使用人工微rna沉默基因的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了使用微RNA(miRNA)的方法和組合物，當(dāng)在植物細(xì)胞中表達(dá)時，微RNA能夠降低靶序列(即內(nèi)源性序列)的mRNA水平而不降低一個或多個密切相關(guān)序列的mRNA水平。當(dāng)miRNA可被設(shè)計為對于特定靶序列具有特異性時，本專利申請展示了miRNA能特異性沉默靶序列而不沉默與所述靶序列具有很高序列同一性的密切相關(guān)的序列。在某些實施例中，可用重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體抑制內(nèi)源性的靶序列，而不沉默具有與所述靶序列密切相關(guān)的序列的重組的目的多核苷酸。此類方法和組合物使用了制備21-nt?miRNA的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體。還提供了摻入了包含目的多核苷酸的miRNA表達(dá)構(gòu)建體和重組多核苷酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子。
【專利說明】使用人工微RNA沉默基因的方法和組合物
[0001]相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002]本專利申請要求提交于2011年10月28日的美國臨時申請61/552，700的權(quán)益，其全部內(nèi)容以引用方式并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明的領(lǐng)域一般涉及植物分子生物學(xué)。更具體地，其涉及降低靶序列表達(dá)水平的構(gòu)建體和方法。
【背景技術(shù)】
[0004]生物化學(xué)家和生物技術(shù)專家為了得到期望的表型將基因的改版(或改組版)導(dǎo)入生物體中。然而，由于仍然殘存的內(nèi)源性基因產(chǎn)物的存在通常沒有得到所期望的結(jié)果。因此，希望用改版替換內(nèi)源性基因。
[0005]在植物中已經(jīng)使用了多種方法來克服這些問題；遺憾的是，此類方法被證明對于用改版替換內(nèi)源性基因是不夠的。例如，使用長的雙鏈RNA的傳統(tǒng)RNAi (RNA干擾)沉默已被證明是有效的，因為所述內(nèi)源性的和被導(dǎo)入的基因間的同源性使得兩種基因都沉默。靶向所述內(nèi)源性基因的啟動子的雙鏈RNA有一些成功希望，但是很多情況下沉默的效率不夠，并且因為所述啟動子被沉默了不可能使用內(nèi)源性啟動子表達(dá)被導(dǎo)入的基因。因此，在植物中需要方法和組合物以使得編碼具有改善特性的蛋白的基因的改版表達(dá)，同時除去或降低所述基因的內(nèi)源性型式的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]提供了使用微RNA( miRNA)的方法和組合物，當(dāng)在植物細(xì)胞中表達(dá)時，微RNA能夠降低靶序列(即內(nèi)源性序列)的mRNA水平而不降低一個或多個密切相關(guān)序列的mRNA水平。當(dāng)miRNA可被設(shè)計為對于特定祀序列具有特異性時,本專利申請展示了 miRNA能特異性沉默靶序列而不沉默與所述靶序列具有很高序列同一性的密切相關(guān)的序列。在某些實施例中，可使用重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體抑制靶序列(即內(nèi)源性序列)而不沉默目的重組多核苷酸，其具有與所述靶序列緊密相關(guān)的序列。此類方法和組合物使用了制備21-nt miRNA的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體。還提供了摻入了包含目的多核苷酸的miRNA表達(dá)構(gòu)建體和重組多核苷酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物和種子。
[0007]附圖和序列說明
[0008]圖1是所述質(zhì)粒PHP39309的圖表。
[0009]圖2是所述質(zhì)粒PHP39307的圖表。
[0010]圖3是所述質(zhì)粒PHP39308的圖表。
[0011]圖4是所述質(zhì)粒PHP40973的圖表。
[0012]圖5是所述質(zhì)粒PHP38464的圖表。
[0013]圖6是所述質(zhì)粒PHP38463的圖表。[0014]圖7是所述質(zhì)粒PHP38465的圖表。
[0015]圖8是所述質(zhì)粒PHP38462的圖表。
[0016]序列描述以及所附序列表遵循如37C.F.R.§ 1.821-1.825所列出的關(guān)于專利申請中核苷酸和/或氨基酸序列公開的規(guī)定。此序列表中以單個字母表示核苷酸，并且以三字母表示氨基酸，如 Nucleic Acids Res.13:3021-3030 (1985)和 Biochemical J.219(2):345-373(1984)中所述的IUPAC-1UBMB標(biāo)準(zhǔn)，它們引入本文以供參考。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循如37C.F.R.§ 1.822所示的規(guī)定。
[0017]SEQ ID NO:1是對應(yīng)于本文中稱作PEPC4A的amiRNA的DNA的核苷酸序列。
[0018]SEQ ID NO:2是對應(yīng)于本文中稱作PEPC4B的amiRNA的DNA的核苷酸序列。
[0019]SEQ ID NO:3是對應(yīng)于在所述396h-PEPC4A amiRNA前體中的人工星序列的DNA的核苷酸序列。
[0020]SEQ ID NO:4是對應(yīng)于在所述396h-PEPC4b amiRNA前體中的人工星序列的DNA的核苷酸序列。
[0021]SEQ ID NO:5是對應(yīng)于在所述169r-PEPC4A amiRNA前體中的人工星序列的DNA的核苷酸序列。
[0022]SEQ ID NO:6是所述amiRNA前體396h_P`EPC4A的核苷酸序列。
[0023]SEQ ID NO:7是所述amiRNA前體396h_PEPC4B的核苷酸序列。
[0024]SEQ ID NO:8是所述amiRNA前體169r_PEPC4A的核苷酸序列。
[0025]SEQ ID NO:9是所述PHP38464質(zhì)粒的核苷酸序列(圖5)。
[0026]SEQ ID NO:10是所述質(zhì)粒PHP38463的核苷酸序列(圖6)。
[0027]SEQ ID NO: 11是所述質(zhì)粒PHP38465的核苷酸序列(圖7)。
[0028]SEQ ID NO:12是所述質(zhì)粒PHP38462的核苷酸序列(圖8)。
[0029]SEQ ID NO:13是對應(yīng)于本文中稱作RCAla的amiRNA的DNA的核苷酸序列。
[0030]SEQ ID NO:14是對應(yīng)于在所述396h-RCAla amiRNA前體中的人工星序列的DNA的核苷酸序列。
[0031]SEQ ID NO:15是對應(yīng)于在所述169r-RCAla amiRNA前體中的人工星序列的DNA的
核苷酸序列。
[0032]SEQ ID NO: 16是所述amiRNA前體396h_RCAla的核苷酸序列。
[0033]SEQ ID NO:17是所述amiRNA前體169r_RCAla的核苷酸序列。
[0034]SEQ ID NO:18是所述質(zhì)粒PHP39309的核苷酸序列(圖1)。
[0035]SEQ ID NO:19是所述質(zhì)粒PHP39307的核苷酸序列(圖2)。
[0036]SEQ ID NO:20是所述質(zhì)粒PHP39308的核苷酸序列(圖3)。
[0037]SEQ ID NO:21是所述質(zhì)粒PHP40973的核苷酸序列(圖4)。
[0038]SEQ ID NO:22 是玉米中所述 Rubisco 活化酶 I 基因(ZmRCAl ；Genbank IDN0.AF084478.3)的核苷酸序列。
[0039]SEQ ID NO:23是本文稱作ZmRCAlMODl的ZmRCAl的改組型式的核苷酸序列。
[0040]SEQ ID N0:24是本文稱作ZmRCAlM0D2(變體I)的ZmRCAl的改組型式的核苷酸序列。
[0041]SEQ ID NO:25是本文稱作ZmRCAlM0D3的ZmRCAl的改組型式的核苷酸序列。[0042]SEQ ID NO:26是玉米中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的C4形式的核苷酸序列。
[0043]SEQ ID NO:27是本文稱作ZmPEPCM0D2的PEPC的改組型式的核苷酸序列。
[0044]SEQ ID NO:28是本文稱作ZmPEPCM0D3的PEPC的改組型式的核苷酸序列。
[0045]SEQ ID NO:29是玉米中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的C3形式的核苷酸序列(NCBI GI N0.429148)。
[0046]SEQ ID NO:30是玉米中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的根部形式的核苷酸序列(NCBI GI N0.3132309)。
[0047]SEQ ID NO:31是本文稱作ZmPEPCMODl的PEPC的改組型式的核苷酸序列。
[0048]SEQ ID NO:32是由SEQ ID NO:23 (ZmRCAlMODl)編碼的蛋白的氨基酸序列。
[0049]SEQ ID NO:33是由SEQ ID NO:24(ZmRCAlM0D2 (變體I))編碼的蛋白的氨基酸序列。
[0050]SEQ ID NO:34是由SEQ ID NO:25 (ZmRCAlM0D3)編碼的蛋白的氨基酸序列。
[0051]SEQ ID NO:35 是所述玉米 Rubisco 活化酶 I 蛋白(NCBI GI N0.162458161)的氨
基酸序列。
[0052]SEQ ID NO:36是由SEQ ID NO:31 (ZmPEPCMODl)編碼的蛋白的氨基酸序列。
[0053]SEQ ID NO: 37是由SEQ ID NO:27 (ZmPEPCM0D2)編碼的蛋白的氨基酸序列。
[0054]SEQ ID NO: 38是由SEQ ID NO:28 (ZmPEPCM0D3)編碼的蛋白的氨基酸序列。
[0055]SEQ ID NO: 39是所述玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC) (NCBI GIN0.27764449)的氨基酸序列。
【具體實施方式】
[0056]現(xiàn)將結(jié)合附圖在下文中更全面地描述本發(fā)明，其中示出了本發(fā)明的一些而非全部實施例。實際上，這些發(fā)明可以許多不同的形式來體現(xiàn)，并且不應(yīng)理解為受本文所示實施例的限制；相反，提供這些實施例以使本公開滿足適用的法律要求。類似的數(shù)字在全文中指代類似的元件。
[0057]這些發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本文所示發(fā)明的許多修改形式和其他實施例具有前述說明和相關(guān)附圖中所示教導(dǎo)的有益效果。因此，應(yīng)當(dāng)了解，本發(fā)明不受所公開的具體實施例的限制，并且修改形式和其他實施例也旨在被包括在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。雖然本文采用了具體術(shù)語，但是這些術(shù)語僅以一般性和描述性意義使用而不是為了進(jìn)行限制。
[0058]1.綜沭:
[0059]提供了使用微RNA(miRNA)的方法和組合物，當(dāng)在植物或適當(dāng)?shù)募?xì)胞中表達(dá)時，微RNA能夠降低靶序列的表達(dá)而不降低密切相關(guān)序列的表達(dá)。例如，所述方法和組合物可允許蛋白的改進(jìn)版表達(dá)，同時降低類似蛋白的表達(dá)。
[0060]此類方法和組合物使用了重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體。如本文所用，“重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體”是指包含miRNA前體主鏈的DNA構(gòu)建體，其具有編碼miRNA和星序列的多核苷酸序列。所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建 體被設(shè)計成使得從所述構(gòu)建體產(chǎn)生的豐度最高的miRNA為21-核苷酸的miRNA。[0061]“微RNA”或“miRNA”是指寡核糖核酸，一般來講長度為約19至約24核苷酸(nt)，其調(diào)控包含靶序列的多核苷酸的表達(dá)。微RNA是非蛋白編碼RNA，在動物和植物中都已鑒定出來(Lagos-Quintana 等人，Science294:853-858 (2001)，Lagos-Quintana 等人，Curr.Biol.12:735-739(2002) ；Lau 等人，Science294:858-862(2001) ；Lee 和 Ambros,Science294:862-864(2001) ;Llave等人，Plant Celll4:1605-1619 (2002) ;Mourelatos等人，Genes.Dev.16:720-728(2002) ;Park 等人，Curr.Biol.12:1484-1495(2002) ； Re inhart等人，Genes.Dev.16:1616-1626(2002))。在植物中，miRNA來源于經(jīng)由類dicerl加工而成的較大的前體多核苷酸。如本文其它地方另外詳細(xì)討論的，miRNA可為“人工miRNA”或“amiRNA”，其包含被合成設(shè)計成沉默靶序列的miRNA序列。
[0062]植物miRNA通過募集沉默因子至靶轉(zhuǎn)錄本的互補(bǔ)結(jié)合位點來調(diào)控內(nèi)源性基因表達(dá)。微RNA被初始轉(zhuǎn)錄為長的多腺苷化RNA，然后被加工形成能夠形成穩(wěn)定發(fā)夾結(jié)構(gòu)的較短的序列，當(dāng)進(jìn)一步以所述siRNA機(jī)制加工時,釋放miRNA。在植物中,這兩個加工步驟是由類Dicer的核酸酶進(jìn)行的。miRNA通過與互補(bǔ)RNA靶序列堿基配對、由RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)觸發(fā)靶序列的RNA裂解來實現(xiàn)功能。微RNA分子高效抑制內(nèi)源性基因的表達(dá)，并且它們導(dǎo)致的RNA干擾被遺傳至后續(xù)的植物世代。
[0063]II.鉬合物
[0064]A.編碼21-核苷酸miRNA的重纟目miRNA表汰構(gòu)律體
[0065]本文提供了編碼21-核苷酸(21-nt)miRNA的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體。如本文所用，重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體包含能被轉(zhuǎn)錄為RNA序列的多核苷酸，所述RNA序列在細(xì)胞中被最終加工形成miRNA。在一些實施例中，由所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體編碼的miRNA是人工miRNA。在所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體中可進(jìn)行多種修飾以編碼miRNA。此類修飾在本文其它地方詳細(xì)討論。
[0066]在一個實施例中，所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體包含miRNA前體主鏈，其具有異源的miRNA和對應(yīng)的星序列。如本文所用，“miRNA前體主鏈”是提供了形成發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)所需主鏈結(jié)構(gòu)的多核苷酸，所述發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)允許加工和最終形成miRNA。因此，所述miRNA前體主鏈被用作模板以表達(dá)人工miRNA和其對應(yīng)的星序列。在重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體范圍內(nèi)，所述miRNA前體主鏈包含具有異源性miRNA和星序列的DNA序列。當(dāng)表達(dá)為RNA時，miRNA前體主鏈的結(jié)構(gòu)允許形成能被加工為miRNA的發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)。在一些實施例中，所述miRNA前體主鏈包含基因組miRNA前體序列，其中所述序列包含插入了異源性miRNA和星序列的天然前體。
[0067]所述miRNA前體主鏈可來源于任何來源。在一些實施例中，所述miRNA前體主鏈來源于植物來源。在一些實施例中，所述miRNA前體主鏈來自單子葉植物。在其它實施例中，所述miRNA前體主鏈來自雙子葉植物。在另外的實施例中，所述主鏈來自玉米或大豆。在前已描述過微RNA前體主鏈。例如，US20090155910A1公開了下述大豆miRNA前體主鏈:156c、159、166b、168c、396b 和 398b，而 US20090155909A1 公開了下述玉米 miRNA 前體主鏈:159c、169r、168a、164h和396h。這些參考文獻(xiàn)的每一個均全文以引用方式并入。本文公開的miRNA前體主鏈的非限制性例子包括，例如，所述miRNA ZM-169r前體主鏈或其活性變體以及所述miRNA ZM-396h前體主鏈或其活性變體。已經(jīng)認(rèn)識到，本文所提供的在miRNA前體主鏈進(jìn)行的一些修飾，使得其核苷酸序列與未修飾的miRNA前體主鏈的核苷酸序列保持至少 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的序列同一性。此類miRNA前體主鏈的變體保持了 miRNA前體主鏈活性，從而繼續(xù)允許加工和最終形成 miRNA。
[0068]當(dāng)設(shè)計重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體以祀向目的序列時，主鏈的miRNA序列可被設(shè)計用以靶向任何受關(guān)注序列的異源性miRNA所取代。在這種情況下，所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體中的對應(yīng)的星序列將被改變使得當(dāng)被折疊時所述莖的結(jié)構(gòu)保持與所述內(nèi)源性的結(jié)構(gòu)相同。在這種情況下，星序列和miRNA序列兩者對于miRNA前體主鏈?zhǔn)钱愒葱缘摹?br> [0069]因此，在一個實施例中，可改性miRNA前體主鏈以允許在miRNA前體主鏈內(nèi)有效插入新miRNA和星序列。在這種情況下，采用聚合成酶鏈反應(yīng)技術(shù)將所述miRNA前體主鏈的miRNA片段和星片段替換為異源性miRNA和異源性星序列，并克隆至表達(dá)質(zhì)粒中以生成重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體。已經(jīng)認(rèn)識到，可以改變異源性miRNA和星序列插入至主鏈的位點。例如，在美國專利申請20090155909A1和US20090155910A1中已描述了將所述miRNA和星序列插入至所述miRNA前體主鏈的詳細(xì)方法，所述專利申請均全文以引用方式并入本文。
[0070]在一個實施例中，所述miRNA前體主鏈包含編碼miRNA的第一多核苷酸片段和編碼星序列的第二多核苷酸片段，其中第一和第二多核苷酸片段對于miRNA前體主鏈為異源性的。如本文所用，相對于序列的“異源性”旨在表示源自外來物種的序列，或如果源自相同物種，則為通過蓄意的人為干預(yù)而從其原生形式在組成和/或基因組基因座方面基本上改性的序列。例如，對于核酸，其可以是源自外來物種的核酸，或是合成設(shè)計的核酸，或如果源自相同物種，則為通過蓄意的人為干預(yù)而從其原生形式在組成和/或基因組基因座方面基本上改性的核酸。因此，在重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的范圍內(nèi)，異源性miRNA和星序列與所述miRNA前體主鏈?zhǔn)欠窃?。包含此類異源miRNA和星序列的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體也可被稱作“人工的”miRNA表達(dá)構(gòu)建體。相似地，“人工的” miRNA表達(dá)構(gòu)建體包含相對于所述主鏈為異源的miRNA和星 序列。
[0071]miRNA和星序列在所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體內(nèi)的順序可以改變。例如，在具體的實施例中，包含所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的miRNA片段的第一多核苷酸片段位于包含所述星序列的第二多核苷酸序列的5'端。作為另外一種選擇，包含所述星序列的第二多核苷酸序列可位于包含所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體中miRNA序列的第一多核苷酸序列的5'端。
[0072]如上所討論，將重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體設(shè)計成使得由miRNA表達(dá)構(gòu)建體產(chǎn)生的豐度最高形式的miRNA的長度為21-nt。此類表達(dá)構(gòu)建體因此將包含第一多核苷酸片段(其包含所述miRNA序列)以及第二多核苷酸片段(其包含對應(yīng)的星序列)，其中所述星序列和miRNA長度為21-nt。在這種情況下,所述星序列和所述miRNA序列彼此雜交。此類結(jié)構(gòu)體導(dǎo)致21-ntmiRNA成為所生成的miRNA中豐度最高的形式。
[0073]如本文所用，“豐度最高的形式”意為21-nt miRNA代表了由所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體制得的miRNA的最大群體。換句話講，雖然重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體可制備長度非
21-nt (即19-nt、20-nt、22-nt等)miRNA，但由重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體產(chǎn)生的豐度最高的miRNA的長度為21-nt。因此，所述21_nt miRNA代表了由重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體制得的總miRNA 群體的至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、或 100%。
[0074]如本文所用，“星序列”是指在miRNA前體主鏈內(nèi)與miRNA互補(bǔ)并與miRNA形成雙工以形成發(fā)夾RNA的莖結(jié)構(gòu)的序列。在一些實施例中，星序列可包含與miRNA序列小于100%的互補(bǔ)性。作為另外一種選擇，只要星序列與miRNA序列具有足夠的互補(bǔ)性以形成雙鏈結(jié)構(gòu)，星序列可包含與miRNA序列至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%或更低互補(bǔ)性的序列。在另外的實施例中，星序列包含與miRNA序列具有1、2、3、4、5或更多處錯配的序列，并仍具有足夠的互補(bǔ)性與miRNA序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致生成miRNA并抑制靶序列。
[0075]由重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體產(chǎn)生的豐度最高的miRNA是長度為21-nt，并與其RNA水平待減少的靶序列具有足夠的序列互補(bǔ)性。與靶序列的“足夠的序列互補(bǔ)性”是指其互補(bǔ)性足夠使得所述21-nt miRNA與所述靶序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)并降低所述靶序列的表達(dá)水平。在具體的實施例中，具有與靶序列足夠互補(bǔ)性的miRNA可與靶序列共有100%互補(bǔ)的序列或可與靶序列共有小于100%互補(bǔ)的序列(即至少99%,98%,97%,96%,95%,90%,85%,80%、75%、70%或更低互補(bǔ)的序列)。在其它實施例中，miRNA與靶序列可具有1、2、3、4、5或至多6處改性或錯配，只要21-nt miRNA與靶序列具有足夠的互補(bǔ)性以降低靶序列的表達(dá)水平。已經(jīng)報道了與靶序列有多處錯配的內(nèi)源性miRNA。例如，參見Schawb等人(2005)Developmental Cell8:517-27 和 Cuperus 等人(2010) Nature Structural and MolecularBiologyl7:997-1003,全文以引用方式并入本文。
[0076]當(dāng)設(shè)計用于本文所公開的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的miRNA序列和星序列時，可以有多種設(shè)計選擇。參見例如Schwab R等人(2005)Dev Cellg:517_27。在非限制性實施例中，本文所公開的miRNA序列可具有位于5'端的“U”、位于第19核苷酸位點的“C”或“G”、以及位于第10核苷酸位點的“A”或“U”。在其它實施例中，miRNA設(shè)計使得miRNA具有如ZipFold算法計算的高自由 Δ -G (Markham, N.R.& Zuker,M.(2005) Nucleic Acids Res.33:W577-W581)。任選地，在miRNA的Y部分內(nèi)可加入一對堿基對變化，以使所述序列與靶序列相差一個核苷酸。
[0077]B.靶序列
[0078]如本文所用，“靶序列”是指設(shè)計miRNA以降低并從而調(diào)控例如降低其RNA表達(dá)的序列。被用于設(shè)計miRNA的受關(guān)注基因的靶序列區(qū)可為開放閱讀框、5'或3'非翻譯區(qū)、外顯子、內(nèi)含子、側(cè)翼序列等的一部分。一般類別的受關(guān)注基因包括例如那些涉及信息的諸如轉(zhuǎn)錄因子，那些涉及通訊的諸如激酶，以及那些涉及持家的諸如熱休克蛋白。更具體的類別例如包括編碼對于農(nóng)藝學(xué)、抗昆蟲性、抗病性、抗除草劑性、不育、谷粒特征、以及商品的重要性狀的基因。受關(guān)注基因包括一般來講涉及油脂、淀粉、碳水化合物或營養(yǎng)物代謝的那些，以及影響籽粒大小、蔗糖載量等的那些。靶序列可以是內(nèi)源性序列，或可以是導(dǎo)入的異源性序列。在具體的實施例中，所述靶序列是植物細(xì)胞內(nèi)源的序列。如本文所用，“內(nèi)源性的”序列是原生的或天然存在的序列。當(dāng)存在于生物體內(nèi)時，所述內(nèi)源性的序列是所述生物體內(nèi)原生的并且存在于其原生的基因組位點上。
[0079]靶序列的非限制性例子包括，例如，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)蛋白家族的成員或RUBISC0活化酶I。
[0080] PEPC是羧基裂解酶家族的成員。PEPC影響了碳酸氫鹽加成至磷酸烯醇式丙酮酸以形成草酰乙酸，并參與了碳固定和光合作用。在非限制性實施例中，所述靶序列編碼所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白家族的一個成員。來自玉米的PEPC多核苷酸序列的非限制性例子如SEQ ID NOs:26,29和30所示。如SEQ ID NO:1和2所示為對應(yīng)于amiRNA的非限制性例子的DNA序列，所述amiRNA被設(shè)計以降低具有SEQ ID NO:26的PEPC的mRNA水平。
[0081]RUBISC0，核酮糖_1，5_ 二磷酸羧化酶加氧酶，催化核酮糖_1，5_ 二磷酸與二氧化碳的羧化反應(yīng)或與氧氣的氧化反應(yīng)，其為光合作用中的主要限速步驟。RUBISC0活化酶是所述AAA+超家族的成員，參與RUBISC0的激活。RUBISC0活化酶通過以ATP依賴的方式增強(qiáng)從RUBISC0的活性位點去除抑制物來參與RUBISC0的激活。有2種同種型的RUBISC0活化酶，43kDa和46kDa的同種型，是通過可變剪切形成的，僅在C末端區(qū)有差異。在非限制性實施例中，所述靶序列編碼RUBISC0活化酶I。來自玉米的RUBISC0活化酶I多核苷酸序列的非限制性例子如SEQ ID N0:22所示。如SEQ ID NO: 13所示為對應(yīng)于amiRNA的非限制性例子的DNA序列，所述amiRNA被設(shè)計以降低RUBISCO活化酶I的mRNA水平。
[0082]由所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體制得的21_nt miRNA能夠降低所述祀序列的mRNA水平而不降低緊密相關(guān)的目的重組多核苷酸的mRNA水平。測定mRNA表達(dá)降低的方法包括，例如，監(jiān)視所述靶序列mRNA水平的降低或監(jiān)視表型的改變。本文其他地方討論了測定靶序列表達(dá)降低的多種方法。因此，如本文所公開，單個miRNA能沉默目的靶序列，但不沉默緊密相關(guān)的目的重組多核苷酸。
[0083]如本文所用，“降低”、“抑制”、“沉默”、“抑制作用”互換使用，以表示相對于野生型生物體中其正常表達(dá)水平的靶序列產(chǎn)物表達(dá)水平的下調(diào)。通過“降低RNA的水平”要達(dá)到的目的是降低表達(dá)至任一統(tǒng)計意義上的顯著性數(shù)量，例如相對于野生型表達(dá)水平降低至少 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%。如本文所用，“不會降低mRNA的水平”或“沒減少”是指在相對于沒有所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)的mRNA水平，mRNA的任一水平?jīng)]有降低至任一統(tǒng)計意義上的顯著性數(shù)量，包括，例如，mRNA降低約9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%>0.5%,0.1%或更少。如本 文所用，術(shù)語“表達(dá)”是指基因產(chǎn)物的生物合成，包括所述基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。因此，核酸分子的表達(dá)可以指核酸片段的轉(zhuǎn)錄(例如，轉(zhuǎn)錄生成mRNA或其他功能RNA)和/或RNA翻譯成前體或成熟蛋白(多肽)。
[0084]C.所述靶序列和密切相關(guān)序列間的關(guān)系
[0085]由本文所公開的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體制得的miRNA能夠抑制靶序列，但不降低具有與所述靶序列密切相關(guān)的序列的目的多核苷酸的mRNA水平。如本文所用，“密切相關(guān)的”序列是與所述靶序列相關(guān)的使得所述密切相關(guān)的序列的給定核酸與所述靶序列共有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。由本文所公開的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體制得的miRNA能夠抑制靶序列使得與所述靶序列密切相關(guān)的至少1、2、3、4、5或更多不同序列的mRNA水平不被降低。在一個實施例中，所述靶序列是內(nèi)源性的序列。在另一個實施例中，所述密切相關(guān)的序列是重組的目的多核苷酸。
[0086]在具體的實施例中，所述目的多核苷酸是所述靶序列的改組變體。術(shù)語“改組”或“經(jīng)改組的”是本文用以指示相似但非相同多核苷酸序列間的重組。如本文所用，“經(jīng)改組的變體”是通過改組創(chuàng)造的新基因。一般來講，多于一種的重組循環(huán)是以改組方法進(jìn)行的。以此類程序，能夠調(diào)控一個或多個不 同的目的基因以創(chuàng)造具有所期望的性能的新的目的多核苷酸。如此，從一組包含具有基本的序列同一性、并且能在體外和體內(nèi)進(jìn)行同源重組的序列區(qū)域的相關(guān)多核苷酸序列，產(chǎn)生了重組多核苷酸文庫。例如，使用這種方法，編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序可在目的基因和其他已知基因之間改組以獲取編碼具有改善的受關(guān)注特性(諸如在酶的情況下的Km)的蛋白的新基因。此類DNA改組方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如 Stemmer (1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91: 10747-10751 ；Stemmer(1994)Nature370:389-391 ；Crameri 等人(1997)Nature Biotech.15:436-438 ；Moore 等人(1997)J.Mol.Biol.272:336-347 ；Zhang 等人(1997) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:4504-4509 ；Crameri等人(1998)Nature391:288-291 ;以及美國專利 5，605，793 和 5,837,458。
[0087]在一個實施例中，由所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體編碼的miRNA對應(yīng)于所述靶序列的mRNA區(qū)域的互補(bǔ)序列。所述祀序列的mRNA區(qū)域可具有與所述21-nt miRNAlOO1^的互補(bǔ)性，或所述祀序列的mRNA區(qū)域可具有至少1、2或3個與所述21_nt miRNA不互補(bǔ)的核苷酸，使得所述miRNA降低了所述靶序列的mRNA水平但不降低緊密相關(guān)的目的寡核苷酸的mRNA水平。如本文所用，“互補(bǔ)核苷酸”，“互補(bǔ)序列”或“互補(bǔ)序列”參考序列或核苷酸區(qū)域，是能夠形成雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸。因此，“非互補(bǔ)”核苷酸是不能形成雙鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸。在另外的實施例中，所述miRNA包含至少5、6、7、8、9、10或更多個與橫跨由目的多核苷酸編碼的mRNA的長度的任何給定區(qū)域非互補(bǔ)核苷酸，使得所述miRNA降低了所述靶序列的mRNA水平但不降低目的寡核苷酸的mRNA水平。
[0088]在一個實施例中，包含重組表達(dá)構(gòu)建體(其包含目的多核苷酸)的第一元件，和包含重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的第二元件，存在于同一多核苷酸構(gòu)建體上。在這種情況下，所述第一元件和所述第二元件在同一構(gòu)建體上被整合到植物細(xì)胞的基因組中。另外，所述第一和第二元件可被可操作地連接至同一啟動子。作為另外一種選擇，所述第一元件和所述第二元件可存在于分離的多核苷酸構(gòu)建體上，并且在不同多核苷酸構(gòu)建體上被整合到植物細(xì)胞的基因組中。在這種情況下，所述第一元件包含第一啟動子可操作地連接至編碼目的多核苷酸的序列，所述第二元件包含第二啟動子可操作地連接至所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體。
_9] P.目的多核苷酸
[0090]所述組合物還包括多個目的多核苷酸。目的多核苷酸可以為但不限于原生多核苷酸、轉(zhuǎn)基因、所述靶序列的改組變體，或任何具有與所述靶序列緊密相關(guān)的序列的多核苷酸。在一個實施例中，所述miRNA，當(dāng)在植物中表達(dá)時，降低了所述靶序列的mRNA水平而不降低由目的多核苷酸編碼的mRNA水平。
[0091]表型上的多種變化是目的，包括植物中脂肪酸組合物的修飾、植物氨基酸含量的變化、植物的病原體抵御機(jī)制的變化、植物的除草劑耐受性的變化等等?？赏ㄟ^提供異源的產(chǎn)物(即目的多核苷酸)的表達(dá)實現(xiàn)這些結(jié)果。作為另外一種選擇，可以通過提供減少一種或多種內(nèi)源性產(chǎn)物的表達(dá)，而在同時提供植物中目的多核苷酸的表達(dá)來實現(xiàn)其結(jié)果。這些變化導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的植物的表型變化。
[0092]目的多核苷酸/多肽包括但不限于非生物和生物脅迫耐受性編碼序列，或改變植物性狀諸如產(chǎn)量、格令重質(zhì)量、營養(yǎng)成分、淀粉質(zhì)量和數(shù)量、氮固定和/或利用率、以及油含量和/或組合物的序列。更多具體的 目的多核苷酸包括但不限于增加作物產(chǎn)量的基因、改善作物的有利條件的多肽、編碼賦予非生物脅迫(諸如干旱、氮、溫度、鹽分、毒性金屬或微量元素)抗性的蛋白的基因。
[0093]除了使用傳統(tǒng)的育種方法，能夠基因改變重要農(nóng)藝性狀諸如油脂、淀粉和蛋白含量。修飾包括增加油酸、飽和及不包含油脂含量、增加賴氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸、還有淀粉的修飾。在美國專利5, 703, 049,5, 885, 801,5, 885, 802 5，990，389中描述了Hordothionin蛋白修飾，以引用方式并入本文。另一個例子是美國專利5，850，016中描述的由大豆2S白蛋白基因編碼的賴氨酸和/或硫豐富的種子蛋白，以及Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165 =99-106中所述來自大麥的胰凝乳蛋白酶抑制劑，上述公開以引用方式并入本文。
[0094]商業(yè)性狀也能被編碼在目的多核苷酸上，其能夠增加例如，用于乙醇生產(chǎn)的淀粉，或提供蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)化的植物的另一個重要商業(yè)用途是生產(chǎn)聚合物和生物塑料諸如美國專利5，602，321中所述的?；蛑T如酮硫酶、PHBase (多羥基丁酸酯合成酶)、以及乙酰乙?；?CoA 還原酶(參加 Schubert 等人(1988) J.Bacteriol.170:5837-5847)有利于多羥基鏈烷酸酯(PHAs)的表達(dá)。
[0095]改善作物產(chǎn)量的多核苷酸包括矮桿基因，諸如Rhtl和Rht2(Peng等人(1999)Nature400:256-261)，和那些增加植物生長的，諸如銨誘導(dǎo)的谷氨酸脫氫酶。改善作物的有利條件的多核苷酸包括，例如，那些使得作物具有降低的飽和脂肪含量的、那些提高植物的營養(yǎng)價值的、以及那些增加籽粒蛋白的。改善耐鹽的多核苷酸是那些增加或允許被導(dǎo)入了耐鹽基因植物生長于較植物原生環(huán)境更高鹽的環(huán)境。
[0096]影響氨基酸生物合成的多核苷酸/多肽包括，例如，鄰氨基苯甲酸合成酶(AS;EC4.1.3.27)，其催化植物、真菌和細(xì)菌中從芳族氨基酸途徑分支至色氨酸生物合成的第一個反應(yīng)。在植物中，對于色氨酸的生物合成的化學(xué)過程是區(qū)室化于葉綠體中的。參見例如美國專利公開20080050 506，以引用方式并入本文。附加的目的序列包括分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)，其是指編碼催化分支酸至丙酮酸和pHBA的轉(zhuǎn)化過程的酶的基因。最充分鑒定過的CPL基因分離自大腸桿菌(E.coli)，擁有GenBank登錄號M96268。參見美國專利7，361，811，以引用方式并入本文。
[0097]在一些實施例中，所述目的多核苷酸具有與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)蛋白家族的成員的核苷酸序列密切相關(guān)的核苷酸序列。SEQ ID N0:27、28和31或其活性變體和片段代表了具有與如SEQ ID NO:26所示的PEPC基因密切相關(guān)的序列的目的多核苷酸的非限制性例子。在其它實施例中，所述目的多核苷酸具有與RUBISC0活化酶I密切相關(guān)的核苷酸序列。SEQ ID NO:23,24和25或其活性變體和片段代表了具有與如SEQ ID NO:22所示的RUBISC0活化酶I基因密切相關(guān)的序列的目的多核苷酸的非限制性例子。
[0098]還提供了目的多核苷酸/多肽的活性變體或片段。此類活性變體可包含與目的原生多核苷酸 / 多肽至少 65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，其中所述活性變體保持了所述原生多核苷酸/多肽的生物活性。本文提供PEPC的活性變體或片段(即SEQ ID N0:27、28、和31或其活性變體和片段)使得它們保持了 PEPC活性從而影響了草酰乙酸的形成。可使用在本領(lǐng)域中已知的任何方法以測定PEPC的活性，包括但不限于測量在磷酸烯醇式丙酮酸、PEPC和二氧化碳存在下樣品中草酰乙酸的形成。本文也提供了 RUBISC0活化酶I的活性變體或片段(即SEQ ID NO:23,24和25或其活性變體和片段)使得它們保持了 RUBISC0活化酶I活性從而誘導(dǎo)RUBISCO激活?？墒褂迷诒绢I(lǐng)域中已知的任何方法以測定RUBISC0活化酶的活性，包括但不限于RUBISCO激活和ATP水解。
[0099]E.多核苷酸
[0100]組合物還包括分離的或重組多核苷酸或多核苷酸構(gòu)建體(其編碼所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體)、多種重組表達(dá)構(gòu)建體(其編碼目的多核苷酸)、所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的多種組分、以及被加工成miRNA的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的多種產(chǎn)物。重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的示例性組分包括例如包含miRNA前體主鏈、miRNA和星序列的多核苷酸,用于生成編碼不同RNA序列的miRNA和核苷酸序列的引物。本文所用術(shù)語“編碼(encodes或encoding) ”是指可被加工以產(chǎn)生RNA和/或多肽的DNA序列。
[0101]在一個實施例中，提供了包含第一元件(其具有包含目的多核苷酸的重組表達(dá)構(gòu)建體)和第二元件(其包含重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體)的多核苷酸構(gòu)建體。在具體的實施例中，所述第一和第二元件被可操作地連接至同一啟動子。
[0102]本文可互換使用術(shù)語“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸片段”。這些術(shù)語涵蓋核苷酸序及類似的范圍。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它們可以是單鏈或雙鏈，任選地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因組DNA、合成DNA或它們的混合物的一個或多個片段構(gòu)成。術(shù)語“多核苷酸”的使用并非旨在將本發(fā)明限制為包含DNA的多核苷酸。本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員將認(rèn)識到，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合。此類脫氧核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成類似物。本文提供的多核苷酸也涵蓋所有形式的序列，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等。
[0103]本文提供的組 合物可包含分離的或基本上經(jīng)純化的多核苷酸?！胺蛛x的”或“經(jīng)純化的”多核苷酸，是基本上或本質(zhì)上不含那些在天然存在環(huán)境中正常伴隨多核苷酸或與其相互作用的游離組分。因此，分離的或經(jīng)純化的多核苷酸基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)、或當(dāng)通過重組體技術(shù)生產(chǎn)時的培養(yǎng)基、或基本上不含當(dāng)通過化學(xué)合成時的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。最理想地，“分離的”多核苷酸不含多核苷酸所來源于的生物的基因組DNA中天然地存在于所述多核苷酸兩翼(即，位于所述多核苷酸的5'和3'端)的序列(最理想地蛋白編碼序列)。例如，在不同的實施例中，所述分離的多核苷酸可包含少于多核苷酸所來源的細(xì)胞的基因組DNA中天然地存在于所述多核苷酸兩翼約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb、或
0.1kb的多核苷酸。
[0104]還提供了包含所述目的多核苷酸、所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體和它們的多種組分的重組多核苷酸。本文可互換使用術(shù)語“重組多核苷酸”和“重組DNA構(gòu)建體”。重組構(gòu)建體包含人工的或異源的核酸序列的組合例如非天然共存的調(diào)控和編碼序列。例如，重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體可包含miRNA前體主鏈，其具有包含miRNA序列和星序列的異源性多核苷酸，因此所述miRNA序列和星序列對于miRNA前體主鏈不是原生的。在其它實施例中，重組構(gòu)建體可包含來源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或來源于相同來源但以不同于天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。此類構(gòu)建體可獨自使用或與載體組合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于用以轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法，該宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。例如可以使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員熟知為了成功地轉(zhuǎn)化、篩選和繁殖包括本發(fā)明任何分離的核酸片段的宿主細(xì)胞，必須存在于載體上的遺傳元件。技術(shù)人員還將認(rèn)識到，不同的獨立轉(zhuǎn)化事件將導(dǎo)致不同水平和模式的表達(dá)(Jones等人，EMBO J.4 =2411-2418 (1985)；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics218:78-86 (1989))，因此為了獲得顯示期望的表達(dá)水平和模式的細(xì)胞系必須篩選多個事件。這種篩選可通過DNA的Southern印跡分析、mRNA表達(dá)的Northern印跡分析、蛋白表達(dá)的免疫印跡分析或表型分析等完成。
[0105]在具體的實施例中，本文所述的一個或多個表達(dá)構(gòu)建體可以表達(dá)盒形式提供以在植物或其他生物體或目的細(xì)胞類型中表達(dá)。所述盒可包括5'和3'調(diào)控序列，其被可操作地連接至本文提供的多核苷酸。“可操作地連接”旨在表示兩個或更多個元件之間的功能性連接。例如，目的多核苷酸和調(diào)控序列(即一個啟動子)之間的可操作的連接為允許該目的多核苷酸的表達(dá)的功能性連接?？刹僮鞯剡B接的元件可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。當(dāng)用于指兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)的連接時，“可操作地連接”意指所述編碼區(qū)處于同一閱讀框。所述盒可附加地包含至少一個將被轉(zhuǎn)化到生物體中的附加基因。作為另外一種選擇，能通過多個表達(dá)盒提供附加基因。這樣的表達(dá)盒具有多個限制性位點和/或重組位點，用以將重組多核苷酸插入至使其處于所述調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下的位置。所述表達(dá)盒可附加地包含選擇性標(biāo)記基因。
[0106]所述表達(dá)盒可包括在轉(zhuǎn)錄的5' -3'方向中，轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟動子)、本文所提供的重組多核苷酸、以及在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。所述調(diào)控區(qū)(即，啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和翻譯終止區(qū))和/或本文所提供的重組多核苷酸對宿主細(xì)胞而言或?qū)Ρ舜硕钥梢允翘烊坏?類似的。作為另外一種選擇，本文所提供的調(diào)控區(qū)和/或重組多核苷酸對宿主細(xì)胞而言或?qū)Ρ舜硕钥梢允钱愒吹?。例如，可操作地連接至異源多核苷酸的一個啟動子所來自的物種，不同于所述多核苷酸所來源自的物種；或如果二者來自相同的/類似的物種，則二者之一或二者均為從其原始形式和/或基因組基因座經(jīng)過充分修飾的，或所述啟動子并非針對可操作地連接的多核苷酸的天然啟動子。作為另外一種選擇，本文所提供的調(diào)控區(qū)和/或重組多核苷酸可以是全部合成的。
[0107]所述終止區(qū)就轉(zhuǎn)錄起始區(qū)而言可以是天然的，就目的可操作地連接的重組多核苷酸而言可以是天然的，就植物宿主而言可以是天然的，或就啟動子、目的重組多核苷酸、植物宿主或它們的任意組合而言 ，可以是源自其他來源的(即，外來的或異源的)。使用方便的終止區(qū)得自根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)的Ti質(zhì)粒，諸如章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶終止區(qū)。也參見 Guerineau 等人(1991)Mol.Gen.Genet.262: 141-144 ；Proudfoot (1991)Cell64:671-674 ;Sanfacon 等人(1991)Genes Dev.5:141-149 ;Mogen 等人(1990)PlantCell2:1261-1272 ;Munroe 等人(1990)Gene91:151-158 ;Ballas 等人(1989)NucleicAcids Res.17:7891-7903 ;以及 Joshi 等人(1987)Nucleic Acids Res.15:9627_9639。
[0108]在制備表達(dá)盒的過程中，可操作多個DNA片段以在正確方向上提供DNA序列。為了這一目的，可使用銜接子或連接子以接合DNA片段，或使用其他操作方法提供方便的限制性位點以移除冗余DNA、移除限制性位點等。為了這一目的，可使用體外誘變、引物修復(fù)、限制性酶切、退火、再取代，例如轉(zhuǎn)換和顛換。
[0109]許多啟動子可用于本文提供的多種表達(dá)構(gòu)建體?？苫谄谕Y(jié)果選擇啟動子。已經(jīng)認(rèn)識到可通過在所述重組表達(dá)構(gòu)建體和/或所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體中使用不同的啟動子以增強(qiáng)不同的應(yīng)用，從而調(diào) 節(jié)目的多核苷酸和/或所述miRNA的表達(dá)時間、地點和/或水平。如果需要，此類重組表達(dá)構(gòu)建體可含有啟動子調(diào)節(jié)區(qū)(例如賦予誘導(dǎo)型、組成型、環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的、或細(xì)胞或組織特異性/選擇性表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū))，轉(zhuǎn)錄起始開始位點、核糖體結(jié)合位點、RNA加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點和/或聚腺苷酸化信號。
[0110]在一些實施例中，本文提供的表達(dá)構(gòu)建體可與組成型、組織優(yōu)選的或其他啟動子合并以在植物中表達(dá)。組成型啟動子的例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、源自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的I'-或2'-啟動子、泛素蛋白I啟動子、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子(美國專利5，683，439)、Nos啟動子、pEmu啟動子、rubisco啟動子、GRP1-8啟動子、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的來自各種植物基因的其他轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。如果期望低水平的表達(dá)，可以使用弱啟動子。弱組成型啟動子包括例如Rsyn7啟動子的核心啟動子(W099/43838和美國專利6，072, 050)、35S CaMV核心啟動子等等。其他組成型啟動子包括例如美國專利5，608，149 ;5，608，144 ;5，604，121 ;5，569，597 ；5，466，785 ;5，399，680 ;5，268，463 ;和 5，608，142。還參見美國專利 6，177，611，以引用方式并入本文。
[0111]誘導(dǎo)型啟動子的例子是可通過低氧或寒冷脅迫誘導(dǎo)的Adhl啟動子，可通過熱脅迫誘導(dǎo)的Hsp70啟動子,PPDK啟動子和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pepcarboxylase)啟動子，二者都是可光誘導(dǎo)的。還有用的啟動子是可化學(xué)誘導(dǎo)的啟動子，諸如安全劑誘導(dǎo)的In2-2啟動子(美國專利5，364，780)，雌激素誘導(dǎo)的ERE啟動子，以及植物生長素誘導(dǎo)的和絨氈層(tapetum)特異性的，而且在愈傷組織中也有活性的Axigl啟動子(PCT US01/22169)。
[0112]處于發(fā)育控制下的啟動子的例子包括優(yōu)先在某些組織，諸如葉、根、果實、種子或花中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子。示例性啟動子是花藥特異性啟動子5126(美國專利5，689，049和5，689，051)。種子優(yōu)選的啟動子的例子包括但不限于27kDY玉米醇溶蛋白啟動子和臘狀啟動子，Boronat, A.等人(1986)Plant Sc1.47:95-102 ；Reina, Μ.等人 Nucl.AcidsRes.18(21):6426 ;和 Kloesgen，R.B.等人(1986)Mol.Gen.Genet203:237_244。在胚芽、果皮和胚乳中表達(dá)的啟 動子公開在美國專利6，225，529和PCT公開W000/12733中。這些專利的每一個的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。
[0113]化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動子可用于通過施用外來化學(xué)調(diào)節(jié)劑來調(diào)芐基因在植物中的表達(dá)。根據(jù)這一目標(biāo)，啟動子可以是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，其中施用化學(xué)物質(zhì)來誘導(dǎo)基因表達(dá)，或化學(xué)抑制型啟動子，其中施用化學(xué)物質(zhì)來抑制基因表達(dá)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)型啟動子是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于玉米In2-2啟動子，其是通過苯磺酰胺除草劑安全劑來激活的，玉米GST啟動子，其是通過用作芽前除草劑的疏水親電性化合物而激活的，以及煙草PR-1a啟動子，其是通過水楊酸激活的。目的其他化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動子包括留類化合物反應(yīng)性啟動子(參見例如，Schena 等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:10421-10425 和 McNellis 等人(1998)PlantJ.14(2):247-257)，以及四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素抑制型啟動子(參見例如Gatz 等人(1991)Mol.Gen.Genet227:229_237，和美國專利 5，814，618 和 5，789，156)，其以引用方式并入本文。
[0114]組織優(yōu)選的啟動子可用于靶向增強(qiáng)在特定植物組織內(nèi)的表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)。組織優(yōu)選的啟動子是本領(lǐng)域已知的。參見例如Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2):255-265 ;Kawamata 等人(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803 ;Hansen 等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343 ；Russell 等人(1997)Transgenic Res.6(2):157-168 ；Rinehart 等人(1996)Plant Physiol.112(3): 1331-1341 ；Van Camp 等人(1996)PlantPhysiol.112(2):525-535 ；Canevascini 等人(1996)Plant Physiol.112(2):513-524;Yamamoto 等人(1994) Plant Cell Physiol.35 (5):773-778 ；Lam(1994) Results Prob1.Cell Differ.20:181-196 ;Orozco 等人(1993)Plant Mol Biol.23(6):1129-1138 ；Matsuoka 等人(1993)Proc Nail.Acad.Sc1.USA90 (20):9586-9590 ;以及 Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3):495_505。如果需要的話，可修飾這樣的啟動子以進(jìn)行弱表達(dá)。
[0115]葉優(yōu)選的啟動子是本領(lǐng)域已知的。參見例如Yamamoto等人(1997) PlantJ.12(2):255-265 ；Kwon 等人(1994)Plant Physiol.105:357-67 ;Yamamoto 等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778 ；Gotor 等人(1993)Plant J.3:509-18 ；Orozco 等人(1993) Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138 JPMatsuoka 等人(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (20):9586-9590。此外，可以使用cab和rubisco的啟動子。參見例如Simpson等人(1958)EMBO J4:2723-2729 和 Timko 等人(1988)Nature318:57_58。
[0116]根優(yōu)選的啟動子是已知的，并且可以選自文獻(xiàn)中記載的很多啟動子或從不同相容物種中從頭分離的啟動子。參見例如Hire等人(1992)Plant Mol.Biol.20(2):207-218(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner (1991)Plant Cell3 (10):1051-1061 (法國菜豆的GRP1.8基因的根特異性控制元件)；Sanger等人(1990)PlantMol.Biol.14 (3):433-443 (根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露氨酸合成酶(MAS)基因的根特異性啟動子)；以及Miao等人(1991)Plant Cell3(l):11-22(編碼胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表達(dá))。也參見Bogusz等人(1990)Plant Cell2(7):633_641，其中描述了兩種根特異性啟動子，它們是從來自固氮非豆科Parasponia andersonii以及相關(guān)非固氮非豆科山麻黃(Trema tomentosa)的血紅蛋白基因分離的。將這些基因的啟動子與β_葡糖醛酸酶報道基因連接，并且導(dǎo)入非豆科的煙草(Nicotiana tabacum)和豆科的百脈根(Lotus corniculatus)內(nèi)，在這兩種情況下，都保持了根特異 性啟動子活性。Leach和Aoyagi (1991)描述了他們對于發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的高表達(dá)的roIC和roID根誘導(dǎo)基因的啟動子的分析(參見Plant Science (Limerick) 79 (I):69-76)。他們推斷,在這些啟動子中增強(qiáng)子和組織特異性DNA決定子是解離的。Teeri等人(1989)使用與IacZ的基因融合以表明編碼章魚堿合成酶的農(nóng)桿菌(Agrobacterium)T-DNA基因在根尖的表皮中具有特別活性，以及TR2'基因在完整植物中是根特異性的，并且受葉組織中的傷害的刺激，這是用來與殺蟲或殺幼蟲基因一起使用的特別期望的特征組合(參見EMBO J.8 (2):343-350)。與nptll (新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)融合的TRl'基因表現(xiàn)出類似特征。其他根優(yōu)選的啟動子包括VfEN0D-GRP3基因啟動子(Kuster 等人(1995)Plant Mol.Biol.29(4):759-772) JProIB 啟動子(Capana等人(1994)Plant Mol.Biol.25(4):681_691。也參見美國專利 5，837，876 ;5，750，386 ;5，633，363 ;5，459，252 ;5，401，836 ;5，110，732 ;和 5，023，179。菜豆蛋白基因(Murai 等人(1983)Science23:476-482 和 Sengopta-Gopalen 等人(1988)PNAS82:3320_3324。
[0117]所述表達(dá)盒也可包含選擇性標(biāo)記基因，用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。利用選擇性標(biāo)記基因以選擇轉(zhuǎn)化過的細(xì)胞或組織。標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因，諸如那些編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II (NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的基因，以及賦予除草化合物抗性的基因，除草化合物諸如草胺磷銨、溴苯腈、咪唑啉酮類、和2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)以及磺脲類藥物。其他選擇性標(biāo)記包括表型標(biāo)記物諸如半乳糖苷酶和熒光蛋白諸如綠色熒光蛋白(GFP) (Su等人2004)Biotechnol.Bioeng.85:610-9和Fetter 等人(2004)Plant Celll6:215-28)，青色熒光蛋白(CYP) (Bolte 等人(2004)J.Cell Sciencell7:943-54 和 Kato 等人(2002)Plant Physiol.129:913-42)，以及黃色熒光蛋白(來自 Evrogen 的 PhiYFP.TM.;參見，Bolte 等人(2004) J.Cell Sciencell7:943-54) ο 關(guān)于其他選擇性標(biāo)記，一般參見 Yarranton (1992) Curr.0pin.Biotech.3:506-511 ；Christopherson 等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:6314-6318 ;Yao 等人(1992)Cell71:63-72 ；Reznikoff (1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422 ；Barkley 等人(1980)The Operon,第 177-220 頁；Hu 等人(1987)Cell48:555-566 ；Brown 等人(1987)Cell49:603-612 ；Figge 等人(1988)Cell52:713-722 ；Deuschle 等人(1989)Proc.Natl.Acad.Ac1.USA86:5400-5404 ；Fuerst 等人(1989)Proc.Nail.Acad.Sc1.USA86:2549-2553 ；Deuschle 等人(1990) Science248:480-483 ；Gossen (1993)博士學(xué)位論文，Universityof Heidelberg ；Reines 等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:1917-1921 ；Labow 等人(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356 ;Zambretti 等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:3952-3956 ；Baim 等人(1991) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:5072-5076 ；ffyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653 ；Hillenand-ffissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10:143-162 ；Degenkolb 等人(1991) Antimicrob.AgentsChemother.35:1591-1595 ；Kleinschnidt 等人(1988)Biochemistry27:1094-1104 ；Bonin(1993)博士學(xué)位論文，University of Heidelberg ；Gossen 等人(1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:5547-5551 ;01iva 等人(1992) Antimicrob.Agents Chemother.36:913-919 ;Hlavka 等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology,第 78 卷(Springer-Verlag, Berlin)；Gill等人(1988)Nature334:721-724。此類公開以引用方式并入本文。上文的選擇性標(biāo)記基因列表并不意味是限制性的。任何選擇性標(biāo)記可用于本文介紹的組合物中。[0118]F.棺物
[0119]還提供了包含轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物和轉(zhuǎn)基因種子的組合物。在一個實施例中，所述轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物或轉(zhuǎn)基因種子包含重組表達(dá)構(gòu)建體(其包含具有與靶序列(即內(nèi)源性的序列)密切相關(guān)的序列的目的多核苷酸)和重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體，其中所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體編碼由21個核苷酸組成的miRNA，并且當(dāng)所述miRNA在植物細(xì)胞中表達(dá)時，其降低所述靶序列(即內(nèi)源性的序列)的mRNA水平而不降低目的多核苷酸的mRNA水平。
[0120]已經(jīng)認(rèn)識到由重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體編碼的miRNA能靶向任何靶序列。在非限制性實施例中，所述靶序列編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白家族的成員或RUBISCO活化酶I。如本文其他地方所述,在被導(dǎo)入植物細(xì)胞、植物或種子的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體中可使用多種miRNA前體主鏈的任一。此外，本文其它地方討論的多種目的多核苷酸(即原生多核苷酸、轉(zhuǎn)基因、所述靶序列的改組變體，或任何具有與所述靶序列密切相關(guān)的序列的多核苷酸)的任一，可用于所述重組表達(dá)構(gòu)建體中并在植物細(xì)胞、植物或種子中表達(dá)。在另一個實施例中，編碼的miRNA對應(yīng)于所述祀序列的mRNA區(qū)域的互補(bǔ)序列,使得所述區(qū)域與21_ntmiRNA有3個或更少的非互補(bǔ)核苷酸，并且相對橫跨由目的多核苷酸編碼的miRNA的長度的任何給定區(qū)域所述miRNA包含5個或更多的非互補(bǔ)核苷酸。在具體的實施例中，所述靶序列的mRNA區(qū)域的互補(bǔ)序列相對所述21-nt miRNA可包含2個非互補(bǔ)核苷酸、相對所述21_ntmiRNA可包含I個非互補(bǔ)核苷酸或相對所述21-nt miRNA具有100%的序列互補(bǔ)性。
[0121]在一些實施例中，所述重組表達(dá)構(gòu)建體和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體能在同一多核苷酸構(gòu)建體上被整合到植物細(xì)胞的基因組中。作為另外一種選擇，所述重組表達(dá)構(gòu)建體和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體能在不同多核苷酸構(gòu)建體上被整合到植物細(xì)胞的基因組中。
[0122]如本文所用，“植物”包括作為參照的完整植物、植物器官、植物組織、種子和相同的子代。植物細(xì)胞包括但不限于得自下列物質(zhì)的細(xì)胞:種子、懸浮培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子。術(shù)語“植物組織”包括分化和未分化的組織，包括但不限于下列部分:根、莖、芽、葉、花粉、種子、腫瘤組織和不同形式的細(xì)胞和培養(yǎng)物(例如單個細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚和愈傷組織)。植物組織可存在于植物或植物器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中。
[0123]本文提供的轉(zhuǎn)化的植物或轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞是指其遺傳改變，諸如轉(zhuǎn)化，已被目的基因影響，或來自這種改性的植物或細(xì)胞的后代并包含這種改性的植物或植物細(xì)胞。“轉(zhuǎn)基因”是已通過轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入基因組內(nèi)的基因。因此，“轉(zhuǎn)基因植物”是指包含轉(zhuǎn)基因的植物，不論是通過轉(zhuǎn)化或通過育種將轉(zhuǎn)基因引入特定植物的；因此，該定義涵蓋了最初轉(zhuǎn)化的植物的后代?！皩φ铡被颉皩φ罩参铩被颉皩φ罩参锛?xì)胞”為測量受試植物或植物細(xì)胞的表型變化提供了基準(zhǔn)點。對照植物或植物細(xì)胞可包括例如:(a)野生型植物或細(xì)胞，即，與用于遺傳改性生成受試植物或細(xì)胞的起始材料具有相同基因型的；(b)與起始材料具有相同基因型、但用空構(gòu)建體轉(zhuǎn)化了的植物或細(xì)胞(即，用不表達(dá)miRNA的構(gòu)建體和/或不表達(dá)目的多核苷酸的構(gòu)建體，諸如包含標(biāo)記基因的構(gòu)建體)；(c)為受試植物或植物細(xì)胞子代中的非轉(zhuǎn)化的分離體的植物或植物細(xì)胞；(d)與受試植物或植物細(xì)胞遺傳上相同、但未暴露于將導(dǎo)致miRNA表達(dá)的條件或刺激的植物或植物細(xì)胞；或(e)所述受試植物或植物細(xì)胞本身，在包含目的多核苷酸的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體和/或所述重組表達(dá)構(gòu)建體不表達(dá)的情況下。
[0124]已被轉(zhuǎn)化以具有本文提供的重組表達(dá)構(gòu)建體和/或重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的植物細(xì)胞可長成完整植物。從單個植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體或從多種經(jīng)轉(zhuǎn)化的外植體再生、發(fā)育和培育植物是本領(lǐng)域所熟知的。參見例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports5:81-84 ；ffeissbach 和 Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology,(編輯)，Academic Press, Inc.San Diego, Calif., (1988)。該再生和生長方法通常包括如下步驟:選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、培養(yǎng)這些單獨化的細(xì)胞通過胚發(fā)育的通常階段以及通過生根小植株階段。轉(zhuǎn)基因胚以及種子以類似的方式再生。隨后將所得的轉(zhuǎn)基因的生根小苗種植在諸如土壤之類的合適植物生長培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，將再生的植物進(jìn)行自花授粉以產(chǎn)生純合的轉(zhuǎn)基因植物?；蛘撸瑢⒌米栽偕参锏幕ǚ叟c農(nóng)學(xué)上重要的品系的產(chǎn)生種子的植物進(jìn)行雜交。相反，將來自這些重要品系的植物用于給再生植物授粉?？梢陨L兩代或多代以保證所希望的表型特征的表達(dá)穩(wěn)定地保持和遺傳，然后收獲種子以保證所希望的表型特征的表達(dá)已經(jīng)實現(xiàn)。這樣，本文介紹的組合物提供了轉(zhuǎn)化的種子(也被稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)，其具有本文提供的多核苷酸的例如重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體，穩(wěn)定地整合在其基因組中。
[0125]本文提供的重組表達(dá)構(gòu)建體和重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化任何植物種類，包括但不限于單子葉植物(例如玉米、甘蔗、小麥、稻、大麥、高粱或黑麥)和雙子葉植物(例如大豆、蕓苔屬植物、向日葵 、棉花或苜蓿)。目的植物種類的例子包括但不限于玉米(Zea mays)、蕓苔屬植物(例如油菜(B.napus)、蕪菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)),尤其是那些用作種子油源的蕓苔屬植物物種、苜猜(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、黑麥(Secale cereale)、高梁(蜀黍(Sorghum bicolor)、南非蜀黍(Sorghum vulgar))、小米(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黃米(Panicum miIiaceum)、粟(Setariaitalica)、龍爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、紅花(Carthamustinctorius)、小麥(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、煙草屬植物(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(海島棉(Gossypium barbadense)、陸地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea 屬物種)、椰子(Cocos nucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、柑橘(Citrus 屬物種)、可可(Theobroma cacao)、荼(Camellia sinensis)、香蕉(Musa 屬物種)、鱷梨(Persea americana)、無花果(Ficus casica)、番石植(Psidiumguajava)、芒果(Mangifera indica)、撤攬(Olea europaea)、番木瓜果(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亞堅果(Macadamia integrifolia)、杏(Prunusamygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘鹿(Saccharum屬物種)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物、和針葉樹。
[0126]蔬菜包括西紅柿(Lycopersicon esculentum)、萬苣(例如葉用萬苣(Lactucasativa))、菜豆(Phaseolus vulgaris)、利馬豆(Phaseolus Iimensis)、豌豆(香豌豆屬物種(Lathyrus spp.))、和黃瓜屬物種如黃瓜O、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。觀賞植物包括杜鹽花(Rhododendron屬物種)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscus rosasanensis)、薔薇(Rosa屬物種)、郁金香(Tulipa屬物種)、水仙花(Narcissus 屬物種)、矮牽?；?Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品紅(Euphorbia pulcherrima)、和菊花。
[0127]本文可使用的針葉樹包括例如松樹諸如火炬松(Pinus taeda)、沼澤松(Pinuselliotii)、北美黃松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)、和福射松(Pinusradiata);花方萁松(Ps eudotsuga menziesii);異葉鐵杉(Tsuga canadensis);北美云杉(Picea glauca);紅杉(Sequoia sempervirens);真冷杉如銀微(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea);和雪松諸如西岸紅雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黃檜(Chamaecyparis nootkatensis)。在具體的實施例中，本文提供的植物為作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、蕓苔屬植物、大豆、紅花、豌豆、高粱、小麥、粟、煙草屬植物等)。在其它實施例中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外的實施例中大豆植物是最佳的。
[0128]其他目的植物包括提供受關(guān)注種子的谷物植物、油料種子植物和豆科植物。目的種子包括谷物種子，諸如玉米、小麥、大麥、稻、高粱、黑麥等。油料種子植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、蕓苔屬植物、玉米、苜蓿、棕櫚、椰子等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜爾膠、剌槐豆膠、胡蘆巴、大豆、花園豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、扁豆、鷹嘴豆等。
[0129]根據(jù)靶序列，表達(dá)本文提供的重組表達(dá)構(gòu)建體和/或重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因的植物、植物細(xì)胞或種子可具有表型變化，包括但不限于改性的病原體或昆蟲防御機(jī)制、對一種或多種除草劑抗性的增加、耐受脅迫環(huán)境條件能力的增加、改性的生產(chǎn)淀粉能力、改性的淀粉生產(chǎn)水平、改性的油脂含量和/或組成、改性的碳水化合物含量和/或組成、改性的脂肪酸含量和/或組成、改性的利用、分配和/或儲存氮的能力等。
[0130]II1.導(dǎo)入的方法[0131]本文提供的方法包括將包含目的多核苷酸的重組表達(dá)構(gòu)建體和編碼21-nt miRNA的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞、植物或種子?？蓪⒈疚奶峁┑亩喾N目的多核苷酸、重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體或其活性變體和片段的任一導(dǎo)入植物細(xì)胞、植物或種子。
[0132]在一些實施例中，將包含目的多核苷酸的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體和所述重組表達(dá)構(gòu)建體在同一多核苷酸構(gòu)建體上被導(dǎo)入到植物細(xì)胞。作為另外一種選擇，將所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體和所述重組表達(dá)構(gòu)建體在不同多核苷酸構(gòu)建體上被導(dǎo)入到植物細(xì)胞。
[0133]本文提供的方法不依賴于將序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的特定方法，只要使多核苷酸進(jìn)入宿主的至少一個細(xì)胞的內(nèi)部即可。將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞(即植物)中的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時轉(zhuǎn)化方法、和病毒介導(dǎo)的方法。
[0134]術(shù)語“導(dǎo)入"(introducing和introduced)旨在表示提供核酸(例如，重組表達(dá)構(gòu)建體和/或重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體或其活性變體或片段)或蛋白進(jìn)入細(xì)胞。導(dǎo)入包括指將核酸整合到真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸可整合到細(xì)胞的基因組內(nèi)，并且包括指將核酸或蛋白質(zhì)暫時提供給細(xì)胞。導(dǎo)入包括指穩(wěn)定的或瞬時的轉(zhuǎn)化方法以及有性雜交。因此，將核酸片段(例如重組表達(dá)構(gòu)建體和/或重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體或其活性變體或片段)插入細(xì)胞內(nèi)的情況下的“導(dǎo)入”意指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指將核酸片段整合到真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸片段可以整合到細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)、轉(zhuǎn)變成自主的復(fù)制子或瞬時表達(dá)的(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。
[0135]“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”旨在表示將核苷酸構(gòu)建體導(dǎo)入宿主并整合到植物基因組中，并且能夠由其后代遺傳?！八矔r轉(zhuǎn)化”旨在表示將多核苷酸引入宿主(即植物)中并暫時表達(dá)。
[0136]轉(zhuǎn)化方案以及用于將多核苷酸序列引入植物內(nèi)的方案可以根據(jù)被定向轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的類型，即單子葉植物或雙子葉植物而改變。將多核苷酸引入植物細(xì)胞的適當(dāng)方法包括顯微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques4:320_334)、電穿孔(Riggs 等人(1986) Proc.N atl.Acad.Sc1.USA83:5602-5606, Agrobacteriumnediatedtransformation (Townsend 等人，美國專利 5, 563, 055 ；Zhao 等人，美國專利 5, 981, 840)，直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3:2717-2722)，和沖擊粒子加速(參見例如Sanford等人，美國專利4，945, 050 ；Tomes等人，美國專利5，879, 918 ；Tomes等人，美國專利 5，886，244 ；Bidney 等人，美國專利 5，932，782 ；Tomes 等人(1995) “DirectDNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,，，PlantCell, Tissue, and Organ Culture !Fundamental Methods, Gamborg 和 Phillips 編輯(Springer-Verlag, Berlin) ；McCabe 等人(1988)Biotechnology6:923-926)；和 Lecltransformation(W000/28058) ? 還參見 Weissinger 等人(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477 ；Sanford 等人(1987)Particulate Science 和 Technology5:27-37(洋蔥)；Christou 等人(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；McCabe 等人(1988)Bio/Technology6:923-926(大豆)；Finer 和 McMulIen (1991) In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(大豆);Singh 等人(1998) Theor.Appl.Genet.96:319-324 (大豆);Datta等人(1"0) Biotechnology8:736_740 (水稻);Klein 等人(I988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:4305-4309(玉米)；Klein 等人(1988)Biotechnology6:559-563(玉米)；Tomes，美國專利 5，240，855 ；Buising 等人，美國專利 5，322，783 和 5，324，646 ；Tomes 等人(1995) “Direct DNA Tra nsfer into Intact Plant Cells via Microproj ectileBombardment,，，Plant Cell, Tissue, and Organ Culture -Fundamental Methods,Gamborg 編輯(Springer-Verlag, Berlin)(玉米);Klein 等人(1988)Plant Physiol.91:440-444 (玉米)；Fromm 等人(I99O)Biotechnology8:833-839 (玉米)；Hooykaas_VanSlogteren 等人(1984) Nature (London) 311:763-764 ；Bowen 等人，美國專利 5, 736, 369 (谷物);Bytebier 等人(1987) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA84:5345-5349 (百合科)；De Wet 等人(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,Chapman等人編輯(Longman,New York),第 197-209 頁(花粉);Kaeppler 等人(1990)Plant Cell Reports9:415-418和 Kaeppler 等人(1992) Theor.Appl.Genet.84:560-566 (頸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化);D' Halluin等人(1992) Plant Cell4:1495-1505 (電穿孔)；Li 等人(1993) Plant Cell Reportsl2:250-255 和 Christou 和 Ford(1995) Annals of Botany75:407-413 (水稻);0sjoda 等人(1996) Nature Biotechnologyl4:745-750 (玉米,通過根癌農(nóng)桿菌)；所有這些文獻(xiàn)以引用方式并入本文。
[0137]在具體的實施例中，本文所公開的重組表達(dá)構(gòu)建體和/或所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體可使用多種瞬時轉(zhuǎn)化方法提供給植物。此類瞬時轉(zhuǎn)化方法包括但不限于將所述重組表達(dá)構(gòu)建體或所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體或其變體直接導(dǎo)入植物。此類方法包括例如顯微注射或微粒轟擊法。參見例如 Crossway 等人(1986)Mol Gen.Genet.202: 179-185 ;Nomura 等人(1986)Plant Sc1.44:53-58 ；Hepler 等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.91:2176-2180和 Hush 等人(1994)The Journal of Cell Sciencel07:775_784，所有文獻(xiàn)以引用方式并入本文。作為另外一種選擇，可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將多核苷酸瞬時轉(zhuǎn)化至植物中。此類技術(shù)包括病毒載體系統(tǒng)和以排除后續(xù)DNA釋放的方式沉淀多核苷酸。因此，來自微粒結(jié)合的DNA的轉(zhuǎn)錄可以進(jìn)行，但其被釋放以整合至基因組的頻率大大降低了。此類方法包括使用以聚乙基亞胺(PEI ；Sigma#P3143)包被的顆粒。
[0138]在其它實施例中，可通過用病毒或病毒核酸接觸植物將本文所公開的重組表達(dá)構(gòu)建體和重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體引入植物。通常，此類方法涉及將本文提供的核苷酸構(gòu)建體摻入病毒DNA或RNA分子內(nèi)。涉及病毒DNA或RNA分子的用于將多核苷酸導(dǎo)入植物內(nèi)并且表達(dá)其中編碼的蛋白的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如美國專利5，889，191,5,889, 190、5，866，785,5, 589，367,5, 316，931、以及 Porta 等人(1996)Molecular Biotechnology5:209-221 ;其以引用方式并入本文。
[0139]用于在植物基因組的特定位置定向插入多核苷酸的方法是本領(lǐng)域中已知的。在一個實施例中，多核苷酸在所期望的基因組位置的插入利用位點特異性重組系統(tǒng)實現(xiàn)。參見例如 W099/25821、W099/25854、W099/25840、W099/25855、和 W099/25853，它們均以引用方式并入本文。簡而言之，本文提供的重組表達(dá)構(gòu)建體和/或重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體可包含在側(cè)翼有兩個不同的重組位點的轉(zhuǎn)移盒中。所述轉(zhuǎn)移盒被導(dǎo)入植物中，所述植物的基因組中已穩(wěn)定地整合了兩翼與兩個不同的重組位點相連的靶位點，所述重組位點對應(yīng)于所述轉(zhuǎn)移盒中的位點。提供了適當(dāng)?shù)闹亟M酶，并且所述轉(zhuǎn)移盒被整合至所述靶位點。所述重組表達(dá)構(gòu)建體和/或重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體從而被整合至植物基因組中的特定染色體位點上。
[0140] 已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可根據(jù)常規(guī)方法生長為植物。參見例如McCormick等人(1986)Plant Cell R印orts5:81_84。然后可培養(yǎng)這些植物，并用相同的或不同的轉(zhuǎn)化過的植物進(jìn)行授粉，具有所期望表型特征的組成型表達(dá)的所得到的子代被鑒定?？梢陨L兩代或多代以保證所希望的表型特征的表達(dá)穩(wěn)定地保持和遺傳，然后收獲種子以保證所希望的表型特征的表達(dá)已經(jīng)實現(xiàn)。這樣，提供了轉(zhuǎn)化的種子(也被稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)，其具有本文所公開的穩(wěn)定地整合在其基因組中的重組表達(dá)構(gòu)建體和/或重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體。
[0141]IV.使用方法
[0142]提供了通過將重組表達(dá)構(gòu)建體(其包含目的多核苷酸)和重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體(其編碼21-nt miRNA)導(dǎo)入植物細(xì)胞、植物或種子以降低靶序列的mRNA水平的方法。在此類方法中，所述靶序列(即內(nèi)源性的序列)的mRNA水平相對于沒有所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄情況下所述靶序列(即內(nèi)源性的序列)的mRNA水平是降低了，而目的多核苷酸的mRNA水平相對于沒有所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄情況下目的多核苷酸的mRNA水平?jīng)]有降低。
[0143]已經(jīng)認(rèn)識到任何降低所述靶序列的表達(dá)水平但不降低目的多核苷酸的mRNA水平的miRNA能用于本文提供的方法。此外，本文所公開的多種目的多核苷酸(即原生多核苷酸、轉(zhuǎn)基因、所述靶序列的改組變體，或任何具有與所述靶序列密切相關(guān)的序列的多核苷酸)的任一，可用于所提供的方法中。在此類方法中，編碼的miRNA對應(yīng)于所述靶序列的mRNA區(qū)域的互補(bǔ)序列，其中所述區(qū)域可與21-nt miRNA有3個或更少的非互補(bǔ)核苷酸、與21-nt miRNA有2個非互補(bǔ)核苷酸、與21_nt miRNA有I個非互補(bǔ)核苷酸或與所述21_ntmiRNA具有100%的序列互補(bǔ)性。在這種情況下，相對橫跨由目的多核苷酸編碼的miRNA的長度的任何給定區(qū)域所述miRNA包含5個或更多非互補(bǔ)核苷酸。
[0144]已經(jīng)認(rèn)識到在所述方法中使用的由重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體編碼的miRNA能祀向任何靶序列。在非限制性實施例中，所述靶序列編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白家族的成員或RUBISCO活化酶I。如本文其他地方所述，在本文提供的方法中的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體中可使用多種miRNA前體主鏈的任一。
[0145]在本文提供的方法中，目的多核苷酸和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體可存在于同一多核苷酸構(gòu)建體上，或作為另外一種選擇，可存在于不同多核苷酸構(gòu)建體上。在具體的實施例中，所述重組表達(dá)構(gòu)建體包含可操作地連接至第一啟動子的目的多核苷酸，編碼所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的序列被可操作地連接至第二啟動子，其中所述第一和第二啟動子在植物中是有活性的。作為另外一種選擇，在所述方法的一些實施例中，所述重組表達(dá)構(gòu)建體的目的多核苷酸和所述miRNA表達(dá)構(gòu)建體被可操作地連接至同一啟動子。
[0146]本文提供的方法可用于任何植物中。在具體的實施例中，所述植物包括雙子葉植物或單子葉植物，在另外的實施例中，所述雙子葉植物為大豆、蕓苔屬植物、向日葵、棉花或苜蓿，而單子葉植物為玉米、甘蔗、小麥、稻、大麥、高粱或黑麥。
[0147]任何合適的方法可用于測定靶序列表達(dá)降低的水平。例如，評估植物或植物部分中祀核酸表達(dá)降低，可通過多種方法諸如mRNA表達(dá)的Northern印跡分析、蛋白表達(dá)的Western 印跡分析、或以編碼的蛋白功能計的表型分析來實現(xiàn)。在一些實施例中，可分析其他植物副產(chǎn)品諸如油脂的水平作為兩條或更多序列表達(dá)水平降低的指示。靶序列的表達(dá)產(chǎn)物可用多種方法中任一進(jìn)行檢測，其取決于產(chǎn)品的性質(zhì)(例如Western印跡分析和酶反應(yīng)分析法)。用上述方法也能測定目的多核苷酸(其mRNA水平?jīng)]被miRNA降低)的表達(dá)水平。
[0148]V.變體、片段和序列比較[0149]本文提供的方法和組合物采用了多種不同組分。已經(jīng)認(rèn)識到在整個說明書中一些組分可具有活性變體和片段。此類組分包括，例如，目的多核苷酸的任一，或所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的任一或它的組分之一，諸如所述miRNA前體主鏈、miRNA或星序列(即SEQ IDNO:1-21)。本文其他地方描述了這些組分的每一個的生物活性。
[0150]還涵蓋了在組合物和方法中應(yīng)用的多核苷酸的活性變體。例如，本文涵蓋了目的多核苷酸的、或所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的任一的或它的組分之一的活性變體,諸如所述miRNA前體主鏈、miRNA或星序列?！白凅w”是指基本上類似的序列。就多核苷酸而言，變體包括在多核苷酸的一個或多個內(nèi)部位點有一個或多個核苷酸的缺失和/或插入，和/或在多核苷酸的一個或多個位點有一個或多個核苷酸的取代。如本文其他地方所述，本文所公開的目的多核苷酸、重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體、miRNA前體主鏈、miRNA和/或星序列的變體可保持目的多核苷酸、重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體、miRNA前體主鏈、miRNA和/或星序列的活性。變體多核苷酸可包括合成來源的多核苷酸，諸如那些例如通過定點誘變生成的。一般來講，本文所公開的目的多核苷酸、重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體、miRNA前體主鏈、miRNA和/或星序列的變體與由序列比對程序和本文其他地方所述參數(shù)確定的特定多核苷酸具有至少約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、
99%或更高的序列同一性。
[0151]本文也涵蓋了目的多核苷酸的片段?！捌巍笔侵付嗪塑账岬牟糠只虬被嵝蛄幸约坝纱司幋a的蛋白質(zhì)的部分。多核苷酸的片段可編碼保持所述原生蛋白的生物活性的蛋白片段。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分別包括天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。因此，多核苷酸的片段的范圍可為至少約20個核苷酸、約50個核苷酸、約100個核苷酸和至多全長多核苷酸。編碼在所述方法或組合物中使用的蛋白的有生物活性部分的多核苷酸的片段，編碼存在于全長蛋白中的至少15、25、30、50、100、150、200、或250個鄰接的氨基酸，或至多全部數(shù)量的氨基酸。作為另外一種選擇，用作雜交探針或引物的多核苷酸的片段一般來講不編碼保持生物活性的片段蛋白。因此，核酸序列的片段范圍可為至少約10、20、30、40、50、60、70、80個核苷酸或至多全長序列。
[0152]可通過分離編碼目的部分的多核苷酸之一的部分、表達(dá)所編碼的蛋白的部分(例如通過體外重組表達(dá))、評估所述多肽的部分的活性來制備多肽的生物活性部分。例如，編碼目的多肽片段的多核苷酸可包含核苷酸序列，其包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1，000,1, 100,1, 200,1, 300、或
1，400個核苷酸，或至多為存在于本文提供的方法和組合物中使用的核苷酸序列中的核苷
酸數(shù)量。
[0153]用于比對的序列比對方法是本領(lǐng)域熟知的。因此，能使用數(shù)學(xué)算法測定任意兩個序列之間的序列同一性百分比。此類數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是Myers和Miller (1988)CAB10S4:11-17 的算法；Smith 等人(1981)Adv.Appl.Math.2:482 的局部比對算法；Needleman 和 Wunsch(1970) J.Mol.Biol.48:443-453 的全局比對算法；Pearson和 Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.85:2444-2448 的局部搜尋比對方法；Karlin 和Altschul (1990) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA872264 的算法，由 Karlin 和 Altschul 改進(jìn)(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873_5877。
[0154]能利用計算機(jī)實施這些數(shù)學(xué)算法，以比對序列、測定序列同一性。此類具體實施包括但不限于:在 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL(可得自 Intelligenetics, Mountain View,California) ;ALIGN 程序(版本 2.0)和 GCG Wisconsin Genetics Software Package,版本 10 (可自 Accelrys Inc., 9685Scranton Road, San Diego, California, USA 獲得)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。能夠使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行使用這些程序的比對。以下文獻(xiàn)很好地描述了 CLUSTAL程序:Higgins 等人(1988)Gene73:237-244(1988) ;Higgins 等人(1989)CAB10S5:151-153 ;Corpet 等人(1988) Nucleic Acids Res.16:10881-90 ；Huang等人(1992) CAB10S8:155-65 ;以及 Pearson 等人(1994)Meth.Mol.Biol.24:307_331。Altschul 等人(1990) J.Mol.Biol.215:403 的 BLAST 程序基于 Karlin 和 Altschul 的算法(1990,同上)ο可使用BLASTN程序進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，score = 100, wordlength=12，以獲取與本文提供的核苷酸序列同源的核苷酸序列。為了獲取用于比對目的的空位比對，可利用 Gapped BLAST (BLAST2.0)，如 Altschul 等人(1997) Nucleic Acids Res.25:3389。作為另外一種選擇，可使用PS1-BLAST (BLAST2.0)進(jìn)行重復(fù)搜索，它檢測分子間的較遠(yuǎn)關(guān)系。參見 Altschul 等人(1997，同上)。當(dāng)利用 BLAST、Gapped BLAST、PS1-BLAST 時，可使用相應(yīng)程序(例如用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)的默認(rèn)參數(shù)。參見www.ncb1.nlm.nih.gov。也可通過檢查進(jìn)行手動比對。
[0155]除非另作說明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP版本10獲得的值，使用以下參數(shù):核苷酸序列的％同一'I"生和％相似性使用GAPWeight50和Length Weight3,以及nwsgapdna.cmp計分矩陣；氨基酸序列的同一'丨生百分比和相似性百分比使用8的空位權(quán)重和2的長度權(quán)重，以及BL0SUM62計分矩陣?！暗刃С绦颉笔侵笣M足下列條件的任何序列比對程序:就任何正被討論的兩個序列而言，與GAP版本10生成的對應(yīng)比對相比，所述序列比對程序生成具有相同核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同序列同一性百分比的比對。
[0156]單位、前綴和 符號可以以其SI接受的形式表示。除非另外說明，核酸是以5'到 方向從左往右寫；氨基酸序列是分別以氨基到羧基方向從左往右寫。數(shù)值范圍包括限定
范圍數(shù)值的端值在內(nèi)。在 本文中氨基酸可用其通常已知的三字母符號或用IUPAC-1UB生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母符號表示。同樣，核苷酸可以用其通常接受的單字母代碼表示。把說明書作為一個整體時，上面定義的術(shù)語就定義得更全面。
[0157]本文所公開的方法和組合物的非限制性例子如下述:
[0158]1.多核苷酸構(gòu)建體，其包含
[0159](a)包含重組表達(dá)構(gòu)建體的第一元件，所述重組表達(dá)構(gòu)建體包含目的多核苷酸，所述目的多核苷酸與靶序列具有至少80%的序列同一性；和
[0160](b)包含重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的第二元件，其中所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體編碼由21個核苷酸(21-nt)組成的miRNA，并且其中當(dāng)所述miRNA在植物細(xì)胞中表達(dá)時，其降低所述靶序列的mRNA水平而不降低所述第一元件的mRNA水平。
[0161]2.根據(jù)實施例1所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述編碼的miRNA對應(yīng)于所述靶序列的mRNA區(qū)域的互補(bǔ)序列，其中所述區(qū)域相對所述21-nt miRNA具有3個或更少的非互補(bǔ)核苷酸；并且其中所述miRNA相對任何給定區(qū)域包含5個或更多的非互補(bǔ)核苷酸，所述區(qū)域橫跨由目的多核苷酸編碼的mRNA的長度。
[0162]3.根據(jù)實施例2所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述靶序列的mRNA區(qū)域的所述互補(bǔ)序列包含[0163](a)相對所述21-nt miRNA的2個非互補(bǔ)核苷酸；
[0164](b)相對所述21-nt miRNA的I個非互補(bǔ)核苷酸；或
[0165](c)與所述21-nt miRNAlOO1^的序列互補(bǔ)性。
[0166]4.根據(jù)實施例1-3中任一項所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述靶序列對于所述植物細(xì)胞是內(nèi)源性的。
[0167]5.根據(jù)實施例1-4中任一項所述的多核苷酸構(gòu)建體,其中
[0168](a)所述第一元件包含第一啟動子，所述第一啟動子可操作地連接至編碼目的多核苷酸的所述序列；并且
[0169](b)所述第二元件包含第二啟動子，所述第二啟動子可操作地連接至編碼所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的所述序列；
[0170]其中所述第一和第二啟動子在植物中是有活性的。
[0171]6.根據(jù)實施例1-4中任一項所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述第一元件和所述第二元件可操作地連接至同一啟動子。
[0172]7.根據(jù)實施例1-6中任一項所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述目的多核苷酸是所述靶序列的改組變體。
[0173]8.根據(jù)實施例7所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述靶序列編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白家族的成員。
[0174]9.根據(jù)實施例7所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述靶序列編碼RUBISCO活化酶I。
[0175]10.轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其包含
[0176](a)包含目的多核苷酸的重組表達(dá)構(gòu)建體，目的多核苷酸當(dāng)與在所述植物細(xì)胞中表達(dá)的內(nèi)源性的靶序列進(jìn)行比較時具有至少80%的序列同一性；和
[0177](b)在所述植物細(xì)胞中能夠被轉(zhuǎn)錄為RNA序列的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體，
[0178]其中所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體編碼由21個核苷酸(21_nt)組成的miRNA，并且其中當(dāng)所述miRNA在所述植物細(xì)胞中表達(dá)時，其降低所述內(nèi)源性的靶序列的mRNA水平而不降低所述目的多核苷酸的mRNA水平。
[0179]11.根據(jù)實施例10所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述編碼的miRNA對應(yīng)于所述靶序列的mRNA區(qū)域的互補(bǔ)序列，其中所述區(qū)域相對所述21-nt miRNA具有3個或更少的非互補(bǔ)核苷酸；并且，
[0180]其中所述miRNA相對任何給定區(qū)域包含5個或更多的非互補(bǔ)核苷酸,所述區(qū)域橫跨由目的多核苷酸編碼的mRNA的長度。
[0181]12.根據(jù)實施例11所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述靶序列的mRNA區(qū)域的所述互補(bǔ)序列包含
[0182](a)相對所述21-nt miRNA的2個非互補(bǔ)核苷酸；
[0183](b)相對所述21-nt miRNA的I個非互補(bǔ)核苷酸；或
[0184](c)與所述21-nt miRNA100%的序列互補(bǔ)性。
[0185]13.根據(jù)實施例10-12中任一項所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述重組表達(dá)構(gòu)建體和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體在同一多核苷酸構(gòu)建體上被整合到所述植物細(xì)胞的基因組中，所述重組表達(dá)構(gòu)建體包含目的多核苷酸。
[0186]14.根據(jù)實施例10-12中任一項所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述重組表達(dá)構(gòu)建體和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體在不同多核苷酸構(gòu)建體上被整合到所述植物細(xì)胞的基因組中。
[0187]15.根據(jù)實施例10-14中任一項所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述目的多核苷酸是所述靶序列的改組變體。
[0188]16.根據(jù)實施例15所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述靶序列編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白家族的成員。
[0189]17.根據(jù)實施例15所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述靶序列編碼RUBISCO活化酶
1
[0190]18.植物，其包含實施例10-17中任一項的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
[0191]19.轉(zhuǎn)基因種子，其包含實施例10-17中任一項的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
[0192]20.根據(jù)實施例10-17中任一項所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自雙子葉植物。
[0193]21.根據(jù)實施例20所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述雙子葉植物為大豆、蕓苔屬植物、向日葵、棉花或苜蓿。
[0194]22.根據(jù)實施例10-17中任一項所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物。
[0195]23.根據(jù)實施例22所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述單子葉植物為玉米、甘蔗、小
麥、稻、大麥、高粱或黑麥。
[0196]24.降低植物細(xì)胞中靶序列的mRNA水平的方法，其包括向植物細(xì)胞中導(dǎo)入
[0197](a)包含目的多核苷酸的重組表達(dá)構(gòu)建體，其中所述目的多核苷酸與內(nèi)源性的靶序列具有至少80%的序列同一性，所述內(nèi)源性的靶序列可操作地連接至在所述植物細(xì)胞中有活性的啟動子；和
[0198](b)重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體，其中所述重組niRNA表達(dá)構(gòu)建體編碼由21個核苷酸(21-nt)組成的 miRNA ；
[0199]其中所述內(nèi)源性的靶序列的mRNA水平相對于沒有所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄情況下所述內(nèi)源性的靶序列的mRNA水平是降低的，并且其中所述目的多核苷酸的mRNA水平相對于沒有所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄情況下所述目的多核苷酸的mRNA水平?jīng)]有降低。
[0200]25.根據(jù)實施例24所述的方法，其中包含所述目的多核苷酸和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的所述重組表達(dá)構(gòu)建體被導(dǎo)入所述植物細(xì)胞在同一多核苷酸構(gòu)建體上。
[0201]26.根據(jù)實施例24所述的方法，其中所述重組表達(dá)構(gòu)建體和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體在不同多核苷酸構(gòu)建體上被導(dǎo)入到所述植物細(xì)胞中，所述重組表達(dá)構(gòu)建體包含所述目的多核苷酸。
[0202]27.根據(jù)實施例24-26中任一項所述的方法，其中所述編碼的miRNA對應(yīng)于所述靶序列的mRNA區(qū)域的互補(bǔ)序列，其中所述區(qū)域相對所述21-nt miRNA具有3個或更少的非互補(bǔ)核苷酸；并且
[0203]其中所述miRNA相對任何給定區(qū)域包含5個或更多的非互補(bǔ)核苷酸，所述區(qū)域橫跨由目的多核苷酸編碼的mRNA的長度。
[0204]28.根據(jù)實施例27所述的方 法，其中所述靶序列的mRNA區(qū)域的所述互補(bǔ)序列包含[0205](a)相對所述21-nt miRNA的2個非互補(bǔ)核苷酸；
[0206](b)相對所述21-nt miRNA的1個非互補(bǔ)核苷酸；或
[0207](c)與所述21-nt miRNA100%的序列互補(bǔ)性。
[0208]29.根據(jù)實施例24-28中任一項所述的方法，其中
[0209](a)所述重組表達(dá)構(gòu)建體包含所述目的多核苷酸，所述目的多核苷酸可操作地連接至第一啟動子；并且
[0210](b)編碼所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的所述序列可操作地連接至第二啟動子，
[0211]其中所述第一和第二啟動子在植物中是有活性的。
[0212]30.根據(jù)實施例24-28中任一項所述的方法，其中所述重組表達(dá)構(gòu)建體和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體可操作地連接至同一啟動子。
[0213]31.根據(jù)實施例24-30中任一項所述的方法，其中所述目的多核苷酸是所述靶序列的改組變體。
[0214]32.根據(jù)實施例31所述的方法，其中所述靶序列編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白家族的成員。
[0215]33.根據(jù)實施例31所述的方法，其中所述靶序列編碼RUBISCO活化酶I。
[0216]34.根據(jù)實施例24-33中任一項所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來自雙子葉植物。
[0217]35.根據(jù)實施例34所述的方法，其中所述雙子葉植物為大豆、蕓苔屬植物、向日葵、棉花或苜蓿。
[0218]36.根據(jù)實施例24-33中任一項所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物。
[0219]37.根據(jù)實施例36所述的方法，其中所述單子葉植物為玉米、甘蔗、
[0220]小麥、稻、大麥、高粱或黑麥。
[0221]實驗
[0222]提供以下實例以示出受權(quán)利要求書保護(hù)的本發(fā)明，但本發(fā)明不受以下實例的限制。應(yīng)當(dāng)理解本文所述的實例和實施例僅用于例證性的目的，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到在不脫離本發(fā)明精神或所附權(quán)利要求范圍的情況下可改變多種試劑或參數(shù)。
[0223]實例1
[0224]設(shè)計人工微RNA序列
[0225]主要根據(jù)Schwab R，等人(2005)Dev Cellg:517_27中所述的規(guī)則設(shè)計能夠沉默期望的靶基因的人工微RNA (amiRNA)?？偠灾NA序列長度為21個核苷酸，在其5’ -端有“U”，相對于其星序列顯示出5'不穩(wěn)定性(這是通過在位點19包括C或G實現(xiàn)的)，并且在其第10個核苷酸有“A”或“U”。對于人工微RNA設(shè)計的附加要求是用ZipFold算法(Markham，N.R.& Zuker, Μ.(2005) Nucleic Acids Res.33:W577-ff581)來計算具有高度自由Λ G的amiRNA。任選地，在amiRNA的5'部分內(nèi)可加入一對堿基對變化使得所述序列與靶序列相差一個核苷酸。
[0226]實例 2
[0227]設(shè)計人工星序列
[0228]“星序列”是前體RNA中堿基對與amiRNA序列在一起以形成不完全的莖結(jié)構(gòu)的那些序列。為了形成完全的莖結(jié)構(gòu)，星狀序列將是amiRNA的完全反向互補(bǔ)序列。
[0229]可使用mfold 折疊前體序列(Zhang 等人(2006)FEBS Lett.580(15):3753-62)(M.Zuker (2003) Nucleic Acids Res.H:3406-15 ;和 D.H.Mathews，J.等人(1999) J.Mol.Biol.2M =911-940)。然后用所述amiRNA序列置換所述miRNA序列，并且用所述amiRNA的完全反向互補(bǔ)序列置所述換內(nèi)源性的星序列?？赏ㄟ^在所述星序列中導(dǎo)入變化來設(shè)計人工星序列，使得所述莖的結(jié)構(gòu)保持與所述內(nèi)源性的結(jié)構(gòu)相同。然后用mfold折疊所述發(fā)生改變的序列，并目測比較所述內(nèi)源性的和發(fā)生改變的結(jié)構(gòu)。如果必要的話，可將更多的改變導(dǎo)入人工星序列中以保持結(jié)構(gòu)。
[0230]實例 3
[0231]將基因組微RNA前體轉(zhuǎn)化成人工微RNA前體
[0232]可使用重疊聚合酶鏈反應(yīng)(overlapping PCR)將基因組miRNA前體基因轉(zhuǎn)化為amiRNA，可將所得的DNA全部測序，然后克隆至載體中用于轉(zhuǎn)化。
[0233]作為另外一種選擇，可商業(yè)合成amiRNA,例如通過Codon Devices, (Cambridge,MA)。然后將所述合成的DNA克隆至載體中用于轉(zhuǎn)化。
[0234]實例4
[0235]轉(zhuǎn)化玉米
[0236]A.玉米微粒介導(dǎo)的DNA傳遞
[0237]可以將DNA構(gòu)建體導(dǎo)入能夠在合適的玉米培養(yǎng)基中生長的玉米細(xì)胞內(nèi)。此類感受態(tài)細(xì)胞可來源于玉米懸浮培養(yǎng)物，在固體培養(yǎng)基上的愈傷組織培養(yǎng)物，新分離的未成熟胚芽或分生組織細(xì)胞?？梢允褂肏1-1I基因型的未成熟胚芽作為靶細(xì)胞。在授粉后大約10天收獲穗，并且從種仁分離出1.2-1.5mm未成`熟胚芽，并且放置使得盾片側(cè)朝下在玉米培養(yǎng)物上。
[0238]從穗上收獲之后18-72小時，轟擊未成熟胚芽。在轟擊之前6和18小時之間，將未成熟胚芽放置在含有附加滲壓劑的培養(yǎng)基(MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Musashige和Skoog，1962，Physiol.Plantl5:473_497，含有0.25M山梨醇)上。將在高滲透性培養(yǎng)基上的胚芽用作轟擊靶，并且在轟擊后，在該培養(yǎng)基上再放置18小時。
[0239]對于粒子轟擊，使用標(biāo)準(zhǔn)CaC12_亞精胺化學(xué)(參見例如Klein等人，1987，Nature327:70-73)將質(zhì)粒DNA(上述)在1.8mm鶴粒子上沉淀。使用DuPont HeliumGun (Lowe 等人，1995，Bio/Technoll3:677-682)將每個平板以 600PSI 轟擊一次。對于用于玉米未成熟胚芽分離、愈傷組織引發(fā)、愈傷組織增長以及植物再生的典型培養(yǎng)基制劑，參見 Armstrong, C, 1994, “The Maize Handbook，，，M.Freeling 和 V.Walbot 編輯，SpringerVerlag, NY,第 663-671 頁。
[0240]在粒子轟擊之后1-7天內(nèi)，將胚芽移動到含有3mg/l選擇試劑雙丙氨磷的N6-基培養(yǎng)基上。每2周將胚芽以及晚期愈傷組織轉(zhuǎn)移到新選擇平板上。對于所需表型，篩選從未成熟胚芽上發(fā)育的愈傷組織。6-8周后，回收轉(zhuǎn)化的愈傷組織。
[0241]B.使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米
[0242]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化基本上按照Zhao等人，Meth.Mol.Biol.318:315-323(2006)中描述的方法進(jìn)行(還可參見Zhao等人，Mol.fceed.8:323-333 (2001)和1999年11月9日公布的美國專利5，981，840，其以引用方式并入本文)。該轉(zhuǎn)化過程涉及細(xì)菌接種，共培養(yǎng)，靜息，選擇和植物再生。
[0243]1.未成熟胚芽制備:[0244]將未成熟胚芽從穎果上切下來，并且放置在含有2mL PH1-A培養(yǎng)基的2mL微管中。
[0245]2.未成熟胚芽的農(nóng)桿菌屬細(xì)菌感染和共培養(yǎng):
[0246]2.1感染步驟:
[0247]用ImL微吸移管將(I)的PH1-A培養(yǎng)基取出，并且加入ImL農(nóng)桿菌屬懸浮液。將該管輕輕地倒置以混合。將該混合物在室溫下培養(yǎng)5分鐘。
[0248]2.2共培養(yǎng)步驟:
[0249]用ImL微量吸移管將農(nóng)桿菌屬懸浮液從感染步驟中移出。使用無菌刮刀將胚從管中刮出并轉(zhuǎn)移到100X 15mm培養(yǎng)皿中的PH1-B培養(yǎng)基的平板中。測定胚的朝向，使得胚軸在培養(yǎng)基表面上朝下。將具有胚芽的平板在20°C下于黑暗中培養(yǎng)3天。L-半胱氨酸可用于共培養(yǎng)階段。采用標(biāo)準(zhǔn)二元載體，補(bǔ)充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培養(yǎng)培養(yǎng)基對于回收穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因事件是至關(guān)重要的。
[0250]3.選擇推定的轉(zhuǎn)基因事件:
[0251]向在100X 15mm培養(yǎng)皿中的每個PH1-D培養(yǎng)基的平板轉(zhuǎn)移10個胚芽，保持朝向，并且用parafilm將培養(yǎng)皿密封。將平板在黑暗中于28°C下培養(yǎng)。預(yù)計在六至八周將看見作為黃色胚芽組織的主動生長推定事件。不產(chǎn)生事件的胚可能是棕色和壞死的，并且?guī)缀蹩床灰姶嘈越M織生長。以二 -三周的間隔將推定的轉(zhuǎn)基因胚芽組織轉(zhuǎn)移到新鮮的PH1-D平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，時間間隔取決于生長速度。記錄事件。
[0252]4.TO棺物的再牛:
[0253]將在PH1-D培養(yǎng)基上繁殖的胚芽組織轉(zhuǎn)移到在100X 25mm培養(yǎng)皿中的PH1-E培養(yǎng)基(體細(xì)胞胚芽成熟培養(yǎng)基)中 進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在28°C下于黑暗中孵育直至體細(xì)胞胚芽成熟，培養(yǎng)大約10-18天。將具有良好限定的盾片和胚芽鞘的個體成熟體細(xì)胞胚芽轉(zhuǎn)移到PH1-F胚芽發(fā)芽培養(yǎng)基中，并且在28°C于光中(約80 μ E，來自冷光燈或同等熒光燈)培養(yǎng)。在七天至十天，將約IOcm高的再生的植物置于盆中的園藝混合物中，并且使用標(biāo)準(zhǔn)園藝方法進(jìn)行耐寒鍛煉。
[0254]用于植物轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基:
[0255]1.PH1-A:4g/L CHU 基礎(chǔ)鹽，1.0mL/L1000XEriksson's 維生素混合物，0.5mg/L鹽酸硫胺，1.5mg/L2,4-D,0.69g/L L-脯氨酸,68.5g/L 鹿糖,36g/L 葡萄糖，pH5.2。加入100 μ M乙酰丁香酮(過濾滅菌的)。
[0256]2.PH1-B =PH1-A,不含有葡萄糖，將2，4-D增加至2mg/L，將蔗糖降低至30g/L，并且補(bǔ)充0.85mg/L硝酸銀(過濾滅菌的)，3.0g/L Gelriteκ, 100 μ M乙酰丁香酮(過濾滅菌的)，ρΗ5.8。
[0257]3.PH1-C:ΡΗΙ_Β，不含Gelrite?和乙酰丁香酮，將2，4_D降低至1.5mg/L，并且補(bǔ)充
8.0g/L瓊脂，0.5g/L2-[N-嗎啉代]乙烷-磺酸(MES)緩沖液，100mg/L羧芐西林(過濾滅菌的)。
[0258]4.PH1-D =PH1-C補(bǔ)充3mg/L雙丙氨磷(過濾滅菌的)。
[0259]5.PH1-E:4.3g/L 的 Murashige and Skoog(MS)鹽(Gibco, BRLl 1117-074)、0.5mg/L的煙酸、0.lmg/L的鹽酸硫胺素、0.5mg/L的鹽酸吡哆醇、2.0mg/L的甘氨酸、0.lg/L的肌酉享、0.5mg/L的玉米素(Sig ma,目錄號:Z_0164)，lmg/L 口引哚乙酸(IAA), 26.4 μ g/L脫落酸(ABA)，60g/L鹿糖，3mg/L bialaphos (過濾滅菌的),100mg/L羧節(jié)西林(過濾滅菌的),8g/L 瓊脂，pH5.6。
[0260]6.PH1-F:不含玉米素、IAA、ABA的PH1-E ;將蔗糖降低至40g/L ；用1.5g/L Gelrite1'替代瓊脂；pH 為 5.6。
[0261]可通過首先將組織簇轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充以0.2mg每升2，4D的N6培養(yǎng)基中來從轉(zhuǎn)基因愈傷組織中再生植物。在兩周后，可將所述組織轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基(Fromm等人，Bio/Technology8:833839 (1990))。
[0262]實例5
[0263]用于在玉米中沉默內(nèi)源性的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和表達(dá)改組的PEPC的序列和載體
[0264]設(shè)計人工miRNA以沉默玉米中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的C4形式(SEQ ID NO:26)而非 C3 形式(SEQ ID NO:29 ；NCBI GI N0.429148)也非根部形式(SEQ ID NO:30 ；NCBI GI N0.3132309)。在本文中稱為 PEPC4A 的一個 aniRNA 是5’-ucucugcagagccucaucgag_3’ (對應(yīng)于該 amiRNA 的 DNA 序列用 SEQ ID NO:1 表示)，而另一個(amiRNA),在本文中稱作 PEPC4B,是 5’-uucagaaacuccagaagccag_3’(對應(yīng)于該 amiRNA的DNA序列用SEQ ID NO:2表示)。表1中示出了用于沉默磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的對應(yīng)于所述人工星序列的DNA序列。
[0265]表1:用于沉默PEPC的人工miRNA星序列
[0266]
【權(quán)利要求】
1.多核苷酸構(gòu)建體，包含 (a)包含重組表達(dá)構(gòu)建體的第一元件，所述重組表達(dá)構(gòu)建體包含目的多核苷酸，所述目的多核苷酸與靶序列具有至少80%的序列同一性；和 (b)包含重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的第二元件， 其中所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體編碼由21個核苷酸(21-nt)組成的miRNA，并且其中當(dāng)所述miRNA在植物細(xì)胞中表達(dá)時，其降低所述靶序列的mRNA水平而不降低所述第一元件的mRNA水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述編碼的miRNA對應(yīng)于所述靶序列的mRNA區(qū)域的互補(bǔ)序列，其中所述區(qū)域相對所述21-ntmiRNA具有3個或更少的非互補(bǔ)核苷酸；并且 其中所述miRNA相對任何給定區(qū)域包含5個或更多的非互補(bǔ)核苷酸，所述區(qū)域橫跨由所述目的多核苷酸編碼的mRNA的長度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述靶序列的mRNA區(qū)域的所述互補(bǔ)序列包含 (a)相對所述21-ntmiRNA的2個非互補(bǔ)核苷酸； (b)相對所述21-ntmiRNA的I個非互補(bǔ)核苷酸；或 (c)與所述21-ntmiRNAlOO1^的序列互補(bǔ)性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中 任一項所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述靶序列對于所述植物細(xì)胞是內(nèi)源性的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中 (a)所述第一元件包含第一啟動子，所述第一啟動子可操作地連接至編碼所述目的多核苷酸的所述序列；并且 (b)所述第二元件包含第二啟動子，所述第二啟動子可操作地連接至編碼所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的所述序列； 其中所述第一和第二啟動子在植物中是有活性的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述第一元件和所述第二元件可操作地連接至同一啟動子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述目的多核苷酸是所述靶序列的改組變體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述靶序列編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白家族的成員。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多核苷酸構(gòu)建體，其中所述靶序列編碼RUBISC0活化酶I。
10.轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，包含: (a)包含目的多核苷酸的重組表達(dá)構(gòu)建體，所述目的多核苷酸當(dāng)與在所述植物細(xì)胞中表達(dá)的內(nèi)源性的靶序列進(jìn)行比較時具有至少80%的序列同一性；和 (b)在所述植物細(xì)胞中能夠被轉(zhuǎn)錄為RNA序列的重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體， 其中所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體編碼由21個核苷酸(21_nt)組成的miRNA，并且其中當(dāng)所述miRNA在所述植物細(xì)胞中表達(dá)時，其降低所述內(nèi)源性的靶序列的mRNA水平而不降低所述目的多核苷酸的mRNA水平 。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述編碼的miRNA對應(yīng)于所述靶序列的mRNA區(qū)域的互補(bǔ)序列，其中所述區(qū)域相對所述21-nt miRNA具有3個或更少的非互補(bǔ)核苷酸；并且 其中所述miRNA相對任何給定區(qū)域包含5個或更多的非互補(bǔ)核苷酸，所述區(qū)域橫跨由所述目的多核苷酸編碼的mRNA的長度。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述靶序列的mRNA區(qū)域的所述互補(bǔ)序列包含 (a)相對所述21-ntmiRNA的2個非互補(bǔ)核苷酸； (b)相對所述21-ntmiRNA的I個非互補(bǔ)核苷酸；或 (c)與所述21-ntmiRNAlOO1^的序列互補(bǔ)性。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述重組表達(dá)構(gòu)建體和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體在同一多核苷酸構(gòu)建體上被整合到所述植物細(xì)胞的基因組中，所述重組表達(dá)構(gòu)建體包含所述目的多核苷酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述重組表達(dá)構(gòu)建體和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體在不同多核苷酸構(gòu)建體上被整合到所述植物細(xì)胞的基因組中。
15.根據(jù)權(quán)利要求10-14中任一項所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述目的多核苷酸是所述靶序列的改組變體。
16.根 據(jù)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述靶序列編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白家族的成員。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述靶序列編碼RUBISC0活化酶I。
18.植物，包含權(quán)利要求10-17中任一項的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
19.轉(zhuǎn)基因種子，包含權(quán)利要求10-17中任一項的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求10-17中任一項所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自雙子葉植物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述雙子葉植物為大豆、蕓苔屬植物、向日葵、棉花或苜蓿。
22.根據(jù)權(quán)利要求10-17中任一項所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中所述單子葉植物為玉米、甘蔗、小麥、稻、大麥、高粱或黑麥。
24.降低植物細(xì)胞中靶序列的mRNA水平的方法，包括向植物細(xì)胞中導(dǎo)入 (a)包含目的多核苷酸的重組表達(dá)構(gòu)建體，所述目的多核苷酸與內(nèi)源性的靶序列具有至少80%的序列同一性，所述內(nèi)源性的靶序列可操作地連接至在所述植物細(xì)胞中有活性的啟動子；和 (b)重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體，其中所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體編碼由21個核苷酸(21-nt)組成的 miRNA ； 其中所述內(nèi)源性的靶序列的mRNA水平相對于沒有所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄情況下所述內(nèi)源性的靶序列的mRNA水平是降低的，并且其中所述目的多核苷酸的mRNA水平相對于沒有所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄情況下所述目的多核苷酸的mRNA水平?jīng)]有降低。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述重組表達(dá)構(gòu)建體和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體在同一多核苷酸構(gòu)建體上被導(dǎo)入到所述植物細(xì)胞中，所述重組表達(dá)構(gòu)建體包含所述目的多核苷酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述重組表達(dá)構(gòu)建體和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體在不同多核苷酸構(gòu)建體上被導(dǎo)入到所述植物細(xì)胞中，所述重組表達(dá)構(gòu)建體包含所述目的多核苷酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求24-26中任一項所述的方法，其中所述編碼的miRNA對應(yīng)于所述靶序列的mRNA區(qū)域的互補(bǔ)序列，其中所述區(qū)域相對所述21-nt miRNA具有3個或更少的非互補(bǔ)核苷酸；并且 其中所述miRNA相對任何給定區(qū)域包含5個或更多的非互補(bǔ)核苷酸，所述區(qū)域橫跨由所述目的多核苷酸編碼的mRNA的長度。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述靶序列的mRNA區(qū)域的所述互補(bǔ)序列包含 (a)相對所述21-ntmiRNA的2個非互補(bǔ)核苷酸； (b)相對所述21-ntmiRNA的I個非互補(bǔ)核苷酸；或 (c)與所述21-ntmiRNAlOO1^的序列互補(bǔ)性。
29.根據(jù)權(quán)利要求24-28中任一項所述的方法，其中 (a)所述重組表達(dá)構(gòu)建體包含所述目的多核苷酸，所述目的多核苷酸可操作地連接至弟一啟動子；并且 (b)編碼所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體的所述序列可操作地連接至第二啟動子， 其中所述第一和第二啟動子在植物中是有活性的。
30.根據(jù)權(quán)利要求24-28中任一項所述的方法，其中所述重組表達(dá)構(gòu)建體和所述重組miRNA表達(dá)構(gòu)建體可操作地連接至同一啟動子。
31.根據(jù)權(quán)利要求24-30中任一項所述的方法，其中所述目的多核苷酸是所述靶序列的改組變體。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述靶序列編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白家族的成員。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述靶序列編碼RUBISC0活化酶I。
34.根據(jù)權(quán)利要求24-33中任一項所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來自雙子葉植物。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述雙子葉植物為大豆、蕓苔屬植物、向日葵、棉花或苜蓿。
36.根據(jù)權(quán)利要求24-33中任一項所述的方法，其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述單子葉植物為玉米、甘蔗、小麥、稻、大麥、高粱或黑麥。
【文檔編號】C12N15/82GK103890179SQ201280052118
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年10月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月28日
【發(fā)明者】I.庫雷克, B.麥戈尼格勒, G.朱 申請人:納幕爾杜邦公司, 先鋒國際良種公司