專利名稱：一種新的大腸桿菌分裂功能相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物生理學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新的大腸桿菌分裂功能相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移 酶的發(fā)現(xiàn)。
背景技術(shù)：
細(xì)菌細(xì)胞的分裂機(jī)制是迄今為止尚未完全揭示的領(lǐng)域之一 [1_2]。大腸桿菌 (Escherichia coli)基因組的2分鐘區(qū)域有一個(gè)與細(xì)胞分裂密切相關(guān)的活躍表達(dá)基因 簇-dcwcluster，這個(gè)基因簇的14個(gè)已知功能的基因序列中，有一半在E. coli (大腸桿菌) 中表達(dá)為細(xì)胞分裂環(huán)狀復(fù)合體的直接裝配蛋白(FtsL、FtsI、FtsW、FtsQ、FtsA、FtsZ、EnvA)， 另一半則表達(dá)為肽聚糖合成有關(guān)的連接酶和轉(zhuǎn)移酶等(MurE、MurF、MraY、MurD、MurG、MurC、 DdlB) [3_4]。見附圖IE. coli細(xì)胞分裂時(shí)，具有GTPase活性的FtsZ蛋白在FtsA蛋白的幫助 下，首先自我聚合于細(xì)胞中部，形成結(jié)合于質(zhì)膜上的Z環(huán)結(jié)構(gòu)，GTPase水解GTP提供能量使 Z環(huán)收縮并牽拉細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷，驅(qū)動(dòng)胞質(zhì)分離；隨后FtsI、FtsW等與肽聚糖合成有關(guān)的蛋白 依次聚合到Z環(huán)上，所以質(zhì)膜內(nèi)陷同時(shí)肽聚糖層合成；在最后裝配的AmiC(非dew簇蛋白) 等水解酶作用下，完成肽聚糖層分離，并通過脂蛋白橋接以生成細(xì)胞外膜[5_7]。然而，這個(gè)有序的細(xì)胞分裂Z環(huán)復(fù)合體組裝過程卻被發(fā)現(xiàn)受到細(xì)胞內(nèi)S-腺苷甲硫 氨酸水平的影響。S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)是細(xì)胞代謝途徑中的通用甲基供體，細(xì)胞內(nèi)幾 乎所有用于甲基化修飾的甲基都來自AdoMet甲硫高能鍵，AdoMet在體內(nèi)主要是由AdoMet 合成酶(MetK)通過甲硫氨酸和ATP合成[8_9]。Newman等發(fā)現(xiàn)當(dāng)E. coli的AdoMet合成酶水 平降低，造成細(xì)胞內(nèi)甲基供體AdoMet缺乏時(shí)，細(xì)胞就不會(huì)正常分裂，而是形成十幾或幾十 微米長的絲狀菌體_。LaMonte等也發(fā)現(xiàn)，如果將來自T3噬菌體的AdoMet水解酶基因?qū)?E. coli菌體細(xì)胞，使胞內(nèi)AdoMet水平下降時(shí)，大腸桿菌也形成了長的絲狀體[11]。進(jìn)一步研 究表明，絲狀菌體中，引發(fā)E. coli細(xì)胞分裂的Z環(huán)復(fù)合體裝配可以正常起始，但不會(huì)完成， 而當(dāng)亮氨酸調(diào)節(jié)的AdoMet合成酶水平恢復(fù)正常，細(xì)胞內(nèi)甲基供體AdoMet不再缺乏時(shí)，細(xì)胞 分裂也隨即恢復(fù)正常[1°]。由此推測，分裂復(fù)合體的某些裝配元件可能需要甲基化修飾后才 能被組裝，也可能某些已經(jīng)裝配的蛋白元件必須在甲基化修飾后才能招集到后續(xù)的蛋白元 件與之結(jié)合[1°]，再一可能性就是該蛋白元件的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)過程需要甲基化修飾的參與。那么細(xì)胞分裂過程中，AdoMet所提供的甲基在E. coli細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)過程中又是 由哪個(gè)酶進(jìn)行傳遞的呢？這就是本發(fā)明的切入點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞分裂過程起調(diào)節(jié)作用的甲基轉(zhuǎn)移酶。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案我們對(duì)文獻(xiàn)資料綜合分析后發(fā)現(xiàn)，最有可能的候選甲基轉(zhuǎn)移酶就是基因同樣位于 dew基因簇上的YabC蛋白。yabB和yabC是位于dew基因簇前兩位的未知功能基因，它們 都是高度同源保守又活躍表達(dá)的序列，其中yabC不僅同源保守性高，而且該序列廣泛存在于幾乎所有的細(xì)菌分裂基因簇上，而dew基因簇上其它的基因，甚至于表達(dá)為Z環(huán)復(fù)合體中 的最重要蛋白的ftsZ基因，都不是所有細(xì)菌基因組中必須存在的[2’12]。而與之相對(duì)應(yīng)，在 產(chǎn)黃青霉、產(chǎn)黃頭孢霉等細(xì)胞分裂不明顯的絲狀真菌的基因組中，我們卻沒有發(fā)現(xiàn)yabC的 同源基因序列。我們將YabC蛋白序列與海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)的已知甲基轉(zhuǎn)移酶 lm6y序列[13]同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，YabC蛋白結(jié)構(gòu)中存在明顯的AdoMet結(jié)合位點(diǎn)，如附圖2所示。 由此判斷，YabC很可能就是細(xì)胞分裂過程中，執(zhí)行甲基化修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶。根據(jù)以上分析，我們進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，首先通過PCR擴(kuò)增獲取yabC序 列，與PGEX質(zhì)粒重組，成功地構(gòu)建了 pGST-yabC表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析分離純化得 到GST-YabC融合蛋白。甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測方面，我們建立了基于重組S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy) 核苷酶(MTAN，EC 3. 2. 2. 9)和重組S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS，EC3. 2. 1. 148)的酶偶聯(lián) 分析檢測技術(shù)(附圖3)。 AdoMet通過甲基轉(zhuǎn)移酶被轉(zhuǎn)甲基后生成AdoHcy，產(chǎn)物AdoHcy通過MTAN (AdoHcy 核苷酶)和LuxS兩個(gè)過量重組酶催化，兩步裂解反應(yīng)后，完全轉(zhuǎn)化為高半胱氨酸 (homocycteine)，最后用 ElIman試劑 DTNB 定量。LuxS和 MTAN分別來自 BL21 (DE3) /pLuxS轉(zhuǎn) 化株和GI728/pMTAN轉(zhuǎn)化株，這兩種酶蛋白序列的N末端均連有組氨酸標(biāo)簽(His-tagged)， 我們通過Ni2+瓊脂糖親和層析柱吸附，咪唑洗脫得到甲基轉(zhuǎn)移酶酶偶聯(lián)反應(yīng)的兩個(gè)重組 酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，獲取的兩個(gè)重組酶均呈現(xiàn)很好的催化能力，酶偶聯(lián)反應(yīng)生成的TNB與 AdoHcy濃度呈現(xiàn)顯著的線性正相關(guān)。我們將E. coli的AdoMet合成酶基因(metK)的突變菌株MEW402metK84作為YabC 蛋白的甲基轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)受體來源，該菌株在低濃度的亮氨酸培養(yǎng)基中，AdoMet合成酶水平下 降，細(xì)胞分裂異常，形成長的絲狀體。絲狀體細(xì)胞中由于甲基供體AdoMet缺乏，會(huì)含有大量 未甲基化或部分甲基化的甲基靶點(diǎn)受體。我們將培養(yǎng)獲得的絲狀體細(xì)胞進(jìn)行超聲波裂解， 絲狀體裂解液(含有未甲基化的甲基靶點(diǎn)受體)在過量的AdoMet條件下和純化的YabC蛋 白進(jìn)行細(xì)胞外孵育，通過酶偶聯(lián)技術(shù)檢測到了明顯的AdoHcy的生成。而同樣條件下，YabC 蛋白與正常分裂細(xì)胞裂解液(含有己甲基化的甲基靶點(diǎn)受體)孵育，則沒有任何AdoHcy生 成。這個(gè)結(jié)果充分證明了 YabC蛋白的甲基轉(zhuǎn)移酶功能及與細(xì)胞分裂的關(guān)聯(lián)特性。


圖1圖示了 E. coli基因組2分鐘區(qū)域的dew基因簇。圖2是蛋白分子空間構(gòu)象模擬圖，表明了以lm6y為模板模擬的E.coli的YabC蛋 白3D分子結(jié)構(gòu)。Domain I包含甲基轉(zhuǎn)移酶共同的AdoMet的結(jié)合域，Domain II是特異性 底物的結(jié)合域。圖3是酶偶聯(lián)分析檢測技術(shù)反應(yīng)機(jī)理圖。圖4為凝膠電泳圖，YabC蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)電泳圖，GST-YabC融合蛋白分子量約為60kDa，被蛋白酶Factor Xa酶切后，呈 現(xiàn)為34. 9kDa的YabC蛋白和約為26kDa的GST蛋白。圖5A為微生物細(xì)胞的顯微照片，MEW402metK84菌株在高濃度的亮氨酸(100 μ g/ml)培養(yǎng)基中正常分裂的細(xì)胞。圖5B為微生物細(xì)胞的顯微照片，.MEW402metK84菌株在低濃度的亮氨酸(5 μ g/ ml)培養(yǎng)基中生成的絲狀菌體細(xì)胞。圖6圖示了細(xì)胞裂解液在過量的AdoMet條件下37 °C和純化的YabC蛋白 進(jìn)行孵育30分鐘，通過酶偶聯(lián)分析技術(shù)檢測到的YabC蛋白催化的甲基轉(zhuǎn)移過程 生成的SAH(AdoHcy)。a. MEW402metK84 (Mm84)菌株正常分裂的細(xì)胞裂解液(CLs)； b. MEW402metK84(Mm84)菌株絲狀菌體細(xì)胞裂解液；c. DH5 α菌株正常分裂的細(xì)胞裂解液； f.對(duì)照除了 GST-YabC蛋白在鹽酸胍終止反應(yīng)后再加入反應(yīng)體系，包含有MEW402metK84菌 株絲狀菌體細(xì)胞裂解液在內(nèi)的所有酶偶聯(lián)分析系統(tǒng)的組分。圖7為隨甲基化反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)體系中檢測到的產(chǎn)物SAH(AdoHcy)濃度的變化曲線 圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1GST-YabC融合蛋白的表達(dá)與純化，其過程包括以下步驟i.表達(dá)采用包含BamHI與XhoI內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物，正向引物 YabC-GST-R(BamHI) :GCC GGATCC GAAAACTATAAACATACTACG，反向引物 YabC-GST-F(XhoI) GCG CTCGAG TCATGCATTCGTCCTCTCTGC,以大腸桿菌XLl-Blue染色體DNA為模板聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增942bp的產(chǎn)物yabC，PCR產(chǎn)物克隆入pGEX(InVitrogen)質(zhì)粒載體， 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5 α。轉(zhuǎn)化株接種于含有100 μ g/mL氨芐青霉素 的 Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)液中 37 "C，225rpm 振蕩培養(yǎng)至 OD6tltl 達(dá)到 0. 5-0. 6，ImM 異丙 基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)GST-YabC融合蛋白。ii.純化離心收集菌體，IXPBS緩沖液洗三次，超聲波裂解離心(30，OOOg)去沉 淀，裂解液上樣于5ml谷胱甘肽瓊脂糖4B親和層析柱(Pharmacia)，用IXPBS(pH 7. 8)緩 沖液洗5-6個(gè)柱體積，最后用含有IOmM還原性谷胱甘肽的50mMTris-Cl，pH 8. O洗脫液洗 脫，SDS-PAGE確定產(chǎn)率和純度(見附圖4) ,GST-YabC融合蛋白分子量約為60kDa，被蛋白酶 Factor Xa酶切后，呈現(xiàn)為34. 9kDa的YabC蛋白和約為26kDa的GST蛋白。實(shí)施例2制備AdoMet合成酶基因(metK)的突變菌株MEW402metK84絲狀體細(xì)胞裂解液，其 過程包括以下步驟i.培養(yǎng)LB平板上挑取MEW402metK84單菌落，37°C、225rpm LB培養(yǎng)液振蕩過夜培 養(yǎng)；以1 1000的接種量轉(zhuǎn)接含有0.2%葡萄糖、100yg/ml亮氨酸的基本培養(yǎng)基中，37°C、 225rpm振蕩培養(yǎng)10-12小時(shí)；離心收集細(xì)胞后，用含有5 μ g/ml亮氨酸的基本培養(yǎng)基洗2_3 次，以1 2000的接種量轉(zhuǎn)接含有0.2%葡萄糖、5μ g/ml亮氨酸的基本培養(yǎng)基中，37°C、 225rpm振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)，即得MEW402metK84絲狀體細(xì)胞(見附圖5B)。ii.裂解離心收集菌體，Hepes緩沖液洗三次，超聲波裂解離心(30，OOOg)去沉 淀，即得MEW402metK84絲狀體細(xì)胞裂解液。絲狀體細(xì)胞裂解液蛋白濃度采用Bradford法 測定。實(shí)施例3
利用基于重組S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶(MTAN，EC 3. 2. 2. 9)和重組S-核糖 基高半胱氨酸酶(LuxS，EC 3.2. 1. 148)的酶偶聯(lián)分析檢測技術(shù)測定YabC蛋白的甲基轉(zhuǎn)移 酶活性，其過程包括以下步驟酶偶聯(lián)分析檢測技術(shù)檢測甲基轉(zhuǎn)移酶活性酶偶聯(lián)分析檢測系統(tǒng)包含有 1. 5yMYabC蛋白、0. 23mg/ml MEW402metK84絲狀體細(xì)胞裂解液、430 μ M S-腺苷甲硫氨酸 (AdoMet)，1. 5 μ M S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶(MTAN)，10 μ M S-核糖基高半胱氨酸酶 (LuxS)，ρΗ8· 0的IOOmM Hepes緩沖液，37°C反應(yīng)30分鐘，用四倍體積的5，5，-聯(lián)硫-2， 2，-雙硝基苯甲酸(DTNB) (133 μ M)-鹽酸胍(8Μ)溶液終止反應(yīng)，412nm比色測定生成的 5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)，根據(jù)S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)與5-硫代-2-硝基 苯甲酸(TNB)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算轉(zhuǎn)甲基生成的S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)量，來分析 YabC蛋白的甲基轉(zhuǎn)移酶活性(見附圖6-7)。
權(quán)利要求
一種新的大腸桿菌分裂功能相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶-YabC蛋白，其特征在于該蛋白與大腸桿菌分裂異常的絲狀菌體細(xì)胞裂解液以及甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)孵育后，可成功地檢測到甲基轉(zhuǎn)移后生成的共同產(chǎn)物S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述YabC蛋白，其特征在于(1)該蛋白對(duì)應(yīng)的核酸序列位于大腸桿菌基因組的2分鐘區(qū)域與細(xì)胞分裂密切相關(guān)的 活躍表達(dá)基因簇-dew cluster上，是高度同源保守又活躍表達(dá)的序列；(2)該蛋白序列與海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)的已知甲基轉(zhuǎn)移酶lm6y序列同 源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，YabC蛋白結(jié)構(gòu)中存在明顯的AdoMet結(jié)合位點(diǎn)；(3)該蛋白分子量約為34.9kDa,由分子量約為60kDa的GST-YabC融合蛋白被蛋白酶 Factor Xa酶切后獲得；(4)該蛋白的甲基轉(zhuǎn)移酶活性通過檢測甲基轉(zhuǎn)移后生成的共同產(chǎn)物S-腺苷-L-高半胱 氨酸(AdoHcy)確定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述GST-YabC融合蛋白，其特征在于(1)該融合蛋白是YabC蛋白的基因序列yabC經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增后、克隆入 pGEX (InVitrogen)質(zhì)粒載體、并轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌DH5 α中表達(dá)的產(chǎn)物；(2)該融合蛋白通過谷胱甘肽瓊脂糖4Β親和層析柱吸附，經(jīng)過還原性谷胱甘肽洗脫獲 得純化的GST-YabC融合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基因序列yabC，其特征在于是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的 942bp的核酸序列，PCR擴(kuò)增的正向和反向引物分別包含BamHI與XhoI內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述甲基轉(zhuǎn)移后生成的共同產(chǎn)物S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)， 其特征在于該產(chǎn)物生成量通過基于重組S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶(MTAN，EC 3. 2. 2. 9)和重組S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS，EC3. 2. 1. 148)的酶偶聯(lián)分析檢測技術(shù)確 定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于重組S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶(MTAN，EC3.2.2.9) 和重組S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS，EC3. 2. 1. 148)的酶偶聯(lián)分析檢測技術(shù)，其特征在于 酶偶聯(lián)分析檢測系統(tǒng)包含有YabC蛋白、MEW402metK84絲狀體細(xì)胞裂解液、S-腺苷甲硫氨酸 (AdoMet)，S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶(MTAN)，IS-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS)，Hepes 緩沖液，反應(yīng)終止用四倍體積的5，5'-聯(lián)硫_2，2'-雙硝基苯甲酸(DTNB)-鹽酸胍溶液 終止反應(yīng)，比色測定生成的5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)，根據(jù)S-腺苷-L-高半胱氨酸 (AdoHcy)與5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算轉(zhuǎn)甲基生成的S-腺苷-L-高 半胱氨酸(AdoHcy)量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的MEW402metK84絲狀體細(xì)胞裂解液，其特征在于由 MEW402metK84絲狀體細(xì)胞超聲波裂解離心后獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的MEW402metK84絲狀體細(xì)胞，其特征在于(1)是S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)合成酶基因(metK)的突變菌株；(2)通過接種含有葡萄糖、高濃度亮氨酸的基本培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后離心收集細(xì)胞 后，再以低的接種量轉(zhuǎn)接含有葡萄糖、低濃度亮氨酸的基本培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)獲得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的大腸桿菌分裂功能相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明通過生物信息學(xué)序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法推測位于大腸桿菌染色體2分鐘區(qū)域的與細(xì)胞分裂密切相關(guān)的活躍表達(dá)基因簇-dcw cluster上的yabC基因表達(dá)的蛋白YabC是調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂過程的甲基轉(zhuǎn)移酶，并采用基于重組S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶和重組S-核糖基高半胱氨酸酶的酶偶聯(lián)分析檢測技術(shù)，通過YabC蛋白與大腸桿菌分裂異常的絲狀菌體細(xì)胞裂解液以及甲基供體S-腺苷甲硫氨酸孵育，成功地檢測到了甲基轉(zhuǎn)移后生成的共同產(chǎn)物S-腺苷-L-高半胱氨酸，從而證明了YabC蛋白催化甲基轉(zhuǎn)移的功能以及細(xì)胞分裂的關(guān)聯(lián)特性。
文檔編號(hào)C12N9/10GK101880653SQ20101019780
公開日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者葉春江, 谷勁松 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)