)'賦陰性(^y^^4^所研究的表型)，其中已知當(dāng)一種菌林的著色強(qiáng)度值〉0.5Bt4皮認(rèn)為是陽(yáng)性的。按照該培養(yǎng)基的原理，狄P-半孝l4t苷酶活性(利用X-3-半豸Ut苷)的霍亂弧菌菌抹應(yīng)該產(chǎn)生藍(lán)-綠色菌落，而利用L-阿拉伯糖從而使培養(yǎng)^^f沐有色指示劑變色的副溶血弧菌菌林應(yīng)該產(chǎn)生,的M紅色菌落。M屬或物種可以產(chǎn)生紫羅蘭色菌落(利用與e-半浮ut香酶活'射目關(guān)的阿拉伯糖)或無(wú)色菌落(阿拉伯糖(-)和p-半fut苷酶(-))。4.培^4的閱讀著色強(qiáng)度閱讀量表"chelle):這是所有生物樣品和受試培養(yǎng)基的共同的任意量表(6chellearbitraire)。這個(gè)量糾于該實(shí)驗(yàn)以財(cái)于所有下迷實(shí)|^是有效的。它可以以下Ji^"式i^f亍定義0相應(yīng)于^在活性，0.1相應(yīng)于存在痕量著色，0.5相應(yīng)于存在非常孩調(diào)的著色，1相應(yīng)于存在低強(qiáng)度的清晰的著色，2相應(yīng)于存在中等強(qiáng)度的純凈的著色，3相應(yīng)于存在強(qiáng)的著色，4相應(yīng)于存在非常強(qiáng)的著色。a)對(duì)于純菌林結(jié)^4示為在溫育24小時(shí)后在靈^l和特異性方面相對(duì)于所有測(cè)試而言的良^^斷的％，并且列于下表中，其中靈M的財(cái)目應(yīng)于在所,養(yǎng)JJ^r測(cè)出的真陽(yáng)性數(shù)目除以待檢測(cè)的真陽(yáng)性總數(shù)目，而特異性的財(cái)目應(yīng)于在所，養(yǎng)基J^"測(cè)出的真陰性數(shù)目除以#^"測(cè)的真陰性總數(shù)目。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>這些結(jié)絲明，一方面所有霍《Ul菌菌^^Mf地產(chǎn)生具有預(yù)期顏色的菌落(靈敏復(fù)100%),另一方面57個(gè)非霍^i瓜菌菌林中沒(méi)有一個(gè)菌林顯示出霍舌l(xiāng)i瓜菌所特有的顏色(特異f生100%)。4個(gè)副溶血弧菌菌#身也產(chǎn)生具有預(yù)期顏色的菌落(靈100%)。在65個(gè)非副溶j^瓜菌菌林中，其中僅3個(gè)被分類為假P日性(2/2河流弧菌和1/2產(chǎn)，桿菌(fi^ero6a"eraeroge/es))并產(chǎn)生副溶血弧菌所特有的皿紅色菌落(特異l"生95.5%)。b)對(duì)于食物絲下表中列出的結(jié)果是在37'C下溫育24小時(shí)后的觀測(cè)結(jié)果。#f^J^AX質(zhì)而獲得的)進(jìn)行t嫩，以使擬目關(guān)菌叢中標(biāo)出在理論上用于污染食物的細(xì)菌物種。那么，分離出經(jīng)如j^示出的每個(gè)菌落，然后借助于標(biāo)準(zhǔn)測(cè)"^ii行鑒定。如^ii種鑒定得到證實(shí)，那么該菌^皮認(rèn)為是真+的，&目反的情況下則是假+的。另外，除了具有預(yù)期顏色的菌落外，必寸非預(yù)期的但呈現(xiàn)出特征性著色的務(wù)他菌落進(jìn)行鑒定。如果該鑒定證實(shí)了屬于除了所預(yù)期的WN^卜的^Wft的、但為霍舌U1菌(創(chuàng)傷弧菌，最小弧菌)或副#弧菌組的成員的物種，那么其為在該食物中天j^^在的真+;相M，如果該鑒定沒(méi)有證實(shí)霍舌l(xiāng)i瓜菌(創(chuàng)傷弧菌，最小弧菌)或副溶血孤菌，則該樹(shù)被認(rèn)為是假+。靈狄(所獲得的真+的數(shù)目/預(yù)期的真+的數(shù)目)特躲(所獲得的假+的數(shù)目)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>在本發(fā)明的培養(yǎng)^Jl進(jìn)行預(yù)富集和分離后，發(fā)現(xiàn)了所有用于污染食物M的菌林。該培養(yǎng)基的可讀性^:^H^人滿意的，因?yàn)榭扇菀椎卦诟綄倬鷧仓袠?biāo)出藍(lán)-綠色或玫itoi色的陽(yáng)性菌落，即^^斤述附屬菌叢大量存在。5.所述弧菌ID培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)所itl瓜菌ID培養(yǎng)絲靈^^和特異性方面具有艦的性能?？勺x性，即檢測(cè)陽(yáng)性菌落或排除陰性菌落的能力，也是非常好的。在低污染樣品的情況下，靈^Jbl非常好的。權(quán)利要求1.用于霍4li且弧菌細(xì)菌(霍亂弧菌/創(chuàng)傷孤菌和最小弧菌)和副溶血弧菌的^JI培養(yǎng)基，其包含使得能夠檢測(cè)p-半iut苷im活性的底物，糖，有色指示劑。2.權(quán)利要求1的^I培養(yǎng)基，其中所i^物是X-p-半專Ut普生色底物。3.權(quán)利要求1或2的^培養(yǎng)基，其中所i^t是L-阿拉伯糖。4.權(quán)利要求1-3中4—項(xiàng)的A^培養(yǎng)基，其中所述有色指示劑是中性紅。5.權(quán)利要求1-4中^-項(xiàng)的A^培養(yǎng)基，其中它還包含第J^t糖。6.權(quán)利要求5的a培養(yǎng)基，其中所錄4糖是葡糖。7.霍亂弧菌和副溶血孤菌的體外鑒;t^法，其中檢測(cè)P-半專源苷酶活性以鑒定出霍亂《瓜菌，和檢測(cè)糖的酸化以檢測(cè)出副溶it瓜菌。8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的培養(yǎng)基用于分離和鑒定霍《li且弧菌(霍舌l(xiāng)i瓜菌/創(chuàng)傷弧菌和最小孤菌)和副溶jfiL瓜菌的體外用途。全文摘要本發(fā)明涉及用于霍亂組弧菌細(xì)菌(霍亂弧菌/創(chuàng)傷弧菌和最小弧菌)和副溶血弧菌的反應(yīng)培養(yǎng)基，其包含使得能夠檢測(cè)β-半乳糖苷酶酶活性的底物、糖、有色指示劑。本發(fā)明還涉及這種培養(yǎng)基用于分離和鑒定霍亂組弧菌(霍亂弧菌/創(chuàng)傷弧菌和最小弧菌)和副溶血弧菌。最后，本發(fā)明涉及用于鑒定霍亂弧菌和副溶血弧菌的方法，根據(jù)這種方法，檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性以鑒定出霍亂弧菌，和檢測(cè)糖的酸化以檢測(cè)出副溶血弧菌。文檔編號(hào)C12Q1/04GK101313077SQ200680016852公開(kāi)日2008年11月26日申請(qǐng)日期2006年5月16日優(yōu)先權(quán)日2005年5月18日發(fā)明者D·羅比雄,D·蒙熱申請(qǐng)人:拜奧默里克斯公司