專利名稱：用于獲得具有沉默標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,及細(xì)胞和生物體以及用其篩 ...的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
本申請(qǐng)是1999年12月12日的申請(qǐng)地No.09/438,392的部分繼續(xù)申請(qǐng)，而09/438,392是1998年6月28日申請(qǐng)的No.09/014,592的部分繼續(xù)申請(qǐng)，其2000年5月16日被授予美國專利，專利號(hào)6,063,985。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為在多細(xì)胞機(jī)體中著力解決重要生物學(xué)問題的有力工具，并尤其在植物領(lǐng)域。許多通過傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法不能解決的問題，現(xiàn)在可以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)解決，包括將同源或異源基因?qū)胫参铮薷墓δ芗案淖儽磉_(dá)模式。這種技術(shù)的成功通常依賴于使用標(biāo)記，以鑒別轉(zhuǎn)基因植物和控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子。
可選擇的標(biāo)記廣泛用于植物轉(zhuǎn)化。歷史上這種標(biāo)記通常是編碼抗生素或除草劑抗性的顯性基因(Yoder和Goldsbrough，1994)。盡管這種標(biāo)記是高效的，但它們?nèi)跃哂幸恍┤秉c(diǎn)。用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗生素和除草劑通常具有對(duì)增殖和分化的負(fù)作用，并在轉(zhuǎn)化過程期間可以延遲無定形莖的分化(Ebinuma等，1997)。同樣，一些植物種屬對(duì)這些選擇劑是敏感或耐受的，并因此難以分離轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織(Ebinuma等，1997)。另外，這些基因是組成型表達(dá)的，并且在實(shí)驗(yàn)室之外生長(zhǎng)的植物中插入這種組成型表達(dá)的基因還存在環(huán)境和健康問題(Bryant和Leather，1992；Gressel，1992；Flavell等，1992)。
一種既不是抗生素也不是除草劑的標(biāo)記是來自Agrobacteriumtumefaciens的Ti質(zhì)粒的ipt基因。這種基因編碼用于細(xì)胞激動(dòng)素合成中的異戊烯轉(zhuǎn)移酶(Barry等，1984)。異戊烯轉(zhuǎn)移酶使用5’-AMP和異戊烯二磷酸催化異戊烯-腺苷-5’-單磷酸的形成，其是細(xì)胞激動(dòng)素生物合成中的第一個(gè)中間體。Ipt基因的過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞激動(dòng)素水平提高(Medford等，1989；McKenzie等，1998；Faiss等，1997；Redig等，1996；Ebinuma等，1997)。細(xì)胞激動(dòng)素是在植物發(fā)育中通過介導(dǎo)形態(tài)學(xué)變化起重要作用的激素(Mok和Mok，1994；Davies，1995；Coenen和Lomax，1997)。例如細(xì)胞激動(dòng)素能刺激葉片擴(kuò)展及延緩葉片衰老(Kuraish和Okumura，1956；Wingler，1998；Gan和Amasion，1995)。在黑暗生長(zhǎng)的幼苗中，高細(xì)胞激動(dòng)素水平可產(chǎn)生去黃化的表型，與光亮生長(zhǎng)的秧苗的形態(tài)相似，具有短的下胚軸，開放的鉤和擴(kuò)展的子葉(Chaudhury，1993；Miklashevichs和Walden，1997)。細(xì)胞激動(dòng)素也可以從頂端優(yōu)勢(shì)中釋放側(cè)向芽，并刺激芽從頭形成(Cline，1991；Skoog和Miller，1957；Sachs和Thimmann，1967)。這類激素因此在無定形莖形成中起關(guān)鍵作用。如Skoog和Miller(1957)所表明，高細(xì)胞分裂素水平可誘導(dǎo)莖干從煙草莖中分化，這是再生轉(zhuǎn)基因植物的前提條件。除了支持腫瘤生長(zhǎng)之外，將T-DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞中也可誘導(dǎo)生理異常的莖干從轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體或葉片中再生。
ipt基因，T-DNA的一種成分，其過表達(dá)(Akiyoshi等，1984；Barry等，1984)導(dǎo)致與生長(zhǎng)素相關(guān)的細(xì)胞分裂素水平提高，其引發(fā)莖干再生(Tran Thanh Van，1981)。這種莖干的超量產(chǎn)生可產(chǎn)生一種大量莖干的表型(在此稱為shooty表型)。這種表型可以用作標(biāo)記(Ebinuma等，1997)。使用在組成型啟動(dòng)子控制下的ipt基因的研究示出，ipt過表達(dá)導(dǎo)致在轉(zhuǎn)基因植物中細(xì)胞分裂素水平提高(Smigocki和Owens，1988；Medford等，1989)。已經(jīng)將在花椰菜花葉病毒(CaMV)啟動(dòng)子控制下的嵌合的ipt基因?qū)腭R鈴薯(Ooms等，1983)，黃瓜(Smigocki和Owens，1989)，和一些Nicotiana種屬(Smigocki和Owens，1988)的細(xì)胞中，這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞增殖并呈現(xiàn)一種極端的shooty表型，及在無激素的培養(yǎng)基中喪失頂端優(yōu)勢(shì)。研究表明在用ipt基因轉(zhuǎn)化以超量產(chǎn)生細(xì)胞分裂素的植物中，細(xì)胞分裂素只是局部作為旁分泌激素(Faiss等，1997)。使用野生型煙草植物和其中ipt基因過表達(dá)的煙草植物進(jìn)行的嫁接實(shí)驗(yàn)示出，細(xì)胞分裂素水平提高仍然局限于ipt過表達(dá)的部分植物(Faiss等，1997)。
使用組成型表達(dá)的ipt作為標(biāo)記的一個(gè)問題是所得轉(zhuǎn)基因植物喪失頂端優(yōu)勢(shì)，且因?yàn)榧?xì)胞分裂素的超量產(chǎn)生而不能生根(Ebinuma等，1997)。另外，組成型過表達(dá)ipt的植物具有改變的葉片形態(tài)和延遲的葉片衰老。這種植物示出少量的根生長(zhǎng)和可憐的拔節(jié)，顯示延遲的葉片衰老，和非常常見的不育(Mok和Mok，1994；Klee等，1987；Ebinuma等，1997)。
Ebinuma等(1997)揭示了一種使用ipt標(biāo)記以克服與ipt的組成型過表達(dá)相關(guān)的問題的方法。他們揭示了一種載體，其中將ipt基因插入包括轉(zhuǎn)座因子Ac的質(zhì)粒中。此構(gòu)建體包括T-DNA(移至植物細(xì)胞中的Ti質(zhì)粒的部分)和35S CaMV啟動(dòng)子。將此構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入A.tumefaciens中。將葉片節(jié)段用轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接種，并生長(zhǎng)于非選擇性培養(yǎng)基中。在很少的情況下，在切除之后Ac因子不能再整合或整合入姐妹染色單體中。選擇具有特別的shooty表型的異常莖干，并進(jìn)一步培養(yǎng)6個(gè)月。其中生長(zhǎng)培育出一些正常的莖干。通過DNA分析測(cè)定，其中有一些是由于轉(zhuǎn)座因子Ac與ipt基因一起從基因組中切除的結(jié)果。這些植物中有一些保留了也包含于質(zhì)粒中的其它必需標(biāo)記。因此這種方法克服了存在ipt基因組成型表達(dá)的問題。不幸地，這種方法需要培養(yǎng)許多個(gè)月，而且只產(chǎn)生喪失ipt基因的少數(shù)植物。Ebinuma等(1997)報(bào)道了在感染6個(gè)月后，無標(biāo)記的植物的出現(xiàn)頻率為0.032％。另外，從異常的再生物中選擇“正?！钡那o干是基于可變的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。形態(tài)學(xué)選擇在喪失35S-ipt基因的植物和嵌合植物或具有極低ipt表達(dá)水平的植物之間，也沒有分辨力。
使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是另一種方法，這種方法已經(jīng)用于克服與ipt基因在轉(zhuǎn)基因植物中組成型過表達(dá)相關(guān)的問題。使用銅誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)ipt基因表達(dá)，使ipt基因在根中特異性表達(dá)，根是細(xì)胞分裂素生物合成的重要器官(McKenzie等，1998)。另外，通過四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的ipt基因表達(dá)(Gatz等，1992)，提供了關(guān)于細(xì)胞分裂素在植物中的生物作用，及其通過維管系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)(Faiss等，1997；Redig等，1996)的數(shù)據(jù)。也已經(jīng)報(bào)道了攜帶在熱激(Medford等，1989)，和光度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Redig等，1996)控制下ipt基因的轉(zhuǎn)基因植物。所有這些系統(tǒng)均用于研究細(xì)胞分裂素的生物作用，而不是用于轉(zhuǎn)化。
CKI1基因是最近鑒別的(Kakimoto，1996)。這種基因在植物中過量產(chǎn)生導(dǎo)致植物呈現(xiàn)典型的細(xì)胞分裂素應(yīng)答，包括在沒有外源性細(xì)胞分裂素的組織培養(yǎng)物中的快速細(xì)胞分化和莖干形成(Kakirnoto，1996)。CKI1基因可以與ipt相似的方式用作選擇標(biāo)記，即CKI1基因可以置于啟動(dòng)子的控制下，并且在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中過表達(dá)，從而在沒有外源性植物激素的情況下誘導(dǎo)莖干形成。可以切下這種莖干，從而獲得轉(zhuǎn)基因植物。得自用ipt或CKI1基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的這種莖干不能正常生長(zhǎng)，通式細(xì)胞過表達(dá)這些轉(zhuǎn)基因。
knotted基因和類knotted基因是第三組基因，當(dāng)其過表達(dá)時(shí)可導(dǎo)致不定枝異位產(chǎn)生(Chuck等，1996；Lincoln等，1994；Matsuoka等，1993)。這些基因可以與ipt和CKI1基因相同方式用作選擇標(biāo)記。通常地，任何可以促進(jìn)莖干再生和發(fā)育的植物基因，可以與ipt，CKI1和類knotted基因相同方式用作選擇標(biāo)記。
除了使用標(biāo)記以鑒別轉(zhuǎn)基因植物之外，使用啟動(dòng)子以控制轉(zhuǎn)基因表達(dá)是這種實(shí)驗(yàn)的常規(guī)部分。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因是強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的，如花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動(dòng)子。然而，需要一種更柔性的基因表達(dá)系統(tǒng)，以從轉(zhuǎn)基因技術(shù)中獲得更多的益處。良好的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)是所需的，因?yàn)榫哂锌烧T導(dǎo)表型的轉(zhuǎn)基因植物與通過傳統(tǒng)的遺傳學(xué)分離的條件突變株一樣有用。關(guān)于此，已經(jīng)報(bào)道了一些誘導(dǎo)系統(tǒng)并成功使用(Ainley和Key，1990；Gatz等，1992；Mett等，1993；Weinmann等，1994)。其中，依賴于四環(huán)素的表達(dá)系統(tǒng)是最先進(jìn)的(參見Gatz，1996)。
糖反質(zhì)激素受體(GR)是動(dòng)物類固醇激素受體家族的一個(gè)成員。GR不僅是受體分子，還是轉(zhuǎn)錄因子，其在存在糖皮質(zhì)激素的情況下，激活含有糖皮質(zhì)激素應(yīng)答因子(GREs)的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄(參見Beato，1989；Picard，1993)。已經(jīng)認(rèn)為GR系統(tǒng)在植物中可以是良好的誘導(dǎo)系統(tǒng)，因?yàn)槠浜?jiǎn)便，而且糖皮質(zhì)激素自身在植物中不產(chǎn)生任何多效作用。然而，針對(duì)轉(zhuǎn)基因植物還未構(gòu)建出使用GR的通常及有效的糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)的系統(tǒng)，盡管已經(jīng)證明包含GR和GREs的系統(tǒng)可以在具有培養(yǎng)的植物細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中工作(Schena等，1991)。另一方面，已經(jīng)報(bào)道了GR的(激素)調(diào)節(jié)區(qū)(或結(jié)構(gòu)域)可以調(diào)節(jié)植物轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)基因植物中的功能(Aoyama等，1995；Lloyed等，1994)。Lioyd等(1994)揭示在Arabidopsis中毛狀體的發(fā)育，可以由包含糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和玉米轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子R的嵌合蛋白成功控制。然而，其活性由糖皮質(zhì)激素受體結(jié)構(gòu)域緊密調(diào)節(jié)的這種嵌合轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)建，不總是容易的和在每種情況下都可以達(dá)到的。緊密調(diào)節(jié)表現(xiàn)為關(guān)鍵依賴于嵌合蛋白的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)，尤其糖皮質(zhì)激素受體結(jié)構(gòu)域和其功能被調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)域之間的相對(duì)位置。
動(dòng)物類固醇激素受體的調(diào)節(jié)區(qū)，包括激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HBD)和HSP90的結(jié)合位點(diǎn)，認(rèn)為對(duì)共價(jià)鍵連的相鄰結(jié)構(gòu)域，在沒有其關(guān)聯(lián)配體的情況下具有抑制作用，適當(dāng)?shù)呐潴w與HBD結(jié)合導(dǎo)致去抑制(Picard，1993)。這種機(jī)制可以通過設(shè)計(jì)一種轉(zhuǎn)錄因子而加以利用，其中組成型激活反式功能是由大鼠GR的調(diào)節(jié)區(qū)順式調(diào)節(jié)的(Picard等，1988；Rusconi和Yamamoto，1987)。由于組成型激活反式功能，選擇一種包含酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4(Keegan等，1986)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和皰疹病毒蛋白VP16(Triezenberg等，1988)的反式結(jié)構(gòu)域的嵌合轉(zhuǎn)錄因子。嵌合蛋白GAL4-VP16認(rèn)為在所有細(xì)胞類型中均可以作為強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子，因?yàn)橐阎猇P16的激活結(jié)構(gòu)域直接與通常的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，這些轉(zhuǎn)錄因子在真核生物中是進(jìn)化保守的(Goodich等，1993；Lin等，1991；Sadowski等，1988)。已經(jīng)揭示人雌激素受體的調(diào)節(jié)區(qū)可以在酵母和動(dòng)物組織培養(yǎng)細(xì)胞中調(diào)節(jié)相似的嵌合轉(zhuǎn)錄因子(Braselmann等，1993；Louvion等，1993)。將大鼠GR的調(diào)節(jié)區(qū)加入嵌合轉(zhuǎn)錄因子中，并將所得雜交轉(zhuǎn)錄因子稱為“GVG”，因?yàn)槠溆筛鱽碜訥AL4，VP16和GR的一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。將編碼GVG轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)DNA片段置于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(Odell等，1985)和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亞單位基因rbcS-E9(Coruzzi等，1984)的聚(A)附加序列之間。作為GVG的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，將含有GAL4 UAS(Giniger等，1985)的6個(gè)拷貝的一個(gè)DNA片段的5’端，融合于最小的CaMV 35S啟動(dòng)子(-46至+9)。
遺傳分析是最重要的基礎(chǔ)之一，基于此建立了現(xiàn)代生命科學(xué)。歷史上遺傳學(xué)研究主要基于篩選喪失功能的突變，這種方法目前仍然是遺傳學(xué)解剖途徑的基本工具。然而，喪失功能的篩選有兩個(gè)主要缺點(diǎn)。首先，這種篩選不能鑒別功能豐余的基因。乙烯信號(hào)途徑的遺傳學(xué)和功能分析例證了這樣的一個(gè)實(shí)例。一些類受體組氨酸激酶在Arabidopsis中已經(jīng)鑒別，而且示出它們彼此高度同源。提示這些蛋白質(zhì)包含于乙烯信號(hào)化中，可能作為激素的受體。而這些基因中的無效突變無一具有任何明顯的表型，攜帶所有這些基因的35S反義轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物針對(duì)乙烯應(yīng)答表現(xiàn)出一些喪失功能表型(Hua和Meyerowitz，1998)。然而，在任何這些基因中的顯性陽性或功能增強(qiáng)的突變導(dǎo)致乙烯應(yīng)答的組成型抑制。由于基因組測(cè)序已經(jīng)證明在許多種屬中存在許多多拷貝基因(Lin等，1999；Mayer等，1999)，功能豐余的問題更加明顯。喪失功能篩選的另一個(gè)問題是由于一些突變導(dǎo)致配子體或胚死亡，使其非常難以或者甚至不能鑒別這種基因或突變。例如，許多Arabidopsis缺陷胚(emb)和相關(guān)的突變體，是由Meinke及其同事通過對(duì)各個(gè)胚進(jìn)行顯微解剖鑒別的(Meinke，1985；Meinke，1995)，這表明這種篩選的技術(shù)問題。
另一種情況是近年來已經(jīng)開發(fā)并使用了顯性陽性或增強(qiáng)功能的突變的篩選方法。在植物中，篩選增強(qiáng)功能的突變也稱為激活標(biāo)記，是由Hayashi等(1992)首先嘗試的，其使用35S增強(qiáng)子的4個(gè)拷貝去激活在攜帶增強(qiáng)子的T-DNA插入體附近的基因。最成功的實(shí)施例是鑒別Arabidopsis CKI1(細(xì)胞分裂素非依賴性1)基因，其過表達(dá)導(dǎo)致在沒有外部細(xì)胞分裂素的情況下莖干從外植體中再生(Kakimoto，1996)。最近，相似的激活標(biāo)記構(gòu)建體已經(jīng)用于產(chǎn)生大量的轉(zhuǎn)基因Arabidopsis植物，從中已經(jīng)分離了大約30種顯性突變體(Weigel等，2000)。與喪失功能篩選類似，激活標(biāo)記的主要缺點(diǎn)是由于一些基因的組成型過表達(dá)導(dǎo)致的致死性，因此不能鑒別這些基因。事實(shí)上，只有與形態(tài)改變或開花時(shí)間相關(guān)的突變從這種大規(guī)模篩選中分離(Weigel等，2000)，提示一些顯性突變，尤其那些嚴(yán)重影響植物發(fā)育(例如胚發(fā)生)的突變，幾乎不可能通過這種方法重獲。
然而激活標(biāo)記可以探查一些基因的功能重要性，喪失功能突變可提供對(duì)大多數(shù)基因功能的更直接的洞察。因此，組合增強(qiáng)和喪失功能篩選的方法在后基因組領(lǐng)域應(yīng)是最有利的。在本發(fā)明中，我們提出一種新策略，產(chǎn)生在一個(gè)基因座中攜帶條件增強(qiáng)和喪失功能(GLF)突變的植物突變體。靶基因座的增強(qiáng)或喪失功能由XVE化學(xué)可誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)相互及緊密控制，由此靶基因座能在相應(yīng)的給定發(fā)育時(shí)間表達(dá)表型。在靶基因座中增強(qiáng)和喪失功能的表型的可控制表達(dá)，與使用個(gè)體方法相比可以更全面地理解基因功能。原則上，這種方法更適于可以高頻率同源重組的種屬，例如哺乳動(dòng)物和酵母細(xì)胞。這可以通過特異性破壞天然啟動(dòng)子，并用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子加以置換而進(jìn)行，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物和酵母細(xì)胞中是功能適當(dāng)?shù)摹?br> 在此所用以例證本發(fā)明背景的出版物和其它材料，尤其提供關(guān)于實(shí)踐的附加詳述的案例，均并入?yún)⒖?，為方便起見在文中以作者和日期表示，并分別在所附參考文獻(xiàn)表詳述。發(fā)明概述
來自Agrobacterium tumefaciens的T質(zhì)粒的異戊烯轉(zhuǎn)移酶(ipt)基因的過表達(dá)，可以提高轉(zhuǎn)基因植物中細(xì)胞分裂素的內(nèi)在水平，使莖干從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生。當(dāng)與地塞米松(DEX)誘導(dǎo)系統(tǒng)組合時(shí)，ipt基因的控制表達(dá)可用于特異性選擇轉(zhuǎn)基因再生體，而不需要抗生素抗性標(biāo)記。這種組合的系統(tǒng)可以用其它基因高效聯(lián)合轉(zhuǎn)化，并產(chǎn)生沒有形態(tài)學(xué)或發(fā)育缺陷的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的一方面涉及一種選擇轉(zhuǎn)基因植物的方法，使用一種化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的選擇標(biāo)記。此方法包括用含有在化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下ipt基因，CKI1基因或來自knotted家族的基因的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；將植物細(xì)胞在沒有植物激素但存在啟動(dòng)子誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)；切除發(fā)育的莖干。本發(fā)明還涉及一種選擇轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因萵苣植物的方法，該方法使用在化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的選擇標(biāo)記。
本發(fā)明另一方面涉及一種用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的載體。將這種載體設(shè)計(jì)為包括一個(gè)選擇標(biāo)記，該標(biāo)記在化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子而不是組成型啟動(dòng)子的控制下。
本發(fā)明還涉及使用上述誘導(dǎo)型載體的方法。
本發(fā)明還涉及包含化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的核酸，其中所述核酸包含編碼雌激素受體的DNA。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種核酸，其包含i)一個(gè)組成型啟動(dòng)子，ii)編碼細(xì)菌阻抑物L(fēng)exA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA，iii)編碼VP16反式結(jié)構(gòu)域的DNA，iv)編碼雌激素受體的DNA，和v)一或多個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)。
本發(fā)明的另一方面涉及一種含有載體的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述載體具有在化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的選擇標(biāo)記。本發(fā)明的一方面涉及的轉(zhuǎn)基因植物是煙草或萵苣植物，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞是煙草或萵苣細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面涉及一種選擇轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法使用在化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的抗生素和除草劑抗性基因。這種抗生素和除草劑抗性基因可以通過有或無誘導(dǎo)物調(diào)節(jié)。
本發(fā)明另一方面涉及一種轉(zhuǎn)基因植物，其含有在化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的除草劑抗性基因或抗生素抗性基因。本發(fā)明還涉及一種轉(zhuǎn)基因煙草植物或轉(zhuǎn)基因萵苣植物，其含有在化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的除草劑抗性基因。
本發(fā)明還涉及一種在存在低水平生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的情況下，選擇用ipt，CKI1或knotted基因轉(zhuǎn)化的根細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)展示熒光設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明還涉及包含一種基因的機(jī)體或細(xì)胞，其中所述基因缺失天然啟動(dòng)子，而且將此基因置于轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下。
本發(fā)明的另一方面涉及通過利用細(xì)胞或機(jī)體篩選基因中突變的的方法，其中所述基因缺失天然啟動(dòng)子，將此基因置于轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，并將機(jī)體或細(xì)胞或其子代在有或無誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)。這可以在生命周期的特異時(shí)期加入或除去誘導(dǎo)物，以篩選增強(qiáng)功能的基因或喪失功能的基因。附圖簡(jiǎn)述


圖1是在pTA7002中的左和右邊界之間插入體的代表圖式。RB代表右邊界，LB代表左邊界。限制酶位點(diǎn)在圖的上方示出。限制酶位點(diǎn)是以縮寫表示的，B-BamHI，H-HindIII，E-EcoRI。
圖2例證了螢光素酶和GVG構(gòu)建體的pMON721的插入點(diǎn)。螢光素酶插入NotI限制酶位點(diǎn)。GVG插入載體的多克隆位點(diǎn)。
圖3A示出自暗灰色(最低)至白色(最高)的發(fā)光密度。盡管是以暗灰色至白色衡量的，實(shí)際上冷光是藍(lán)色的。這種衡量用于解釋圖3B的結(jié)果。圖3B示出由不同濃度的DEX誘導(dǎo)的螢光素酶活性的固定表達(dá)水平。圖3C示出圖3B圖式的抗DEX濃度的結(jié)果。將在0uM DEX獲得的數(shù)值(基礎(chǔ)的無誘導(dǎo)水平)設(shè)定為1。
圖4A-C示出在Arabidopsis中誘導(dǎo)螢光素酶活性。圖4A是示出自暗灰色(最低)自白色(最高)發(fā)光密度的彩色衡量圖式(如圖3所示，冷光是藍(lán)色的，不是圖中所示的灰色)。圖4B表示一種在罐中生長(zhǎng)3周的轉(zhuǎn)基因植物，然后用含有0.5mM熒光素鉀和0.01％(w/v)Tween-20的溶液噴灑，并分析螢光素酶活性。圖4C表示與圖4B相同的植物，只是隨后將植物含有30uM DEX和0.01％(w/v)Tween-20的溶液噴灑。24小時(shí)后，將植物再用熒光素溶液噴灑并分析。對(duì)圖4B和4C而言，植物的發(fā)光是用高密度照相系統(tǒng)顯影的(Hamamatsu攝影系統(tǒng))。用DEX處理的植物中見到的發(fā)光異質(zhì)性是熒光素不均勻吸收所致。
圖5A-B代表由DEX誘導(dǎo)的luc mRNA水平的動(dòng)力學(xué)。將攜帶GVG基因和luc受體基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物首先在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)14天，然后在水培培養(yǎng)基中適當(dāng)生長(zhǎng)3天。DEX處理是通過在培養(yǎng)基中加入終濃度為10uM的DEX起始的(時(shí)間示為0)。在處理24小時(shí)后，從培養(yǎng)基中除去DEX。在每個(gè)所示時(shí)間從20個(gè)植物中制備總RNA，并進(jìn)行Northern分析。將螢火蟲螢光素酶(圖5A)和GVG基因(圖5B)的cDNA片段用作探針。信號(hào)是通過BAS-2000系統(tǒng)顯影的(富士攝影膠片公司)。封閉和開放的箭頭分別表示加入和除去DEX的時(shí)間點(diǎn)。
圖6示出由各種糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的密度和穩(wěn)定性。將攜帶GVG基因和luc受體基因的轉(zhuǎn)基因煙草植物首先在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)14天，然后移至含有30uM的不同糖皮質(zhì)激素的新鮮瓊脂培養(yǎng)基中再生長(zhǎng)2天。在誘導(dǎo)后，將植物移回沒有糖皮質(zhì)激素的瓊脂培養(yǎng)基中(時(shí)間標(biāo)示為0)。繪制由DEX(●)，氟羥脫氫皮醇acetonide(○)，βmethasone(■)和氫化可的松(□)誘導(dǎo)的相關(guān)螢光素酶活性圖。將沒有糖皮質(zhì)激素獲得的數(shù)值(非誘導(dǎo)水平)設(shè)定為1。
圖7示出通過噴灑糖皮質(zhì)激素局部誘導(dǎo)的螢光素酶表達(dá)。
圖8示出煙草和萵苣莖干的地塞米松依賴性再生。將煙草(上排)和萵苣(下排)的葉片用
圖12所示的轉(zhuǎn)化盒轉(zhuǎn)化。然后將植物材料在誘導(dǎo)(10uM DEX)或非誘導(dǎo)(0uM DEX)條件下生長(zhǎng)40天。
圖9A-F示出在煙草和萵苣再生體中螢光素酶活性。螢光素酶活性是在以表達(dá)ipt基因誘導(dǎo)條件下(10uM DEX)生長(zhǎng)40天的再生體中測(cè)定的。再生體中螢光素酶活性是用視頻顯影系統(tǒng)測(cè)定的，綜合5分鐘的測(cè)定結(jié)果及從影像中減去背景測(cè)定。將螢光素酶影像轉(zhuǎn)化為16-8bit圖片，并人工涂色標(biāo)示。紅/綠覆蓋圖示出明亮區(qū)域和螢光素酶活性影像的疊印，以易于檢測(cè)luc陽性和陰性再生體。圖9A，9C和9E是煙草，圖9B，9D和9F是萵苣。圖9A-B示出明亮區(qū)域圖片。9C-D是螢光素酶影像，9E-F是紅/綠覆蓋圖。
圖10A-D示出來自煙草的ipt和luc轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析。示出了來自有(+1至+10)或沒有(-a至-g)可檢測(cè)螢光素酶活性的30天齡再生體的ipt和luc轉(zhuǎn)錄物的水平。將再生體在存在10uM地塞米松的情況下生長(zhǎng)。
圖10A和10C示出ipt轉(zhuǎn)錄物水平，
圖10B和10D示出luc轉(zhuǎn)錄物水平。
圖11A-C示出在轉(zhuǎn)基因煙草秧苗中l(wèi)uc基因的分離和Southern分析。螢光素酶活性是在44株隨機(jī)選擇的秧苗中測(cè)定的。其中33株秧苗表現(xiàn)螢光素酶活性，11株秧苗不表現(xiàn)螢光素酶活性(與
圖11A和11B相比)，表明顯性luc基因3∶1分離。來自秧苗的DNA的Southern印跡分析示于
圖11C。用未切割的DNA(U)檢測(cè)單條帶，之后將DNA用BamHI(B)，SacI(S)，NcoI(N)和XbaI(X)消化，及用放射標(biāo)記的luc基因片段雜交。
圖12示出ipt基因可誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)化盒。將來自Agrobacteriumtumefaciens的ipt基因在糖皮質(zhì)激素應(yīng)答啟動(dòng)子(融合于CaMV35S最小啟動(dòng)子的-46位的6xUAS)的控制下克隆，以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。ipt基因的表達(dá)是由糖皮質(zhì)激素激活的轉(zhuǎn)錄因子(GVG)介導(dǎo)的，如Aoyama和Chua(1997)所述。將編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)(Waldron等，1985)和螢火蟲螢光素酶(luc)(Millar等，1992)的基因在組成型啟動(dòng)子的控制下克隆(NP，NOS啟動(dòng)子；35S；CaMV35S啟動(dòng)子)，以易于檢測(cè)轉(zhuǎn)化和共轉(zhuǎn)化效力。將上述基因在T-DNA的左和右邊界(LB，RB)之間克隆(Klee等，1987；Beavan和Chilton，1982)(pBI 101，Clontech公司)，以允許Agrobacterium介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，所述T-DNA來自Agrobacterium tumefaciens。
圖13是XVE載體的圖譜(Zuo等，2000)。只示出了整合入植物基因組的區(qū)域(在右邊界RB和左邊界LB之間)(沒有刻度)。G1090驅(qū)動(dòng)XVE的合成啟動(dòng)子(Ishige等，1999)；XVE編碼嵌合轉(zhuǎn)錄區(qū)子的DNA序列，所述嵌合轉(zhuǎn)錄因子含有LexA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)(1-87殘基)，VP16的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(413-490)和人雌激素受體的調(diào)節(jié)區(qū)域(272-595)；E9TrbcE9聚A附加序列；NOS胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子；HPT潮霉素選擇標(biāo)記；KAN卡那霉素選擇標(biāo)記；NOST胭脂合酶聚A附加序列；8XlexALexA阻抑物結(jié)合位點(diǎn)的8個(gè)拷貝；-4635S最小啟動(dòng)子；3ATrbcS 3A聚A附加序列；MCS多克隆位點(diǎn)。
圖14A-B示出由XVE誘導(dǎo)系統(tǒng)控制的GFP基因表達(dá)。
圖14A示出pER8-GFP轉(zhuǎn)基因Arabidopsis系的根。發(fā)自相同根的GFP信號(hào)(綠色)是在熒光顯微鏡下觀測(cè)的，如
圖14B所示。
圖15示出對(duì)XVE誘導(dǎo)系統(tǒng)的17-β-雌二醇的劑量依賴性。將在沒有誘導(dǎo)物的情況下培養(yǎng)的3周齡pER8-GFP轉(zhuǎn)基因植物，移至含有各種濃度17-β-雌二醇的培養(yǎng)基上，溫育16小時(shí)。從未處理(0泳道；對(duì)照)或17-β-雌二醇處理的植物中制備RNA，并用GFP cDNA作探針通過Northern印跡分析。每條泳道上的數(shù)字表示處理的濃度(以UuM表示)。
圖16示出XVE系統(tǒng)的泳道時(shí)程。將在沒有誘導(dǎo)物的情況下培養(yǎng)的3周齡pER8-GFP轉(zhuǎn)基因植物，移至含有2uM的17-β-雌二醇的培養(yǎng)基上，并溫育不同的時(shí)間(每條泳道上所示時(shí)間)。如
圖15所述進(jìn)行GFP轉(zhuǎn)錄物的分析。
圖17是XVE激活標(biāo)記載體pER16的圖式。只示出了右邊界RB和左邊界LB之間的區(qū)域(沒有刻度)。兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位和OLexA-46啟動(dòng)子位于RB和LB之間。在第一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中，G10-90啟動(dòng)子(Ishige等，1999)驅(qū)動(dòng)以rbE9c聚A附加序列終止的XVE融合基因。第二個(gè)轉(zhuǎn)錄單位由Nopaline合酶(NOS)基因啟動(dòng)子，新霉素轉(zhuǎn)移酶II(NPTII)基因的編碼序列，和NOS聚腺苷酸化序列組成。OLexA-46啟動(dòng)子由融合于-46 CaMV35S啟動(dòng)子的LexA操縱子序列的8個(gè)拷貝組成。在整合入植物基因組基礎(chǔ)上，OLexA-46啟動(dòng)子可以激活以17-β-雌二醇依賴性方式融合于啟動(dòng)子下游的序列的轉(zhuǎn)錄。發(fā)明詳述
我們?cè)敿?xì)論述了用ipt基因作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記，而又沒有組成型表達(dá)的缺點(diǎn)的誘導(dǎo)系統(tǒng)方案。在誘導(dǎo)條件下，用ipt基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的細(xì)胞分裂素水平應(yīng)提高，并因此具有從植物愈傷組織或外植體中再生莖干的潛力。在文中，ipt基因的過表達(dá)可作為無抗生素標(biāo)記，特異性選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。如Aoyama和Chua(1997)所述，地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)緊密調(diào)節(jié)靶基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。這個(gè)系統(tǒng)由一個(gè)雜種轉(zhuǎn)錄因子和一個(gè)調(diào)節(jié)的基因組成，所述轉(zhuǎn)錄因子當(dāng)用DEX激活時(shí)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，所述基因在只對(duì)這種轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答的順式因子的控制下。因此，我們使用一種含有在DEX誘導(dǎo)系統(tǒng)控制下的ipt基因的轉(zhuǎn)化盒，作為無抗生素標(biāo)記以共轉(zhuǎn)化兩個(gè)其它組成型表達(dá)的基因(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因(Waldron等，1985)和螢火蟲螢光素酶(luc)基因(Millar等，1992))。這種新的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是用Agrobacterium介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化針對(duì)煙草和萵苣建立的。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及已經(jīng)用一種載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，所述載體包括一個(gè)在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的選擇標(biāo)記。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是煙草植物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是萵苣植物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，用于形成轉(zhuǎn)基因植物的載體包括一個(gè)激活選擇標(biāo)記的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。如果需要，也可以將任何其它的相應(yīng)基因置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，這樣可以隨時(shí)將基因啟動(dòng)。這樣的基因不需要標(biāo)記。這樣的載體例如見于以下實(shí)施例中所述，所述實(shí)施例不僅闡述載體，還闡述了用于制備和篩選含有這種載體的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以誘導(dǎo)啟動(dòng)子以選擇已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞或植物，但所述啟動(dòng)子在天然生長(zhǎng)條件下不被誘導(dǎo)。在這種方式中，盡管可選擇的標(biāo)記存在于轉(zhuǎn)基因植物中，但其在植物的正常生長(zhǎng)起見是完全沉默的，并應(yīng)不干擾植物的生長(zhǎng)。這種沉默標(biāo)記基因與例如具有抗生素抗性基因標(biāo)記相比更合乎環(huán)境要求，其中所述抗性基因是在植物正常生長(zhǎng)期間表達(dá)的。使用后一類型標(biāo)記是肯定的，因?yàn)槠淇梢允箤?duì)抗生素有抗性的有機(jī)體發(fā)育。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是糖皮質(zhì)激素受體。已經(jīng)認(rèn)為這是一種良好的植物誘導(dǎo)系統(tǒng)，因?yàn)樘瞧べ|(zhì)激素自身在植物中不產(chǎn)生任何多效性作用。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體的轉(zhuǎn)錄因子是一種嵌合轉(zhuǎn)錄因子，其中將大鼠GR的調(diào)節(jié)區(qū)域加入酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和皰疹病毒蛋白VP16的反式激活結(jié)構(gòu)域中。所得雜合轉(zhuǎn)錄因子稱為“GVG’，因?yàn)槠涫怯煞謩e來自GAL4，VP16和GR的一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的。將GVG基因與螢光素酶(luc)受體基因一起導(dǎo)入煙草中，所述luc受體基因轉(zhuǎn)錄自含有GAL4上游激活序列(GAL4 UAS)的6個(gè)拷貝的啟動(dòng)子?；谔瞧べ|(zhì)激素處理，可以觀測(cè)到螢光素酶活性和luc mRNA水平均得以良好誘導(dǎo)。
GVG系統(tǒng)在植物中的主要優(yōu)點(diǎn)是GR和糖皮質(zhì)激素，至少在所用的濃度，是無毒的并對(duì)植物沒有可觀測(cè)到的不利的生理影響，因此可以誘導(dǎo)靶基因而沒有多效性作用。為保留這種優(yōu)點(diǎn)，GVG系統(tǒng)中所有其它成分也得自非植物源。
這個(gè)系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是糖皮質(zhì)激素具有可以使其作為誘導(dǎo)物化合物的特性。由于糖皮質(zhì)激素可以易于透過植物細(xì)胞，因此可以使用各種方法進(jìn)行快速基因誘導(dǎo)?；虮磉_(dá)的局部誘導(dǎo)可以簡(jiǎn)便地透過噴灑糖皮質(zhì)激素溶液而達(dá)到。當(dāng)整個(gè)植物在露天條件下處理時(shí)，已知誘導(dǎo)物化合物在葉片中積累至較高濃度。甚至在這種條件下，積累的糖皮質(zhì)激素對(duì)葉片沒有任何可觀測(cè)到的損害。誘導(dǎo)水平可以通過使用不同濃度的糖皮質(zhì)激素或其不同的衍生物加以誘導(dǎo)。這個(gè)特點(diǎn)有助于分析誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物的劑量依賴性作用。糖皮質(zhì)激素是經(jīng)最佳研究的生物化合物之一，而且現(xiàn)在可以通過商業(yè)途徑獲得100種以上的不同類型的糖皮質(zhì)激素衍生物。一些糖皮質(zhì)激素衍生物在植物中可以是非常穩(wěn)定的，而其它的是迅速降解的。這些類型的糖皮質(zhì)激素分別用于穩(wěn)定和瞬時(shí)誘導(dǎo)。另外，一些糖皮質(zhì)激素拮抗劑可以用于反向調(diào)節(jié)誘導(dǎo)。
盡管以下闡述了特異的構(gòu)建體，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以易于預(yù)想和產(chǎn)生其它構(gòu)建體。本發(fā)明所述的GVG系統(tǒng)的組分是非常靈活的。例如，轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)可以通過用組織特異性啟動(dòng)子置換GVG基因的35S啟動(dòng)子而限于特異的組織。GVG融合蛋白中的每個(gè)功能結(jié)構(gòu)域也是可以置換的，使系統(tǒng)進(jìn)一步精確。具有一個(gè)不同的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和另一種類固醇激素受體的調(diào)節(jié)區(qū)域，可以產(chǎn)生另一種類固醇誘導(dǎo)系統(tǒng)，可以與GVG系統(tǒng)組合使用。
也已經(jīng)產(chǎn)生了另一種構(gòu)建體，其比GVG系統(tǒng)更具優(yōu)點(diǎn)，或與其聯(lián)合使用。這種構(gòu)建體稱為XVE。其類似于GVG系統(tǒng)，但含有細(xì)菌阻抑物L(fēng)exA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和人雌激素受體的調(diào)節(jié)區(qū)域。XVE構(gòu)建體可以用于代替GVG構(gòu)建體，無論GVG系統(tǒng)是否是本發(fā)明所闡述的，只要適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物用于所用的構(gòu)建體。XVE構(gòu)建體可以與GVG構(gòu)建體一起使用，并可以從GVG構(gòu)建體中控制性分離。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的可現(xiàn)在標(biāo)記是ipt基因。當(dāng)此基因被誘導(dǎo)時(shí)，其產(chǎn)生極端的shooty表型，其中植物細(xì)胞生長(zhǎng)多于根的莖干。這種表型易于通過目測(cè)選擇。一旦除去誘導(dǎo)物，ipt基因變?yōu)槌聊?，而且?xì)胞能正常生長(zhǎng)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，其它選擇標(biāo)記例如CKI1基因可以相似方式使用。再聲明一次，使用的標(biāo)記只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)是活性的，一旦除去化學(xué)誘導(dǎo)物將變?yōu)槌聊摹?br> 結(jié)合使用化學(xué)可誘導(dǎo)標(biāo)記的原理，可以產(chǎn)生各種DNA構(gòu)建體。在以下所述的質(zhì)粒設(shè)計(jì)后，在質(zhì)粒內(nèi)裝配可以良好控制的區(qū)域。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及一種使用選擇標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述選擇標(biāo)記在化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將ipt基因置于質(zhì)粒內(nèi)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將CKI1基因或knotted家族的一個(gè)基因置于質(zhì)粒內(nèi)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。地塞米松誘導(dǎo)系統(tǒng)由一種雜合轉(zhuǎn)錄因子組成，所述轉(zhuǎn)錄因子在存在DEX的情況下介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素受體轉(zhuǎn)錄。這個(gè)系統(tǒng)緊密調(diào)節(jié)ipt基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。將植物細(xì)胞用這個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，并將細(xì)胞在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，所述MS培養(yǎng)基沒有植物激素，但有或沒有地塞米松，這是一種合成的糖皮質(zhì)激素類似物。在誘導(dǎo)條件下，用ipt轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的細(xì)胞分裂素水平提高，并將從植物愈傷組織或外植體中再生莖干。由于細(xì)胞是在沒有植物激素的情況下生長(zhǎng)的，莖干應(yīng)只在轉(zhuǎn)化的和在存在地塞米松的情況下超量產(chǎn)生細(xì)胞分裂素細(xì)胞中產(chǎn)生。未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不產(chǎn)生莖干，而且在沒有地塞米松情況下生長(zhǎng)的細(xì)胞不產(chǎn)生莖干。Ipt基因的過表達(dá)因此可以作為無抗生素標(biāo)記系統(tǒng)，特異地選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。這個(gè)系統(tǒng)也可以作為第二標(biāo)記，以將另外的基因?qū)雽?duì)抗生素已經(jīng)有抗性的植物中。在存在地塞米松的情況下生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞上，在2-3周內(nèi)應(yīng)出現(xiàn)畸胎瘤莖干?？梢郧邢逻@些莖干并置于含有吲哚乙酸但沒有地塞米松的MS培養(yǎng)基上。在這種條件下，ipt，CKI1或knotted基因應(yīng)不久就激活，而且轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)表現(xiàn)是正常的和不育的，并能結(jié)種。原則上，這種方法可用于在任何適當(dāng)誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)控制下的任何植物基因，可以促進(jìn)莖干再生和發(fā)育。
必須指出的是盡管一些植物具有如上所述表現(xiàn)(只有產(chǎn)生的莖干是來自轉(zhuǎn)化的植物)，一些植物即使不是轉(zhuǎn)化的，其在無激素的培養(yǎng)基中也可以生長(zhǎng)莖干。對(duì)這樣的植物可以使用各種方法以成功選擇轉(zhuǎn)化的植物。一種這樣的方法是盡管莖干可以通過轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生，這種莖干看起來是正常的(野生型)，而轉(zhuǎn)化的植物具有shooty表型。因此可以使用這種表型區(qū)分轉(zhuǎn)化的莖干和未轉(zhuǎn)化的莖干。另一種方法是將一種激素如生長(zhǎng)素加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，以抑制未轉(zhuǎn)化的外植體形成莖干。這將降低未轉(zhuǎn)化的莖干呈現(xiàn)的背景噪音水平。加入的生長(zhǎng)素的數(shù)量可以通過滴定法確定，即使用不同濃度的生長(zhǎng)素，確定在未轉(zhuǎn)化的外植體中抑制莖干生長(zhǎng)，但在轉(zhuǎn)化的外植體中莖干生長(zhǎng)的水平。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用一種轉(zhuǎn)化盒(
圖12)共同轉(zhuǎn)化兩個(gè)其它組成型表達(dá)的基因(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)基因和螢火蟲螢光素酶(luc)基因)，所述轉(zhuǎn)化盒含有在GVG糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)系統(tǒng)(Aoyama和Chua，1997)控制下的ipt基因，作為無抗生素標(biāo)記。當(dāng)用DEX誘導(dǎo)時(shí)，異戊烯轉(zhuǎn)移酶表達(dá)自ipt基因，使細(xì)胞分裂素水平提高。在誘導(dǎo)ipt基因表達(dá)的條件下，細(xì)胞分裂素水平提高使轉(zhuǎn)基因莖干從煙草或萵苣外植體中有效再生(圖8)。在再生體中測(cè)定ipt轉(zhuǎn)錄物水平表明再生與ipt表達(dá)緊密偶聯(lián)(
圖10A-D)。甚至在非誘導(dǎo)條件下，其中只有少量莖干自外植體中再生，也有至少50％的再生體含有轉(zhuǎn)基因。對(duì)轉(zhuǎn)基因莖干和植物的Southern和分離分析表明多數(shù)再生體只含有ipt基因的一個(gè)單一拷貝(
圖11A-C)。時(shí)程實(shí)驗(yàn)表明再生是迅速的，而且特異性作用至少維持20天。細(xì)胞分裂素的作用因此是局限的，及激素不散播和觸發(fā)未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與觀測(cè)到的甚至外源性應(yīng)用高濃度的細(xì)胞分裂素產(chǎn)生較多或較少的局部反應(yīng)相一致。共同轉(zhuǎn)化hpt和luc基因的效力，可以通過測(cè)定Luc活性(圖9A-F)和分析潮霉素抗性再生體加以確定。也可以進(jìn)行Northern分析以確定hpt和luc轉(zhuǎn)錄物水平(
圖10A-D)在大約80％的莖干中，luc和hpt基因是用ipt誘導(dǎo)系統(tǒng)成功共同轉(zhuǎn)化的。在將再生體移至非誘導(dǎo)條件下時(shí)，煙草和萵苣植物的形態(tài)是完全正常的。40％以上的煙草再生體在20天內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)大的根系，并可以易于移至土壤中。所得植物示出沒有形態(tài)學(xué)或發(fā)育異常，及轉(zhuǎn)基因傳遞給子代。這些結(jié)果表明可誘導(dǎo)ipt表達(dá)優(yōu)于ipt組成型表達(dá)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將抗生素或財(cái)產(chǎn)抗性基因置于糖皮質(zhì)激素受體科技誘導(dǎo)啟動(dòng)子的控制下。啟動(dòng)子是可以誘導(dǎo)的以使抗生素或除草劑抗性基因表達(dá)，以選擇轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。一旦已經(jīng)選擇了轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，可以抑制抗生素和除草劑抗性基因的表達(dá)。這個(gè)系統(tǒng)比其中轉(zhuǎn)化的植物組成型表達(dá)激活抗生素基因或除草劑抗性基因的系統(tǒng)更合乎環(huán)境要求。
可以更常規(guī)使用化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)，而且當(dāng)然不限于用于誘導(dǎo)ipt，CKI1或knotted基因或其它可選擇的標(biāo)記。其可以用于化學(xué)誘導(dǎo)任何感興趣的基因。其可以用于誘導(dǎo)可篩選標(biāo)記如螢光素酶或其它所需的可篩選標(biāo)記。
所用系統(tǒng)是經(jīng)過一系列步驟進(jìn)行的，以測(cè)試終構(gòu)建體的各個(gè)方面。這些步驟見于以下實(shí)施例。在此首先簡(jiǎn)要解釋實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。首先使用GVG系統(tǒng)以示出可以產(chǎn)生一種構(gòu)建體，其包括可由DEX或糖皮質(zhì)激素類似物誘導(dǎo)的基因。為此使用質(zhì)粒pMON721，將luc置于UAS的控制下。這用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因煙草植物，其是在卡那霉素培養(yǎng)基上選擇的。這些實(shí)驗(yàn)示出這樣的系統(tǒng)的作用(Aoyama和Chua，1997)。接著，需要避免標(biāo)記的抗生素抗性，使用ipt基因作標(biāo)記設(shè)計(jì)新的構(gòu)建體。用具有6XUAS下游多克隆位點(diǎn)的pTA7001或pTA7002載體產(chǎn)生構(gòu)建體。這些構(gòu)建體包括在35S啟動(dòng)子控制下的GVG嵌合的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，也包括由NOS啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的潮霉素抗性基因。將ipt基因置于6XUAS的下游。這個(gè)構(gòu)建體的使用表明得自ipt過表達(dá)的“shooty”表型可以用作標(biāo)記。然后產(chǎn)生不同的構(gòu)建體以將此結(jié)果擴(kuò)展到除煙草之外的其它植物。修飾PTA7002/ipt構(gòu)建體，將用于表達(dá)GVG編碼序列的35S啟動(dòng)子用稱為G10-90的合成啟動(dòng)子置換，G10-90是比35S啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子。其由融合于35S啟動(dòng)子的-90位的G box的4個(gè)拷貝組成。另外，加入一個(gè)另外的基因35S-luc。將此構(gòu)建體用于煙草和萵苣植物中。然后測(cè)試所選擇莖干的螢光素酶表達(dá)和潮霉素抗性。結(jié)果表明shooty再生體示出螢光素酶表達(dá)和潮霉素抗性的百分率均非常高。這證明使用GVG系統(tǒng)和ipt基因可以使技術(shù)人員使用shooty表型在不同植物中作為標(biāo)記。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是通過增強(qiáng)或喪失功能(GLF)系統(tǒng)激活標(biāo)記。GLF系統(tǒng)的原理是用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子置換植物基因組中相應(yīng)基因的天然啟動(dòng)子。因此，由于缺失靶基因的啟動(dòng)子，置換將產(chǎn)生喪失功能的突變。另一方面，靶基因的表達(dá)由誘導(dǎo)物控制，而且誘導(dǎo)的靶基因的異位過表達(dá)產(chǎn)生功能增強(qiáng)的表型。另外，由于突變的類型是有條件的，因此喪失功能的突變可以在適當(dāng)條件下通過靶基因的可誘導(dǎo)表達(dá)補(bǔ)足。在轉(zhuǎn)基因性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的基因表達(dá)，可以由所存在的誘導(dǎo)物濃度加以控制。在沒有誘導(dǎo)物或在非常低水平的誘導(dǎo)物的情況下，啟動(dòng)子是失活的或最小限度的，而且不發(fā)生表達(dá)。在高水平誘導(dǎo)物的情況下，啟動(dòng)子可以過表達(dá)基因。在中等水平誘導(dǎo)物的情況下，基因的表達(dá)可以等價(jià)于野生型表達(dá)，而且植物，細(xì)胞或有機(jī)體可以表現(xiàn)為野生型。
實(shí)際上，GFL系統(tǒng)需要一種緊密調(diào)節(jié)的和高效的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，和宿主基因組中靶啟動(dòng)子序列的相對(duì)精確的置換。本發(fā)明所述的XVE系統(tǒng)充分實(shí)現(xiàn)了GFL系統(tǒng)的需求。除了緊密控制之外，XVE系統(tǒng)比35S啟動(dòng)子刺激靶基因表達(dá)8倍以上，可以理想地用于異位過表達(dá)研究。盡管未知同源重組在高等植物中難以高頻率發(fā)生的原因，但可以產(chǎn)生一個(gè)突變體大集合，并隨后篩選相應(yīng)的功能增強(qiáng)或喪失的突變。我們確實(shí)鑒別了一些突變體，其中靶基因的啟動(dòng)子由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子置換，因此在一個(gè)單一基因座產(chǎn)生功能增強(qiáng)或喪失的突變。如前所述，這個(gè)系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物和酵母中基因特異性突變是非常有效的，其中同源重組實(shí)際上是可能的。
GFL載體(
圖17)是基于所述XVE載體構(gòu)建的，也見于Zuo等(2000)所述，在此并入?yún)⒖?。在插入宿主基因組后，OLexA-46啟動(dòng)子以17-β-雌二醇依賴性方式可激活下游融合的基因，或者LexA操縱子序列(OLexA)也可作為強(qiáng)力的17-β-雌二醇依賴性增強(qiáng)子，激活T-DNA插入體附近的基因。
本發(fā)明參考以下實(shí)施例進(jìn)行闡述，以下實(shí)施例只是例證了本發(fā)明而無以任何方式限制本發(fā)明之意。使用的是本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或下文特別闡述的技術(shù)。實(shí)施例1DNA構(gòu)建體A)構(gòu)建pTA7002
質(zhì)粒pTA7002與pBI101(Clontech)類似，除了右邊界和左邊界之間的序列由3個(gè)轉(zhuǎn)錄單位置換。在pTA7002的右邊界和左邊界之間的插入體如
圖1所示，包含一個(gè)包括以下因子的質(zhì)粒一個(gè)35S啟動(dòng)子，一個(gè)GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個(gè)VP16反式激活結(jié)構(gòu)域，糖皮質(zhì)激素受體調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小單位rbcS-E9聚(A)附加序列，所有這些均是第一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位(35S-GVG-E9)的一部分；一種胭脂氨酸合酶(NOS)啟動(dòng)子，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼序列，和NOS終止子，這些是第二個(gè)轉(zhuǎn)錄單位(NOS-HPT-NOS)的組成部分；及GAL4上游激活序列(UAS)的6個(gè)隨機(jī)拷貝，置于包括TATA區(qū)域的最小限度35S啟動(dòng)子(-46至+8)的上游，這些是第三個(gè)轉(zhuǎn)錄單位(6xUAS-(-46/35S)-3A)的組成部分。第三個(gè)轉(zhuǎn)錄單位還包括插入任何所需編碼序列的限制位點(diǎn)(XhoI和SpeI)，和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小單位rbcS-3A(Fluhr等，1986)。在XhoI-SpeI位點(diǎn)插入的編碼區(qū)域應(yīng)含有起始密碼子和終止密碼子。
更詳細(xì)地，35S-GVG-E9轉(zhuǎn)錄單位包括CaMV 35S啟動(dòng)子的-343至+9位堿基(Odell等，1985)。GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含1-74個(gè)氨基酸(Laughon和Gesteland，1984)。VP16酸性結(jié)構(gòu)域包含413-490個(gè)氨基酸(Dalrymple等，1985)。GR受體結(jié)構(gòu)域包含519-795個(gè)氨基酸(Miesfeld等，1986)。這個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的3’末端是豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小單位rbcS-E9的聚(A)附加序列(Coruzzi等，1984)。驅(qū)動(dòng)GVG基因的35S啟動(dòng)子可以變換為使用Sse8387I和PmeI限制酶位點(diǎn)選擇的啟動(dòng)子片段。由此可以插入啟動(dòng)子，根據(jù)其特性這種啟動(dòng)子在特異組織中或在一段特異時(shí)期可以誘導(dǎo)插入的基因。B)pTA7001
這個(gè)質(zhì)粒與pTA7002相同，除了含有6xGAL4 UAS-TATA-克隆位點(diǎn)-3A終止子的片段的定向不同。因此在這個(gè)質(zhì)粒的T-DNA區(qū)域中也均含有順式和反式因子。反式因子是GVG區(qū)域，由GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，VP16反式結(jié)構(gòu)域，和由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GR受體結(jié)構(gòu)域組成。順式因子由35S啟動(dòng)子的6xGAL4 UAS和TATA區(qū)域組成。再一次，這個(gè)質(zhì)?；趐BI101(Clontech)，其中RB和LB之間的區(qū)域已經(jīng)置換。在pTA7001中，這個(gè)區(qū)域已經(jīng)變?yōu)?br> 1-39來自pBI101的pTiPOST37(RB＝1-25)
47-858來自pBI221的35S啟動(dòng)子(TATA＝813-816)
867-1097GAL4(aa 1-77)
1117-1340VP16(aa 519-795)
1347-2180大鼠GR(aa 519-795)
2207-2764豌豆rbcsE9終止子
2780-3112來自pBI101的NOS啟動(dòng)子
3120-4145潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶
4147-4399來自pBI101的NOS終止子
4893-4423豌豆rbcs-3A終止子
4941-4894XhoI，SpeI的克隆位點(diǎn)
4995-494235S啟動(dòng)子TATA區(qū)域(TATA＝4980-4977)
5197-49966xGAL4 UAS
5198-5357pBI101的M13mmp19 EcoRI-HaeII片段
5358-5862pBI101的pTiPOST37(LB＝5838-5862)C)pTA7002/ipt
這個(gè)質(zhì)粒是通過在pTA7002質(zhì)粒中6xUAS啟動(dòng)子的下游，插入含有pTiT37質(zhì)粒(Goldberg等，1984)的異戊烯轉(zhuǎn)移酶(ipt)基因的限制性片段(XhoI，SpeI)而制備的。D)pMON721/ipt
這個(gè)質(zhì)粒在設(shè)計(jì)上與pTA7002相似，其中摻入相同的GVG系統(tǒng)。然而，這是基于pMON721載體(Monsanto Corp.，St.Louis，MO)而不是pTA7002質(zhì)粒。轉(zhuǎn)錄自CaMV 35S啟動(dòng)子(Odell等，1985)的-343至+1區(qū)域的GVG基因，在豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小單位rbcS-E9(Coruzzi等，1984)的聚(A)附加序列3’末端的兩側(cè)。編碼特異結(jié)構(gòu)域的DNA片段是用進(jìn)行框架內(nèi)克隆的適當(dāng)序列的引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的。GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含1-74個(gè)氨基酸(Laughon和Gestelang，1984)，VP16酸性結(jié)構(gòu)域包含413-490個(gè)氨基酸(Dalrymple等，1985)，GR受體結(jié)構(gòu)域包含519-795個(gè)氨基酸(Miesfeld等，1986)。GAL4 UAS DNA(5’-CGGGTGACAGCCCTCCG-3’SE ID NO1)是化學(xué)合成的，luc基因的編碼序列(Wet等，1987)是自pGEM-luc(Promega公司)中移除的。Luc編碼序列轉(zhuǎn)錄自GAL4 UAS的6個(gè)拷貝，將5’末端置于35S啟動(dòng)子的-46至+1區(qū)域，并在豌豆rbcS-3A的聚(A)附加序列3’末端兩側(cè)(Fluhr等，1986)。圖2例證了插入GVG和luc核酸構(gòu)建體的pMON721中的插入點(diǎn)。E)pTA7002G/ipt/luc(pYS4)
這個(gè)質(zhì)粒類似于pTA7002ipt，但有兩處不同。pTA7002/ipt載體的35S啟動(dòng)子用稱為G10-90的合成啟動(dòng)子置換。G10-90啟動(dòng)子由融合于35S的-90位的G box(GCCACGTGCC SEQ ID NO2)的4個(gè)拷貝組成。另外，還包括35S-luc基因，以易于用感光顯影系統(tǒng)目測(cè)識(shí)別轉(zhuǎn)化體。這個(gè)載體示于
圖12。見Kunkel等，1999.F)XVE載體
XVE載體(見
圖13)已經(jīng)由Zuo等(2000)闡述。XVE一種嵌合的轉(zhuǎn)錄因子，含有LexA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(1-87殘基)，VP16的反式激活結(jié)構(gòu)域(413-490)，和人雌激素受體的調(diào)節(jié)區(qū)域(272-595)。控制相應(yīng)基因的第二個(gè)表達(dá)盒，是通過將LexA結(jié)合位點(diǎn)的8個(gè)拷貝融合于35S最小啟動(dòng)子的-46位而產(chǎn)生的。
PER8-CKI1(XVE-CKI1)將含有CKI1 cDNA的編碼區(qū)以及部分5’和3’未翻譯區(qū)的XhoI/SpeI DNA片段，插入8XLexA-46啟動(dòng)子下游pER8載體的相同位點(diǎn)。在此構(gòu)建體中，CKI1基因因此置于XVE誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制下，而且其轉(zhuǎn)錄只可由17-β-雌二醇或4-羥基三苯氧胺激活。
PER8-Lexl(XVE-Lecl)將含有Lecl cDNA的編碼區(qū)以及部分5’和3未翻譯區(qū)的XhoI/SpeI DNA片段，插入8XLexA-46啟動(dòng)子下游pER8載體的相同位點(diǎn)。在此構(gòu)建體中，Lecl基因因此置于XVE誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制下，而且其轉(zhuǎn)錄只可由17-β-雌二醇或4-羥基三苯氧胺激活。
PER8-SERK(XVE-SERK)將含有Arabidopsis SERK基因的一個(gè)基因組DNA片段(沒有SERK啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列)，插入8XlexA-46啟動(dòng)子下游的pER8載體的相同位點(diǎn)中。在此構(gòu)建體中，SERK基因因此置于XVE誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制下，而且其轉(zhuǎn)錄只可由17-3-雌二醇或4-羥基三苯氧胺激活。實(shí)施例2用基于pMON721的載體轉(zhuǎn)化植物
載體pMON721可以與A.tumefaciens菌株ABI組合使用，但不能與A.tumefaciens菌株LB4404組合使用。菌株ABI不用激素單獨(dú)就可以從在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的葉片中誘導(dǎo)莖干，并因此不可用于標(biāo)記是莖干生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)中。pMON721-A.tumefaciens菌株ABI組合可用于那些實(shí)驗(yàn)，所述實(shí)驗(yàn)其中是篩選其它標(biāo)記，例如選擇抗生素抗性時(shí)。在這些實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞生長(zhǎng)于具有激素的培養(yǎng)基中，而且是通過卡那霉素抗性選擇的，并將其在有或沒有誘導(dǎo)物如地塞米松的情況中生長(zhǎng)。A)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入細(xì)菌
將質(zhì)粒導(dǎo)入Agrobacterium tumefaciens中。將衍生自pMON721的質(zhì)粒通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法置于菌株ABI(MonsantoCorp.，St.Louis，MO)中。例如，就pMON721/Luc而言，從含有50mg/L卡那霉素，25mg/L氯霉素，100mg/L壯觀霉素和100mg/L鏈霉素的YEB培養(yǎng)皿中選擇一個(gè)單一的A.tumefaciens菌株ABI的集落(Monsanto Corp.，St.Louis，MO)。將Agrobacterium細(xì)胞移至含有10ml YEB液態(tài)培養(yǎng)基的50ml無菌螺紋蓋試管中，所述培養(yǎng)基具有50mg/l卡那霉素，25mg/l氯霉素，100mg/l壯觀霉素和100mg/l鏈霉素。將培養(yǎng)物在28℃生長(zhǎng)24小時(shí)。通過在4℃在3000rpm離心10分鐘收集培養(yǎng)物中的Agrobacterium細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀在具有抗生素的10ml YEB培養(yǎng)基中沖洗1次，然后再懸浮于30ml B5培養(yǎng)基中，用于接種外植體。YEB培養(yǎng)基是由1.0L以下物質(zhì)組成的5.0g蔗糖，5.0g蛋白胨，5.0g牛肉膏，1.0g酵母膏和0.04g MgSO4.7H2O。B)與Agrobacteria共培養(yǎng)
如Horsch等(1988)所述轉(zhuǎn)化和再生Nicotiana tabacum cv SR1的葉片，并根據(jù)Valvekens等(1988)所述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化Arabidopsis。C)含有螢光素酶的轉(zhuǎn)基因植物
使原始轉(zhuǎn)基因植物自體受精并收集種子。將轉(zhuǎn)基因子代在MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)上萌發(fā)以進(jìn)行選擇，所述培養(yǎng)基補(bǔ)加了3％蔗糖，0.8％瓊脂和100ug/ml卡那霉素。將在萌發(fā)后在相同瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)14天的T3純合植物用于誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。在一些實(shí)驗(yàn)中，將植物移至含有1/100濃度的MS鹽的水培生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并在使用前適于生長(zhǎng)條件3天。在所有情況下，將植物暴露于持續(xù)光照和27℃(煙草)或22℃(Arabidopsis)的溫度下。實(shí)施例3用基于PTA7002或PTA7001的載體轉(zhuǎn)化的植物
載體pTA7002和pTA7001可以與A.tumefaciens菌株LB4404一起使用。與A.tumefaciens菌株ABI不同，LB4404菌株不誘導(dǎo)莖干，而且載體與細(xì)菌菌株的這種組合可以用于那些其中莖干生長(zhǎng)是標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中。在此所述實(shí)驗(yàn)使用的是pTA7002/ipt。然而，使用的載體可以包括其它不在GVG系統(tǒng)控制下的感興趣的基因，需要將這些其它基因轉(zhuǎn)化入植物中。在這些實(shí)驗(yàn)中，植物是在沒有激素和抗生素培養(yǎng)基上，但在有或沒有誘導(dǎo)物(例如地塞米松)的情況下選擇的。只有在存在誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)的那些細(xì)胞應(yīng)該產(chǎn)生莖干。切下這些莖干，置于具有生長(zhǎng)素但沒有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中。沒有誘導(dǎo)物使ipt基因轉(zhuǎn)錄停止，培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素促進(jìn)根再生。這些然后可以通過Northern印跡分析或潮霉素抗性測(cè)試，以確定哪個(gè)再生的植物實(shí)際上是轉(zhuǎn)化的。A)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入細(xì)菌中
將質(zhì)粒導(dǎo)入Agrobacterium tumefaci中。將衍生自pTA7002或pTA7001的質(zhì)粒，通過本領(lǐng)域熟知的方法置于菌株LB404中(Clontech實(shí)驗(yàn)室公司)。例如，就pTA7002/ipt而言，含有pTA7002/ipt的LB4404的一個(gè)單一集落，選自含有50mg/l卡那霉素和100mg/l鏈霉素的YEB平板。將Agrobacterium細(xì)胞移至一個(gè)含有10ml YEB液態(tài)培養(yǎng)基的50ml無菌螺紋蓋試管中，所述培養(yǎng)基中具有50mg/l卡那霉素和100mg/l鏈霉素。將培養(yǎng)物在28℃生長(zhǎng)24小時(shí)。通過在4℃在3000rpm離心10分鐘收集培養(yǎng)物中Agrobacterium細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀在具有抗生素的10ml YEB培養(yǎng)基中沖洗一次，，然后再懸浮于30ml的B5培養(yǎng)基中，用于接種外植體。B)與Agrobacteria共培養(yǎng)
在濕的無菌濾紙上將煙草葉片切成4mm×4mm的切片，然后移至無菌的去離子水中。將葉片切片在培養(yǎng)皿中的Agrobacteria溶液(在B5培養(yǎng)基中)中浸漬幾分鐘。將切片在一張無菌濾紙上印干，然后置于MBDK平板上。MBDK培養(yǎng)基的組分是MS鹽-4.3g/l；維生素B5-112mg/l；2-4-D-0.5mg/l；細(xì)胞分裂素-0.1mg/l；蔗糖-20g/l；phytagel-2g/l；pH5.7。C)莖干再生
在用Agrobacteria共培養(yǎng)煙草葉片3天后，將外植體通過在培養(yǎng)皿中含有200mg/l羧芐青霉素的30ml無菌水中浸漬沖洗3次。在無菌紙巾上印干之后，將外植體置于有或沒有地塞米松(DEX，30uM)的MBC培養(yǎng)基上。MBC培養(yǎng)基的組分是MS鹽-4.3g/l；維生素35-112mg/l；蔗糖-20g/l；羧芐青霉素-200mg/l；phytagel-2g/l；pH5.7。將平板在25℃和16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的條件下，在組織培養(yǎng)室中溫育。在2周后，只是在含有DEX(30uM)的培養(yǎng)基上的外植體的傷口部位出現(xiàn)綠色莖干芽。切下這些莖干并移至MBCI平板上。MBCI培養(yǎng)基的組分是MS鹽-4.3g/l；維生素B5-112mg/l；蔗糖-20g/l；羧芐青霉素-200mdg/l；phytagel-2g/l；pH5.7，吲哚乙酸(IAA)-0.15mg/l。D)選擇轉(zhuǎn)基因植物
在MBCI平板上培養(yǎng)10天后，出現(xiàn)一些無定形的莖干。將這些莖干切下并移至新的MBCI平板上。這些莖干在培養(yǎng)10天后看起來是正常的。在2-3周后，它們?cè)偕烁⑸L(zhǎng)為4-6個(gè)葉片的小苗。在這個(gè)階段后，對(duì)它們進(jìn)行測(cè)試以確定它們是否確實(shí)是轉(zhuǎn)化的。由于pTA7001或pTA7002質(zhì)粒含有NOS-Hpt基因，轉(zhuǎn)化的莖干應(yīng)對(duì)潮霉素有抗性。因此，切下含有葉柄的葉片樣品并移至含有40mg/l潮霉素的MBCI培養(yǎng)基中，以誘導(dǎo)根產(chǎn)生。只有大約10％的收集的莖干是確實(shí)轉(zhuǎn)化的。由于吸收產(chǎn)生自鄰近細(xì)胞的細(xì)胞分裂素，非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以形成根，所述鄰近細(xì)胞是轉(zhuǎn)化的并產(chǎn)生細(xì)胞分裂素。選擇的莖干在存在潮霉素的情況下生長(zhǎng)，可用于選擇轉(zhuǎn)化的莖干。Northern或Southern印跡分析是另一種測(cè)試轉(zhuǎn)化的方法。這些方法在其中NOS-hpt基因已經(jīng)自pTA7001或pTA7002質(zhì)粒中缺失，而且取而代之插入一個(gè)相應(yīng)基因的實(shí)驗(yàn)中是有用的。將生根的莖干移至罐中并在溫室中生長(zhǎng)成熟。轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)是正常的，而且是不育的并結(jié)種。實(shí)施例4用糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)
所有糖皮質(zhì)激素衍生物，地塞米松(DEX)，氟羥脫氫皮醇acetonide，betamethasone和氫化可的松均購自Wako Pure化學(xué)制品廠。將化學(xué)制品在使用之前溶解于30mM乙醇中，并在生長(zhǎng)培養(yǎng)基或噴灑溶液中稀釋。將同體積的乙醇加入陰性對(duì)照培養(yǎng)基或溶液中。在組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的情況中(如實(shí)施例3)，具有phytagel的組織培養(yǎng)基中包括DEX。在整個(gè)植物處理的情況中，將植物生長(zhǎng)于含有糖皮質(zhì)激素的瓊脂培養(yǎng)基中，或?qū)⑵涓]在含有0.01mM糖皮質(zhì)激素的水培生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。就噴灑方法而言，噴灑溶液含有30uM DEX和0.01％(w/v)Tween-20；后者是作為濕潤劑加入的。在包含噴灑一個(gè)葉片的一半的實(shí)驗(yàn)中，將葉片的另一半和植物的其它部分用塑料膜覆蓋。應(yīng)注意盡管DEX不是特別毒性的化合物，但其對(duì)人體有一些生理作用，所以應(yīng)小心使用，尤其當(dāng)噴灑此化合物時(shí)應(yīng)使用眼部防護(hù)措施。實(shí)施例5螢光素酶分析
如Millar等(1992)所述進(jìn)行螢光素酶提取和相關(guān)螢光素酶活性分析。為顯影螢光素酶的冷光，將用DEX處理的植物根在含有0.5mM熒光素鉀(Sigma)的溶液中浸沒1小時(shí)，或?qū)姙⒌娜~片的葉柄在0.5mM熒光素鉀的溶液中浸沒30分鐘。將罐中植物用含有0.5mM熒光素鉀和0.01％ Tween-20的溶液噴灑，并留置30分鐘。用圖象強(qiáng)化照相機(jī)(VIM)和光子計(jì)數(shù)圖象加工儀(ARGUS-50)觀測(cè)植物的螢光素酶冷光，所述儀器購自Hamamatsu Photonic系統(tǒng)。曝光時(shí)間為10分鐘。為對(duì)噴灑的葉片的螢光素酶冷光攝像，將葉片和即時(shí)彩色膠片(LP100，富士膠片公司)中間放置一個(gè)薄塑料膜，彼此相接觸5小時(shí)。實(shí)施例6RNA分析
如Nagy等(1988)所述進(jìn)行總RNA分離Northern印跡雜交。在雜交后，用BAS-2000系統(tǒng)(富士膠片公司)對(duì)信號(hào)進(jìn)行顯影。實(shí)施例7選擇最佳的轉(zhuǎn)基因品系
獲得一些非依賴性轉(zhuǎn)基因品系并進(jìn)行測(cè)試。應(yīng)選擇具有低基礎(chǔ)水平和高誘導(dǎo)水平的最佳品系。通常將T-DNA片段的多拷貝插入一個(gè)基因座中。在這種情況中，RB附近的35S啟動(dòng)子可以恰巧在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子附近，并將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)變?yōu)榻M成型激活的啟動(dòng)子。除了這種情況，在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子附近的染色體序列也可以影響活性。因此最好測(cè)試所得轉(zhuǎn)基因品系以發(fā)現(xiàn)具有低基礎(chǔ)活性和高誘導(dǎo)水平的品系。實(shí)施例8在轉(zhuǎn)基因植物中誘導(dǎo)螢光素酶活性
測(cè)定螢光素酶活性對(duì)不同濃度糖皮質(zhì)激素應(yīng)答的固定誘導(dǎo)水平。將生長(zhǎng)于瓊脂培養(yǎng)基上的幼轉(zhuǎn)基因植物(用pMON721/luc載體制備的)，移至含有不同濃度DEX的新鮮瓊脂培養(yǎng)基中。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天后，從10個(gè)植物中制備所有細(xì)胞裂解物并分析螢光素酶活性。圖3B示出用高靈敏度照相機(jī)攝制的來自植物的螢光素酶冷光。圖3B的彩色刻度示于圖3A。圖3C示出由不同濃度的DEX誘導(dǎo)的相關(guān)螢光素酶活性。在沒有DEX的情況下檢測(cè)的螢光素酶活性非常低，并與得自攜帶加在TATA區(qū)域之前的螢光素酶基因的轉(zhuǎn)基因植物的螢光素酶活性相當(dāng)(數(shù)據(jù)未示出)。這個(gè)結(jié)果表明GAL4UAS在植物中是靜止的，并不能由任何內(nèi)源性植物轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別。在0.1uM或更高濃度的DEX情況下可以檢測(cè)到誘導(dǎo)，在01--10uM濃度范圍獲得DEX濃度和誘導(dǎo)水平之間的良好關(guān)聯(lián)。最大誘導(dǎo)水平是基礎(chǔ)水平的100倍。
在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將植物用DEX處理足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以保證螢光素酶活性達(dá)到對(duì)每種DEX濃度均平穩(wěn)的狀態(tài)。如在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)到的在塑料器皿中誘導(dǎo)水平非常低，可能是由于在封閉的條件下，蒸發(fā)的水流進(jìn)培養(yǎng)皿中，并因此根吸收的糖皮質(zhì)激素低于在未封閉的開放條件下吸收的糖皮質(zhì)激素。另一方面，在后一條件下，難以精確控制植物中糖皮質(zhì)激素濃度，因?yàn)榧に赜捎谡舭l(fā)的結(jié)果而迅速累積在葉片中。
已經(jīng)將各種植物用于植物科學(xué)的基礎(chǔ)和應(yīng)用方面研究，其中Arabidopsis已經(jīng)成為植物生物學(xué)基礎(chǔ)研究的模型植物。然而針對(duì)這個(gè)植物模型還遠(yuǎn)未產(chǎn)生出良好的誘導(dǎo)系統(tǒng)。使用植物啟動(dòng)子如熱激啟動(dòng)子的誘導(dǎo)系統(tǒng)是不適合的，因?yàn)樗鼈兇碳ざ嘈ё饔?。盡管四環(huán)素依賴性表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成功用于煙草中，但在Arabidopsis中無效(Gatz，1996)。另一方面，觀測(cè)到GVG系統(tǒng)在Arabidopsis中也起作用。圖4A-C示出轉(zhuǎn)基因Arabidopsis中螢光素酶活性是由DEX有效誘導(dǎo)的。GVG系統(tǒng)應(yīng)該可以廣泛用于許多基因和不同種屬的轉(zhuǎn)基因植物。實(shí)施例9DEX誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的動(dòng)力學(xué)
盡管螢光素酶活性易于測(cè)定，其在短時(shí)間范圍內(nèi)不適于動(dòng)力學(xué)研究，因?yàn)槲灩馑孛富钚缘陌胨テ诠烙?jì)為大約3小時(shí)(Thompson等，1991)。為獲得關(guān)于誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)的更直接的信息，制備總RNA并進(jìn)行Northern印跡分析。在這些實(shí)驗(yàn)中，將植物置于通風(fēng)處以保證DEX迅速吸收。將轉(zhuǎn)基因植物在通風(fēng)條件下適應(yīng)水培生長(zhǎng)條件，并在液態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入終濃度為10uM的DEX。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從20個(gè)植物中制備總RNA并進(jìn)行Northern印跡分析。用pMON721/luc轉(zhuǎn)染的植物的結(jié)果示于圖4A和5A。圖4A示出在加DEX 1小時(shí)后首先檢測(cè)到luc mRNA，而且數(shù)量在接下來的3小時(shí)內(nèi)提高到穩(wěn)定水平。為檢測(cè)誘導(dǎo)的持久性，將DEX從培養(yǎng)基中除去，并分析從植物中制備的總RNA。圖5A示出甚至在除去DEX 4天后，仍然可以檢測(cè)到luc mRNA。
通過監(jiān)測(cè)螢光素酶活性可以獲得相似的結(jié)果。由于檢測(cè)的高靈敏性，在加入DEX 30分鐘后和除去激素8天后，也可以測(cè)定誘導(dǎo)的螢光素酶活性(數(shù)據(jù)未示出)。從這些結(jié)果當(dāng)中，可以認(rèn)為由DEX誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄是迅速的，并且可以長(zhǎng)期持續(xù)。實(shí)施例10對(duì)各種糖皮質(zhì)激素的應(yīng)答
測(cè)試不同糖皮質(zhì)激素衍生物的強(qiáng)度和誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間。將在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的幼轉(zhuǎn)基因植物(用pMON721/luc轉(zhuǎn)染的)，移至含有30uM不同糖皮質(zhì)激素的新鮮培養(yǎng)基上，并再生長(zhǎng)2天。在誘導(dǎo)后，將植物再移至沒有糖皮質(zhì)激素的培養(yǎng)基中。在圖6所示的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，收獲10個(gè)植物并分析其螢光素酶活性。圖6示出不同的糖皮質(zhì)激素衍生物的誘導(dǎo)水平及其持續(xù)時(shí)間示不同的。最高誘導(dǎo)水平是用DEX或triamcinolone acetonide獲得的。相反，用betamethasone或氫化可的松分別只檢測(cè)到低或中等誘導(dǎo)水平。在這些實(shí)驗(yàn)中，假定用每個(gè)糖皮質(zhì)激素獲得的誘導(dǎo)水平已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定水平，因?yàn)檎T導(dǎo)較長(zhǎng)時(shí)間也不明顯提高螢光素酶活性(數(shù)據(jù)未示出)。與由triamcinoloneacetonide誘導(dǎo)的水平相比，DEX誘導(dǎo)可以持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，而這兩種糖皮質(zhì)激素在處理開始時(shí)誘導(dǎo)水平相同。盡管在這些實(shí)驗(yàn)中還未知這些糖皮質(zhì)激素在植物中的穩(wěn)定性，但不同糖皮質(zhì)激素的誘導(dǎo)特性可以用于調(diào)節(jié)誘導(dǎo)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。實(shí)施例11通過噴灑糖皮質(zhì)激素局部誘導(dǎo)螢光素酶表達(dá)
將攜帶GVG和luc基因的成熟植物(植物是用pMON721/luc載體轉(zhuǎn)基因的)的葉片(大約10cm長(zhǎng))的右半和左半，分別用含有30uM DEX和0.01％(w/v)Tween-20的溶液和對(duì)照溶液噴灑。在噴灑24小時(shí)后，切下葉片并使其通過葉柄吸取熒光素。圖7示出來自已經(jīng)用DEX處理的葉片部分的熒光，而在用沒有DEX的對(duì)照溶液處理的葉片部分未見到熒光。圖7是將即時(shí)彩色膠片(富士膠片公司，LP100)置于葉片上5小時(shí)的攝像，用薄塑料片間隔。實(shí)施例12XVE誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)
在基礎(chǔ)和應(yīng)用科學(xué)中非依賴性地和可誘導(dǎo)性地控制多基因表達(dá)是非常有益的。第一步，我們研制了一種新的誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，稱為XVE(見
圖13)。原則上，XVE系統(tǒng)類似于GVG，其中核受體的調(diào)節(jié)區(qū)域授予融合于樣板序列的異源DBD激素可誘導(dǎo)性。此XVE異源嵌合體含有細(xì)菌阻抑物L(fēng)exA的DBD(X)(Horii等，1981；Miki等，1981)，和人雌激素受體的調(diào)節(jié)區(qū)域(E)(Greene等，1986)。這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使XVE具有不同的DNA結(jié)合特異性，并由與GVG不同的刺激激活。因此，將LexA結(jié)合位點(diǎn)的8個(gè)拷貝融合于35S最小啟動(dòng)子的-46位，以驅(qū)動(dòng)效應(yīng)基因。
為測(cè)試XVE系統(tǒng)，將編碼綠色熒光蛋白(GFP)的cDNA插入XVE載體的效應(yīng)器彈夾中(pER8；見
圖13之詳述)。將pER8-GFP載體轉(zhuǎn)化入Arabidopsis和煙草中，并評(píng)定GFP基因的表達(dá)。在這兩個(gè)種屬獲得相似的結(jié)果。在此我們示出了得自對(duì)pER8-GFPArabidopsis轉(zhuǎn)基因品系的進(jìn)行詳細(xì)分析的數(shù)據(jù)。我們最初篩選了22個(gè)非依賴性轉(zhuǎn)基因品系，是在常規(guī)熒光顯微鏡下，目測(cè)在沒有(對(duì)照)或有(誘導(dǎo))誘導(dǎo)物(2uM 17-β-雌二醇和luM 4-羥基三苯氧胺的混合物)的情況下萌發(fā)的植物而篩選的。篩選的結(jié)果概括示于表1。在一半以上的品系中觀測(cè)到高水培誘導(dǎo)，代表性實(shí)施例示于
圖14。在剩余的品系中，GFP基因以較低水平表達(dá)(23％)，或者在少數(shù)情況下檢測(cè)不到表達(dá)(9％)。這些品系的一少部分以斑塊模式表達(dá)GFP(14％)。這些數(shù)據(jù)表示XVE是一種高效的表達(dá)系統(tǒng)。在所有測(cè)試的品系中，檢測(cè)不到背景表達(dá)(在沒有誘導(dǎo)物的情況下)，提示此系統(tǒng)是緊密控制的。
表1pER8-GFP轉(zhuǎn)基因Arbidopsis品系概述實(shí)施例13XVE誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的特性
在最初的篩選中，使用17-β-雌二醇和4-羥基三苯氧胺，這是兩種最常用的雌激素受體誘導(dǎo)物。為區(qū)分哪個(gè)化合物是對(duì)應(yīng)答活性形式的，分別測(cè)試這兩個(gè)化合物的可誘導(dǎo)性。這兩個(gè)化合物均能誘導(dǎo)受體基因表達(dá)，4-羥基三苯氧胺比17-β-雌二醇的活性略低。后一誘導(dǎo)物用于所有隨后的實(shí)驗(yàn)中。
為測(cè)試系統(tǒng)的劑量依賴性，將在沒有誘導(dǎo)物的情況下萌發(fā)的3周齡的秧苗，移至含有各種濃度17-β-雌二醇的培養(yǎng)基中，溫育16形式。從未處理的(對(duì)照)或處理的秧苗中制備RNAs，并用GFP cDNA作探針通過Northern印跡分析。如
圖15所示，用0.0004uM(0.4nM)17-β-雌二醇處理，可以檢測(cè)到GFP轉(zhuǎn)錄物，及在大約5uM濃度誘導(dǎo)達(dá)到飽和。
在時(shí)程實(shí)驗(yàn)中，將3周齡的秧苗移至含有2uM的17-β-雌二醇的培養(yǎng)基中，并溫育不同的時(shí)間。如前所述制備和分析RNAs。溫育30分鐘可以檢測(cè)到GFP轉(zhuǎn)錄物，在誘導(dǎo)24小時(shí)后，表達(dá)達(dá)到最大水平(
圖16)。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)5周GFP熒光性表現(xiàn)為不變，提示此系統(tǒng)保持持續(xù)活性。
在
圖15和16所示的實(shí)驗(yàn)中測(cè)試3個(gè)非依賴性轉(zhuǎn)基因品系，獲得相似的結(jié)果。在這兩種情況中，轉(zhuǎn)錄物的誘導(dǎo)通常達(dá)到100-200倍。更重要地，在所有測(cè)試的品系中未觀測(cè)到明顯的毒性作用或生理改變。以上分析表明XVE是一種有效的及可靠的誘導(dǎo)系統(tǒng)。實(shí)施例14用XVE-CKI1轉(zhuǎn)染煙草葉片和根細(xì)胞
除了GVG-ipt之外，pER8-CKI1(XVE-CKI1)已經(jīng)用于轉(zhuǎn)染煙草葉片?；谟?7-β-雌二醇誘導(dǎo)，不用任何外在應(yīng)用的植物激素就可以再生根。在誘導(dǎo)25-35天后莖干發(fā)生。加入IAA(0.15mg/l)不提高效力，反而對(duì)莖干形成有副作用。在培養(yǎng)基中再生效力依賴于17-β-雌二醇劑量(在1，5，10，20和30uM濃度測(cè)試，在10uM發(fā)生飽和)。
XVE-CKI1載體也用于轉(zhuǎn)化煙草根細(xì)胞。使用這種根細(xì)胞，在用17-β-雌二醇誘導(dǎo)后，不用任何外在植物激素就可以再生莖干。當(dāng)用Agrobacteria共培養(yǎng)根時(shí)(在22℃，2-3天)，包括2，4-D(0.5mg/l)和細(xì)胞分裂素(0.1mg/l)。將感染的根置于有或沒有17-β-雌二醇(5uM)的MBC培養(yǎng)基上。每?jī)芍軐⑼庵搀w移至新鮮的MBC培養(yǎng)基中(有或沒有誘導(dǎo)物)。在培養(yǎng)20-30天后，在沒有誘導(dǎo)物的情況中生長(zhǎng)的外植體不產(chǎn)生白色或暗黃色愈傷組織，但這些不形成莖干。在有誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)的外植體形成綠色愈傷組織。在誘導(dǎo)40-50天后，莖干發(fā)生。在MBC培養(yǎng)基上，49個(gè)白色/褐色愈傷組織中無一變?yōu)榫G色及產(chǎn)生莖干，而在補(bǔ)加5uM17-β-雌二醇的MBC培養(yǎng)基上，13/65的白色/褐色愈傷組織變?yōu)榫G色并產(chǎn)生莖干。這個(gè)實(shí)驗(yàn)使用與沒有誘導(dǎo)物相同數(shù)目的具有誘導(dǎo)物的根外植體。由于有誘導(dǎo)物形成65個(gè)愈傷組織，而沒有誘導(dǎo)物形成49個(gè)愈傷組織，因此CKI1的過表達(dá)也可以提高愈傷組織形成的效力。實(shí)施例15用XVE-CKI1轉(zhuǎn)染Arabidopsis根A)制備根材料
將新鮮收獲的種子在使用之前在4℃干燥貯存兩周。將種子置于具有大約1ml滅菌溶液(50％Clorox+0.01％Triton X-100)的1.5mlEppendorf試管中(或其它常規(guī)容器中)，并有規(guī)律地?cái)噭?dòng)10分鐘。在1.5ml Eppendorf試管中最好不要使用太多的種子(＞1000或大約50uL)，因?yàn)槭褂锰嗟姆N子導(dǎo)致滅菌無效。用無菌移液管除去滅菌溶液，并將種子在無菌蒸餾水中沖洗3次，每次用1.0-1.5ml。
將滅菌的種子懸浮于大約0.5ml的無菌0.15％瓊脂水溶液中，然后將其涂布于A平板的表面(MS鹽+30g/l蔗糖+0.8g/l瓊脂，pH5.7)。將種子在4℃春化兩天，以改善種子的萌發(fā)率。然后將這些種子在培養(yǎng)室中溫育，并萌發(fā)3天。將一周的秧苗用于根培養(yǎng)。
將10-15株秧苗移至含有100ml B5培養(yǎng)基(B5鹽+30g/l蔗糖+0.5g/l MES(2-[N-嗎啉]乙磺酸)，pH5.7)的250ml Erlenmeyer燒瓶中。將此燒瓶用兩層鋁箔密封，并置于125rpm搖動(dòng)器上。將培養(yǎng)物在22℃用暗光照射。在B5培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15天后，將根用于轉(zhuǎn)化。應(yīng)選擇白色的根進(jìn)行轉(zhuǎn)化。黃色或淡褐色的根不能良好轉(zhuǎn)化。B)預(yù)處理根外植體
以下步驟應(yīng)在無菌罩中進(jìn)行。將如A)步所述制備的根移至無菌培養(yǎng)皿中。用無菌解剖刀將根系從小植物中切下。。將根切成大約1cm的節(jié)段，并置于無菌紙巾中以吸干超量的培養(yǎng)基。然后用無菌鑷子將根節(jié)段移至F1平板中(B5鹽+20g/l葡萄糖+0.5g/l MES+0.5mg/l2，4-D+0.05mg/l細(xì)胞分裂素+2g/l phytagel，pH5.7)。將根涂布開以使它們與培養(yǎng)基均接觸。將平板用可透氣的帶子密封，并在組織培養(yǎng)室中溫育2-3天。C)培養(yǎng)Agrobacterium
將Agrobacterium(LBA4404菌株，Clontech)用pER8-CKI1(XVE-CKI1)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，并將所得轉(zhuǎn)化體在補(bǔ)加了100mg/l壯觀霉素和100mg/l鏈霉素的YEB培養(yǎng)基中在28℃培養(yǎng)過夜，所述YEB培養(yǎng)基含有5g/l蔗糖，5g/l蛋白胨，5g/l牛肉膏和1g/l酵母膏，0.04g/lMgSO4.7H2O，pH7.0。然后將Agrobacteria沉淀，并用沒有抗生素的YEB培養(yǎng)基沖洗兩次，最后懸浮于2.0-2.5ml YEB中以感染Arabidopsis根外植體。D)用Agrobacterium接種根外植體并共培養(yǎng)
將如B)步制備的根外植體移至無菌培養(yǎng)皿中，并切成0.5cm節(jié)段。將根外植體移至無菌籃中(例如一端有網(wǎng)蓋的玻璃管)，并將其置于含有20ml B5培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。將得自C)步的2mlAgrobacterium溶液置于B5培養(yǎng)基中。將此籃輕輕旋動(dòng)大約2分鐘，以確使根外植體用Agrobacterium接種。在接種后，將含有根外植體的籃子置于4層無菌紙巾上以吸干超量的液體。用鑷子將叢生的根節(jié)段每次從籃子中除去一小部分，并將5-10個(gè)叢生的根節(jié)段的置于F2平板上(F1平板+20mg/l乙酰丁香酮)。將根節(jié)段用Agrobacteria在22℃共培養(yǎng)2-3天。E)選擇和再生轉(zhuǎn)化體
在用Agrobacteria共培養(yǎng)根節(jié)段后，用含有200mg/l羧芐青霉素的無菌蒸餾水將Agrobacteria從根外植體中沖洗去。將根外植體收集在籃子里，然后將籃子置于無菌紙巾上以吸干超量的液體。將根節(jié)段移至有或沒有化學(xué)誘導(dǎo)物(5uM 17-β-雌二醇)的MIC培養(yǎng)基(MS鹽+10g/l蔗糖+0.5g/l MES+0.15mg/l吲哚乙酸(IAA)+100mg/l羧芐青霉素+2.0g/l phytagel，pH5.7)上，并在22℃以16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的循環(huán)培養(yǎng)。MIC培養(yǎng)基含有MS鹽，IAA和羧芐青霉素，但不含有抗生素以選擇轉(zhuǎn)化體。應(yīng)注意存在IAA是不重要的，但當(dāng)與Arabidopsis一起使用時(shí)可提高再生效力。當(dāng)與煙草一起使月時(shí)IAA沒有作用。
在第一周后將上述材料在相同培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，然后每?jī)芍軅鞔囵B(yǎng)一次。在培養(yǎng)大約10天后，在具有化學(xué)誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的外植體上出現(xiàn)一個(gè)小暗綠色愈傷組織，但在沒有化學(xué)誘導(dǎo)物的平板上生長(zhǎng)的外植體上沒有綠色的愈傷組織。在大約15天后，在具有化學(xué)誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上出現(xiàn)小莖干。在莖干形成小玫瑰花形骨針后(3-4片)，將它們移至沒有化學(xué)誘導(dǎo)物的MIC培養(yǎng)基中，以促進(jìn)根再生。在根再生后，將小植物移至土壤中并生長(zhǎng)至成熟。當(dāng)將小植物移至土壤時(shí)，應(yīng)將瓊脂培養(yǎng)基從小植物中徹底沖洗干凈。在土壤中生長(zhǎng)的前2天，應(yīng)將小植物用塑料膜覆蓋以保持高度濕潤。F)轉(zhuǎn)基因植物的成熟
在大約5-6周后，大多數(shù)長(zhǎng)角成為黃色的和干燥的。將種子單獨(dú)收集并貯存在4℃。實(shí)施例16用XVE-Lecl轉(zhuǎn)染Arabidopsis
Lecl在XVE誘導(dǎo)系統(tǒng)(pER8-Lecl)控制下的過表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因Arabidopsis秧苗的子葉中形成體細(xì)胞胚或類胚結(jié)構(gòu)。在沒有任何植物激素的情況中，這個(gè)系統(tǒng)可用于在沒有植物激素的條件下產(chǎn)生體細(xì)胞胚。這與目前所有組織培養(yǎng)方法不同，目前的組織培養(yǎng)方法中體細(xì)胞胚的形成依賴于2，4-D。在移至沒有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上后，體細(xì)胞胚將萌發(fā)為秧苗，從而產(chǎn)生不表達(dá)抗生素選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)化體。Lecl的有條件過表達(dá)也可以提高單子葉植物和裸子植物的轉(zhuǎn)化和再生的效力。使用目前的技術(shù)，非常難以獲得大多數(shù)有經(jīng)濟(jì)重要性的種屬的再生體和/或轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的這種方法對(duì)單子葉植物和裸子植物尤為重要，所述植物的再生主要是通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生的。實(shí)施例17用XVE-SERK轉(zhuǎn)染
將Arabidopsis SERK基因通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))克隆。將SERK基因置于XVE系統(tǒng)的控制下。將XVE-SERK系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)染煙草和Arabidopsis。基于誘導(dǎo)，在沒有任何附加的植物激素的情況中，體細(xì)胞胚在沒有植物激素的條件下形成?，F(xiàn)有技術(shù)需要存在2，4-D才能形成體細(xì)胞胚。在移至沒有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上后，體細(xì)胞胚萌發(fā)為秧苗，從而產(chǎn)生不表達(dá)抗生素選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)化體。SERK的有條件過表達(dá)也可以提高單子葉植物和裸子植物的轉(zhuǎn)化和再生的效力，所述植物先前非常難以再生和轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的這種方法對(duì)單子葉植物和裸子植物尤為重要，所述植物的再生主要是通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生的。實(shí)施例18Dual誘導(dǎo)系統(tǒng)
本發(fā)明的一個(gè)主要目的是產(chǎn)生一種雙向誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，其中可以非依賴性及可誘導(dǎo)地調(diào)節(jié)多個(gè)基因。攜帶a)XVE和b)GVG的轉(zhuǎn)基因Arabidopsis植物，可以通過共同轉(zhuǎn)化或在各個(gè)品系之間雜交而產(chǎn)生。雙重誘導(dǎo)系統(tǒng)中的每種成分將非依賴性地操縱并彼此互不干擾，而且它們還保持其可誘導(dǎo)性和緊密控制。在每種啟動(dòng)子控制下的基因可通過正確和適時(shí)使用啟動(dòng)子而依次或同時(shí)誘導(dǎo)。實(shí)施例19使用knotted基因誘導(dǎo)莖干形成
knotted基因及其家族成員例如knotted同源基因KNAT1和KNAT2，在莖干中高度表達(dá)(Lincoln等，1994；Chuck等，1996)。已經(jīng)用在CaMV 35S啟動(dòng)子控制下的例如KNAT1基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，發(fā)生明顯變化，包括異位莖干形成(Lincoln等，1994)。然而，這種莖干因?yàn)閗notted基因的非控制表達(dá)而不能正常發(fā)育。一種其中植物是用可調(diào)節(jié)的knotted基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)，可產(chǎn)生將產(chǎn)生莖干的植物，然后通過抑制此基因在莖干中表達(dá)，使用此莖干再生正常的植物。本發(fā)明提供了達(dá)到這種目的的一種方法。將一種knotted基因例如來自玉米的knl置于載體中，由此其在上述GVG系統(tǒng)的控制下。用這種載體轉(zhuǎn)化的植物，在沒有GVG或XVE系統(tǒng)的誘導(dǎo)物的情況下正常生長(zhǎng)。外植體，例如這些轉(zhuǎn)基因植物的葉片，可以用誘導(dǎo)物處理(例如地塞米松或17-β-雌二醇)，以刺激無定形莖干的發(fā)育。切下發(fā)育的莖干并抑制沒有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中。然后這些莖干將正常發(fā)育產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。所用的載體可以包括需要轉(zhuǎn)化入植物中的其它感興趣的基因，這些基因不在GVG或XVE系統(tǒng)的控制下。選擇的植物包括感興趣的基因，而且不需要使用抗生素選擇標(biāo)記選擇。注意選擇轉(zhuǎn)化的莖干應(yīng)如實(shí)施例3所述進(jìn)行，即在沒有激素但具有殺死Agrobacteria的羧芐青霉素的培養(yǎng)基上(MBC)。也可以使用來自其它單子葉或雙子葉植物的玉米knotted基因的同系物。實(shí)施例20使用CKI1基因誘導(dǎo)莖干形成
CKI1基因是最近鑒別的。這種基因在植物中的過表達(dá)導(dǎo)致植物呈現(xiàn)典型的細(xì)胞分裂素應(yīng)答，包括在沒有外源細(xì)胞分裂素的情況下，在組織培養(yǎng)物中快速的細(xì)胞分化和莖干形成。CKI1基因可以類似于ipt的方式用作選擇標(biāo)記。一種其中植物是用可調(diào)節(jié)的CKI1基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)，可產(chǎn)生將產(chǎn)生莖干的植物，然后通過抑制此基因在莖干中表達(dá)，使用此莖干再生正常的植物。本發(fā)明提供了達(dá)到這種目的的一種方法。將一種CKI1基因置于載體中，由此其在上述GVG系統(tǒng)的控制下。用這種載體轉(zhuǎn)化的植物，在沒有GVG或XVE系統(tǒng)的誘導(dǎo)物的情況下正常生長(zhǎng)。外植體，例如這些轉(zhuǎn)基因植物的葉片，可以用誘導(dǎo)物處理(例如地塞米松)，以刺激無定形莖干的發(fā)育。切下發(fā)育的莖干并抑制沒有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中。然后這些莖干將正常發(fā)育產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。所用的載體可以包括需要轉(zhuǎn)化入植物中的其它感興趣的基因，這些基因不在GVG或XVE系統(tǒng)的控制下。選擇的植物包括感興趣的基因，而且不需要使用抗生素選擇標(biāo)記選擇。如實(shí)施例3和19所述，在MBC平板上進(jìn)行選擇莖干，然后將其移至MBCI中生根。實(shí)施例21在GVG或XVE控制下具有抗生素抗性或除草劑抗性的載體
產(chǎn)生抗生素抗性的基因已經(jīng)廣泛用于載體中作為選擇標(biāo)記。使用這種系統(tǒng)的一個(gè)問題是這些基因趨向于組成型激活，而且由此轉(zhuǎn)化的植物將持續(xù)表達(dá)這些基因。將這種組成型表達(dá)的基因插入在實(shí)驗(yàn)室外生長(zhǎng)的的植物中，存在環(huán)境和健康方面的問題(Bryant和Leather，1992；Gressel，1992；Flavell等，1992)。將這種基因置于GVG或XVE系統(tǒng)控制下則克服了這些問題?？股乜剐曰?qū)⒅辉谏L(zhǎng)培養(yǎng)基存在糖皮質(zhì)激素的選擇期間表達(dá)，但這些基因當(dāng)在實(shí)驗(yàn)室之外在沒有糖皮質(zhì)激素的情況下生長(zhǎng)時(shí)不被激活?？梢岳萌魏嗡璧目股乜剐曰??？梢允褂媒?jīng)適當(dāng)修改的pTA7001和pTA7002載體。將相應(yīng)的抗生素基因克隆入例如XhoI-SpeI克隆位點(diǎn)中。修改pTA7001或pTA7002載體以使hpt基因失活或除去?？梢允褂眠@些修改的載體。適當(dāng)?shù)妮d體可以通過用例如pBI101(Clontech)載體起始制備。將此載體左右邊界之間的區(qū)域除去，并用上述GVG或XVE系統(tǒng)置換，簡(jiǎn)而言之，其包括35S啟動(dòng)子，GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，VP16反式激活結(jié)構(gòu)域，糖皮質(zhì)激素受體結(jié)構(gòu)域加上6xGAL4 UAS區(qū)域，后接克隆位點(diǎn)。這種載體不包括外源性抗生素抗性基因?？梢詫⑷魏嗡璧目股鼗虿迦?xGAL4 UAS區(qū)域附近的克隆位點(diǎn)中，并將在糖皮質(zhì)激素的控制下。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(npt)基因例如是可以利用的兩種抗生素基因。包括DEX可調(diào)節(jié)的npt或hpt基因的Ti載體，可用于轉(zhuǎn)化所需種屬的外植體。在組織培養(yǎng)期間，在存在DEX(其激活適當(dāng)?shù)目股乜剐曰?和存在適當(dāng)抗生素(卡那霉素或潮霉素)的情況下選擇再生的莖干。一經(jīng)核實(shí)，然后將轉(zhuǎn)基因植物移至具有抗生素但沒有化學(xué)誘導(dǎo)物(DEX)的組織培養(yǎng)基中。所得植物含有抗生素抗性基因，但這些基因在沒有化學(xué)誘導(dǎo)物的情況下是沒有活性的。
可將除草劑抗性基因類似地置于GVG或XVE控制下，并用于在組織培養(yǎng)期間選擇轉(zhuǎn)化在植物。這種植物在田地里不表達(dá)除草劑抗性基因。除草劑抗性基因例如是PAT(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)，其授予對(duì)BASTA除草劑(活性成分膦絲菌素)(Rathore等，1993；Becker等，1992)和一種突變形式的乙酰乳酸合酶的抗性，所述乙酰乳酸合酶對(duì)DuPont公司的磺酰脲除草劑有抗性(見例如Wiersma等，1989；Harms等，1992；Hattori等，1992；Hattori等，1995)。原理上，這些基因不僅可以在組織培養(yǎng)中用作選擇標(biāo)記，也可以在田地中表達(dá)。由于噴灑DEX或17-β-雌二醇存在危險(xiǎn)因素，人們不想在田地中的植物上噴灑DEX，但如果將一種比DEX更安全的化合物用作誘導(dǎo)物，則可以使用這種方法。實(shí)施例22植物生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化
將Nicotiana tabacum栽培種SR1在含有0.02％Tween20的30％商購漂白劑中表面滅菌10分鐘，并用無菌水沖洗5次。將植物在22℃以16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的循環(huán)，生長(zhǎng)于組織培養(yǎng)室中。基本如Horsch等(1985)和Klee等(1987)所述轉(zhuǎn)化煙草。從4周齡的植物的幼葉中制備葉片，并將外植體在MB培養(yǎng)基(MS鹽，維生素B5，20g/l蔗糖，20mg/l乙酰丁香酮，0.2％phytagel，pH5.7)上培養(yǎng)兩天。在用Agrobacterium tumefaciens共培養(yǎng)3天后，將葉片移至含有不同DEX濃度的MS培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)20-40天后，從外植體切下再生的莖干，并在含有IAA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)以誘導(dǎo)根再生。
如針對(duì)煙草所述萌發(fā)滅菌的萵苣葉(Lactuca sativa var.GreatLake#118)及生長(zhǎng)秧苗。如Curtis等所述(1996)進(jìn)行轉(zhuǎn)化萵苣葉片，除了培養(yǎng)基中沒有細(xì)胞分裂素。實(shí)施例23在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中誘導(dǎo)ipt基因的最佳條件
將用pTA7002G/ipt/luc轉(zhuǎn)染獲得的煙草葉片和萵苣葉片，置于含有羧芐青霉素和不同濃度地塞米松(DEX)的培養(yǎng)基中。每?jī)芍軐⑼庵搀w移至新鮮培養(yǎng)基中以保持恒定的培養(yǎng)條件。再生自給定數(shù)量葉片的莖干數(shù)目隨著DEX濃度提高而明顯提高(表2)。在10uM DEX從28個(gè)外植體中再生了170個(gè)煙草莖干和198個(gè)萵苣莖干。在沒有DEX的情況下，在均是28個(gè)外植體中煙草只有7個(gè)莖干再生，萵苣再生30個(gè)莖干(圖8)。
表2實(shí)施例24在煙草和萵苣再生體中測(cè)定Luc活性
轉(zhuǎn)化彈夾pTA7002G/ipt/luc(
圖12)含有在CaMV 35S啟動(dòng)子控制下的luc基因(Millar等，1992；Benfey和Chua，1990)。測(cè)定luc活性，以使用Michelet和Chua(1996)所述的視頻顯影系統(tǒng)評(píng)估轉(zhuǎn)基因莖干數(shù)目。綜合5分鐘以上的測(cè)定結(jié)果，并將相應(yīng)背景從顯影中減去(圖9A-F)。將近50％的再生體表達(dá)luc基因(表2)。在未誘導(dǎo)條件下(0uM DEX)，42％的煙草再生體和12％的萵苣再生體示出可檢測(cè)的luc活性(表2)。這表明少量轉(zhuǎn)化的細(xì)胞對(duì)細(xì)胞分裂素非常敏感，其水平可以由于滲漏ipt表達(dá)而略微提高。由于再生體的高產(chǎn)量，使用來自用10uM DEX處理的外植體的莖干進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例25測(cè)定用DEX超時(shí)誘導(dǎo)ipt的作用
為進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)定性，我們檢測(cè)了誘導(dǎo)期間的作用以及外源應(yīng)用植物激素的作用。進(jìn)行時(shí)程實(shí)驗(yàn)以確定ipt基因的誘導(dǎo)特異性是否由于細(xì)胞分裂素的超量產(chǎn)生和擴(kuò)散而隨著時(shí)間而降低，細(xì)胞分裂素可以在相鄰的未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中引發(fā)再生。在用10uM DEX誘導(dǎo)20，30和40天后，測(cè)定54個(gè)煙草再生體(得自用pTA7002G/ipt/luc轉(zhuǎn)染)中l(wèi)uc活性，以評(píng)估轉(zhuǎn)化率。隨著時(shí)間的過去發(fā)現(xiàn)再生體中可檢測(cè)luc活性沒有明顯差異。在20天后，46％的再生體具有可檢測(cè)的luc活性。另外，當(dāng)ipt基因表達(dá)是在用Agrobacterium共培養(yǎng)期間直接誘導(dǎo)的時(shí)，轉(zhuǎn)化效力沒有可檢測(cè)到的變化(如測(cè)定luc活性)。用萵苣也獲得相似的結(jié)果。實(shí)施例26在誘導(dǎo)期間外源應(yīng)用生長(zhǎng)素的影響
測(cè)定來自煙草外植體(得自用pTA7002G/ipt/luc轉(zhuǎn)染的)的莖干中螢光素酶活性，將所述莖干在含有1.0，1.5和2.0mg/ml生長(zhǎng)素和10uM DEX的培養(yǎng)基上培養(yǎng)40天。高生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素水平利于根再生，并對(duì)莖干再生有抑制作用，因此可以降低未轉(zhuǎn)基因的再生體數(shù)目。螢光素酶活性在不同的生長(zhǎng)素濃度沒有明顯差異。在1.0mg/ml生長(zhǎng)素濃度，45％的再生體具有可檢測(cè)的luc活性，在1.5mg/ml生長(zhǎng)素濃度，58％的再生體具有可檢測(cè)的luc活性，及在2.0mg/ml生長(zhǎng)素濃度，47％再生體具有可檢測(cè)的luc活性。實(shí)施例27用Northern分析測(cè)定莖干中ipt轉(zhuǎn)錄物水平
ipt轉(zhuǎn)錄物水平是在30天齡的具有或沒有可檢測(cè)螢光素酶活性的煙草和萵苣再生體(得自用pTA7002G/ipt/luc轉(zhuǎn)染)中測(cè)定的。將此再生體在存在10uM地塞米松的情況下生長(zhǎng)。
使用Qiagen RNA提取試劑盒和方法，從0.1g植物材料中提取RNA。將總RNA在含有0.8uM甲醛的1％瓊脂糖凝膠上分離。根據(jù)生產(chǎn)者指導(dǎo)(Stratagene)，將RNA移至Duralon UV膜上。在印跡后，通過UV照射將RNA與膜共價(jià)交聯(lián)。將此膜封阻，并用StratageneQuikHyb溶液在68℃根據(jù)生產(chǎn)者指導(dǎo)進(jìn)行雜交。在雜交后，將此膜用2×SCC+0.1％SDS在65℃沖洗3次15分鐘，并用0.1×SSC+0.1％SDS在60℃沖洗1次15分鐘。
Northern分析的結(jié)果表明只有一個(gè)例外(
圖10C，樣品f)，其它所有測(cè)試的煙草和萵苣再生體均表達(dá)ipt基因(表3)。ipt轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量在煙草再生體中高于在萵苣再生體中，并在不同莖干之間各不相同。ipt轉(zhuǎn)錄物水平在LUC+莖干中高于在沒有可檢測(cè)螢光素酶活性(LUC-)的再生體中水平。這表明再生幾乎全部偶聯(lián)于ipt基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞分裂素水平提高。
表3實(shí)施例28使用Southern和Northern分析確定莖干中l(wèi)uc基因存在情況及其轉(zhuǎn)錄物的水平
為分析luc基因的存在情況，用來自LUC+和LUC-煙草再生體(得自用pTA7002G/ipt/luc轉(zhuǎn)染)的DNA進(jìn)行Southern印跡分析。DNA是用Nucleon DNA提取試劑盒和方法，從0.1g煙草植物材料中提取的。將DNA在0.8％瓊脂糖凝膠上分離。根據(jù)生產(chǎn)者指導(dǎo)將DNA移至Duralon UV膜上。在印跡后，通過UV照射將RNA與膜共價(jià)交聯(lián)。將此膜封阻，并用Stratagene QuikHyb溶液在68℃根據(jù)生產(chǎn)者指導(dǎo)進(jìn)行雜交。在雜交后，將此膜用2×SSC+0.1％SDS在65℃沖洗3次15分鐘，并用0.1×SSC+0.1％SDS在65℃沖洗1次15分鐘。在所有LUC+再生體和50％LUC-莖干中發(fā)現(xiàn)luc基因。
如實(shí)施例27進(jìn)行Northern分析，以分析LUC+和LUC-煙草再生體中l(wèi)uc轉(zhuǎn)錄物的存在情況。與來自LUC+再生體的luc轉(zhuǎn)錄物相比，LUC-再生體具有較小的較低豐度的luc轉(zhuǎn)錄物，LUC+再生體是較大及更高豐度的(表3)。實(shí)施例29潮霉素抗性分析
hpt基因的表達(dá)授予潮霉素抗性。為分析LUC+和LUC-煙草再生體中(得自用pTA7002G/ipt/luc轉(zhuǎn)染)中hpt基因存在情況，如實(shí)施例3所述分析潮霉素抗性。將具有葉柄的幼葉片置于具有潮霉素的培養(yǎng)基中，并記錄根形成情況。在具有含有20mg/l潮霉素的非誘導(dǎo)性培養(yǎng)基的平板上測(cè)試潮霉素抗性。所有測(cè)試的LUC+煙草再生體中95％對(duì)潮霉素有抗性，及60％以上的LUC-莖干是潮霉素抗性的。實(shí)施例30根再生，植物形態(tài)，和煙草中拷貝數(shù)
將煙草莖干(得自用pTA7002G/ipt/luc轉(zhuǎn)染)移至不含DEX的誘導(dǎo)根再生的培養(yǎng)基中(1×MS鹽，維生素B5，0.15mg/l IAA，20g/l蔗糖，0.2％ phytagel，pH5.7)。在轉(zhuǎn)移后20天內(nèi)，40％以上的轉(zhuǎn)基因煙草莖干產(chǎn)生強(qiáng)大的根系。除了極少例外(少于2％)，轉(zhuǎn)基因煙草植物的形態(tài)是正常的。然后將此煙草植物移至土壤中。植物產(chǎn)生正常的葉和花，及在種子產(chǎn)生方面無影響。
用一個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草系的44個(gè)隨機(jī)選擇的秧苗(T1子代)，對(duì)luc基因家族進(jìn)行分離分析(
圖11A-B)。從已經(jīng)自身雜交的轉(zhuǎn)基因植物中獲取種子。對(duì)子代的一個(gè)群體(萌發(fā)的小植物)進(jìn)行分析。在這些秧苗中測(cè)定螢光素酶活性示出顯性luc基因明顯3∶1分離。這表明在一個(gè)基因座中插入一個(gè)插入體，而且轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定地傳遞給第二世代。
在用限制酶消化DNA后，對(duì)來自秧苗的DNA進(jìn)行Southern分析。檢測(cè)單獨(dú)的凝膠條帶(
圖11C)。實(shí)施例31對(duì)煙草再生體進(jìn)行Southern印跡分析
在將來自18個(gè)煙草再生體(得自用pTA7002G/ipt/luc轉(zhuǎn)染)的DNA用BamHI，SacI，和XbaI消化后，進(jìn)行Southern分析。大多數(shù)莖干只含有轉(zhuǎn)基因的一個(gè)單獨(dú)的拷貝。18個(gè)再生體中只有2個(gè)示出存在一個(gè)以上的雜交條帶(表3)。實(shí)施例32GLF系統(tǒng)的特點(diǎn)和應(yīng)用
圖17是XVE激活標(biāo)記載體pER16的圖式。只示出了右邊界(RB)和左邊界(LB)之間的區(qū)域(無刻度)。兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位和OLexA-46啟動(dòng)子位于RB和LB之間。在第一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中，G10-90啟動(dòng)子(Ishige等，1999)驅(qū)動(dòng)以rbcs E9聚A附加序列終止的XVE融合基因。第二個(gè)轉(zhuǎn)錄單位由胭脂氨酸合酶(NOS)基因啟動(dòng)子，新霉素轉(zhuǎn)移酶II(NPT II)基因的編碼序列和NOS聚腺苷酸化序列組成。OLexA-46啟動(dòng)子由融合于-46 CaMV35S啟動(dòng)子的LexA操縱子序列的8個(gè)拷貝組成?；谡先胫参锘蚪M，OLexA-46啟動(dòng)子可以以17-β-雌二醇依賴性方式，激活融合于啟動(dòng)子下游的序列轉(zhuǎn)錄。
GLF系統(tǒng)可以用于大范圍遺傳學(xué)篩選相應(yīng)的突變體。例如，我們可以產(chǎn)生大量的攜帶功能性基因組GLF載體的Arabidopsis突變體(Bechtold等，1993)。從在含有17-β-雌二醇的誘導(dǎo)性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的T1子代中，可以立即鑒別功能增強(qiáng)的突變體。即使在功能增強(qiáng)的突變是致死的情況下，除去誘導(dǎo)物也能恢復(fù)突變體。注意這種類型致死突變不能通過所有先前公布的系統(tǒng)恢復(fù)(Hayashi等，1992；Kakimoto，1996；Weigel等，2000)。另一方面，功能喪失的表型可以在T2子代中定性。GLF系統(tǒng)的另一優(yōu)點(diǎn)是可以有條件地遺傳性補(bǔ)足功能喪失的突變。這可以通過用誘導(dǎo)物17-β-雌二醇適當(dāng)處理功能喪失突變體而達(dá)到，這樣有條件性地將突變體表型恢復(fù)為野生型表型。
本發(fā)明通過參考優(yōu)選的實(shí)施方案加以了揭示，應(yīng)理解這種揭示只是例證了本發(fā)明而無限制之意，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明精神和所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明加以修改。參考文獻(xiàn)
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權(quán)利要求
1、一種篩選包含一個(gè)沉默選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因萵苣植物的方法，其中所述方法包括以下步驟
用載體轉(zhuǎn)化萵苣根細(xì)胞，其中所述載體包含一個(gè)選自ipt基因，CKI1基因，來自knotted家族的基因，和其表達(dá)能促進(jìn)莖干(shoot)再生的基因，其中所述基因在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下；
生長(zhǎng)所述萵苣根細(xì)胞，以使莖干發(fā)育；
切下從具有shooty表型的植物中發(fā)育的莖干，其中所述莖干在沒有所述誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)時(shí)，也可生長(zhǎng)為正常的轉(zhuǎn)基因植物。
2、權(quán)利要求1的方法，其中所述載體還包含一或多個(gè)感興趣的基因。
3、權(quán)利要求1的方法，其中所述載體還包含一種抗生素抗性基因。
4、權(quán)利要求1的方法，其中所述載體還包含一種除草劑抗性基因。
5、權(quán)利要求1的方法，其還包括以下步驟
d)在沒有所述誘導(dǎo)物的情況下培養(yǎng)至少一個(gè)所述莖干，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
6、權(quán)利要求3的方法，其中通過將所述莖干在有抗生素的情況下生長(zhǎng)加以進(jìn)一步選擇，所述抗生素是所述抗生素抗性基因授予抗性的一種抗生素。
7、權(quán)利要求4的方法，其中通過將所述莖干在有除草劑的情況下生長(zhǎng)加以進(jìn)一步選擇，所述除草劑是所述除草劑抗性基因授予抗性的一種除草劑。
8、權(quán)利要求1的方法，其中所述載體包含編碼糖皮質(zhì)激素受體的調(diào)節(jié)區(qū)域的DNA。
9、權(quán)利要求1的方法，其中所述誘導(dǎo)物選自地塞米松，氟羥脫氫皮醇acetonide，βmethasone和氫化可的松。
10、權(quán)利要求1的方法，其中在b)步驟期間存在IAA。
11、一種包含化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體，其中所述載體包含編碼雌激素受體的DNA。
12、權(quán)利要求11的載體，其中所述載體包含一種編碼選擇標(biāo)記或篩選標(biāo)記的基因。
13、權(quán)利要求12的載體，其中所述基因是ipt，CKI1，lucifrase，knotted家族的一個(gè)成員，或其表達(dá)刺激莖干再生和發(fā)育的基因。
14、權(quán)利要求12的載體，其中所述載體還包含一個(gè)感興趣的基因。
15、權(quán)利要求12的載體，其中所述載體還包含一個(gè)抗生素抗性基因。
16、權(quán)利要求12的載體，其中所述載體還包含一個(gè)除草劑抗性基因。
17、權(quán)利要求11的載體，其中所述載體包含編碼細(xì)菌阻抑物L(fēng)exA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA。
18、權(quán)利要求17的載體，還包含編碼雌激素受體的調(diào)節(jié)區(qū)域的DNA。
19、權(quán)利要求17的載體，還包含編碼VP16反式激活域的DNA。
20、權(quán)利要求11的載體，其中所述化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包含LexA結(jié)合位點(diǎn)的一或多個(gè)拷貝。
21、權(quán)利要求20的載體，其中所述化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包含一個(gè)35S最小啟動(dòng)子。
22、權(quán)利要求17的載體，其中編碼細(xì)菌阻抑物L(fēng)exA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述DNA融合于一個(gè)組成型啟動(dòng)子。
23、權(quán)利要求22的載體，其中所述組成型啟動(dòng)子是G1090。
24、權(quán)利要求17的載體，其中編碼細(xì)菌阻抑物L(fēng)exA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述DNA融合于一個(gè)組織特異性啟動(dòng)子。
25、一種載體，其包含i)一個(gè)組成型啟動(dòng)子，ii)編碼細(xì)菌阻抑物L(fēng)exA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA，iii)編碼VP16的反式激活域的DNA，iv)編碼雌激素受體的DNA，和v)一或多個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)。
26、一種包含化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的核酸，其中所述核酸還包含編碼雌激素受體的DNA。
27、權(quán)利要求26的核酸，還包含編碼糖皮質(zhì)激素受體的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的DNA。
28、權(quán)利要求26的核酸，其中所述核酸還包含編碼選擇標(biāo)記或篩選標(biāo)記的一個(gè)基因。
29、權(quán)利要求28的核酸，其中所述基因是ipt，CKI1，lucifrase，knotted家族的一個(gè)成員，或其表達(dá)刺激莖干再生和發(fā)育的基因。
30、權(quán)利要求28的核酸，其中所述核酸還包含一個(gè)感興趣的基因。
31、權(quán)利要求28的核酸，其中所述核酸還包含一個(gè)抗生素抗性基因。
32、權(quán)利要求28的核酸，其中所述核酸還包含一個(gè)除草劑抗性基因。
33、權(quán)利要求26的核酸，其中所述載體包含編碼細(xì)菌阻抑物L(fēng)exA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA。
34、權(quán)利要求33的核酸，還包含編碼雌激素受體的調(diào)節(jié)區(qū)域的DNA。
35、權(quán)利要求33的核酸，還包含編碼VP16反式激活域的DNA。
36、權(quán)利要求26的核酸，其中所述化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包含LexA結(jié)合位點(diǎn)的一或多個(gè)拷貝。
37、權(quán)利要求36的核酸，其中所述化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包含一個(gè)35S最小啟動(dòng)子。
38、權(quán)利要求33的核酸，其中所述細(xì)菌阻抑物L(fēng)exA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合于組成型啟動(dòng)子。
39、權(quán)利要求38的核酸，其中所述組成型啟動(dòng)子是G1090。
40、權(quán)利要求33的核酸，其中所述細(xì)菌阻抑物L(fēng)exA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合于組織特異性啟動(dòng)子。
41、一種核酸，其包含i)一個(gè)組成型啟動(dòng)子，ii)編碼細(xì)菌阻抑物L(fēng)exA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA，iii)編碼VP16的反式激活域的DNA，iv)編碼雌激素受體的DNA，和v)一或多個(gè)LexA結(jié)合位點(diǎn)。
42、一種包含載體的轉(zhuǎn)基因萵苣植物或轉(zhuǎn)基因萵苣植物細(xì)胞，其中所述載體包含化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
43、一種包含載體的轉(zhuǎn)基因萵苣植物或轉(zhuǎn)基因萵苣植物細(xì)胞，其中所述載體包含可由雌激素誘導(dǎo)的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
44、權(quán)利要求43的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其包含兩個(gè)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中第一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以由糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)，另一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以由雌激素誘導(dǎo)。
45、權(quán)利要求44的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其包含權(quán)利要求24的載體。
46、權(quán)利要求44的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其所包含的載體包含i)一個(gè)組成型啟動(dòng)子，ii)編碼GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA，iii)編碼VP16的反式激活域的DNA，iv)編碼糖皮質(zhì)激素受體的DNA，v)一或多個(gè)GAL4上游激活序列。
47、權(quán)利要求43的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述載體還包含選自以下的一個(gè)基因ipt，CKI1，knotted家族的一個(gè)成員，和其表達(dá)能促進(jìn)莖干再生和發(fā)育的基因。
48、權(quán)利要求43的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述載體還包含一個(gè)螢光素酶基因。
49、用權(quán)利要求11的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
50、一種生產(chǎn)展示一熒光設(shè)計(jì)，一個(gè)字或多個(gè)字的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法包含以下步驟
a)制備一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含在化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下
的螢光素酶基因，所述啟動(dòng)子是由雌激素控制的；
b)將誘導(dǎo)所述化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的化合物，以所需的設(shè)計(jì)，
一個(gè)字或多個(gè)字的模式置于所述轉(zhuǎn)基因植物上；
從而所述植物將產(chǎn)生螢光素酶并且以化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子置于所述轉(zhuǎn)基因植物上的模式發(fā)出熒光。
51、一種包含抗生素抗性基因的轉(zhuǎn)基因萵苣植物，其中所述抗生素抗性基因在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。
52、一種包含抗生素抗性基因的轉(zhuǎn)基因萵苣植物，其中所述抗生素抗性基因在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包含編碼雌激素受體的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的DNA。
53、權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是由17-β-雌二醇或4-羥基三苯氧胺誘導(dǎo)的。
54、一種選擇轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法包括將權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)基因植物在存在抗生素及所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)，其中所述抗生素是由所述抗生素抗性基因授予對(duì)其的抗性的抗生素。
55、一種選擇轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法包括將權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)基因植物在存在抗生素及所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)，其中所述抗生素是由所述抗生素抗性基因授予對(duì)其的抗性的抗生素。
56、一種選擇轉(zhuǎn)基因萵苣植物的方法，其中所述方法包括將權(quán)利要求53的轉(zhuǎn)基因植物在存在抗生素和17-β-雌二醇或4-羥基三苯氧胺的情況下生長(zhǎng)，其中所述抗生素是由所述抗生素抗性基因授予對(duì)其的抗性的抗生素。
57、一種包含除草劑基因的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述除草劑抗性基因是在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包含編碼雌激素受體的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的DNA。
58、權(quán)利要求57的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以由選自17-β-雌二醇和4-羥基三苯氧胺的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)。
59、一種選擇轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法包含將權(quán)利要求57的轉(zhuǎn)基因植物在存在除草劑和所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)，其中所述除草劑是由所述除草劑抗性基因授予對(duì)其的抗性的除草劑。
60、權(quán)利要求59的方法，其中所述誘導(dǎo)物選自17-β-雌二醇和4-羥基三苯氧胺。
61、一種包含一種基因的生物體或細(xì)胞，其中所述基因的天然啟動(dòng)子缺失或是無效的，且所述基因在一轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。
62、權(quán)利要求61的生物體或細(xì)胞，其中所述生物體是植物，或者所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。
63、權(quán)利要求61的生物體或細(xì)胞，其中所述生物體是哺乳動(dòng)物，或者所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
64、權(quán)利要求61的生物體或細(xì)胞，其中所述生物體或細(xì)胞是酵母。
65、權(quán)利要求61的生物體或細(xì)胞，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能在存在誘導(dǎo)物的情況下過表達(dá)。
66、權(quán)利要求61的生物體或細(xì)胞，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是由存在于所述生物體或細(xì)胞中的不是在所述生物體或細(xì)胞中天然發(fā)現(xiàn)的化學(xué)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的。
67、權(quán)利要求66的生物體或細(xì)胞，其中所述誘導(dǎo)物是激素。
68、權(quán)利要求67的生物體或細(xì)胞，其中所述激素是17-β-雌二醇。
69、權(quán)利要求61的生物體或細(xì)胞，其包含表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因基因，其中所述轉(zhuǎn)錄因子在存在誘導(dǎo)物的情況下激活所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
70、權(quán)利要求69的生物體或細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因基因包含細(xì)菌阻抑物L(fēng)exA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
71、權(quán)利要求69的生物體或細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因基因包含酸性的VP16反式激活域。
72、權(quán)利要求69的生物體或細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因基因包含雌激素受體的調(diào)節(jié)區(qū)域。
73、權(quán)利要求61的生物體或細(xì)胞，其中所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包含OLexA-46。
74、一種篩選生物體或細(xì)胞的基因中突變的方法，包括
a)制備一種生物體或細(xì)胞，其中所述基因的天然啟動(dòng)子缺失或無效，而且所述基因在轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，
b)培養(yǎng)所述生物體或細(xì)胞。
75、權(quán)利要求74的方法，其中所述突變是條件顯性陽性的或功能增加的突變。
76、權(quán)利要求74的方法，其中所述突變是功能喪失突變。
77、權(quán)利要求74的方法，其中所述生物體或細(xì)胞是在存在所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物的情況下培養(yǎng)。
78、權(quán)利要求74的方法，還包括
c)將T1轉(zhuǎn)基因植物或其子代在存在所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物的情況下培養(yǎng)，以篩選功能增加的突變體。
79、權(quán)利要求76的方法，還包括
d)將純合的T2轉(zhuǎn)基因植物或其子代在沒有所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物的情況下培養(yǎng)。
80、權(quán)利要求74的方法，其中將所述生物體或細(xì)胞在存在所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)一段時(shí)間，隨后在沒有所述誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)。
81、權(quán)利要求74的方法，其中將所述生物體或細(xì)胞在沒有所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)一段時(shí)間，隨后在存在所述誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)。
82、權(quán)利要求80的方法，其中所述的一段時(shí)間是所述生物體或細(xì)胞的生命周期的一或多個(gè)階段的一部分或全部。
83、權(quán)利要求82的方法，其中所述時(shí)期選自胚發(fā)生，胚成熟，種子發(fā)芽，器官發(fā)生和形態(tài)發(fā)生，開花和受精階段。
84、權(quán)利要求81的方法，其中所述的一段時(shí)間是所述生物體或細(xì)胞的生命周期的一或多個(gè)階段的一部分或全部。
85、權(quán)利要求84的方法，其中所述時(shí)期選自胚發(fā)生，胚成熟，種子發(fā)芽，器官發(fā)生和形態(tài)發(fā)生，開花和受精階段。
86、權(quán)利要求74的方法，其中所述基因影響細(xì)胞分化，細(xì)胞延伸或細(xì)胞分化。
87、權(quán)利要求74的方法，其中所述生物體或細(xì)胞是i)植物或植物細(xì)胞，ii)哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或iii)酵母細(xì)胞。
88、權(quán)利要求74的方法，其中可以篩選所述生物體或細(xì)胞的子代，通過將一些子代在存在誘導(dǎo)物的情況下，一些子代在沒有誘導(dǎo)物的情況下生長(zhǎng)，以篩選所述基因功能增強(qiáng)的突變和所述基因功能喪失的突變。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,其用于用可調(diào)控基因轉(zhuǎn)化植物或植物細(xì)胞,所述可調(diào)控基因通過將植物或細(xì)胞加入到含有誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中或?qū)⒅参锘蚣?xì)胞從這種培養(yǎng)基中移出而被調(diào)控。所述啟動(dòng)子可由糖皮質(zhì)激素、雌激素或非植物內(nèi)源性的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)。這種啟動(dòng)子可與促進(jìn)莖干再生和發(fā)育的任何植物基因一起應(yīng)用,以在存在糖皮質(zhì)激素、雌激素或誘導(dǎo)物的情況下誘導(dǎo)莖干形成。所述啟動(dòng)子可與抗生素或除草劑抗性基因或可由給定誘導(dǎo)物的存在或不存在調(diào)控的其它基因一起應(yīng)用。本發(fā)明還提供了包含一種基因的生物體或細(xì)胞,其中所述基因的天然啟動(dòng)子被破壞且所述基因被置于轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。這些生物體和細(xì)胞及其子代可用于篩選條件性功能增加和功能喪失突變。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1423702SQ00818368
公開日2003年6月11日 申請(qǐng)日期2000年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月12日
發(fā)明者左建儒, 蔡南海 申請(qǐng)人:洛克菲勒大學(xué)