專利名稱：基于PCR擴(kuò)增的200bpDNAladder模板p222及其制備體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域中電泳耗材DNAmarkeHDNA分子量 標(biāo)準(zhǔn))的制備方法的革新。具體地說，本發(fā)明以一種專有的PCR模板設(shè)計(jì)，建立了一套全新 的基于PCR擴(kuò)增方法的200bp DNA ladder的制備體系。
背景技術(shù)：
DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)是指一組分子量已知的DNA分子的混合物，電泳后按照其分子量 的大小和遷移率的不同，在凝膠上形成一個DNA片段分布的梯度(ladder)，用以指示電泳 過程中未知DNA樣品的分子量。目前，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)多是購自生物公司；同時由于其應(yīng)用 的普遍性和必要性，為了節(jié)約開支，很多實(shí)驗(yàn)室都自己制備常用的分子量標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)市場 上的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)從最初的以進(jìn)口產(chǎn)品為主、到目前以國產(chǎn)產(chǎn)品為主和許多自制品的出 現(xiàn)，其神秘的面紗正在慢慢退去。按照DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)制備所涉及的關(guān)鍵技術(shù)(過程)，其 制備方法可以分為限制性內(nèi)切酶酶切和PCR擴(kuò)增兩種方法；其中限制性內(nèi)切酶酶切的DNA 分子的來源又可以分為天然的基因組DNA和人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體；PCR擴(kuò)增又可分為單片 段的擴(kuò)增和多片段的擴(kuò)增。1.通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)利用DNA分子中存在的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(天然的或人為加入的)，采用合 適的內(nèi)切酶對其進(jìn)行消化，從而形成一組分子量各異的DNA片段，用來作為DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)。按照被消化DNA的來源可以分為兩種天然來源的特種DNA(如基因組)和人工構(gòu)建的 質(zhì)粒DNA。天然來源的基因組DNA的限制性內(nèi)切酶酶切是通過分離某種來源的基因組DNA 分子，然后用一種或幾種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，從而產(chǎn)生一系列的DNA片段組合，目前最 常見的此類DNA分子是Lamda噬菌體的基因組DNAU DNA)，由其產(chǎn)生的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)有 XDNA/Hindlll，λ DNA/EcoRI+HindIII等，也可以是某種具有多個常見酶切位點(diǎn)質(zhì)粒，如 pBR322DNA/AluI marker和pBR322DNA/BsuRI (HaeIII)marker,但是所用的內(nèi)切酶都是不常 用的，因而成本較高。人工構(gòu)建載體(質(zhì)粒)的限制性內(nèi)切酶酶切是通過一次性把所需要 的各種DNA片段克隆到高拷貝數(shù)的載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，通過發(fā)酵培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA的分離 純化，經(jīng)過適當(dāng)?shù)拿盖屑纯梢垣@得大量的目標(biāo)DNA片段。這種方法的優(yōu)勢在于通過大腸桿 菌的發(fā)酵擴(kuò)增質(zhì)粒獲得目的DNA片段，其制備規(guī)模很容易放大(50升的發(fā)酵體系很容易建 立，而PCR擴(kuò)增一般只能在小于500微升的體系內(nèi)進(jìn)行)，獲得的DNA片段條帶在凝膠上條 帶銳利，過程重復(fù)性高。不存在PCR擴(kuò)增再現(xiàn)性不好的缺點(diǎn)。但是由于DNA小片段分子量 小，電泳時條帶相對于高分子量的DNA大片段非常弱，所以上述重組載體不適用于制備DNA 小片段。這是利用重組載體制備各種DNA marker體系中存在的明顯缺陷。目前各種DNA 小片段的制備主要以PCR擴(kuò)增的方法為主。2.通過PCR擴(kuò)增制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)由于PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)強(qiáng)大的DNA片段的擴(kuò)增能力，同時由 于目前Taq DNA聚合酶工程菌株的廣為流傳，目前利用PCR方法生產(chǎn)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)不存在技術(shù)問題，成本主要是引物合成和dNTP的購置，其他PCR試劑如Taq DNA聚合酶，模板DNA， 反應(yīng)Buffer等均可自制。由于生產(chǎn)效率低，濃度強(qiáng)度高，因而限制了其大規(guī)模的制備和應(yīng)用。長期以來，分子生物學(xué)試劑與基因工程研究領(lǐng)域缺少作為PCR模板用的復(fù)合重組 載體設(shè)計(jì)方案和一種用于200bp DNA ladder中片段擴(kuò)增的專用載體，以及與之相應(yīng)的制備 體系。利用本發(fā)明中的載體可以復(fù)合體的方式制備DNA小片段，然后通過PCR產(chǎn)物的酶切 得到所需的目標(biāo)DNA小片段；以克服普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)生DNA片段生產(chǎn)效率低，勞動強(qiáng)度高等 缺陷；從而能夠快速、大規(guī)模的地生產(chǎn)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)200bp ladder。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，我們設(shè)計(jì)和重組構(gòu)建了用作PCR擴(kuò)增模板p222，并建立了相應(yīng)的200bp DNA ladder的制備體系，恰恰滿足了上述需求；其目的在于提供了一種專門用于200bp DNA ladder制備用的PCR擴(kuò)增模板p222。本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供一種利用上述的PCR擴(kuò)增模板p222制備200bp DNA ladder中所需的DNA分子的制備體系。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的制備用模板P222是一種專門用于200bpDNA ladder制備用的PCR擴(kuò)增模板，其中含有3個200bp的重組DNA片段，每個200bp片段兩端 均有兩個EcoRI酶切位點(diǎn)，三條重組DNA片段的結(jié)構(gòu)為E200E200E200E。本發(fā)明中200bp DNA ladder的PCR擴(kuò)增模板p222的構(gòu)建方法，包括如下步驟分別以Lambda噬菌體基因組DNA為模板，利用PCR的方法擴(kuò)增獲得如下片段 200E、E200E、E200bp，其中200E的3，末端、E200bp的5，末端，以及E200Ebp的兩個末端帶 有EcoRI限制向內(nèi)切酶的位點(diǎn)，三種DNA片段經(jīng)EcoRI酶切后，以一種順序連接的方式進(jìn)行 連接，然后以末端引物PFlR對連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，篩選獲得200-200-200bp連接產(chǎn)物。同 時為其末端添加TA克隆中所需要的突出端A(腺嘌呤核苷酸)；將上述連接產(chǎn)物TA克隆到 克隆載體pGEM-Teasy中，即得到設(shè)計(jì)模板p222。制備200bp DNA ladder中所需的DNA分子的制備體系以p222為擴(kuò)增模板，在其兩端(200-200-200)序列選擇合適位點(diǎn)作為引物位點(diǎn)， 擴(kuò)增獲得如下PCR產(chǎn)物200/400/600-拉00-200-200丨.-200/400/600,共九種PCR產(chǎn)物。經(jīng) EcoRI酶切后，所得產(chǎn)物均為200bp DNA ladder中的片段。PCR引物的組合可以調(diào)節(jié)目標(biāo) DNA片段之間的數(shù)量比例，從而使其具有相當(dāng)?shù)馁|(zhì)量關(guān)系。本發(fā)明中的PCR模板載體p222是一種專門用于200bp DNA ladder片段制備用 的PCR擴(kuò)增模板；通過靈活的引物位點(diǎn)選擇，可以特異性的以復(fù)合體的形式擴(kuò)增DNA片段 (200-1200bp)；所獲得的PCR產(chǎn)物過EcoRI的酶切可以釋放其中的目標(biāo)DNA片段。本發(fā)明的有益效果在于設(shè)計(jì)了一種PCR擴(kuò)增模板p222，其中含有3條由4個 EcoRI酶切位點(diǎn)分隔的200bp重組DNA片段；以此重組載體為PCR擴(kuò)增模板能夠以復(fù)合體 的形式高效制備200bp ladder中的DNA片段(通過EcoRI酶切)。與傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增方法 相比具有消耗少(如dNTP、DNA聚合酶、引物、反應(yīng)緩沖液、實(shí)驗(yàn)耗材等)、效率高(多片段 的同時擴(kuò)增)、省時省力等優(yōu)點(diǎn)；其優(yōu)勢還在于通過引物位點(diǎn)的選擇可以靈活的調(diào)整制備 片段的種類及其之間的數(shù)量關(guān)系。


圖1是基于PCR技術(shù)的200bp DNAladder制備用重組模板p222的圖譜。具體實(shí)施實(shí)例參照附圖，本發(fā)明提供的p222是一種專門用于200bp DNA ladder制備用的PCR 擴(kuò)增模板；其圖譜中含有3個200bp的重組DNA片段，每個200bp片段兩端均有兩個EcoRI 酶切位點(diǎn)，三條重組DNA片段的結(jié)構(gòu)為E200E200E200E。其200bp DNA ladder 制備體系為以p222為PCR擴(kuò)增模板，在其核心序列(200-200_200bp)兩側(cè)選擇合適位點(diǎn)作為 引物序列，擴(kuò)增可以獲得如下類型的PCR產(chǎn)物復(fù)合體200/400/600- |200-200-200丨-200/400/600，共 9 種擴(kuò)增復(fù)合體；每種復(fù)合體經(jīng)EcoRI部分或完全酶切后，所得產(chǎn)物均為200bp DNA ladder中的 DNA片段。
權(quán)利要求
基于PCR擴(kuò)增的200bp DNA ladder模板p222，其特征在于其圖譜中含有3個200bp的重組DNA片段，每個200bp片段兩端均有兩個EcoRI酶切位點(diǎn)，三條重組DNA片段的結(jié)構(gòu)為E200E200E200E。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于PCR擴(kuò)增的200bpDNA ladder模板p222的制備體系， 其特征在于以重組載體P222為模板，在其核心序列(200-200-200bp)兩側(cè)選擇合適位 點(diǎn)作為引物序列，擴(kuò)增可以獲得如下類型的PCR產(chǎn)物復(fù)合體=200/400/600- |200-200-200|. -200/400/600,共9種復(fù)合體；每一種復(fù)合物經(jīng)EcoRI酶切后，所得產(chǎn)物均為200bp DNA ladder中的片段。
全文摘要
基于PCR擴(kuò)增的200bp DNA ladder模板p222，其圖譜中含有3個200bp的重組DNA片段，每個200bp片段兩端均有兩個EcoRI酶切位點(diǎn)，三條重組DNA片段的結(jié)構(gòu)為E200E200E200E。其制備體系以重組載體p222為模板，在其核心序列(200-200-200bp)兩側(cè)選擇合適位點(diǎn)作為引物序列，擴(kuò)增可以獲得如下類型的PCR產(chǎn)物復(fù)合體200/400/600--200/400/600，共9種復(fù)合體；經(jīng)EcoRI酶切后，所得產(chǎn)物均為200bpDNAladder中的片段。
文檔編號C12N15/11GK101880661SQ20101019781
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者葉春和, 葉春江, 谷勁松 申請人:濟(jì)南大學(xué)