專利名稱：運(yùn)用分子雜交－酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)，具體地講是運(yùn)用分子雜交—酶聯(lián)免疫顯色方法檢測(cè)致病細(xì)菌，特別是坂崎腸桿菌的技術(shù)。
背景技術(shù)：
坂崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是革蘭氏陰性細(xì)菌，屬腸桿菌科腸桿菌屬。1980年被命名為坂崎腸桿菌前該菌被稱為產(chǎn)黃色素陰溝腸桿菌。是臨床上很少見的病原菌，其引起的腦膜炎、敗血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎在全世界范圍內(nèi)均有報(bào)告。并有不斷增多的趨勢(shì)，大多數(shù)病例發(fā)生在嬰幼兒，而且病程短，在一些情況下病死率達(dá)80％。雖然坂崎腸桿菌的傳染源不很清楚，但嬰兒配方奶粉起到了傳播媒介的作用。特別是2002年11月26日國家質(zhì)檢總局發(fā)布公告2002年第120號(hào)。主要內(nèi)容是暫停辦理美國惠氏公司生產(chǎn)的某些批號(hào)的配方奶粉的報(bào)檢通關(guān)和相關(guān)的檢驗(yàn)檢疫手續(xù)，對(duì)已進(jìn)口的相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)督銷毀處理，原因是美國食品與藥品管理局(FDA)在上述產(chǎn)品中檢出坂崎腸桿菌。

發(fā)明內(nèi)容
目前我國尚沒有食品中和臨床上檢測(cè)坂崎腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，美國FDA 2002年8月發(fā)布的坂崎腸桿菌分離計(jì)數(shù)方法，依然沿用了“三管”增菌法檢測(cè)坂崎腸桿菌。需要經(jīng)過前增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定等經(jīng)典的檢驗(yàn)方法檢測(cè)目標(biāo)菌。試驗(yàn)時(shí)間長，處理樣品量小，而且靈敏度和特異性都相對(duì)較低。針對(duì)上述情況，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供了一種運(yùn)用分子雜交技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下1.探針設(shè)計(jì)根據(jù)坂崎腸桿菌16s和23s rRNA基因間區(qū)的DNA序列，設(shè)計(jì)6條特異性寡核苷酸探針，其序列如下。
探針序列一GCTGCTGCATTTCTCCGTAATAAGGAATGCGCGGTGTGT探針序列二CAGAGTCTCTCAAACTCGCAGCACGAA GACTTCTTC探針序列三GTAAAGAAGCAGGGTTGTCTGCGAAAGCGAAGTC探針序列四GCGAAAGCGAAGTCCCTTTCGTCTAGAGGCCCAGGACA探針序列五ACTCCGCAGGAGTTGAAGAGGTTTAACTACG探針序列六TGCAAGATACAACCCCGCAGGAGTTGAAGAGG2.PCR引物設(shè)計(jì)和靶DNA序列的擴(kuò)增用PCR方法擴(kuò)增待測(cè)樣品中全部原核微生物的16s和23s rRNA基因間區(qū)的DNA片段，PCR引物的核苷酸序列如下。
引物序列一GCTCGTGTNGTGANATGTTGCCA引物序列二GCGATTTCYGAATGGGGRAAGGG其中N代表4種堿基中的任意一種；Y代表堿基C或T中的任意一個(gè)；R代表堿基A或G中的任意一個(gè)。
PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分 濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/ 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL引物序列一 10μmol/L2μL引物序列二 10μmol/L2μL
dNTPs 每種10mmol/L 0.3μLDIG-dUTP 1mmol/L0.3μLDNA樣品 2μL雙蒸水 33.1μL總體積 50μLPCR擴(kuò)增程序?yàn)?)95℃ 10min2)95℃ 30s3)55℃ 20s4)72℃ 30s5)95℃ 30s，重復(fù)5次6)95℃ 30s7)68℃ 30s8)95℃ 30s，重復(fù)25次9)72℃ 2min3.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的地高辛標(biāo)記按照Roche公司地高辛標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒的使用說明，對(duì)從待測(cè)樣品中擴(kuò)增出的16s和23s rRNA基因間區(qū)DNA片段進(jìn)行地高辛標(biāo)記。
(1)設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸探針，用于核酸分子雜交檢測(cè)；(2)PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品中全部原核微生物的16s和23s rRNA基因間區(qū)的DNA片段，然后進(jìn)行地高辛標(biāo)記；4.寡核苷酸探針與地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物的分子雜交將濃度為1mmol/L的寡核苷酸探針溶液0.1μL點(diǎn)在尼龍膜上，在長波紫外燈下交聯(lián)5-10min，然后與地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交，方法如下。
預(yù)雜交預(yù)雜交液先預(yù)熱到雜交溫度(50℃)，把點(diǎn)入寡核苷酸探針的尼龍膜放入塑料袋中，加入預(yù)雜交液，封好口，50℃預(yù)雜交30min。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熱變性地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物加熱到95℃，保持10min，然后插入冰浴中冷卻。
DNA雜交把預(yù)雜交好的尼龍膜裝入塑料袋，加入變性的地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物10μL，再加入1mL雜交液，封好口，按照Roche公司地高辛標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒的使用說明，于50℃雜交1h。雜交結(jié)果通過酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)顯色，用肉眼觀察，可發(fā)現(xiàn)能與坂崎腸桿菌PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交的特異性探針顯示出藍(lán)色雜交斑點(diǎn)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是該方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確的鑒定特異的目標(biāo)細(xì)菌。首先，避免了反復(fù)培養(yǎng)，節(jié)約時(shí)間；而且DNA-DNA雜交鑒定方法較生理生化的鑒定方法更為準(zhǔn)確，不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響。本發(fā)明填補(bǔ)了使用DNA分子雜交方法進(jìn)行坂崎腸桿菌檢測(cè)的空白。


圖1某進(jìn)口品牌嬰兒配方奶粉的DNA雜交結(jié)果圖2某品牌出口魚肉粉的DNA雜交結(jié)果圖3某品牌進(jìn)口狗咬膠的DNA雜交結(jié)果具體實(shí)施方式
實(shí)施例1樣本某進(jìn)口品牌嬰兒配方奶粉，常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)出坂崎腸桿菌疑似菌落。
1.DNA抽提取增菌液1mL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000r/min，離心5min，棄去上清液，加入100μL溶菌酶溶液，37℃保溫10min，補(bǔ)加TE緩沖液500μl，振蕩混勻。加等體積Tris飽和酚(pH8.0)，強(qiáng)烈振蕩，12000r/min，離心3min，吸取上清液，重復(fù)酚抽提。吸取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30min，于12000r/min離心5min。棄去上清，加70％冰乙醇振蕩洗滌一次，室溫下12000r/min，離心5min，棄上清。加入50μL TE溶液，置-20℃保存。
2.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)混合物成分成分 濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL0.3μL引物序列一10μmol/L 2μL引物序列二10μmol/L 2μLdNTPs 每種10mmol/L 0.3μLDIG-dUTP 1mmol/L 0.3μLDNA樣品 2μL雙蒸水 33.1μL總體積 50μLPCR擴(kuò)增條件1)95℃ 10min2)95℃ 30s3)55℃ 20s4)72℃ 30s5)95℃ 30s，重復(fù)5次6)95℃ 30s7)68℃ 30s8)95℃ 30s，重復(fù)25次9)72℃ 2min3.靶DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交預(yù)雜交預(yù)雜交液先預(yù)熱到雜交溫度(50℃)，把分別點(diǎn)入寡核苷酸探針序列一、二、三、四的尼龍膜放入塑料袋中，加入預(yù)雜交液，封好口，50℃預(yù)雜交30min。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熱變性地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物加熱到95℃，保持10min，然后插入冰浴中冷卻。
DNA雜交把預(yù)雜交好的尼龍膜裝入塑料袋，加入變性的地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物10μL，再加入1mL雜交液，封好口，按照Roche公司地高辛標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒的使用說明，于50℃雜交1h。雜交結(jié)果通過酶聯(lián)免疫方法顯色。結(jié)果表明，尼龍膜上的sak1、sak2、sak3和sak4處均深為藍(lán)色斑點(diǎn)，此為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有坂崎腸桿菌，而陰性對(duì)照樣品未出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)(圖1)。
圖1中的各個(gè)點(diǎn)分別是(1)陽性對(duì)照(2)探針序列一(3)探針序列二
(4)探針序列三(5)探針序列四(6)陰性對(duì)照待測(cè)樣品經(jīng)常規(guī)微生物培養(yǎng)，使用生化檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明被測(cè)樣品98％為坂崎腸桿菌，其中一個(gè)菌株命名為fps6。這說明用探針序列一、二、三、四對(duì)樣品中坂崎腸桿菌的檢測(cè)結(jié)果是可信的。
實(shí)施例2樣本某品牌出口魚肉粉，常規(guī)生化法檢測(cè)出坂崎腸桿菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例1。
2.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)混合物的成分同實(shí)施例1。
PCR擴(kuò)增條件1)95℃ 10min2)95℃ 30s3)55℃ 20s4)72℃ 30s5)95℃ 30s，重復(fù)5次6)95℃ 30s7)72℃ 30s8)95℃ 30s，重復(fù)25次9)72℃ 2min3.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交方法同實(shí)施例1。所用寡核苷酸探針為序列三、四、五、六。雜交結(jié)果表明，尼龍膜上的sak3、sak4、sak5和sak6均出現(xiàn)深藍(lán)色斑點(diǎn)，此為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有坂崎腸桿菌，而陰性對(duì)照樣品未出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)(圖2)。
圖2中的各個(gè)點(diǎn)分別是(1)陽性對(duì)照(2)探針序列三(3)探針序列四(4)探針序列五(5)探針序列六(6)陰性對(duì)照待測(cè)樣品經(jīng)常規(guī)微生物培養(yǎng)，使用生化檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明被測(cè)樣品100％為坂崎腸桿菌，其中一個(gè)菌株命名為fis5。這說明用探針序列三、四、五、六對(duì)樣品中坂崎腸桿菌的檢測(cè)結(jié)果是可信的。
實(shí)施例3樣品某品牌進(jìn)口狗咬膠，常規(guī)生化檢測(cè)出坂崎腸桿菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實(shí)施例1。
2.PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)混合物的成分同實(shí)施例1。
PCR擴(kuò)增條件同實(shí)施例2。
3.靶DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交方法同實(shí)施例1。所用寡核苷酸探針為序列一、二、三、四。雜交結(jié)果表明，尼龍膜上的sak1、sak2、sak3、sak4均無藍(lán)色斑點(diǎn)產(chǎn)生，此為陰性雜交結(jié)果，表明樣品中不含有坂崎腸桿菌(圖3)。
圖3中的各個(gè)點(diǎn)分別是(1)陽性對(duì)照(2)探針序列一(3)探針序列二(4)探針序列三(5)探針序列四(6)陰性對(duì)照待測(cè)樣品經(jīng)常規(guī)微生物培養(yǎng)，使用生化檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明被測(cè)樣品100％為團(tuán)聚腸桿菌，其中一個(gè)菌株命名為dot3。這進(jìn)一步說明，用探針序列一、二、三、四對(duì)樣品中坂崎腸桿菌的檢測(cè)結(jié)果是可信的。
此外，還進(jìn)行了腸桿菌屬和腸桿菌科道的其他細(xì)菌的對(duì)照平行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、團(tuán)聚腸桿菌、大腸桿菌、蜂房哈夫尼亞氏菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌等均不產(chǎn)生雜交斑點(diǎn)。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>南開大學(xué)<120>運(yùn)用分子雜交—酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌的方法<130>041106<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>39<212>DNA<213>人工合成<400>1gctgctgcat ttctccgtaa taaggaatgc gcggtgtgt 39<210>2<211>36<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(36)<223>
<400>2cagagtctct caaactcgca gcacgaagac ttcttc36
<210>3<211>34<212>DNA<213>人工合成<220>
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<400>4gcgaaagcga agtccctttc gtctagaggc ccaggaca 38<210>5<211>31<212>DNA<213>人工合成<220>
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<400>5actccgcagg agttgaagag gtttaactac g 31<210>6<211>32<212>DNA<213>人工合成<220>
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<400>6tgcaagatac aaccccgcag gagttgaaga gg32
<210>7<211>23<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(23)<223>
<400>7gctcgtgtag tgacatgttg cca 23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(23)<223>
<400>8gcgatttctg aatggggcaa ggg 2權(quán)利要求
1.一種運(yùn)用分子雜交—酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，所設(shè)計(jì)的特異性寡核苷酸探針序列如下探針序列一GCTGCTGCATTTCTCCGTAATAAGGAATGCGCGGTGTGT探針序列二CAGAGTCTCTCAAACTCGCAGCACGAAGACTTCTTC探針序列三GTAAAGAAGCAGGGTTGTCTGCGAAAGCGAAGTC探針序列四GCGAAAGCGAAGTCCCTTTCGTCTAGAGGCCCAGGACA探針序列五ACTCCGCAGGAGTTGAAGAGGTTTAACTACG探針序列六TGCAAGATACAACCCCGCAGGAGTTGAAGAGG
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的運(yùn)用分子雜交—酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，用PCR方法擴(kuò)增待測(cè)樣品中全部原核微生物的16s和23s rRNA基因間區(qū)的DNA片段，然后對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行地高辛標(biāo)記，PCR引物的核苷酸序列如下引物序列一GCTCGTGTNGTGANATGTTGCCA引物序列二GCGATTTCYGAATGGGGRAAGGG其中N代表4種堿基中的任意一種；Y代表堿基C或T中的任意一個(gè)；R代表堿基A或G中的任意一個(gè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的運(yùn)用分子雜交—酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，還包括由上述6條探針序列衍生出來的、差別不大于8個(gè)堿基的寡核苷酸序列以及每個(gè)序列的反義互補(bǔ)序列，或它們的變體，或它們的部分序列，或由上述幾條序列的全部或部分拼接的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的運(yùn)用分子雜交—酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸探針，用于核酸分子雜交檢測(cè)；(2)PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品中全部原核微生物的16s和23s rRNA基因間區(qū)的DNA片段，然后進(jìn)行地高辛標(biāo)記；(3)將寡核苷酸探針和地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分子雜交；(4)雜交結(jié)果通過酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)顯色；(5)顯色結(jié)果用肉眼觀察，可發(fā)現(xiàn)對(duì)坂崎腸桿菌進(jìn)行雜交的特異性探針顯色。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的的運(yùn)用分子雜交—酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌的方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分 濃度 加樣量PCR緩沖液10倍 5μLMgCl220mmol/ 5μLTaq DNA聚合酶5u/μL 0.3μL引物序列一 10μmol/L2μL引物序列 10μmol/L2μLdNTPs每種10mmol/L 0.3μLDIG-dUTP 1mmol/L 0.3μLDNA樣品 2μL雙蒸水33.1μL總體積50μL
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的的運(yùn)用分子雜交—酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，PCR方法中擴(kuò)增程序?yàn)?)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)95℃30s，重復(fù)5次6)95℃30s7)68℃30s8)95℃30s，重復(fù)25次9)72℃2min
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種運(yùn)用分子雜交—酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，將濃度為1mmol/L的寡核苷酸探針溶液0.1μL點(diǎn)在帶有正電荷的尼龍膜上，在長波紫外燈下交聯(lián)5-10min。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的的一種運(yùn)用分子雜交—酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，PCR產(chǎn)物的地高辛標(biāo)記及其與寡核苷酸探針的雜交，方法如下*預(yù)雜交預(yù)雜交液先預(yù)熱到雜交溫度(50℃)，把點(diǎn)入寡核苷酸探針的尼龍膜放入塑料袋中，加入預(yù)雜交液，封好口，50℃預(yù)雜交30min。*PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熱變性地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物加熱到95℃，10min，然后插入冰浴中冷卻。*地高辛標(biāo)記的靶DNA分子與尼龍膜上的探針DNA雜交把預(yù)雜交好的尼龍膜裝入塑料袋，加入變性的地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物10μL，再加入1mL雜交液，封好口，50℃雜交1h，溫和攪動(dòng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的運(yùn)用分子雜交—酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，由本發(fā)明設(shè)計(jì)的6條專一性寡核苷酸探針在基因芯片檢驗(yàn)坂崎腸桿菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種運(yùn)用分子雜交－酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)檢測(cè)坂崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)的方法，屬于細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)，特別是運(yùn)用分子雜交方法檢測(cè)致病細(xì)菌的技術(shù)。其技術(shù)方案是，用PCR方法擴(kuò)增待測(cè)細(xì)菌的16s和23s rRNA基因間區(qū)序列，并用地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物，然后與設(shè)計(jì)的一組特異性寡核苷酸探針雜交，經(jīng)酶聯(lián)免疫顯色后，可以精確地判斷待測(cè)樣品中是否含有坂崎腸桿菌。該方法的優(yōu)點(diǎn)是，省去了重復(fù)的細(xì)菌培養(yǎng)篩選環(huán)節(jié)，節(jié)約時(shí)間；分子雜交鑒定方法不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1635155SQ20041007270
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2004年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月11日
發(fā)明者黃熙泰, 劉寅, 蔡小寧, 楊曉川 申請(qǐng)人:南開大學(xué)