專利名稱：基于PCR擴增的DL2000中DNA小片段制備模板p1251及其制備體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域中電泳耗材DNA分子量標準制備方 法的創(chuàng)新。具體地說，本發(fā)明以一種專有的PCR模板設(shè)計，建立了全新的基于PCR擴增方法 的DL2000DNA marker小片段的制備體系。
背景技術(shù)：
DNA分子量標準是指一組分子量已知的DNA分子的混合物，電泳后按照其分子量 的大小和遷移率的不同，在凝膠上形成一個DNA片段分布的梯度(ladder)，用以指示電泳 過程中未知DNA樣品的分子量。目前，DNA分子量標準多是購自生物公司；同時由于其應(yīng)用 的普遍性和必要性，為了節(jié)約開支，很多實驗室都自己制備常用的分子量標準。國內(nèi)市場 上的DNA分子量標準從最初的以進口產(chǎn)品為主、到目前以國產(chǎn)產(chǎn)品為主和許多自制品的出 現(xiàn)，其神秘的面紗正在慢慢退去。按照DNA分子量標準制備所涉及的關(guān)鍵技術(shù)(過程)，其 制備方法可以分為限制性內(nèi)切酶酶切和PCR擴增兩種方法；其中限制性內(nèi)切酶酶切的DNA 分子的來源又可以分為天然的基因組DNA和人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體；PCR擴增又可分為單片 段的擴增和多片段的擴增。1.通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切制備DNA分子量標準利用DNA分子中存在的限制性內(nèi)切酶酶切位點(天然的或人為加入的)，采用合 適的內(nèi)切酶對其進行消化，從而形成一組分子量各異的DNA片段，用來作為DNA分子量標 準。按照被消化DNA的來源可以分為兩種天然來源的特種DNA(如基因組)和人工構(gòu)建的 質(zhì)粒DNA。天然來源的基因組DNA的限制性內(nèi)切酶酶切是通過分離某種來源的基因組DNA 分子，然后用一種或幾種限制性內(nèi)切酶進行消化，從而產(chǎn)生一系列的DNA片段組合，目前最 常見的此類DNA分子是Lamda噬菌體的基因組DNAU DNA)，由其產(chǎn)生的DNA分子量標準有 XDNA/Hindlll，λ DNA/EcoRI+HindIII等，也可以是某種具有多個常見酶切位點質(zhì)粒，如 pBR322DNA/AluI marker 和 pBR322DNA/BsuRI (HaeIII)marker，但是所用的內(nèi)切酶都是不 常用的，因而成本較高。人工構(gòu)建載體(質(zhì)粒)的限制性內(nèi)切酶酶切是通過一次性把所需 要的各種DNA片段克隆到高拷貝數(shù)的載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，通過發(fā)酵培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA的分 離純化，經(jīng)過適當?shù)拿盖屑纯梢垣@得大量的目標DNA片段。這種方法的優(yōu)勢在于通過大腸 桿菌的發(fā)酵擴增質(zhì)粒獲得目的DNA片段，其制備規(guī)模很容易放大(50升的發(fā)酵體系很容易 建立，而PCR擴增一般只能在小于500微升的體系內(nèi)進行)，獲得的DNA片段條帶在凝膠上 條帶銳利，過程重復(fù)性高。不存在PCR擴增再現(xiàn)性不好的缺點。但是由于DNA小片段分子量 小，電泳時條帶相對于高分子量的DNA大片段非常弱，所以上述重組載體不適用于制備DNA 小片段。這是利用重組載體制備各種DNA marker體系中存在的明顯缺陷。目前各種DNA 小片段的制備主要以PCR擴增的方法為主。2.通過PCR擴增制備DNA分子量標準由于PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)強大的DNA片段的擴增能力，同時由于目前Taq DNA聚合酶工程菌株的廣為流傳，目前利用PCR方法生產(chǎn)DNA分子量標準不存在 技術(shù)問題，成本主要是引物合成和dNTP的購置，其他PCR試劑如Taq DNA聚合酶，模板DNA， 反應(yīng)Buffer等均可自制。由于生產(chǎn)效率低，濃度強度高，因而限制了其大規(guī)模的制備和應(yīng)用。長期以來，分子生物學(xué)試劑與基因工程研究領(lǐng)域缺少作為PCR模板用的復(fù)合重組 載體設(shè)計方案和一種用于DL2000 DNA marker中DNA片段擴增的專用載體，以及與之相應(yīng) 的制備體系；以克服普通PCR擴增產(chǎn)生DNA片段生產(chǎn)效率低，勞動強度高等缺陷；從而能夠 快速、大規(guī)模的地生產(chǎn)DNA分子量標準DL2000中的DNA小片段。

發(fā)明內(nèi)容
經(jīng)過長期的實驗室研究，本發(fā)明恰恰滿足了上述需求，設(shè)計并重組構(gòu)建了用作PCR 擴增的模板P1251，并建立了相應(yīng)的DNAmarkerDL2000中DNA小片段的制備體系，恰恰滿足 了上述需求；其目的在于提供了一種DL2000中DNA小片段PCR擴增的模板pl251。本發(fā)明的進一步目的在于提供一種利用上述模板P1251通過PCR擴增和酶切相 結(jié)合的方法制備DL2000中DNA小片段的體系。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的制備用模板P1251是一種專門用于DNAmarker DL2000中DNA小片段制備用的PCR擴增模板；其圖譜如附圖1所示，其中含有3個重組DNA 片段(100bp、250bp、IOObp)，每條片段兩端均有兩個EcoRI酶切位點，三條重組DNA片段的 結(jié)構(gòu)為:E100E250E100Eo本發(fā)明中DNA marker DL2000的PCR擴增模板pl251的構(gòu)建方法，包括如下步驟分別以擬南芥基因組DNA為模板，利用PCR的方法擴增獲得了如下DNA片段100E、 E250E、E100bp，其中100E的3，末端、ElOO的5，末端，以及250bp的兩個末端帶有EcoRI限 制性內(nèi)切酶的位點。三種DNA片段經(jīng)EcoRI酶切后，以一種“順序連接”的方式進行連接， 然后以末端引物PF、PR對連接產(chǎn)物進行擴增，篩選獲得100-250-100bp連接產(chǎn)物。同時為 其末端添加TA克隆中所需要的突出端A’(腺嘌呤核苷酸)；將上述連接產(chǎn)物TA克隆到克 隆載體pGEM-T easy中，即得到設(shè)計模板pl251。制備DL2000中所需的DNA小片段的制備體系為以pl251為模板，在其兩端序列(100-250-100bp)兩側(cè)選擇合適位點作為引物位 點，PCR 擴增可獲得如下復(fù)合產(chǎn)物100/250/500- [l00-250-100| -100/250/-500/ 共九種 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)EcoRI酶切后，所得產(chǎn)物均為100、250或500bp，均可作為DL2000中的小片段。PCR 產(chǎn)物的組合可以調(diào)節(jié)100、250、500bp三種DNA片段之間的相對數(shù)量比例。本發(fā)明提供的PCR模板載體pl251是一種專門用于DL2000小片段制備用的PCR 擴增模板；通過靈活的引物位點選擇，可以特異性的以復(fù)合體的形式擴增DNA小片段100、 250和500bp ；所獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)過EcoRI的酶切可以釋放目標DNA片段。本發(fā)明的有益效果在于設(shè)計了一種PCR擴增模板pl251，其中含有由4個EcoRI酶切位點分隔的lOObp、 250bp、IOObp重組DNA片段；以pl251為PCR擴增模板能夠以復(fù)合體的形式高效制備DL2000 中的DNA小片段片段(通過EcoRI酶切)。與傳統(tǒng)的PCR擴增方法相比具有消耗少(如 dNTP、DNA聚合酶、引物、反應(yīng)緩沖液、實驗耗材等)、效率高(多片段的同時擴增)、省時省力等優(yōu)點。


圖1是制備DNA分子量標準DL2000小片段專用的重組PCR模板pl251的圖譜。具體實施實例參照附圖，本發(fā)明提供的pl251是一種專門用于DL2000中DNA小片段制備用的 PCR擴增模板；其中含有由4個EcoRI酶切位點分隔的100bp、250bp、IOObp重組DNA片段， 三條重組DNA片段的結(jié)構(gòu)為E100E250E100E。其DL2000DNA小片段制備體系為以pl251為PCR擴增模板，在其核心序列(100-250-100bp)兩側(cè)選擇合適位點作 為弓I物序列，擴增可以獲得如下類型的PCR產(chǎn)物復(fù)合體100/250/500- |l00-250-100| -100/250/500，共 9 種 PCR 產(chǎn)物復(fù)合體；每種復(fù)合體經(jīng)EcoRI完全酶切后，所得產(chǎn)物均為DNA marker DL2000中的DNA片段。
權(quán)利要求
基于PCR技術(shù)的用于DL2000中DNA小片段制備用的PCR擴增模板p1251，其特征在于其圖譜中其中含有由4個EcoRI酶切位點分隔的100bp、250bp、100bp重組DNA片段，三條重組DNA片段的結(jié)構(gòu)為E100E250E100E。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于PCR技術(shù)通過模板P1251制備DL2000中DNA小片段的 體系，其特征在于以重組載體P1251為PCR模板，在其核心序列(100-250-100bp)兩側(cè)選 擇合適位點作為引物序列，擴增可以獲得如下類型的PCR產(chǎn)物復(fù)合體100/250/500-1100-250-IO^ -100/250/500，共 9 種復(fù)合體；每種復(fù)合體經(jīng) EcoRI 完全酶 切后，所得產(chǎn)物均為 DNA marker DL2000 中的 DNA 片段(100bp、250bp、500bp)。
全文摘要
基于PCR擴增的DL2000中DNA小片段制備模板p1251，其圖譜中含有由4個EcoRI酶切位點分隔的100bp、250bp、100bp重組DNA片段，三條重組DNA片段的結(jié)構(gòu)為E100E250E100E。以p1251為PCR擴增模板，在其核心序列(100-250-100bp)兩側(cè)選擇合適位點作為引物序列，擴增可以獲得如下類型的PCR產(chǎn)物復(fù)合體100/250/500--100/250/500，共9種PCR產(chǎn)物復(fù)合體；每種復(fù)合體經(jīng)EcoRI完全酶切后，所得產(chǎn)物均為DNA marker DL2000中的DNA片段。
文檔編號C12N15/10GK101880660SQ20101019781
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者葉春和, 葉春江, 谷勁松 申請人:濟南大學(xué)