專(zhuān)利名稱(chēng)：一種制備小牛胸腺alpha 1的新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種天然存在的胸腺肽制備方法，尤其涉及一種制備小牛胸腺alpha 1的新工藝。
背景技術(shù)：
胸腺肽，中文名胸腺肽α1；小牛胸腺alpha 1；胸腺素alpha 1；胸腺28肽；英文名Thymosinα1；Thymosin alpha 1；商品名日達(dá)仙，化學(xué)結(jié)構(gòu)式Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-L-Asp Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH分子式及分子量C145H240N44O48S23431.9胸腺素α1最早是從牛的胸腺中分離到的。由于組織提取受到材料來(lái)源的限制，且產(chǎn)率極低，不適合大批量生產(chǎn)。
1979年Wang等用液相化學(xué)合成方法合成本品之后，有人陸續(xù)報(bào)道了用固相全合成和片段合成法化學(xué)合成，為生產(chǎn)創(chuàng)造了條件。目前市場(chǎng)上出售的胸腺素α1均為化學(xué)合成，國(guó)外的產(chǎn)品已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)，并且已成功進(jìn)入我國(guó)市場(chǎng)。
胸腺肽a1由瑞士諾華制藥公司研制開(kāi)發(fā)，商品名為密鈣息(英文名Miacaicic)，1991年3月獲得FDA批準(zhǔn)上市。
美國(guó)專(zhuān)利(USP508,382)報(bào)道了一種固相法合成胸腺肽α1的制備方法采用Bco策略合成胸腺肽α1的方法，該所述文獻(xiàn)公開(kāi)的方法使用劇毒、腐蝕性試劑，三廢多，工藝復(fù)雜，成本高，工業(yè)化實(shí)施具有一定的難度，不能滿足臨床應(yīng)用的需要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)一種制備小牛胸腺alpha 1的新工藝，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，滿足臨床應(yīng)用的需要。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)以Rink Amide PEGA樹(shù)脂、Rink Amide AM樹(shù)脂或Rink Amide MBHA樹(shù)脂其中的任何一種為起始原料，在接肽試劑中，與Fmoc-Asn(R1)-OH或Fmoc-Asp(R2)-R3接肽反應(yīng)，以TBTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt其中的任何一種為縮合劑，逐個(gè)接上氨基酸，其間依次加入醋酐進(jìn)行乙?；忸^反應(yīng)、加入脫帽試劑脫帽反應(yīng)，脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，獲得保護(hù)二十八肽樹(shù)脂；其中R1＝-H，-Trt，-Xan。
R2＝-OH，-OAll，-OMe，-OEt，-OPr，-OBu，-OtBu，-Obzl或OcHx。
R3＝-OH，-OAll，-OMe，-OEt，-OPr，-OBu，-OtBu，-OBzl，OcHx或-OPfp。
所說(shuō)的接肽試劑為T(mén)BTU(MW321.1)、HBTU(MW379.3)或BOP(MW442.3)其中的任何一種、HOBT(MW135.1)或HOAT(MW136.1)、NMM(MW＝101.2)或DIPEA(MW＝129.2)和DMF，NMM或DIPEA和DMF的體積比為NMM或DIPEA∶DMF＝1∶5～15；以被封頭的樹(shù)脂的重量為基準(zhǔn)，醋酐的用量為2～20毫升/克；所說(shuō)的脫帽試劑為六氫吡啶的DMF溶液，六氫吡啶的重量濃度為15～55％，以被脫帽的樹(shù)脂的重量為基準(zhǔn)，脫帽試劑的用量為5～20毫升/克；接肽反應(yīng)溫度為15～55℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5～3小時(shí)；乙?；忸^反應(yīng)溫度為15～55℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5～3小時(shí)；脫帽反應(yīng)溫度為15～55℃，反應(yīng)時(shí)間為10～50分鐘；(2)加入切肽試劑切肽，得胸腺肽α1粗品；(3)在C18柱或C8中進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
總收率約為12％。
其中保護(hù)二十八肽樹(shù)脂的制備方法，包括如下步驟(1)將原料樹(shù)脂Rink Amide-AM樹(shù)脂、Rink Amide-MBHA樹(shù)脂或Rink Amide PEGA樹(shù)脂其中的任何一種，用DMF浸泡0.5～2小時(shí)，使樹(shù)脂充分溶脹，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(A)；(2)然后加入Fmoc-Asp-OtBu和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(B)；NMM或DIPEA和DMF的混合溶液中(A)的重量濃度為5～20％，F(xiàn)moc-Asp-OtBu的摩爾數(shù)為(A)的2～5倍，TBTU、HBTU或BOP的摩爾數(shù)為(A)的2～5倍，HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為(A)的2～5倍；(3)在(B)中加入脫帽試劑，15～55℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Glu(OtBu)-OH(MW425.5)和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙酰化反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(C)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(B)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Glu(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(4)在步驟(3)的(C)中加入脫帽試劑，15～55℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤隖moc-Ala-OH(MW311.3)和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(D)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(C)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ala-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(5)在步驟(4)的(D)中加入脫帽試劑，15～55℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加入Fmoc-Glu(OtBu)-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(E)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(D)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Glu(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(6)在步驟(5)的(E)中加入脫帽試劑，15～55℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞＜覨moc-Glu(OtBu)-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(F)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(E)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Glu(OtBu)-OH的重量為摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(7)在步驟(6)的(F)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加Fmoc-Val-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(G)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(F)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Val-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(8)在步驟(7)的(G)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加Fmoc-Val-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤氪佐?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(H)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(G)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Val-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(9)在步驟(8)的(H)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加Fmoc-Glu(OtBu)和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(I)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(H)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Glu(OtBu)的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(10)在步驟(9)的(I)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加Fmoc-Lys(Boc)-OH(FW468.5)和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙酰化反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(J)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(I)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；
(11)在步驟(10)的(J)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加Fmoc-Lys(Boc)-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(K)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(J)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Lys(Boc)-OH摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(12)在步驟(11)的(K)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加Fmoc-Glu(OtBu)-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙酰化反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(L)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(K)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Glu(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(13)在步驟(12)的(L)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑覨moc-Lys(Boc)-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(M)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(L)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(14)在步驟(13)的(M)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑覨moc-Leu-OH(FW335.4)和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(N)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(M)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Leu-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；
(15)在步驟(14)的(N)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Asp(OtBu)-OH(FW411.5)和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤氪佐?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，依用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(O)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(N)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(16)在步驟(15)的(O)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Lys(Boc)-OH(FW468.5)和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙酰化反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(P)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(O)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(17)在步驟(16)的(P)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Thr(tBu)-OH(FW397.5)和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(Q)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(P)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(18)在步驟(17)的(Q)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Thr(tBu-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙酰化反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(R)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(Q)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(19)在步驟(18)的(R)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Ile-OH(FW353.4)和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(S)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(R)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ile-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；醋酐的DMF溶液中，醋酐的重量濃度同上；(20)在步驟(19)的(S)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Glu(OtBu)-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(T)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(S)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Glu(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(21)在步驟(20)的(T)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑覨moc-Ser(tBu)-OH(FW383.4)和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤氪佐?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(U)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(T)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(22)在步驟(21)的(U)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑覨moc-Ser(tBu)-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤氪佐?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(V)；
NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中；(U)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(23)在步驟(22)的(V)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞＜覨moc-Thr(tBu)-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙酰化反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(X)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(V)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(24)在步驟(23)的(X)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Asp(OtBu)-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙酰化反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(Y)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(X)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(25)在步驟(24)的(Y)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑覨moc-Val-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(Z)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(Y)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Val-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(26)在步驟(25)的(Z)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Ala-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙酰化反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?，獲得(Z1)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(Z)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ala-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(27)在步驟(27)的(Z1)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑覨moc-Ala-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙酰化反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(Z2)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(Z1)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ala-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(28)在步驟(27)的(Z2)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患覨moc-Asp(OtBu)-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(Z3)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(Z2)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(29)在步驟(28)的(23)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Ser(tBu)-OH(FW383.4)和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋?5～55℃乙?；磻?yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(Z4)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(Z3)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(30)在步驟(29)的(Z4)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加入醋?5～55℃乙酰化反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈?，甲醇洗滌，干燥，獲得保護(hù)的28肽樹(shù)脂
Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBtu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-S34(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-樹(shù)脂。
所說(shuō)的切肽包括如下步驟將所說(shuō)的保護(hù)的28肽樹(shù)脂加入切肽試劑(TFA/TIS/EDT/H2O＝900/40/25/10，體積)，25-30℃攪拌1～3小時(shí)，過(guò)濾，氮?dú)獯蹈桑瑸V液加無(wú)水乙醚沉淀，過(guò)濾，收集沉淀獲得胸腺肽α1粗品；保護(hù)的28肽樹(shù)脂與切肽試劑的重量比例為保護(hù)的28肽樹(shù)脂∶切肽試劑＝1∶5～20；所說(shuō)的純化包括如下步驟將上述收集的濾液通過(guò)C18或C8柱純化，流動(dòng)相為0.05-1M醋酸鹽或磷酸鹽或三氟乙酸鹽∶乙腈(10-90∶90-10)；流速為50～650ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，凍干，收集目標(biāo)產(chǎn)物，收率17.2％(以Rink AmideMBHA-樹(shù)脂的18.7mmol計(jì))，純度≥98％。
由上述公開(kāi)的技術(shù)方案可見(jiàn)，本發(fā)明的方法，具備規(guī)模生產(chǎn)能力，工藝簡(jiǎn)單，成本低，三廢少，質(zhì)量上乘(純度≥98％)。接肽收率高(每步接肽收率為≥99％)。生產(chǎn)成本低。采用C18柱進(jìn)行分離純化，流動(dòng)相為0.05-1M醋酸鹽或磷酸鹽或三氟乙酸鹽∶乙腈(10-60∶90-40)；流速為50～1000ml/min的方法，避免使用氟化氫，減少三廢。每步接肽收率均在99％以上；總收率約為12％。
由此可見(jiàn)，本發(fā)明的方法便于工業(yè)化實(shí)施，具有較大的產(chǎn)業(yè)化前景。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例和前述過(guò)程中所采用的原料列表如下其中R1＝-H，-Trt，-Xan。
R2＝-OH，-OAll，-OMe，-OEt，-OPr，-OBu，-OtBu，-Obzl或OcHx。
R3＝-OH，-OAll，-OMe，-OEt，-OPr，-OBu，-OtBu，-OBzl，OcHx或-OPfp。
實(shí)施例1實(shí)施例中，所說(shuō)的脫帽試劑為六氫吡啶的DMF溶液，六氫吡啶的重量濃度為25％。
(1)制備Fmoc-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂取50gRink Amide MBHA樹(shù)脂(0.8mmol/g樹(shù)脂，40mmol)裝入反應(yīng)容器中，用500ml DMF浸泡、洗滌，使樹(shù)脂充分溶脹，氮?dú)獯蹈?。DMF洗滌六次，氮?dú)獯涤凇?br>
取82g(FW411.5，200mmol)Fmoc-Asp-OtBu，64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器，25℃反應(yīng)2小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，分別用用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
加入500ml醋酐∶DMF(1∶1，體積，下同)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(2)制備Fmoc-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘，氮?dú)獯蹈桑訢MF洗滌六次。加入85.1g(FW425.5，200mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌三次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(3)制備Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?2.3g(FW311.3，200mmol)Fmoc-Ala-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(4)制備Fmoc-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?5.1g(FW425.5，200mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(5)制備Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?5.1g(FW425.5，200mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜尤?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(6)制備Fmoc-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?5.1g(FW425.5，200mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜尤?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(7)制備Fmoc-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?5.1g(FW425.5，200mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(8)制備Fmoc-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂在上述脫帽反應(yīng)后的樹(shù)脂中，加85.1g(FW425.5，200mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(9)制備Fmoc-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?3.7g(FW468.5，200mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(10)制備Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?3.7g(FW468.5，200mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(11)制備Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜?5.1g(FW425.5，200mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(12)制備Fmoc-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜?3.7g(FW468.5，200mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜尤?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(13)制備Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜?0.7g(FW353.4，200mmol)Fmoc-Leu-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(14)制備Fmoc-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?2.3g(FW411.5，200mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(15)制備Fmoc-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-ASp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?3.7g(FW468.5，200mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(16)制備Fmoc-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?9.5g(FW397.5，200mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(17)制備Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜?9.5g(FW397.5，200mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(18)制備Fmoc-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?0.7g(FW353.4，200mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜尤?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(19)制備Fmoc-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜?5.1g(FW425.5，200mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(20)制備Fmoc-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?6.7g(FW383.4，200mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(21)制備Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜?6.7g(FW383.4，200mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(22)制備Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?0.7g(FW353.4，200mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜尤?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(23)制備Fmoc-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜?2.3g(FW411.5，200mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(24)制備Fmoc-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?5.1g(FW425.5，200mmol)Fmoc-Glu(OtBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(25)制備Fmoc-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜?2.3g(FW311.3，200mmol)Fmoc-Ala-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(26)制備Fmoc-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?2.3g(FW311.3，200mmol)Fmoc-Ala-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜尤?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(27)制備Fmoc-Asp(OtBtu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。?2.3g(FW411.5，200mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(28)制備Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBtu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜?6.7g(FW383.4，200mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、64.2g(200mmol)TBTU、27.0g(200mmol)HOBT，用500ml DMF溶解，加入反應(yīng)容器。25℃反應(yīng)1小時(shí)。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈?。加?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞?br>
(29)制備Ac-Ser(tBu)-Asp(OtBtu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asp-(OtBu)-樹(shù)脂加入500ml脫帽試劑，25℃反應(yīng)15分鐘。DMF洗滌六次，氮?dú)獯蹈伞＜尤?00ml醋酐∶DMF(1∶1)，25℃反應(yīng)1小時(shí)。氮?dú)獯蹈桑謩e用DMF、無(wú)水乙醇、和DMF和無(wú)水乙醇各洗滌三次；氮?dú)獯蹈珊?，放入真空干燥器中干燥，稱(chēng)重，保護(hù)的28肽樹(shù)脂約120g。
(30)制備Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH的粗品保護(hù)的28肽樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到2000ml反應(yīng)瓶中，加入事先配制好的試劑(TFA/EDT/H2O/TIS＝800ml/30ml/15ml/15ml)，25℃攪拌2小時(shí)。濾去樹(shù)脂，樹(shù)脂用TFA洗3次，合并濾液及洗滌液，減壓濃縮至小體積，加入1500ml冷甲基叔丁基醚沉淀，離心收集，用甲基叔丁基醚洗后，P2O5真空干燥，得肽粗品約72g。
6分離純化將肽粗品溶于水后，過(guò)濾，濾液分批經(jīng)C18柱純化，流動(dòng)相0.2M磷酸緩沖液∶乙腈(7.5∶2.5)；流速為500ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后凍干，得12g白色塊狀物成品。總收率12％。
實(shí)施例2～3采用與實(shí)施例1相同的方法和工藝條件，其中分別以Rink Amide AM樹(shù)脂或Rink Amide PEGA樹(shù)脂作起始原料，同前法接上Fmoc-Asp(R1)-R2后，再加入脫帽試劑，25℃反應(yīng)2小時(shí)，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-氨基酸、TBTU或HBTU和HOBT的混合物，25℃反應(yīng)2小時(shí)，再經(jīng)切肽等反應(yīng)，得到11.2g和13.1g白色疏松塊狀物成品，收率分別為11.3％和13.2％。
權(quán)利要求
1.一種制備小牛胸腺alpha 1的新工藝，其特征在于，包括如下步驟(1)以Rink Amide PEGA樹(shù)脂、Rink Amide AM樹(shù)脂或Rink Amide MBHA樹(shù)脂或Rink Amide PEGA樹(shù)脂其中的任何一種為起始原料，在接肽試劑中，與Fmoc-Asn(R1)-OH或Fmoc-Asp(R2)-R3加縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，逐個(gè)接上氨基酸，其間依次加入醋酐進(jìn)行乙酰化封頭反應(yīng)、加入脫帽試劑進(jìn)行脫帽反應(yīng)，脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，獲得保護(hù)二十八肽樹(shù)脂；其中R1＝-H，-Trt，-Xan；R2＝-OH，-OAll，-OMe，-OEt，-OPr，-OBu，-OtBu，-Obzl或OcHx；R3＝-OH，-OAll，-OMe，-OEt，-OPr，-OBu，-OtBu，-OBzl，OcHx或-Opfp；所說(shuō)的接肽試劑為NMM或DIPEA中的一種和DMF，NMM或DIPEA和DMF的體積比為NMM或DIPEA∶DMF＝1∶5～15；所說(shuō)縮合劑為T(mén)BTU/HOBt或HBTU/HOBt或BOP/HOBt及或TBTU/HOAt或HBTU/HOAt或BOP/HOAt其中的任何一種為縮合劑
所說(shuō)的脫帽試劑為六氫吡啶的DMF溶液；(2)加入切肽試劑進(jìn)行切肽，得胸腺肽α1粗品；(3)在C18柱或C8中進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，六氫吡啶的重量濃度為15～55％，以被脫帽的樹(shù)脂的重量為基準(zhǔn)，脫帽試劑的用量為5～20毫升/克；接肽反應(yīng)溫度為15～55℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5～3小時(shí)；乙?；忸^反應(yīng)溫度為15～55℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5～3小時(shí)；脫帽反應(yīng)溫度為15～55℃，反應(yīng)時(shí)間為10～50分鐘；以被封頭的樹(shù)脂的重量為基準(zhǔn)，醋酐的用量為2～20毫升/克。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，保護(hù)二十八肽樹(shù)脂的制備方法，包括如下步驟(1)將原料樹(shù)脂Rink Amide-AM樹(shù)脂、Rink Amide-MBHA樹(shù)脂或Rink Amide PEGA樹(shù)脂其中的任何一種用DMF浸泡0.5～2小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(A)；(2)然后加入Fmoc-Asp-OtBu和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(B)；NMM或DIPEA和DMF的混合溶液中(A)的重量濃度為5～20％，F(xiàn)moc-Asp-OtBu的摩爾數(shù)為(A)的2～5倍，TBTU、HBTU或BOP的摩爾數(shù)為(A)的2～5倍，HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為(A)的2～5倍；(3)在(B)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Glu(OtBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(C)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(B)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Glu(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(4)在步驟(3)的(C)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入Fmoc-Ala-OH(MW311.3)和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(D)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(C)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ala-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(5)在步驟(4)的(D)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)1，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加入Fmoc-Glu(OtBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤氪佐阴；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(E)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(D)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Glu(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(6)在步驟(5)的(E)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加Fmoc-Glu(OtBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(F)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(E)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Glu(OtBu)-OH的重量為摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(7)在步驟(6)的(F)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加Fmoc-Val-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(G)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(F)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Val-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(8)在步驟(7)的(G)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加Fmoc-Val-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙酰化反?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(H)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(G)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Val-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(9)在步驟(8)的(H)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加Fmoc-Glu(OtBu)和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤氪佐阴；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(I)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(H)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Glu(OtBu)的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(10)在步驟(9)的(I)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?。加Fmoc-Lys(Boc)-OH(FW:468.5)和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(J)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(I)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(11)在步驟(10)的(J)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Lys(Boc)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤氪佐阴；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(K)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(J)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Lys(Boc)-OH摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(12)在步驟(11)的(K)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑覨moc-Glu(OtBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤氪佐阴；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(L)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(K)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Glu(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(13)在步驟(12)的(L)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑覨moc-Lys(Boc)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙酰化反?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(M)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(L)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(14)在步驟(13)的(M)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Leu-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，獲得(N)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(M)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Leu-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(15)在步驟(14)的(N)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Asp(OtBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙酰化反?yīng)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(O)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(N)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(16)在步驟(15)的(O)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Lys(Boc)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤氪佐阴；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(P)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(O)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(17)在步驟(16)的(P)中加入脫帽試劑，20～30℃脫帽反應(yīng)10～50分鐘，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Thr(tBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(Q)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(P)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(18)在步驟(17)的(Q)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Thr(tBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙酰化反?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(R)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(Q)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(19)在步驟(18)的(R)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑覨moc-Ile-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(S)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(R)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ile-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；醋酐的DMF溶液中，醋酐的重量濃度同上；(20)在步驟(19)的(S)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Glu(OtBu)-OH和接肽試劑，15～55℃接肽反應(yīng)0.5～3小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(T)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(S)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Glu(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(21)在步驟(20)的(T)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Ser(tBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤氪佐阴；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑@得(U)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(T)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(22)在步驟(21)的(U)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Ser(tBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(V)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(U)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(23)在步驟(22)的(V)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈伞＜覨moc-Thr(tBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙酰化反?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(X)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(V)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(24)在步驟(23)的(X)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈桑覨moc-Asp(OtBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙酰化反?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(Y)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(X)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(25)在步驟(24)的(Y)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Val-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(Z)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(Y)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Val-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(26)在步驟(25)的(Z)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)1，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Ala-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈桑肈MF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(Z1)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(Z)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ala-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(27)在步驟(27)的(Z1)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Ala-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙?；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(Z2)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(Z1)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ala-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(28)在步驟(27)的(Z2)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加Fmoc-Asp(OtBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?；加入醋酐乙酰化反?yīng)，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(Z3)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(Z2)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(29)在步驟(28)的(23)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加Fmoc-Ser(tBu)-OH和接肽試劑，接肽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑珼MF洗滌，氮?dú)獯蹈桑患尤氪佐阴；磻?yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，獲得(Z4)；NMM或DIPEA與DMF的混合溶液中(Z3)的重量濃度為5～20％；Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；TBTU或HBTU或BOP的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；HOBT或HOAT的摩爾數(shù)為樹(shù)脂的2～5倍；(30)在步驟(29)的(Z4)中加入脫帽試劑，脫帽反應(yīng)，氮?dú)獯蹈?，用DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，加入醋酐乙酰化反?yīng)，氮?dú)獯蹈?，DMF洗滌，氮?dú)獯蹈?，甲醇洗滌，干燥，獲得保護(hù)的28肽樹(shù)脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的切肽包括如下步驟將所說(shuō)的保護(hù)的28肽樹(shù)脂加入切肽試劑(TFA/TIS//EDT/H2O＝900ml/40ml/25ml/10ml)，25-30℃攪拌1～3小時(shí)，過(guò)濾，氮?dú)獯蹈?，濾液加無(wú)水乙醚沉淀，過(guò)濾，收集沉淀獲得胸腺肽α1粗品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，保護(hù)的28肽樹(shù)脂與切肽試劑的重量比例為保護(hù)的28肽樹(shù)脂∶切肽試劑＝1∶5～20。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的純化包括如下步驟將上述收集的濾液通過(guò)C18或C8柱純化，流動(dòng)相為0.05-1M醋酸鹽或磷酸鹽或三氟乙酸鹽∶乙腈(10-40∶90-60)；流速為50～1000ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，凍干，收集目標(biāo)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備小牛胸腺alpha 1(天然存在于小牛等動(dòng)物胸腺細(xì)胞中)的新工藝。本發(fā)明利用Fmoc－策略固相法制備胸腺alpha 1的新工藝。包括以下步驟a.RinkAmide PEGA樹(shù)脂或Rink Amide AM樹(shù)脂或Rink Amide MBHA樹(shù)脂或Rink AmidePEGA樹(shù)脂其中的任何一種為起始原料，用Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體掛上樹(shù)脂后，按照固相合成的方法依次連接各種保護(hù)氨基酸得到保護(hù)二十八肽樹(shù)脂；b.其間依次用醋酐封頭；c.其間依次脫去Fmoc－保護(hù)基團(tuán)；d.脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽同步進(jìn)行，得粗品；e.粗品經(jīng)反相HPLC分離純化，制得胸腺肽α1精品。本發(fā)明具備規(guī)模生產(chǎn)能力，工藝簡(jiǎn)單，成本低，三廢少，質(zhì)量上乘(純度≥98％)。接肽收率高(每步接肽收率為≥99％)?？偸章始s為12％，便于工業(yè)化實(shí)施，具有產(chǎn)業(yè)化前景。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101033248SQ200610024610
公開(kāi)日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2006年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月10日
發(fā)明者周逸明 申請(qǐng)人:周逸明, 上海子能制藥有限公司