專利名稱：一種雷莫拉寧的純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗生素雷莫拉寧的制備，特別涉及一種雷莫拉寧的純化方法。
背景技術：
雷莫拉寧(Ramoplanin，A/16686)提純的傳統(tǒng)方法是通過常規(guī)前處理步驟用鹽酸將產(chǎn)生雷莫拉寧菌株，如Actinoplanes sp.ATCC 33076的發(fā)酵產(chǎn)物調(diào)pH至3.5，分離得到菌絲體和發(fā)酵液。其中菌絲體用有機溶劑，如甲醇等低級醇或氯仿等提取，得到含有目的物的粗提液，真空濃縮得到漿狀物，即雷莫拉寧的粗提液濃縮物，再用正丁醇萃取多次，合并萃取液后，再反復用石油醚析出沉淀并分離其，真空干燥得到粗品；而發(fā)酵液也用正丁醇萃取，然后用同樣方法制得粗品。該粗品反復用混合溶劑氯仿∶乙醇∶水(體積比4∶7∶2)處理，得到油狀物，加水結晶并固液分離，得到的固體和液體還需不同溶劑多步處理后，得到較純的粗品再濕法上硅膠柱純化；例如上述的固體用不同的有機溶劑(如甲醇、正丁醇、乙醚等)反復處理，得到較純的粗品后再溶于乙腈與水的混合物，然后濕法上硅膠柱，用不同溶劑(乙腈與水混合物，以及乙腈與0.1N鹽酸混合物)作為流動相洗柱子，用薄層色譜法檢測，收集目的洗脫液(USP 4328316)。可見其過程復雜，有機溶劑使用量很大，污染嚴重，且由于萃取次數(shù)多，造成損失而收率低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是克服上述現(xiàn)有技術中的缺陷，提供一種步驟簡化、明顯減少有機溶劑使用量的雷莫拉寧的純化方法。
本發(fā)明通過下列技術方案來解決上述技術問題。一種雷莫拉寧的純化方法，其包括將雷莫拉寧的粗提液濃縮物先與部分硅膠混合，揮干溶劑，再將得到的固體混合物置于以硅膠為填充物的柱子上端進行柱層析，其中依次用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇與酸水的混合物作為流動相。
其中，該甲醇與酸水的體積比較佳地為1∶4～4∶1。甲醇含量太高或者太低的話，雷莫拉寧和其他的雜質分離效果不明顯。所說的酸水選自鹽酸，硫酸、醋酸和磷酸等；通常選用其稀溶液，其濃度優(yōu)選為0.01mol/l～1mol/l。
而該甲醇水溶液中甲醇與水的體積比優(yōu)選1∶4～4∶1。甲醇比例太低的話，有些雜質洗脫速度慢；反之，甲醇比例太高，有些雜質也不容易洗脫下來。
更佳地，該硅膠柱中粗提液濃縮物(未揮發(fā)溶劑前)占其與硅膠總重量的百分比不超過10％，超過以后，多余量的產(chǎn)物無法被吸附，從而會被開始的丙酮溶劑洗脫下來，無法達到分離的目的。該百分比更佳地為3～8％(根據(jù)實施例改的)。而粗提液濃縮物先與部分硅膠混合時，“部分硅膠”的用量是指能夠將粗提液濃縮物完全混合吸附后便于上柱的量，大約是和粗提液濃縮物等量就可以了，一般不會超過3倍。
而本發(fā)明所說的雷莫拉寧的粗提液濃縮物可根據(jù)現(xiàn)有技術制備，如參照上述專利文獻所公開的有關內(nèi)容。本發(fā)明選用下列具體步驟制得將產(chǎn)生雷莫拉寧菌株，如ATCC33076的發(fā)酵產(chǎn)物用酸調(diào)pH至3.5，離心得到菌絲體和發(fā)酵液；其中菌絲體再用極性有機溶劑浸泡半小時以上，然后離心得到上清液，濃縮至漿狀物即得該雷莫拉寧的粗提液濃縮物。
當然，根據(jù)上述專利文獻所知，本發(fā)明的雷莫拉寧的粗提液濃縮物也可將發(fā)酵液直接濃縮至漿狀物制得。
其中，所述的酸優(yōu)選草酸，所述的極性有機溶劑為甲醇或乙醇。
利用上述本發(fā)明的干法硅膠柱純化方法，可分部收集上述不同流動相的流出液，HPLC跟蹤檢測，收集目的物含量達到85％以上的流出液，濃縮至干得到雷莫拉寧。則純度達到85％以上，而收率達到90％以上。可見，本發(fā)明純化方法步驟簡單，有機溶劑使用量明顯減少，并具有較高的收率和純度。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。
下面實施例中所用的雷莫拉寧的粗提液濃縮物選用下列步驟制得參照現(xiàn)有技術，如上述美國專利文獻的例1發(fā)酵培養(yǎng)ATCC 33076菌株，然后發(fā)酵產(chǎn)物用草酸調(diào)pH至3.5，離心得到菌絲體，再用極性有機溶劑甲醇或乙醇(1L/kg菌絲體)浸泡菌絲體半小時以上，然后離心得到上清液，濃縮至漿狀物(通常體積為上清液的1/10～1/20)即得該雷莫拉寧的粗提液濃縮物。
其中下列實施例中的收率由純化得到的雷莫拉寧/上述上清液(w/w)計算得到。
實施例1取雷莫拉寧的粗提液濃縮物5g，與5g硅膠攪拌混合，揮干溶劑，再將得到的固體混合物置于以50g硅膠為填充物的柱子的上端(柱高×直徑20cm×3cm)，分別用丙酮，甲醇與水(v/v，1∶4)的混合物，以及甲醇與0.1mol/l的鹽酸水溶液(v/v，1∶4)混合物作為流動相，流速1ml/min，分部收集流出液，采用常規(guī)HPLC跟蹤檢測(方法同現(xiàn)有技術USP 4427656)，收集目的物含量達到85％以上的流出液，濃縮至干得到純化的雷莫拉寧。收率為93％，純度達到85％。
實施例2取雷莫拉寧的粗提液濃縮物5g，與7.5g硅膠攪拌混合，流動相中甲醇與水體積比為4∶5，甲醇與酸水(0.5mol/l的硫酸)的體積比為4∶5，余同實施例1。制得雷莫拉寧收率為94％，純度達到89％。
實施例3
取雷莫拉寧的粗提液濃縮物3g，與5g硅膠攪拌混合，流動相中甲醇與水體積比為4∶1，甲醇與酸水(1mol/l的醋酸)的體積比為4∶1，余同實施例1。制得雷莫拉寧收率為93％，純度達到87％。
實施例4取雷莫拉寧的粗提液濃縮物2g，與4g硅膠攪拌混合，流動相中甲醇與水體積比為2∶1，甲醇與酸水(0.01mol/l的磷酸)的體積比為2∶1，余同實施例1。制得雷莫拉寧收率為92％，純度達到86％。
上述實施例中柱層析用硅膠(200～300目)，青島海洋化工廠產(chǎn)品，余試劑均為常規(guī)市售產(chǎn)品。
權利要求
1.一種雷莫拉寧的純化方法，其包括將雷莫拉寧的粗提液濃縮物與部分硅膠混合，揮干溶劑，再將得到的固體混合物置于以硅膠為填充物的柱子上端進行柱層析，其中依次用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇與酸水的混合物作為流動相。
2.如權利要求1所述的純化方法，其特征在于該甲醇與酸水的體積比為1∶4～4∶1。
3.如權利要求1或2所述的純化方法，其特征在于所說的酸水選自鹽酸，硫酸、醋酸和磷酸。
4.如權利要求3所述的純化方法，其特征在于該酸水濃度為0.01mol/l～1mol/l。
5.如權利要求1所述的純化方法，其特征在于該甲醇水溶液中甲醇與水的體積比為1∶4～4∶1。
6.如權利要求1所述的純化方法，其特征在于該硅膠柱中粗提液濃縮物占其與硅膠總重量的百分比不超過10％。
7.如權利要求1所述的純化方法，其特征在于該雷莫拉寧的粗提液濃縮物可由下列步驟制得將產(chǎn)生雷莫拉寧菌株的發(fā)酵產(chǎn)物用酸調(diào)pH至3.5，離心得到菌絲體和發(fā)酵液；其中菌絲體再用極性有機溶劑浸泡半小時以上，然后離心得到上清液，濃縮至漿狀物；或者將發(fā)酵液直接濃縮至漿狀物即得該雷莫拉寧的粗提液濃縮物。
8.如權利要求7所述的純化方法，其特征在于所述的酸為草酸，所述的極性有機溶劑選自甲醇和乙醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雷莫拉寧的純化方法，其包括將雷莫拉寧的粗提液濃縮物與部分硅膠混合，揮干溶劑，再將得到的固體混合物置于以硅膠為填充物的柱子上端進行柱層析，其中依次用丙酮、甲醇水溶液、以及甲醇與酸水的混合物作為流動相。本發(fā)明的提純方法步驟簡單，有機溶劑使用量明顯減少，并具有較高的收率和純度。
文檔編號C07G11/00GK101024662SQ20061002415
公開日2007年8月29日 申請日期2006年2月24日 優(yōu)先權日2006年2月24日
發(fā)明者李繼安, 徐斌 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院