在dna分子的環(huán)化中僅選擇由單分子形成的環(huán)化dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種具有特定結(jié)構(gòu)的環(huán)狀DNA分子的制作方法，該特定結(jié)構(gòu)能夠辨別由單個DNA分子形成的環(huán)狀DNA(單分子環(huán)狀DNA)和由多個DNA分子形成的環(huán)狀DNA(多分子環(huán)狀DNA)及來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA。根據(jù)本發(fā)明，能夠在環(huán)狀DNA的制作中僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA。
【專利說明】在DNA分子的環(huán)化中僅選擇由單分子形成的環(huán)化DNA的方法
【技術(shù)領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及具有能夠辨別由單個DNA分子形成的環(huán)狀DNA、由多個DNA分子形成的環(huán)狀DNA以及來自于多分子環(huán)狀DNA的環(huán)狀DNA的結(jié)構(gòu)的環(huán)狀DNA分子的制作方法，僅選擇由單個DNA分子形成的環(huán)狀DNA的方法，所述方法中使用的新型銜接頭以及包含該新型銜接頭的環(huán)狀DNA制作用試劑盒。并且，本發(fā)明涉及使用通過上述方法所得的環(huán)狀DNA鑒定和/或檢測基因的方法。特別涉及鑒定和/或檢測引起各種病癥的融合基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]作為現(xiàn)有的基因分析方法，可舉出載體法。載體法中，將分析對象基因引入到載體中，利用測序儀確定擴增而得的基因的全長序列。但是，載體法存在需要培養(yǎng)操作這樣的問題，并且需要用測序儀分析基因的全長。
[0003]近年來，已開發(fā)出基因分析中的高速測序儀，隨之而來作為基因分析手段的配對法備受注目。
[0004]圖1示意性地顯示利用配對法的基因分析的概況。配對法中，使分析對象基因的兩個末端與結(jié)合用堿基序列(限制性內(nèi)切酶識別位點)結(jié)合，將對象基因環(huán)化。然后，以限制性內(nèi)切酶識別位點為中心，通常使用II型限制性內(nèi)切酶，從該識別部位開始以前后的15個堿基以上、優(yōu)選25個堿基以上到數(shù)十個堿基以下切下被環(huán)化的基因，將其用PCR進行擴增，然后確定被切下的 部分基因的喊基序列。由此，當確定對象基因的兩個末端的序列時，則可利用已知的序列數(shù)據(jù)來鑒定基因。配對是指解讀一條DNA片段的兩端而得的堿基序列的I組序列數(shù)據(jù)。
[0005]作為切下一定堿基數(shù)的基因的方法，實際使用下述兩種方法:使用II型限制性內(nèi)切酶剪切離開識別部位的部位而切下規(guī)定的堿基數(shù)的方法；用超聲(Sonication)等對環(huán)狀DNA進行物理切割并用附在接頭的生物素回收，用PCR將該片段擴增后確定序列的方法。
[0006]即，配對法中，通過讀取使DNA的兩個末端結(jié)合而環(huán)化的基因中結(jié)合部分的前后的一定堿基序列，能夠鑒定已知的基因。基本上如果讀取基因的頭部分和尾部分的部分堿基序列，則該序列在各個基因中能夠被可靠地區(qū)分，配對法作為可靠且簡單的基因分析方法被采用(非專利文獻I和2)。另外，配對法被應用于下一代的序列分析，隨著高速測序儀的出現(xiàn)，變得越來越重要。
[0007]但是，為了提供給利用配對法進行的基因分析而使DNA環(huán)化的情況下，除單個基因、DNA(單分子)自身環(huán)化以外，還會發(fā)生多個DNA(多分子)的環(huán)化及多分子(2分子以上)的線性結(jié)合。多分子所致的線性分子可以通過其后的操作與環(huán)狀分子分離而被除去，但由多分子形成的環(huán)狀分子無法與由單分子形成的環(huán)狀分子分離，成為雜質(zhì)?；谙率鲇涊d的理由，多分子環(huán)狀物阻礙各個基因分析，使分析特異性大幅度降低。具體而言，如圖2所示，使3種cDNA自環(huán)化時，如(B)所示，在僅單分子DNA環(huán)化的情況下，利用配對法根據(jù)正確的序列能夠鑒定基因。但是，除如(B)所示發(fā)生單分子的環(huán)化之外，如(C)所示還會產(chǎn)生未環(huán)化的線性cDNA、如⑶所示2個或2個以上的cDNA的環(huán)化。(C)情況下可以利用DNA核酸外切酶進行排除，但像(D)這樣多個cDNA環(huán)化而成的產(chǎn)物被識別為環(huán)化分子，無法排除，成為配對法基因分析中的雜質(zhì)。
[0008]配對法中的基因分析是利用對象基因的兩個末端堿基序列來鑒定基因。具體而言，在各個基因的兩個末端結(jié)合用于環(huán)化的結(jié)合用銜接頭，將基因在兩個銜接頭部位結(jié)合環(huán)化后，按照以銜接頭部位為中心成為一定數(shù)目的堿基序列的方式進行切割，其結(jié)果通過分析來自于原始基因的各末端的一部分的堿基序列來鑒定基因。因此，對于由多分子形成的環(huán)化物而言，銜接頭部位有多個，與銜接頭結(jié)合的兩端分別成為不同基因的一個末端。在基因分析時，如上所述，利用上述2個方法中的任一個方法，按照以銜接頭為中心結(jié)合的兩端成為一定數(shù)目的堿基序列的方式切割環(huán)化物進行基因分析。因此，從由多分子形成的環(huán)化物所得的分析用的基因片段包含不同基因的各自一個末端，不能進行單個基因的分析。這樣，在利用配對法的基因分析中，由多分子形成的環(huán)化物的存在阻礙各基因分析。
[0009]多個DNA分子環(huán)化的概率通常為百分之幾到百分之十幾，根據(jù)方法而存在差異，但在已知的基因的分析中，基本可以作為異常的堿基序列被識別，從分析序列中排除。因此，雖然繁瑣，但只是精度稍有下降。然而，將配對法用于從正常基因組中檢測融合基因這種異常基因的存在時，多個正?；颦h(huán)化的情況下，就會被判斷為存在異?；?。其結(jié)果，無法正確地確定融合基因等異?；虻拇嬖?。
[0010]融合基因是指多個(2個)基因結(jié)合而構(gòu)筑成的新功能基因的物質(zhì)。例如癌細胞中，發(fā)現(xiàn)缺失、重疊、重組、易位之類的染色體結(jié)構(gòu)的異常。在DNA水平上發(fā)生基因的斷裂和連接，如果在各切割點存在結(jié)構(gòu)基因，則會形成融合基因。
[0011]通常 ，融合基因?qū)τ诩毎允侵滤赖摹o意義的，多數(shù)情況下臨床上不是問題。但是由融合基因產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)阻礙細胞增殖的調(diào)節(jié)，由此當細胞增殖異常加速時，臨床上形成腫瘤等的趨勢明顯。
[0012]一直認為融合基因主要在造血系統(tǒng)腫瘤中表達，但近年來，推測融合基因還與上皮性實體腫瘤相關(guān)聯(lián)(非專利文獻3)。其中，從前列腺癌和肺癌中發(fā)現(xiàn)負有責任的融合基因(非專利文獻4和5)。
[0013]因此，融合基因的分析、即存在的確認作為腫瘤(癌癥)等的新型診斷方法備受注目。具體而言，通過檢測知道與病癥對應的已知的融合基因，能夠快速診斷病癥。并且，新型融合基因的發(fā)現(xiàn)有助于新型藥物靶標的發(fā)現(xiàn)。
[0014]另一方面，以往，實體腫瘤中染色體分析受限，極難分析.確認融合基因，但最近Mano等人開發(fā)了 cDNA功能性表達分析法等新型方法。但是，由于這些操作的繁瑣性、精度的問題等，目前仍是不完善的技術(shù)(專利文獻I)。另外，最近，開發(fā)了各種的下一代基因高速測序儀，基因的高速序列分析顯著進步，能夠?qū)崿F(xiàn)短時間的分析。因此，開始了腫瘤基因組.基因的利用高速.大量堿基序列分析來探索融合基因(非專利文獻6)。
[0015]為了利用使用了配對法的序列分析來鑒定融合基因，需要可靠地得到由單個cDNA分子形成的環(huán)狀DNA。將利用配對法分析融合基因的示意圖示于圖3。但是，如圖4所示，有可能多個cDNA形成一個環(huán)狀DNA，如果進行使用配對法的序列分析，則結(jié)果出現(xiàn)正?；蛞脖豢醋鋈诤匣蜻@樣的結(jié)果。如果以在現(xiàn)有的基因序列中不存在的理由排除該正?；虻脑?，同樣地融合基因也會被排除，因此實質(zhì)上不可能確認融合基因的存在。[0016]想用配對法通過序列分析檢測融合基因時，必須排除由多個基因形成的環(huán)化cDNA。
[0017]目前為止，本發(fā)明的發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)通過使用具有特定結(jié)構(gòu)的銜接頭進行2步連接，能夠僅發(fā)生單個DNA分子的環(huán)化而不發(fā)生多個DNA分子的多分子間環(huán)化的方法(未公布)。但是，即便利用該方法，完全阻止多個DNA分子的環(huán)化，100%排除由多個DNA分子形成的環(huán)狀DNA也是不可能的。在使用配對法的分析中，特別是在以新型融合基因的探索為目標的分析中，即便是極微量存在由多個基因形成的環(huán)化DNA也會成為假陽性克隆，所以仍就是問題。
[0018]因此，需求一種完全排除由多個DNA分子形成的環(huán)狀DNA、僅可靠地得到由單個DNA分子形成的環(huán)狀DNA的方法。
[0019]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0020]專利文獻
[0021]專利文獻1:日本特許第4303303號公報
[0022]非專利文獻
[0023]非專利文獻1:蛋白質(zhì)核酸酶，2009年8月號(1233-1247，1271-1275)
[0024]非專利文獻2 疾病基因的探索和超高速序列”實驗醫(yī)學增刊，Vol27，Nol2(2009年，113(1929)-143(1959))
[0025]非專利文獻3:Mitelman et al., 2004, Nature Genetics, Vol.36, N0.4, p.331-334
[0026]非專利文獻4:Chinnaiyan et al., 2005, Science, Vol310, p.644-648
[0027]非專利文獻5:Soda et al.，2007，Nature, Vol.448，p.561-566
[0028]非專利文獻6:Bashir et al., April2008, PLoS Computational Biology, Vol4,Issue4, e1000051

【發(fā)明內(nèi)容】

[0029]本發(fā)明的目的在于提供具有能夠辨別由單個DNA分子形成的環(huán)狀DNA (以下也稱為“單分子環(huán)狀DNA”)、由多個DNA分子形成的環(huán)狀DNA(以下也稱為“多分子環(huán)狀DNA”)以及來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的特定結(jié)構(gòu)的環(huán)狀DNA分子的制作方法，和在環(huán)狀DNA的制作中僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的方法。
[0030]本發(fā)明的發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)通過向DNA單分子分別導入具有包含特有序列的特定結(jié)構(gòu)的銜接頭，并進行2步的切割和連接，從而能夠制作具有可辨別不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA、多分子環(huán)狀DNA和來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的特定結(jié)構(gòu)的環(huán)狀DNA分子。本發(fā)明的發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)在制作具有該結(jié)構(gòu)的環(huán)狀DNA分子后通過對銜接頭部位進行序列確定從而能夠僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的方法。
[0031]定義
[0032]本說明書中， “單分子環(huán)狀DNA”是指由單個DNA分子形成的環(huán)狀DNA，“多分子環(huán)狀DNA”是指由多個DNA分子形成的環(huán)狀DNA。
[0033]本說明書中，“環(huán)狀DNA分子”的術(shù)語是指單個環(huán)狀DNA分子或者多個環(huán)狀DNA分子。另外，多個環(huán)狀DNA分子有時也表述為由具有相同或不同的序列的多個環(huán)狀DNA分子構(gòu)成的“環(huán)狀DNA分子的集團”。
[0034]本說明書中，關(guān)于DNA分子，“來自于XX的”是指通過對DNA分子XX進行某種處理而由該DNA分子XX產(chǎn)生的意思。該術(shù)語不是指生成新的分子，典型而言，是指DNA分子的一部分分離而成為獨立的DNA分子、或DNA分子的一部分被切割而產(chǎn)生比切割前短的分子。
[0035]例如，“來自于”多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA是指由單個DNA分子形成的環(huán)狀DNA，是指通過限制性內(nèi)切酶處理等將多分子環(huán)狀DNA切割而產(chǎn)生的單個直鏈狀DNA分子通過自身環(huán)化而形成的環(huán)狀DNA。
[0036]另一方面，“不來自于”多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA是指由單個DNA分子形成的環(huán)狀DNA，是指單個直鏈狀DNA分子不經(jīng)過多分子環(huán)狀DNA的形成而自身環(huán)化產(chǎn)生的環(huán)狀 DNA。
[0037]另外，“來自于”銜接頭㈧或(b)的切割末端是指通過切割銜接頭㈧或(b)的切割位點而產(chǎn)生的末端，例如，通過限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的5’或3’突出末端與其相當。
[0038]本說明書中，“固有序列”是對各個銜接頭(b)而言固有的序列，是對各個銜接頭(b)而言不同的序列。如果固有序列的種類(銜接頭(b)的種類)足夠多，則對每個不同目標DNA結(jié)合具有不同的固有序列的銜接頭(b)。由此，在本發(fā)明的方法中，能夠以固有序列為標記，來辨別被制作的環(huán)狀DNA分子是不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA還是多分子環(huán)狀DNA或者來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA。
[0039]本說明書中，僅“選擇”不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA可以是從環(huán)狀DNA分子的集團中物理分離不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA，也可以是在數(shù)據(jù)分析的步驟中，從由環(huán)狀DNA分子的集團所得的信息(例如堿基序列數(shù)據(jù))中，僅選擇從不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA得到的信息。
[0040]本說明書中，“回文型限制性內(nèi)`切酶位點”是指識別回文序列的限制性內(nèi)切酶的識另IJ位點，“非回文型限制性內(nèi)切酶位點”是指識別非回文序列的限制性內(nèi)切酶的識別位點。
[0041]本發(fā)明在第一方式中，提供一種環(huán)狀DNA分子的集團的制作方法，是能夠從由該方法制作的環(huán)狀DNA分子的集團中僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的方法，包括以下工序:
[0042]I)使第一步環(huán)化用銜接頭(A)與各目標DNA分子的一末端結(jié)合并使包含銜接頭(b)和所述銜接頭(A)的第二步環(huán)化用銜接頭(B)與另一末端結(jié)合的工序，其中，銜接頭(B)介由銜接頭(b)側(cè)與DNA分子結(jié)合，銜接頭(B)中的銜接頭(A)位于DNA分子與銜接頭(b)的鍵的外側(cè)，
[0043]其中，銜接頭㈧包含切割位點，上述切割位點產(chǎn)生與任意銜接頭㈧的切割末端均非特異性結(jié)合的切割末端，
[0044]銜接頭(b)包含2個對每個該銜接頭(b)而言不同的固有序列，這2個固有序列是在相同方向或者相反方向取向的相同的序列，并且，
[0045]銜接頭(b)在這2個固有序列之間包含切割位點，上述切割位點產(chǎn)生與任意銜接頭(b)的切割末端均非特異性結(jié)合的切割末端，該切割位點在切割銜接頭(A)的切割位點時不被切割，且產(chǎn)生不與銜接頭(A)的切割末端結(jié)合的切割末端；
[0046]2)第一切割工序，在銜接頭(A)的切割位點切割工序I)中得到的DNA分子；
[0047]3)第一步環(huán)化工序，使工序2)中得到的DNA分子的兩個末端結(jié)合而環(huán)化；[0048]4)除去工序3)中未環(huán)化的線性DNA分子的工序；
[0049]5)第二切割工序，在銜接頭(b)的切割位點切割工序3)和工序4)中得到的環(huán)狀DNA分子；以及
[0050]6)第二步環(huán)化工序，使工序5)中得到的DNA分子的兩個末端結(jié)合而環(huán)化，
[0051]其中，對銜接頭(b)部分的序列進行序列確定，如果銜接頭(b)部分所含的2個固有序列相同，則判定工序6)中得到的環(huán)狀DNA分子為不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA，如果這2個固有序列不同，則判定工序6)中得到的環(huán)狀DNA分子為多分子環(huán)狀DNA或者來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA。
[0052]應予說明，在工序6)后，以下類型的DNA能夠作為線性DNA殘留:工序5)中被切割的(b)部分沒有再結(jié)合的單分子DNA(極微量)；和工序3)中多個DNA分子環(huán)化且在工序5)中切割各銜接頭(b)后，無法再結(jié)合的單分子或者多分子的DNA(它們占線性DNA的大多數(shù))?？梢猿ミ@些線性DNA，但不一定非要除去。由于該DNA不具有2個相同的固有序列并列的結(jié)構(gòu)，所以通過銜接頭(b)部分的序列確定能夠辨別，從分析對象中排除。
[0053]另外，本發(fā)明在第二方式中，提供一種不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的制作方法，包括以下工序:
[0054]I)利用本發(fā)明的第一方式的方法制作環(huán)狀DNA分子的工序；和
[0055]2)針對該制作的環(huán)狀DNA分子，對銜接頭(b)部分的序列進行序列確定，僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的工序，在此，如果銜接頭(b)部分所含的2個固有序列相同，則該環(huán)狀DNA 分子是不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA，如果這2個固有序列不同，則該環(huán)狀DNA分子是多分子環(huán)狀DNA或者來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA。
[0056]另外，本發(fā)明在第三方式中，提供一種在環(huán)狀DNA分子的制作中僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的方法，包括以下工序:
[0057]I)使第一步環(huán)化用銜接頭(A)與各目標DNA分子的一末端結(jié)合并使包含銜接頭(b)和上述銜接頭(A)的第二步環(huán)化用銜接頭(B)與另一末端結(jié)合的工序，其中，銜接頭(B)介由銜接頭(b)側(cè)與DNA分子結(jié)合，銜接頭(B)中的銜接頭(A)位于DNA分子與銜接頭(b)的鍵的外側(cè)，
[0058]其中，銜接頭㈧包含切割位點，上述切割位點產(chǎn)生與任意銜接頭㈧的切割末端均非特異性結(jié)合的切割末端，
[0059]銜接頭(b)包含2個對每個該銜接頭(b)而言不同的固有序列，這2個固有序列是在相同方向或者相反方向取向的相同的序列，并且，
[0060]銜接頭(b)在這2個固有序列之間包含切割位點，上述切割位點產(chǎn)生與任意銜接頭(b)的切割末端均非特異性結(jié)合的切割末端，該切割位點在切割銜接頭(A)的切割位點時不被切割，且產(chǎn)生不與銜接頭(A)的切割末端結(jié)合的切割末端；
[0061]2)第一切割工序，在銜接頭(A)的切割位點切割工序I)中得到的DNA分子；
[0062]3)第一步環(huán)化工序，使工序2)中得到的DNA分子的兩個末端結(jié)合而環(huán)化；
[0063]4)除去工序3)中未環(huán)化的線性DNA分子的工序；
[0064]5)第二切割工序，在銜接頭(b)的切割位點切割工序3)和工序4)中得到的環(huán)狀DNA分子；[0065]6)第二步環(huán)化工序，使工序5)中得到的DNA分子的兩個末端結(jié)合而環(huán)化；以及
[0066]7)對工序6)中得到的環(huán)狀DNA分子具有的銜接頭(b)部分的序列進行序列確定，僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的工序，其中，如果銜接頭(b)部分所含的2個固有序列相同，則該環(huán)狀DNA分子是不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA，如果這2個固有序列不同，則該環(huán)狀DNA分子是多分子環(huán)狀DNA或者來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA。
[0067]在本發(fā)明的第一到第三方式中，優(yōu)選銜接頭(A)是包含限制性內(nèi)切酶位點的雙鏈DNA,上述限制性內(nèi)切酶位點產(chǎn)生與任意銜接頭(A)的切割末端均彼此互補的切割末端，例如，是包含識別回文序列的限制性內(nèi)切酶的識別位點(“回文型限制性內(nèi)切酶位點”)的雙鏈 DNA。
[0068]在本發(fā)明的第一到第三方式中，優(yōu)選銜接頭(b)包含2個切割位點，上述切割位點產(chǎn)生與任意銜接頭(b)的切割末端均非特異性結(jié)合的切割末端。此時，由于沒有順利進行第二切割工序的環(huán)狀DNA分子的銜接頭(b)內(nèi)的2個切割位點間的序列沒有被除去，所以能夠通過銜接頭(b)的序列確定，將該分子作為“不完全克隆”辨別出來，從分析對象中排除。另外，銜接頭(b)所含的切割位點優(yōu)選是限制性內(nèi)切酶位點，例如，回文型限制性內(nèi)切酶位點。
[0069]在本發(fā)明的第一到第三方式中，銜接頭(b)所含的切割位點的數(shù)目至少為I個，優(yōu)選為2個，也可以為3個以上。另外，也可使用一對彼此取向相反的互為相同的切口制作酶識別位點作為銜接頭(A)和/或銜接頭(b)所含的切割位點。
[0070]在本發(fā)明的第一到第三方式中，優(yōu)選銜接頭(A)是包含回文型限制性內(nèi)切酶位點X的彼此互補的雙鏈DNA，
[0071]優(yōu)選銜接頭(B)是具有下述結(jié)構(gòu)Z1 — Y — Z2 — A或者Z1 — Y — Z’ 2 — A的彼此互補的雙鏈DNA:
【權(quán)利要求】
1.一種環(huán)狀DNA分子的集團的制作方法，是能夠從由該方法制作的環(huán)狀DNA分子的集團中僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的方法，包括以下工序: 1)使第一步環(huán)化用銜接頭(A)與各目標DNA分子的一末端結(jié)合并使包含銜接頭(b)和所述銜接頭(A)的第二步環(huán)化用銜接頭(B)與另一末端結(jié)合的工序，其中，銜接頭(B)介由銜接頭(b)側(cè)與DNA分子結(jié)合，銜接頭⑶中的銜接頭㈧位于DNA分子與銜接頭(b)的鍵的外側(cè)， 其中，銜接頭(A)包含切割位點，所述切割位點產(chǎn)生與任意銜接頭(A)的切割末端均非特異性結(jié)合的切割末端， 銜接頭(b)包含2個對每個該銜接頭(b)而言不同的固有序列，這2個固有序列是在相同方向或相反方向取向的相同序列，并且， 銜接頭(b)在這2個固有序列之間包含切割位點，所述切割位點產(chǎn)生與任意銜接頭(b)的切割末端均非特異性結(jié)合的切割末端，該切割位點在切割銜接頭(A)的切割位點時不被切割，且產(chǎn)生不與銜接頭(A)的切割末端結(jié)合的切割末端； 2)第一切割工序，在銜接頭㈧的切割位點切割工序I)中得到的DNA分子； 3)第一步環(huán)化工序，使工序2)中得到的DNA分子的兩個末端結(jié)合而環(huán)化； 4)除去工序3)中未環(huán)化的線性DNA分子的工序； 5)第二切割工序，在銜接頭(b)的切割位點切割工序3)和工序4)中得到的環(huán)狀DNA分子；以及 6)第二步環(huán)化工序，使工序5)中得到的DNA分子的兩個末端結(jié)合而環(huán)化， 其中，對銜接頭(b)部分的序列進行序列確定，如果銜接頭(b)部分所含的2個固有序列相同，則判定工序6)中得到的環(huán)狀DNA分子為不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA,如果這2個固有序列不同，則判定工序6)中得到的環(huán)狀DNA分子為多分子環(huán)狀DNA或者來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在銜接頭(b)的2個固有序列之間包含2個切割位點，所述切割位點產(chǎn)生與任意銜接頭(b)的切割末端均非特異性結(jié)合的切割末端。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，銜接頭(A)是包含回文型限制性內(nèi)切酶位點X的彼此互補的雙鏈DNA， 銜接頭⑶是具有下述結(jié)構(gòu)21 — ￥ — 22—六或者21 — ￥ — 2’2 —六的彼此互補的雙鏈 DNA， ft 0?





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I?I1A \./ I"銜接失々' 銜接.-- Z1-Y-Z2-A 結(jié)構(gòu)中， A是包含回文型限制性內(nèi)切酶位點X的雙鏈DNA，相當于銜接頭(A)， Z1-Y-Z2相當于權(quán)利要求1或2中的銜接頭(b)，Y是包含回文型限制性內(nèi)切酶位點Y1和y2的雙鏈DNA， Y1和y2相同，具有與X不同的序列，且產(chǎn)生與通過切割X產(chǎn)生的切割末端不互補的切割末端， Z1和Z2是包含對每個銜接頭而言不同的固有序列C1和C2的雙鏈DNA序列，其中，C1和C2是彼此取向相反的相同的序列， η是I~40的整數(shù)， N1~Nn各自相同或不同，是選自dAMP、dCMP、dGMP和dTMP中的脫氧核苷酸， N’ i~N’ n與所述N1~Nn相對應，分別是下述脫氧核苷酸，其中，k是I~η的整數(shù)，
4.一種環(huán)狀DNA分子的集團，是利用權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法制作的。
5.一種不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的制作方法，包括以下工序: 1)利用權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法制作環(huán)狀DNA分子的工序；和 2)針對該制作的環(huán)狀DNA分子，對銜接頭(b)部分的序列進行序列確定，僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的工序，在此，如果銜接頭(b)部分所含的2個固有序列相同，則該環(huán)狀DNA分子是不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA，如果這2個固有序列不同，則該環(huán)狀DNA分子是多分子環(huán)狀DNA或者來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA。
6.一種不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA，是利用權(quán)利要求5所述的方法制作的。
7.—種在環(huán)狀DNA分子的制作中僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的方法，包括以下工序: 1)使第一步環(huán)化用銜接頭(A)與各目標DNA分子的一末端結(jié)合并使包含銜接頭(b)和所述銜接頭(A)的第二步環(huán)化用銜接頭(B)與另一末端結(jié)合的工序，其中，銜接頭(B)介由銜接頭(b)側(cè)與DNA分子結(jié)合，銜接頭⑶中的銜接頭㈧位于DNA分子與銜接頭(b)的鍵的外側(cè)， 其中，銜接頭(A)包含切割位點，所述切割位點產(chǎn)生與任意銜接頭(A)的切割末端均非特異性結(jié)合的切割末端， 銜接頭(b)包含2個對每個該銜接頭(b)而言不同的固有序列，這2個固有序列是在相同方向或者相反方向取向的相同的序列，并且， 銜接頭(b)在這2個固有序列之間包含切割位點，所述切割位點產(chǎn)生與任意銜接頭(b)的切割末端均非特異性結(jié)合的切割末端，該切割位點在切割銜接頭㈧的切割位點時不被切割，且產(chǎn)生不與銜接頭(A)的切割末端結(jié)合的切割末端； 2)第一切割工序，在銜接頭㈧的切割位點切割工序I)中得到的DNA分子； 3)第一步環(huán)化工序，使工序2)中得到的DNA分子的兩個末端結(jié)合而環(huán)化； 4)除去工序3)中未環(huán)化的線性DNA分子的工序； 5)第二切割工序，在銜接頭(b)的切割位點切割工序3)和工序4)中得到的環(huán)狀DNA分子; 6)第二步環(huán)化工序，使工序5)中得到的DNA分子的兩個末端結(jié)合而環(huán)化；以及， 7)對工序6)中得到的環(huán)狀DNA分子具有的銜接頭(b)部分的序列進行序列確定，僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的工序，其中，如果銜接頭(b)部分所含的2個固有序列相同，則該環(huán)狀DNA分子是不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA，如果這2個固有序列不同，則該環(huán)狀DNA分子是多分子環(huán)狀DNA或者來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，銜接頭(b)在2個固有序列之間包含2個切割位點，所述切割位點產(chǎn)生與任意銜接頭(b)的切割末端均非特異性結(jié)合的切割末端。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中，銜接頭(A)是包含回文型限制性內(nèi)切酶位點X的彼此互補的雙鏈DNA， 銜接頭⑶是具有下述結(jié)構(gòu)21 — ￥ — 22—六或者21 — ￥ — 2’2 —六的彼此互補的雙鏈
10.一種不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA,是利用權(quán)利要求7~9中任一項所述的方法選擇的。
11.一種銜接頭，是由具有下述結(jié)構(gòu)Z1 — Y —Z2 — A或Z1 — Y —Z’2 —A的彼此互補的雙鏈DNA構(gòu)成的環(huán)狀DNA制作用銜接頭，用于能夠從使用該銜接頭制作的環(huán)狀DNA分子的集團中僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA，
12.—種試劑盒，是包含權(quán)利要求11所述的銜接頭和由雙鏈DNA構(gòu)成的銜接頭的環(huán)狀DNA制作用試劑盒，該雙鏈DNA包含與權(quán)利要求11所述的銜接頭所含的限制性內(nèi)切酶位點X相同的限制性內(nèi)切酶位點， 能夠從使用該試劑盒制作的環(huán)狀DNA分子的集團中僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA。
13.—種利用權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法制作cDNA文庫的方法，該文庫是能夠從該文庫中僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的文庫。
14.一種利用權(quán)利要求5所述的方法或權(quán)利要求7~9中任一項所述的方法制作cDNA文庫的方法，所述cDNA文庫僅由不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA構(gòu)成。
15.一種將環(huán)狀DNA分子供于配對法來鑒定基因的方法，包括以下工序: 1)解讀堿基序列的工序，所述堿基序列是在由權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法制作的環(huán)狀DNA分子的集團或者權(quán)利要求6或10所述的不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA中的與銜接頭⑶的兩側(cè)鄰接的各15個堿基~600個堿基，其中，使用由權(quán)利要求I~3中任一項所述的方法制作的環(huán)狀DNA分子的集團時，在該工序之前、與該工序同時或者在該工序之后，進一步 包括通過對銜接頭(b)部分的序列進行序列確定而僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的工序；和 2)通過將工序I中解讀的堿基序列與已知的基因的兩個末端的序列比較，來鑒定該不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA所含的基因的工序。
16.一種將環(huán)狀DNA分子供于配對法來檢測融合基因的方法，包括以下工序: 1)解讀堿基序列的工序，所述堿基序列是在由權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法制作的環(huán)狀DNA分子的集團或者權(quán)利要求6或10所述的不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA中的與銜接頭⑶的兩側(cè)鄰接的各15個堿基~600個堿基，其中，使用由權(quán)利要求I~3中任一項所述的方法制作的環(huán)狀DNA分子的集團時，在該工序之前、與該工序同時或者在該工序之后，進一步包括通過對銜接頭(b)部分的序列進行序列確定而僅選擇不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA的工序；和 2)將工序I中解讀的堿基序列與已知的基因的兩個末端的序列比較的工序，其中，兩個末端的基因與已知的相異的基因?qū)獣r，該不來自于多分子環(huán)狀DNA的單分子環(huán)狀DNA所含的基因被鑒定為融合基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的融合基因的檢測方法，其中，與銜接頭(B)的兩側(cè)鄰接的兩側(cè)的序列與已知融合基因的兩側(cè)的末端對應。
18.—種檢測疾病的方法，使用由權(quán)利要求16所述的方法檢測的融合基因作為標志物，檢測以該融合基因的表達為特征的疾病。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，通過與銜接頭(B)的兩側(cè)鄰接的序列與相異的基因的末端序列對應且不與已知融合基因的兩側(cè)的末端對應，從而鑒定環(huán)狀DNA分子所含的基因為新型融合基因。
20.由權(quán)利要求19所述的方法檢測的新型融合基因在藥物開發(fā)篩選中的應用。
【文檔編號】C12N15/09GK103890175SQ201280052157
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月31日
【發(fā)明者】水野晉一, 小澤秀俊, 長藤宏司, 岡村孝 申請人:學校法人久留米大學